Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cỏ seo gà

PHAN THỊ THANH MAI BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014... PHAN THỊ THANH

PHAN THỊ THANH MAI

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

PHAN THỊ THANH MAI

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ Cỏ seo gà”, ngoài

sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Thái Nguyễn

Hùng Thu – Trưởng bộ môn Hóa phân tích và độc chất, người đã dành nhiều thời

gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS Nguyễn Duy Chí – Chủ nhiệm

Khoa kiểm nghiệm Hóa học – Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dược và trang thiết bị

y tế Quân đội, người đã rất nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến DS Nguyễn Hải Đường và các anh chị

Khoa kiểm nghiệm Hóa học, Khoa kiểm nghiệm Vật lý, Khoa nghiên cứu kiểm nghiệm Dược liệu cùng các cán bộ Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dược và trang thiết bị y tế Quân đội đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2014

Phan Thị Thanh Mai

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Thành phần hóa học 2

1.1.3 Tác dụng dược lý 4

1.1.4 Công dụng 5

1.2 MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ 5

1.2.1 Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid 5

1.2.2 Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid 6

1.2.3 Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosid] 7

1.2.4 3,4-dihydroxybenzandehyd 8

1.2.5 Kaempferitrin 9

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 11

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

1.3.2 Máy HPLC 11

1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 12

1.3.4 Ứng dụng của kỹ thuật HPLC 13

1.3.5 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Dung môi, hóa chất 17

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 17

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 19

2.3.2 Chuẩn bị các chất đối chiếu 20

2.3.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 20

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 21

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 23

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24

3.1 ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 24

3.1.1 Độ ẩm của dược liệu 24

3.1.2 Hiệu suất chiết cắn toàn phần 24

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 25

3.2.1 Lựa chọn cột sắc ký 25

3.2.2 Lựa chọn pha động 26

3.2.3 Lựa chọn tốc độ dòng 26

3.2.4 Lựa chọn bước sóng phát hiện 26

3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ 29

3.4 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ SEO GÀ 33

3.4.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 37

3.4.4 Độ đúng 41

3.4.5 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 44

3.5 SƠ BỘ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ SEO GÀ 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47

KẾT LUẬN 47

ĐỀ XUẤT 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DAD: Detector mảng diod (Diod Array Detector)

HDL – Cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng cao mang Cholesterol (High Density

Lipoprotein Cholesterol)

Chromatographic)

HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High-Performance

Liquid Chromatographic – Mass Spectrometry)

IR: Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

LDL – Cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng thấp mang Cholesterol (Low Density

Lipoprotein Cholesterol)

UV – VIS: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet Visible)

Danh mục các bảng Trang Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu 24 Bảng 3.2 Một số thông số trên phổ DAD của các chất nghiên cứu 28 Bảng 3.3 Sự phù hợp của hệ thống HPLC về thời gian lưu 33 Bảng 3.4 Sự phù hợp của hệ thống HPLC về diện tích pic 34 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM3 35 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM12 36 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM18 36 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM15 37 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM9 37 Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM3 38 Bảng 3.11 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM12 38 Bảng 3.12 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM18 39 Bảng 3.13 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM15 40 Bảng 3.14 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM9 40 Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ đúng với PM3 41 Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ đúng với PM12 42 Bảng 3.17 Kết quả khảo sát độ đúng với PM18 42 Bảng 3.18 Kết quả khảo sát độ đúng với PM15 43 Bảng 3.19 Kết quả khảo sát độ đúng với PM9 43 Bảng 3.20 Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 5 hợp chất phân

Danh mục các hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC 11 Hình 1.2 Cấu tạo detector mảng diod (DAD) 15 Hình 3.1 SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm

với các hệ dung môi khác nhau 25 Hình 3.2 Phổ DAD của các chất nghiên cứu 27 Hình 3.3 Phổ UV – VIS của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ seo

Hình 3.4 SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu 29 Hình 3.5 SKĐ của dịch chiết toàn phần cây Cỏ seo gà 29 Hình 3.6 SKĐ của hợp chất PM3 phân lập được từ Cỏ seo gà 30 Hình 3.7 SKĐ của hợp chất PM12 phân lập được từ Cỏ seo gà 30 Hình 3.8 SKĐ của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ seo gà 30 Hình 3.9 SKĐ của hợp chất PM15 phân lập được từ Cỏ seo gà 31 Hình 3.10 SKĐ của hợp chất PM9 phân lập được từ Cỏ seo gà 31 Hình 3.11 Kết quả so sánh phổ DAD của pic tương ứng với thời gian

lưu của chuẩn và thử PM3 32 Hình 3.12 Kết quả chồng phổ DAD của pic một số chất nghiên cứu

trên sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn và của mẫu thử 32 Hình 3.13 SKĐ của mẫu trắng 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, trên thế giới, nhu cầu về dược liệu, thuốc y học cổ truyền và hoạt chất chiết xuất từ dược liệu có xu hướng ngày càng tăng, nhất là ở các nước đang phát triển Nền y học cổ truyền của nước ta có một lịch sử phát triển lâu đời và phong phú Từ xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quý để phòng bệnh và chữa bệnh Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, từ những kinh nghiệm do nhu cầu của thực tiễn, số lượng cây, con được đưa vào làm thuốc ngày càng tăng

