Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 168.27

Với sự gia tăng số lượng các ca tử vong do vi khuẩn kháng thuốc và mối đe dọa của các loại “siêu vi khuẩn” có khả năng kháng lại hầu như mọi loại kháng sinh là một trong những vấn đề gây

NGUYỄN THỊ KIM VUI

GÓP PHẦN

STREPTOMYCES 168.27

- 2013

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành tại bộ môn Vi sinh & Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội

, động viên và giúp đỡ từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện khóa luận này

NGUYỄN THỊ KIM VUI

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2

1.1.3 Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh 2

1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh 3

1.2. Đại cương về xạ khuẩn(Actinomycetes) 3

1.2.1 Đại cương về xạ khuẩn 3

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 4

1.3 Sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn 5

1.3.1 Sự hình thành các chất kháng sinh ở xạ khuẩn 5

1.3.2 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 5

1.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 6

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 7

1.4.1 Mục đích 7

1.4.2 Sàng lọc ngẫu nhiên 7

1.4.3 Đột biến cải tạo giống 8

1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn 9

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9

1.5.1 Khái niệm lên men 9

1.5.2 Các phương pháp lên men 10

1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 11

1.6.1 Chiết xuất 11

1.6.2 Tách, tinh chế sản phẩm: 11

1.7 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12

1.7.1 Phổ tử ngoại 12

1.7.2 Phổ hồng ngoại 13

1.7.3 Khối phổ (MS) 13

1.8 Các nghiên cứu liên quan: 13

1.8.1 Điều chỉnh sinh tổng hợp daunorubicin từ S.peucetius –phản hồi và dự tính kiểm soát phiên mã 13

1.8.2 Sự xuất hiện và sinh tổng hợp C-demethylactinomycin (C-DMA) từ S.chrysomallus và S.parvulus sinh actinomycin 14

1.8.3 Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của actinomycete phân lập từ chất lắng ở biển 15

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp thực nghiệm 18

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 18

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 18

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên 20

2.3.4 Đột biến 20

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 21

2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 22

2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 22

2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 23

2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 24

2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 24

2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 24

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 25

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 25

3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 26

3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 27

3.4 Kết quả đột biến hóa học 28

3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30

3.6 Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt của kháng sinh trong dịch lọc 31

3.7 Kết quả chọn dung môi và pH chiết 32

3.8 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 33

3.9 Kết quả sắc ký cột 34

3.9.1 Chạy cột sắc ký lần 1 34

3.9.2 Chạy cột sắc ký lần 2 36

3.9.3 Chạy cột sắc ký lần 3 39

3.10 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

ADN Acid 2’- deoxyribonucleic

B.subtilis Bacillus subtilis

CLNN Chọn lọc ngẫu nhiên

CKS Chất kháng sinh

DMHC Dung môi hữu cơ

D(mm) Đường kính vòng vô khuẩn

Danh mục các bảng

Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng

Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên chủng

Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1

Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2

Bảng3 7: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học

Bảng 3.8: Kết quả chọn môi trường lên men

Bảng 3.9: Kết quả chọn biến chủng lên men chìm tốt nhất

Bảng 3.10: Kết quả thử độ bền của dịch lọc ở các pH khác nhau Bảng 3.11: Kết quả thử độ bền nhiệt của kháng sinh

Bảng 3.12: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (P.mirabilis)

Bảng 3.13: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn

Hình 1.2: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh Hình 1.3: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn Hình 3.4: Pic sắc ký cột lần 1

Hình 3.5: Pic sắc ký cột lần 2 (nhóm 1)

Hình 3.6: Pic sắc ký cột lần 2 (nhóm 3)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cách đây hơn 70 năm, Penicillin – kháng sinh đầu tiên ra đời có khả năng tiêu diệt vi khuẩn mạnh mẽ đã mở ra một tương lai lạc quan cho nhiều bệnh nhân nhiễm khuẩn Nhưng đến nay cuộc chiến giữa kháng sinh và vi khuẩn vẫn tiếp diễn, nhiều loại vi khuẩn tưởng đã bị tiêu diệt từ lâu với kháng sinh chuyên trị nhưng giờ đây vẫn còn hiện diện và đề kháng với rất nhiều loại kháng sinh Điều hết sức đáng

sợ trong những năm vừa qua là song song với việc phát hiện thêm các chủng vi khuẩn siêu kháng thuốc thì tốc độ tìm ra các loại kháng sinh mới lại không hề theo kịp tốc độ phát triển của các loại vi khuẩn