Cỏ seo gà, còn được gọi là Phượng vĩ, Phượng vĩ thảo, Cỏ luồng có tên khoa

học là Pteris multifida Poir., họ Seo gà (Pteridaceae) Theo y học cổ truyền, Seo gà

có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính lạnh, có tác dụng thanh nhiệt, lương huyết, lợi thấp, chỉ lỵ được dùng chữa kiết lỵ mạn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở, ngứa, bệnh ngoài da, ung thư [3]

Tuy nhiên, cho đến nay có rất ít công trình khoa học nghiên cứu tổng thể về loài thực vật này Năm 2012, NCS Nguyễn Duy Chí đã nghiên cứu, phân lập được một số hợp chất từ Cỏ seo gà thu hái tại Ba Vì, Hà Nội Để đánh giá tiềm năng và

góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu, đề tài “Bước đầu nghiên cứu xây dựng

phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ Cỏ seo gà” đã được thực hiện nhằm các mục tiêu:

1 Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã phân lập được từ cây Cỏ seo gà bằng phương pháp HPLC

2 Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng các hợp chất trên trong mẫu Cỏ seo gà thu hái được

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Pteris multifida Poir., họ Seo gà (Pteridaceae)

Tên đồng nghĩa: Pteris serrulata L.f

Tên khác: Phượng vĩ thảo, cỏ luồng [3], theo gà, phượng vĩ [5]

Tên nước ngoài: Spider brake (Anh) [3]

Cây thảo, cao 20-40 cm, có thể hơn [3] Thân rễ nằm ngang dưới mặt đất, chừng 3-4 cm, hình cong queo, sần sùi, nhiều mấu, hơi cứng, vị hơi ngọt, đắng và

tê, mùi thơm hắc [5] Lá mọc thẳng từ thân rễ, xẻ sâu hình lông chim hai lần, nhẵn, gân lá rõ, có hai loại: lá không sinh sản ngắn, màu lục nhạt hơi vàng, các thùy to nhỏ không đều mọc đối nhau, mép hơi khía răng, có đầu tròn, riêng thùy tận cùng thuôn dài thành mũi nhọn; lá sinh sản dài, màu đen sẫm gồm các thùy hình dải thuôn uốn éo, mọc đối, đầu nhọn hoắt, mép lá gập lại mang túi bào tử dày đặc ở trong; cuống lá rất dài, màu nâu nhạt ở gốc, hơi vàng ở phía trên [3]

Bào tử hình bốn cạnh, hơi tròn, màu vàng nhạt, có nhiều u sần nhỏ [3]

Mùa sinh sản: tháng 5 – 10 [3]

Cỏ seo gà mọc phổ biến ở miền Bắc và miền Trung nước ta, thường gặp nhất

ở trên những vách đá, vách đất, xung quanh thành giếng, ven đường đi, những nơi thoáng ẩm và mát Còn thấy mọc cả ở Trung Quốc, Nhật Bản [5]

Bộ phận dùng làm thuốc của cây là thân rễ và lá [5]

1.1.2 Thành phần hóa học

Năm 1996, từ Pteris multifida Poir (Polypodiaceae), Woerdenbag HJ và cộng

sự đã phân lập bằng sắc ký cột silica gel thu được 2 hợp chất diterpen là: 2β, 16α-diol và ent-kaur-16-en-2β, 15α-diol Cả 2 chất này đều có tác dụng gây độc với tế bào u báng Ehrlich [37]

entkauran-Năm 2006, Hao-Bin Hu, Xu-Dong Zheng và Hong Cao đã phân lập được 2 hợp chất xanthon glycosid mới là 1-hydroxy-4,7-dimethoxy-8-(3-methyl-2-butenyl)-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-[β-D-glucopyranosyl-(13)]-β-

Dglucopyranosylxanthon và α-L-rhamnopyranosyl-(12)-[β-D-glucopyranosyl-(13)]-β-D-

1,3-dihydroxy-7-methoxy-8-(3-methyl-2-butenyl)-6-O-glucopyranosylxanthon cùng với 6 hợp chất khác là quercetin, dehydrogoniothalamin, vanillin, dihydroechioidinin, saucerneol D, licoagrochalcon

D [20]

Năm 2008, Xu-dong Zheng, Hao-bin Hu, Huai-sheng Hu đã phân lập được

hợp chất neolignan glycosid mới là Multifidosid A: 5'-methoxy-7,3'-dioxy-8,4'-neolignan-4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-

rel-(7S,8S)-Δ7'-2,9'-Dihydroxy-glucopyranosid và 4 chất khác là scaphopetalon, (−)-isolariciresinol apiofuranosyl-(1→2)-O-β-glucopyranosid, 6,7-dihydroxy-3'-methoxy-4',5'-methylenedioxyisoflavon 6-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid, polyporusteron I [39]

3α-O-β-Năm 2008, Liva Harinantenaina và cộng sự đã phân lập được 4-caffeoyl quinic acid 5-O-methyl ether, (2R,3R)-pterosin L 3-O-β-D-glucopyrannosid, β-sitosterol β-D-glucopyranosid, apigenin 7-O-β-D-glucopyranosid, luteolin 7-O-β-D-glucopyranosid, sucrose, caffeic acid, pterosin C 3-O-β-D-glucopyranosid, pterosid

C, 4,5-dicaffeoyl quinic acid, pterosid A, wallichosid và tetrahydroxyflavanon [26]

(2S)-5,7,3',5'-Theo Wang WS, Wang ZQ, Zhou YW (2008), từ dịch chiết methanol của

Pteris multifida, sau khi phân lập, tinh chế bằng sắc ký cột pha thuận, sắc ký lớp

mỏng và sắc ký cột nhồi sephadex, đã thu được một sesquiterpen glycosid là pterosin C-3-O-β-D-glucosid và 6 flavonoid là: apigenin, luteolin, apigenin-7-O-β-D-glucosid, apigenin-7-O-β-D-glucosyl-4'-O-α-L-rhanrnosid, apigenin-4'-O-α-L-rhanrnosid, luteolin-7-O-β-D-glucosid [36]

Năm 2008, Xin Ge và cộng sự đã phát hiện 6 hợp chất mới, trong đó có 3 hợp chất ent-kauran diterpenoid là pterokauran M1, pterokauran M2, pterokauran M3 và

3 hợp chất C14 pterosin-sesquiterpenoid là multifidosid A, multifidosid B, multifidosid C đồng thời cũng phân lập được 18 diterpenoid và sesquiterpenoid khác đã biết [38]

Jicheng Shu và cộng sự (2012) đã phân lập được 2S,3S-acetylpterosin C và 2 hợp chất pterosin sesquiterpen mới là: 2R,3R-13-hydroxy-pterosin L 3-O-β-D-

glucopyranosid và 2R,3S-acetylpterosin C [15]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Theo T.C Wang, M.C Ti, S.C Lo, C.C Yang (2007) dịch chiết Pteris

multifida có tác dụng thu dọn gốc tự do DPPH, hydroxyl và có khả năng khử [34]

Năm 2008, Xin Ge, Guan Ye, Ping Li, Wen-Jie Tang, Jin-Li Gao và Wei-Min

Zhao đã phát hiện ra 6 hợp chất mới ở loài Pteris multifida, trong đó multifidosid A

và multifidosid B được chứng minh có tác dụng ức chế đáng kể đối với tế bào HepG2 (ung thư biểu mô tế bào gan) và K562 (ung thư máu) Từ kết quả của nghiên

cứu này, có thể sử dụng Pteris multifida như thuốc dân gian để điều trị ung thư [38]

Harinantenaina L, Matsunami K, Otsuka H (2009) nghiên cứu in vitro đưa ra

kết luận: dịch chiết P multifida Poiret có tác dụng chống oxy hóa thể hiện ở khả

năng thu dọn các gốc tự do như: anion superoxid, 2,2'-azinobis (3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); tạo phức chelat với các ion kim loại chuyển tiếp (Fe2+, Cu2+ ); chống lại sự kích thích của FeCl2/H2O2 lên quá trình peroxyd hóa acid linoleic, phá vỡ phản ứng dây chuyền của sự peroxyd hóa lipid nên có tác dụng chống peroxyd hóa lipid [21]

Năm 2010, Wang TC, Lin CC, Lee HI, Yang C, Yang CC đã phát hiện Cỏ seo

gà có tác dụng làm hạ lipid máu trên chuột ăn chế độ giàu cholesterol: giảm triglycerid, LDL-Cholesterol và tỷ lệ LDL-Cholesterol/HDL-Cholesterol huyết tương, giảm cholesterol, triglycerid gan; đồng thời có tác dụng tăng đào thải lipid và các sản phẩm chuyển hóa qua đường tiêu hóa [35]

Theo Kuang-Ping Lan và cộng sự (2011), dịch chiết P multifida Poiret

(AEPM) có tác dụng thu dọn các gốc tự do α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, hydroxyl,

Fe2+ và khả năng khử mạnh Các chất chống oxy hóa trong AEPM bao gồm acid ascorbic, β-caroten, tocopherol (dạng α-, β- và δ-) và phenol toàn phần, trong đó thành phần chống oxy hóa chính là phenol toàn phần Đây là các chất chống oxy hóa hiệu quả, sự có mặt và lượng chất ảnh hưởng đến tác dụng chống oxy hóa

Dựa trên những kết quả thu được từ nghiên cứu này, AEPM là chất bảo vệ có thể giúp cơ thể con người chống lại sự phá hủy của quá trình oxy hóa [22]

Năm 2013, Yu C, Chen J, Huang L đã công bố nghiên cứu về tác dụng chống

ung thư của flavonoid toàn phần trong Pteris multifida Poir trên chuột mang khối u

H22, kết luận rằng các flavonoid toàn phần này có tác dụng ức chế rõ ràng trên khối

u H22 được cấy; cơ chế hoạt động của nó có thể liên quan với việc cải thiện chức

năng miễn dịch và tăng cường khả năng chống oxy hóa ở chuột [42]

Rễ, lá sao vàng, tán nhỏ đun với dầu vừng thành thuốc dầu bôi chữa một số bệnh ngoài da của trẻ em [5]