Với sự gia tăng số lượng các ca tử vong do vi khuẩn kháng thuốc và mối đe dọa của các loại “siêu vi khuẩn” có khả năng kháng lại hầu như mọi loại kháng sinh

là một trong những vấn đề gây lo ngại và trở thành mối quan tâm nghiên cứu của những nhà khoa học Phương pháp chủ yếu để tìm ra kháng sinh hiện nay vẫn là phương pháp sinh học- các kháng sinh mới có thể được tổng hợp rất phong phú từ

vi khuẩn, xạ khuẩn hoặc nấm

Đặc biệt nước ta với môi trường tự nhiên rất đa dạng là điều kiện thuận lợi cho sự sinh sôi phát triển của hệ vi sinh trong đó đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó chi xạ khuẩn Streptomyces với khả năng tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm nhất Chính vì thế chúng tôi

lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 168.27” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau:

- Nghiên cứu cải tạo nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của

1.1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau Có 5 kiểu chủ yếu [3,

18] :

• Ức chế tổng hợp vách tế bào VK làm VK bị tiêu diệt Một số kháng sinh như: β- lactamase, vancomycin, bacitracin, fosfomycin tác dụng theo cơ chế này

• Tác động lên quá trình tổng hợp protein của VK:

– Gắn vào tiểu đơn vị 30S có tác dụng kìm khuẩn: Cloramphenicol, tetracyclin, macrolid và lincosamid

– Gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom làm tiêu diệt VK: Các aminoglycosid, spectinomycin

• Ức chế tổng hợp acid nucleic từ quá trình sao chép và phiên mã: Actinomycin, antracyclin, rifampicin

• Thay đổi tính thấm của màng: Polymycin, amphotericin

• Kháng chuyển hóa: Co– trimoxazol (gồm sulfamethoxazol và trimethoprim)

1.1.3 Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh

Những yêu cầu của y học đối với một kháng sinh là [6]:

• Kháng sinh phải không độc hoặc rất ít độc đối với cơ thể

• Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh và mạnh đối với VSV gây bệnh

• Dễ hòa tan trong nước và bền vững khi bảo quản lâu dài

• Hoạt tính kháng khuẩn không bị giảm khi tiếp xúc với dịch cơ thể

1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh

• Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh được sử dụng điều trị các bệnh nhiễm

khuẩn, nhiễm nấm và một số bệnh ung thư [3]

• Trong lĩnh vực khác:

– Trong chăn nuôi: Kháng sinh để chữa bệnh cho động vật: Griseoviridin

điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt [6, 10]

– Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để xử lý hạt, đất trồng, kích

thích hạt nảy mầm và tiêu diệt nấm, các VK gây bệnh cho cây trồng (Validamycin

dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả) [6]

–

: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra) [6]

1.2 Đại cương về xạ khuẩn(Actinomycetes)

1.2.1 Đại cương về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, phát triển dạng sợi phân nhánh

có tỷ lệ G+C>55% Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được rất nhiều các nhà khoa học đầu tư nghiên cứu [10, 11]

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces

Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh

có cấu trúc phức tạp [4] Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ

khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces [7]

• Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn

ty khí sinh, chuỗi bào tử [7, 9]

Đặc điểm hình thái xạ khuẩn được thể hiện ở hình 1.1

`Hình 1.1: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn

• Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao

Nguồn carbon thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều hợp chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là muối nitrat, muối amoni…[6, 8]

Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối thích của chúng

là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5

• Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4

loại:sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid [9, 10]

1.3 Sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn

1.3.1 Sự hình thành các chất kháng sinh ở xạ khuẩn

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS Tuy nhiên, hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định [12]

+ CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym

+ CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau + CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

+ Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS

có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor [12]

1.3.2 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh

Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được thể hiện trong hình 1.2 [6, 8]

1.2 1.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

Nhiệt độ: đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 -300

C, nhưng nhiệt

độ tối thích cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 25 – 280

C [10, 12]