Ở Trung Quốc, Pteris multifida Poir đã được sử dụng chủ yếu như một loại

thuốc dân gian truyền thống để điều trị bệnh eczema (chàm), nôn ra máu, viêm ruột, tiêu chảy, lỵ trực trùng và có tác dụng chống ung thư và kháng khuẩn [14]

Pteris multifida Poir có tác dụng hạ sốt, giải độc, chống viêm, kháng sinh,

giải nhiệt, tác dụng chống gây đột biến và chủ yếu được sử dụng như loại thuốc dân

gian để điều trị bệnh tả, lỵ và trĩ nội [24]

1.2 MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ

1.2.1 Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid

Tên khoa học: Maltol-3-O-β-D-glucopyranoside

Công thức phân tử: C12H16O8 (M = 288,26 g/mol) [12]

Năm 2013, Djimtombaye BJ và cộng sự đã phân lập được

Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid từ toàn cây Astragalus halicacabus [9]

Từ 3,0 kg phần trên mặt đất khô của cây Elsholtzia rugulosa (Lamicaeae)

phân lập được 52,2 mg Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [18]

Từ 12 kg bột dược liệu thô Drynaria fortunei phân lập được 11,5 mg

Tên khoa học: Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside-7-O-β-D-glucopyranoside

Công thức phân tử: C27H30O15 (M = 594 g/mol)

1.2.2.1 Tính chất vật lý

Chất rắn vô định hình, màu vàng [α]D25: -72o (c = 0,42, MeOH);

IR νmax (neat): 3400, 1654 cm-1 [21]

1.2.2.2 Nguồn gốc

Năm 1997, Mohamed Sharaf và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid từ một số loài

thuộc chi Cleome: Cleome amplyocarpa Barr and Murb., C brachycarpa Vahl., C

chrysantha Decne., C droserifolia (Forssk.) Del [27]

Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid còn được

tìm thấy ở trong cây Chenopodium murale [10]

Năm 2007, từ 8,1 kg toàn bộ cây tươi Sword Brake fern (Pteris ensiformis

Burm.) phân lập được 30,0 mg glucopyranosid với hàm lượng 2,62 ± 0,02 mg/g khối lượng cắn [43]

Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-1.2.2.3 Tác dụng dược lý

Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid có tác dụng thu dọn các gốc cation tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và ABTS.+

(ABTS là 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) [43]

1.2.2.4 Phương pháp định lượng

HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm×250 mm); pha động: methanol

và nước với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%, tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút

và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ dòng: 1 mL/phút; bước sóng 297 nm [43]

1.2.3 D-glucopyranosid]

Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-Tên khoa học:

Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranoside]

Công thức phân tử: C32H38O19 [24] (M = 726 g/mol)

Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosid] có tác dụng thu dọn các gốc cation tự do DPPH

(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và ABTS.+ (ABTS là 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic

acid) [43]

1.2.3.4 Phương pháp định lượng

HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm× 250 mm); pha động: Methanol

và nước với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%, tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút

và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ dòng: 1 mL/phút; bước sóng 297 nm [43]

1.2.4 3,4-dihydroxybenzandehyd

OHOH

1 2 3 4 5 6

Tên khoa học: 3,4-dihydroxybenzandehyde

Công thức phân tử: C7H6O3 (M = 138,12 g/mol)

1.2.4.1 Tính chất vật lý

Bột màu trắng, To

nc: 152-154oC [7]

1.2.4.2 Nguồn gốc

Năm 2007, Buniyamin A Ayinde, Doris N Onwukaeme và Eric K Omogbal

phân lập được 3,4-dihydroxybenzandehyd từ vỏ thân cây Musanga cecropioides

R.Brown (Moraceae) [7]

Theo Nova Syafni và cộng sự, từ 6,0 kg lá; 4,3 kg thân cây; 1,5 kg rễ cây

Trichomanes chinense L tương ứng phân lập được 35 mg (chiếm 0,002% khối

lượng cắn), 33 mg (0,003% khối lượng cắn) và 8 mg (0,0007% khối lượng cắn)

3,4-dihydroxybenzandehyd [28]

Ngoài ra 3,4-dihydroxybenzandehyde còn được phân lập từ nấm Phellinus

gilvus (Schwein) Pat (Hymenochaetaceae), lan Cremastra appendiculata (D Don)

Makino (Orchidaceae) và lá Vitis vinifera L (Vitaceae) [28]

1.2.4.3 Tác dụng dược lý

3,4-dihydroxybenzandehyd được tinh chế từ quả Xanthium strumarium có tác

dụng ức chế phosphotransferase của CKII với IC50 khoảng 783 μM Nồng độ 300

μM 3,4-dihydroxybenzandehyd gây ra ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào ung thư U937 ở người Nó có thể có khả năng ức chế bệnh ung thư thông qua sự ức chế hoạt động CKII [23]

3,4-dihydroxybenzandehyd được phân lập từ lúa mạch Hordeum vulgare có

tác dụng ức chế sự oxy hóa phá hủy DNA và quá trình apoptosis gây ra bởi H2O2 3,4-dihydroxybenzandehyd có tác dụng thu dọn gốc DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), hydroxyl, ROS nội bào Nó cũng tạo phức chelat với Fe2+ [11]

1.2.5 Kaempferitrin

Tên khoa học: Kaempferol-3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside

Công thức phân tử: C 27H 30O 14 (M = 578,53 g/mol) [13]

1.2.5.1 Tính chất vật lý:

Tinh thể hình kim sáng bóng màu vàng nhạt [19]

Tan trong ethanol hoặc DMSO, to

nc: 201-203oC [13]

1.2.5.2 Nguồn gốc

Kaempferitrin được chiết xuất từ lá Hedyotis verticillata [6]

Năm 2006, Kaempferitrin được chiết xuất từ Celastrus orbiculatus, C

punctatus, C paniculatus, Trichosanthes cucumeroides [32]

Từ 1,5 kg bột dược liệu khô cây Lotus lalambensis phân lập được 180 mg

Kaempferitrin [19]

Năm 2009, Yerra Koteswara Raoa và cộng sự đã chiết xuất được 156 mg

Kaempferitrin từ 500 g bột lá khô Cinnamomum osmophloeum [40]

1.2.5.3 Tác dụng dược lý

Kaempferitrin có tiềm năng chống viêm, có tác dụng ức chế một số chức năng của đại thực bào tham gia vào quá trình viêm Nó ức chế lipopolysaccharid, interferon (IFN)-γ – tạo ra nitric oxid (NO) và các cytokin [yếu tố hoại tử khối u TNF-α và interleukin (IL)-12] [31]

Kaempferitrin có tác dụng hạ đường huyết và tiềm năng chống oxy hóa (có phản ứng cao với DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), ức chế hoạt động myeloperoxidase và làm giảm quá trình peroxy hóa lipid – gây ra bởi gốc ascorbyl [8], [16]

Nghiên cứu này đưa ra bằng chứng về tác dụng kép của Kaempferitrin là: vừa cải thiện đề kháng insulin bằng cách hoạt hóa đường dẫn truyền insulin kinh điển vừa tăng tiết adiponectin (kích thích tế bào mỡ tiết adipokin) [41]

Kaempferitrin có tác dụng chống rối loạn lipid máu: làm giảm cholesterol toàn phần, triglycerid và lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C) huyết tương ở chuột bị rối loạn lipid máu [33]

1.2.5.4 Phương pháp định lượng

HPLC pha đảo với cột C18 Hypersil BDS (4,6mm×100 mm, 3 μm); pha động: Acetonitril (A) và nước chứa 0,1% acid trifluroacetic (B) với tỷ lệ A:B = 10:90, chạy gradient tuyến tính tới 30:70 trong 0-20 phút, duy trì trong 10 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút; bước sóng 265 nm; nhiệt độ cột: 25ºC; khoảng tuyến tính: 5 –

100 μg/mL; độ tìm lại: 98% [40]

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân

bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của chất phân tích

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc

ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1]

1.3.2 Máy HPLC

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi

Hệ thu nhận xử lý dữ

liệu (máy ghi, máy tính)

1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký [1]

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất

Thời gian chết tM là thời gian lưu của chất không bị lưu giữ

Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R = tR – tM

k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất của hai pha và tỷ lệ VS/VM

Thường lựa chọn điều kiện sắc ký để k’ = 1 – 5

(tR)A, (tR)B: thời gian lưu chất A, B

WA, WB : lần lượt là độ rộng pic A, B ở các đáy pic

W1/2A, W1/2B : lần lượt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

RS  1,5 thì 2 pic coi như tách nhau hoàn toàn

1.3.3.5 Số đĩa lý thuyết

Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý thuyết Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc

ký

254

,5

216

2 / 1

t

Trong đó : W là chiều rộng pic ở đáy pic

W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:

 Phương pháp chuẩn ngoại

 Phương pháp chuẩn nội

 Phương pháp thêm chuẩn

 Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại

Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùng điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm

 Chuẩn hóa 1 điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử

Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

CS: nồng độ chất chuẩn

SX (HX): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử

SS (HS): diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn

 Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C) Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính theo 2 cách:

 Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy

ra được nồng độ của nó

 Xây dựng đường hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định

S = a  C + b S: Diện tích pic

a: Độ dốc của đường chuẩn b: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung C: Nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử:

S b C

a



 Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn

1.3.5 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector)

Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – VIS, được dùng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – VIS (trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích Tế bào đo ở trong detector là một ống hình trụ đường kính 1 mm, chiều dài 10 mm Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau

đó được tách ra thành các bước sóng đơn Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau cùng một lúc Thông thường, chỉ có một hoặc hai bước sóng được theo dõi trong quá trình chạy sắc ký Giám sát hai pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic

Hình 1.2 Cấu tạo detector mảng diod (DAD)

Quang phổ và sắc ký đồ có thể được biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của

hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh detector đo ở bước sóng cố định hoặc thay đổi Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian

Ứng dụng: Đầu dò DAD cho phép lựa chọn bước sóng phù hợp nhất cho phân tích, có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất, ngoài ra detector DAD dùng để xác định độ tinh khiết của pic [1]

CHƯƠNG II

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là cây Cỏ seo gà (được làm khô tự nhiên) thu hái tại Ba Vì,

Hà Nội và đã được TS Đỗ Thị Xuyến (Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học là: Pteris

multifida Poir., họ Seo gà (Pteridaceae)

2.1.2 Dung môi, hóa chất

 Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic

 Dung môi loại dùng cho HPLC: acetonitril, methanol (Merck – Đức)

 Nước cất hai lần dùng cho HPLC

 Các hợp chất đã phân lập được từ cây cỏ Seo gà là:

PM3 (Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid),

PM9 (Kaempferol 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranosid),

PM12 (3,4-dihydroxybenzandehyd),

PM15 (Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid), PM18 (Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosid]), đã được tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng phương pháp phổ NMR

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu SPD – 10AVP (Nhật)

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HEWLETT – PACKARD 1100 (Detector DAD) (Mỹ)

 Cột sắc ký Phenomenex Luna 5u C18 100A (150 mm  4,6 mm, 5 µm)

 Cột sắc ký Chromolith RP18e 130A (100 mm  4,6 mm)

 Cột sắc ký Zobax Eclipse XBD – C18 (250 mm  4,6 mm, 5 µm)

 Cột bảo vệ Phenomenex C18 (cartridge 4  30 mm ID)

 Bể siêu âm ELMA S 180/H (Đức)

 Tủ sấy UNB 400 Memmert (Đức)

 Tủ sấy chân không Shellab1430 D-2E (Đức)

 Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45µm

 Cân phân tích AB-265S Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d=0,00001 g)

 Cân phân tích XS-204 Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d=0,0001g)

 Bể cách thủy ổn nhiệt WNB14 – Memmert (Đức)

 Máy đo pH Seven compact S220 (Mettler Toledo – Thụy Sỹ)

 Micropipet 10-100L, 100-1000L

 Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế được bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích để kiểm tra khả năng sử dụng chúng như các chất đối chiếu

 Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp chất trong hỗn hợp các chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong dịch chiết cây Cỏ seo gà

 Định tính các pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với quét phổ DAD

 Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu

là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích

 Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng các hợp chất trên có trong mẫu cây Cỏ seo gà đã thu hái được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử

2.3.1.1 Xác định độ ẩm của bột dược liệu

Toàn cây Cỏ seo gà sau khi được làm khô tự nhiên, nghiền thành bột thô rồi xác định độ ẩm của dược liệu theo phương pháp mất khối lượng do làm khô (Phụ

lục 9.6, Dược điển Việt Nam IV, năm 2009)

Dùng cốc thủy tinh có nắp mài làm bì đựng mẫu thử, làm khô bì trong tủ sấy ở

áp suất thường trong 30 phút, làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân ngay để xác định khối lượng bì Cân ngay vào bì này một lượng chính xác mẫu thử khoảng 2 g, dàn mỏng thành lớp có độ dày khoảng 5 mm, sấy ở

105oC đến khối lượng không đổi Từ đó xác định độ ẩm của bột mẫu nghiên cứu [4]

2.3.1.2 Chiết xuất

Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi chọn xử

lý mẫu theo phương pháp chiết siêu âm

Cân khoảng 50 g dược liệu toàn cây Cỏ seo gà (đã xác định độ ẩm trước) đã được làm nhỏ, chiết siêu âm với methanol đến kiệt, thu dịch chiết, lọc, bốc hơi cách thủy dung môi trên tới cắn, sấy khô và bảo quản cắn ở 4oC

2.3.1.3 Tính hiệu suất chiết

Hàm lượng % của cắn toàn phần so với khối lượng bột dược liệu được tính theo công thức sau:

100

(100 )

a X

50 mL, lọc qua màng lọc 0,45 m trước khi định tính và định lượng bằng HPLC

2.3.2 Chuẩn bị các chất đối chiếu

2.3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập được

Các chất nghiên cứu được cân chính xác, hòa tan và định mức thành các dung dịch trong methanol, lọc qua màng lọc và tiêm vào hệ thống sắc ký

Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có trong chúng sau khi được phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc Tổng tạp của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích

Nếu chất phân lập không bị lẫn các tạp chất khác, tạm bỏ qua hàm ẩm (vì khối lượng chất phân lập được rất ít) để coi hàm lượng của các chất phân lập là 100% trong xây dựng phương pháp định lượng

2.3.2.2 Pha các dung dịch đối chiếu gốc

Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu đã phân lập và tinh chế được, hòa tan và định mức vừa đủ bằng methanol để thu được các dung dịch đối chiếu gốc

có nồng độ chính xác lần lượt: PM3 khoảng 100 g/mL, PM12 khoảng 100 g/mL, PM18 khoảng 200 g/mL, PM15 khoảng 200 g/mL, PM9 khoảng 250 g/mL Các dung dịch này dùng để kiểm tra tổng tạp và được pha loãng thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn

2.3.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên các cột C18 có kích thước hạt nhồi là 5 µm hoặc kích thước khác, với chiều dài cột là 10 cm, 15 cm hoặc 25 cm

2.3.3.2 Chọn pha động

Pha động là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ các chất phân

tích và hiệu quả của sự tách sắc ký

Qua nghiên cứu tính chất lý hóa của các chất nghiên cứu và tham khảo một số tài liệu, dung môi thường sử dụng là acetonitril, methanol, nước Tiến hành khảo sát với nhiều hệ dung môi khác nhau sao cho các pic của các hợp chất nghiên cứu tách riêng rẽ với thời gian phân tích hợp lý

Phép định lượng các hợp chất phân lập được từ Cỏ seo gà bằng phương pháp

HPLC được thẩm định thông qua các chỉ tiêu:

 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký

 Độ lặp lại của phương pháp

 Độ tuyến tính và khoảng xác định

 Độ đúng

 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

2.3.4.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký

Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý xong

Cách xác định: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: RSD  2,0%

Ngoài ra, sự phù hợp của hệ thống còn thể hiện ở tính chọn lọc Tính chọn lọc

là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần

2.3.4.2 Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của một phương pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích

Tiến hành: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình Độ lặp lại được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: RSD  2,0%

2.3.4.3 Độ tuyến tính và khoảng xác định

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan r

Khoảng xác định: Là khoảng nồng độ đã được khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi là khoảng tuyến tính) Khảo sát nồng độ từ 40% đến 140% nồng độ lý thuyết của mẫu

Cách xác định: Chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính

Yêu cầu: r2  0,99 (r  0,995)

2.3.4.4 Độ đúng

Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực

Cách xác định: Pha dung dịch thử và dung dịch đối chiếu theo quy trình chuẩn

bị dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Thêm vào mẫu thử những lượng chất đối chiếu khác nhau sao cho tổng lượng hoạt chất có trong mẫu nằm trong khoảng tuyến tính rồi tiến hành định lượng để xác định hàm lượng của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phương trình đường chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất đối chiếu tìm được so với lượng chất đối chiếu thêm vào

Yêu cầu: Độ tìm lại: 95,0 – 105,0%

2.3.4.5 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được về mặt định tính

LOQ là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp

Cách xác định: Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N) Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký Đo tín hiệu liên tục từ mẫu trắng (B)

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN

3.1.1 Độ ẩm của dược liệu

Lấy ngẫu nhiên 3 mẫu ở 3 vị trí khác nhau của bột dược liệu rồi xác định độ

ẩm của dược liệu theo phương pháp mất khối lượng do làm khô Kết quả thu được tại bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu

3.1.2 Hiệu suất chiết cắn toàn phần

 Khối lượng cắn toàn phần:

Cân 50,2785 g dược liệu toàn cây Cỏ seo gà (độ ẩm 15,93%) đã được làm nhỏ, chiết siêu âm với methanol đến kiệt, thu dịch chiết, lọc, bốc hơi cách thủy dung môi trên tới cắn Cắn được sấy trong tủ sấy áp suất giảm ở 60oC đến khối lượng không đổi, thu được 2,1410 g cắn toàn phần, bảo quản cắn ở 4oC

Nhận xét: Để định lượng các hợp chất trong Cỏ seo gà đạt kết quả tốt, trước

hết cần phải chiết kiệt hoạt chất và làm sạch dịch chiết Chúng tôi chọn phương pháp chiết siêu âm với methanol Đây là phương pháp dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, thời gian chuẩn bị mẫu ngắn mà lại cho hiệu suất cao

 Hiệu suất chiết:

100

(100 )

a X

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

3.2.1 Lựa chọn cột sắc ký

Vì mẫu phân tích là dược liệu có nhiều thành phần nên cần có sự tách tốt và thời gian phân tích phù hợp Chúng tôi tiến hành khảo sát trên loại cột C18 với kích thước hạt nhồi là 5µm hoặc kích thước khác và chiều dài cột là 10 cm, 15cm hoặc

25 cm

Với cột Phenomenex Luna 5u C18 100A (150 mm  4,6 mm, 5 µm) hoặc cột Chromolith RP18e 130A (100 mm x 4,6 mm) có nhiều kích thước hạt khác nhau kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (cartridge 4  30 mm ID) với nhiều hệ dung môi khác nhau đều thu được các sắc ký đồ trong đó các pic không tách riêng được (hình 3.1) Trong số các cột khảo sát, cột Zobax Eclipse XBD – C18 (250 mm  4,6 mm,

5 µm) là phù hợp nhất, cho các pic tách tốt, thời gian lưu hợp lý (hình 3.3, 3.4)

Hình 3.1 SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm với các hệ

dung môi khác nhau

3.2.2 Lựa chọn pha động

Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột Zobax Eclipse XBD – C18 (250

mm  4,6 mm, 5 µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (cartridge 4  30 mm ID) Quá trình khảo sát tiến hành ở nhiệt độ phòng là 25oC

Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động với các hệ dung môi: methanol – nước (có 0,1% acid formic), acetonnitril – methanol (có 0,1% acid formic), acetonitril – nước (có 0,1% acid formic) với tỷ lệ thành phần khác nhau

Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động acetonitril (kênh A) và nước

có 0,1% acid formic (kênh B) với chế độ gradient dung môi cho kết quả tốt nhất Với chương trình dung môi tỷ lệ A:B sử dụng ban đầu là (5:95), thay đổi tuyến tính đến (9:91) ở phút thứ 4, rồi thay đổi tuyến tính đạt tới (16:84) ở phút thứ 5, duy trì đến phút thứ 12, sau đó tiếp tục thay đổi tuyến tính tới (28:72) ở phút thứ 22, thay đổi tuyến tính trở về tỷ lệ ban đầu (5:95) ở phút 29, duy trì đến phút 30 là phù hợp nhất, có khả năng tách tốt cả 5 hợp chất cần phân tích, cho pic nhọn, cân đối và thời gian lưu hợp lý, thời gian phân tích không quá dài Vì vậy, chúng tôi lựa chọn hệ dung môi trên làm pha động trong nghiên cứu này

3.2.3 Lựa chọn tốc độ dòng

Tiến hành khảo sát ở các tốc độ dòng khác nhau 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút; 1,1 mL/phút và 1,2 mL/phút Kết quả cho thấy tốc độ dòng 1,0 mL/phút là hợp lý vì cho kết quả tách tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý

3.2.4 Lựa chọn bước sóng phát hiện

Lấy phổ DAD của các pic tương ứng với các chất nghiên cứu Hình ảnh phổ DAD của các chất nghiên cứu được thể hiện trong hình 3.2, độ hấp thụ quang A tại một số bước sóng được ghi trong bảng 3.2

Các số liệu cho thấy cả 3 chất PM18, PM15 và PM9 đều hấp thụ cực đại tại bước sóng  = 264 nm, 2 chất còn lại là PM3 có cực đại ở 258 nm và PM12 có cực đại ở 280 nm và chúng đều có độ hấp thụ tại  = 264 nm tương đối lớn Detector DAD này chỉ đưa ra các kết quả ở các bước sóng chẵn, mặt khác khi quét phổ UV – VIS bằng máy quang phổ UV – VIS, cả 3 chất PM18, PM15 và PM9 đều hấp thụ

cực đại tại bước sóng  = 265 nm (như hình 3.3) Do vậy, chúng tôi lựa chọn bước sóng 265 nm cho các nghiên cứu tiếp theo để tất cả các chất đều có thể cho pic có diện tích đủ lớn

PM9

Hình 3.2 Phổ DAD của các chất nghiên cứu

Hình 3.3 Phổ UV – VIS của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ seo gà

Bảng 3.2 Một số thông số trên phổ DAD của các chất nghiên cứu



(nm)

A (mAU)



(nm)

A (mAU)



(nm)

A (mAU)

 Cột: Zobax Eclipse XBD – C18 (250 mm  4,6 mm, 5 µm) kết hợp cột bảo

vệ Phenomenex C18 (cartridge 4  30 mm ID), nhiệt độ 250C

 Pha động: Sử dụng hệ pha động Acetonitril (kênh A) và nước có 0,1% acid formic (kênh B) với chế độ gradient dung môi Tỷ lệ A:B sử dụng ban đầu là (5:95), thay đổi tuyến tính đến (9:91) ở phút thứ 4, rồi thay đổi tuyến tính đạt (16:84) ở phút thứ 5, duy trì đến phút thứ 12, sau đó tiếp tục thay đổi tuyến tính tới (28:72) ở phút thứ 22, thay đổi tuyến tính trở về tỷ lệ ban đầu (5:95) ở phút 29, duy trì đến phút 30

 Detector SPD-10A với  = 265 nm

 Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

 Thể tích tiêm: 20 L

Với điều kiện sắc ký như trên, các chất trong hỗn hợp chuẩn và trong mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết toàn phần Cỏ seo gà đều được tách tương đối tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý Các SKĐ thu được như ở hình 3.4 và hình 3.5

Hình 3.5 SKĐ của dịch chiết toàn phần cây Cỏ seo gà

Tiến hành sắc ký với từng hợp chất nghiên cứu (hình 3.6 đến hình 3.10) và so sánh với SKĐ thu được của hỗn hợp 5 chất (hình 3.4) xác định được thời gian lưu của các chất PM3, PM12, PM18, PM15, PM9 lần lượt là khoảng 6,1; 10,0; 10,5; 10,9; 19,2 phút

3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ

ĐỒ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ

Thực hiện chương trình sắc ký đã chọn ở mục 3.2 với 5 hợp chất phân lập được từ cây Cỏ seo gà thu được các SKĐ như ở các hình 3.6 – 3.10

Các SKĐ ở các hình cho thấy cả 5 hợp chất đều không xuất hiện pic tạp chất (trong thời gian sắc ký là 30 phút) nên có thể sử dụng các hợp chất này làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu Tuy nhiên do lượng các hợp chất phân lập được còn

ít và chưa đủ thời gian cho phép để thiết lập chất chuẩn, do vậy chúng tôi tạm dùng

chúng như chất đối chiếu để khảo sát phương pháp định lượng các hợp chất phân lập được từ cây Cỏ seo gà

Hình 3.10 SKĐ của hợp chất PM9 phân lập được từ Cỏ seo gà

Tiến hành so sánh phổ DAD các pic có cùng thời gian lưu trên sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn và dịch chiết Cỏ seo gà Kết quả thu được ở hình 3.11 và hình 3.12