Giống truyền ủ trong phòng thí

nghiệm Bình nhân giống trong phòng thí

nghiệm Bình nhân giống trên thiết bị nhân

giống Bình lên men tạo kháng sinh

Dịch lên men

Dịch lọc Sinh khối

Sinh khối thô

Dịch chiết sinh khối

Sản phẩm tinh chế

Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết đậm đặc

Sản phẩm tinh chế

Sản phẩm đã kiểm nghiệm

Sản phẩm được đóng gói

pH môi trường: pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến

hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axít đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [10,13]

Độ thông khí: Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các

VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy) [10, 12]

Tuổi giống: Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men,

mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Tuổi giống thích hợp nhất là 36-72h Lượng giống cấy truyền khoảng từ 2 - 10% [10, 12]

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.4.1 Mục đích

Các xạ khuẩn mới phân lập từ thiên nhiên thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp Do đó, để đáp ứng yêu cầu của nhà sản xuất công nghiệp cần cải tạo giống VSV với mục đích khác nhau [17]:

- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên

men, tạo ít bọt hơn…

- Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn

- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết mới, nhóm chức

mới

1.4.2 Sàng lọc ngẫu nhiên

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20-30 % so với những cá thể khác Tuy nhiên trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao để nghiên cứu ban đầu, chưa có giá trị áp dụng vào sản xuất Để thu được những chủng

có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo [6, 17]

1.4.3 Đột biến cải tạo giống

Các loại đột biến: Đột biến điểm, đột biến đa điểm, đột biến trượt khung[16] Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm [7, 16]:

Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin, dimethylsulphat…

Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia neutron hay electron Tác nhân vật

lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV) Ánh sáng tử ngoại gây đột biến theo cơ chế: tác dụng lên acid nucleic mạnh nhất ở bước sóng 260 nm, gây hiện tượng dime hóa Timin Ở đây hai Timin đứng gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C4-C5, hậu quả dẫn đến sao chép bị sai lệch do ADN polymerase dễ lắp 1 nucleotid không chính xác vào vị trí bên Do tác dụng của ánh sáng UV, trên sợi ADN đồng thời cũng xuất hiện một dime Pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-

4 Ở đây C6 của Pyrimidin 5’ (Timin hoặc Cystorin) được liên kết với C4 của Pyrimidin 3’ (thường là Cystorin) Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu gây đột biến của ánh sáng UV Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ

Ánh sáng thường: sau khi đột biến bằng UV, nếu đem chiếu ánh sáng thường thì có khoảng 50-80 % tế bào được phục hồi do tác dụng của enzym photolyase Hiện tượng này gọi là quang phục hoạt [16]

Tác nhân sinh học: Tác nhân transposon, phage M4,

Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các vi sinh vật Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương) Cần chọn lọc ra những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để nghiên cứu tiếp [7]

Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần [6, 7]

1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn

Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không

bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ [17]

Hiện nay có nhiều phương pháp để bảo quản các chủng VSV như: cấy chuyền, làm khô, đông khô, ổn định trong đất…

Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong

tủ lạnh và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [13, 17]

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.5.1 Khái niệm lên men

Lên men là quá trình phân giải hydratcarbon được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng [15]

Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bâc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha dừng [15]

Đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn nối tiếp: pha lag, pha log, pha dừng và pha suy tàn, được thể hiện ở hình 1.3 [6, 7]

Hình 1.3: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

1.5.2 Các phương pháp lên men

Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn

hay thể lỏng tùy loài VSV VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên bề mặt MT Vì vậy yêu cầu của lên men bề mặt là bề mặt môi trường phải rộng và lớp môi trường không quá sâu (2-10cm), trong quá trình lên men cần quạt để tăng độ thoáng khí đồng thời phải giữ độ ẩm môi trường khoảng 60% (có trường hợp 90-100%) để tránh khô bề mặt môi trường [6, 7, 8]

Ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống

Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3

chiều Chính vì thế mà sản phẩm thu được với hiệu suất cao trong môi trường dịch thể Với ư

Tuy nhiên n

lên men sẽ gây thất thu, tốn kém rất lớn [6, 7, 8]

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

+ Lên men mẻ (lên men chu kỳ)

+ Lên men có bổ sung

+ Lên men liên tục

+ Lên men bán liên tục

1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp

của các ion H+

hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác dụng gián tiếp [8, 15]

Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất

trong tế bào Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của VSV Đối với nhiều VSV, sự thông khí hợp lý sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiếm phát Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai

đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí tương đối mạnh là tốt [8, 15]

Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn [8]

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng cần tách riêng kháng sinh khỏi các

tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị Do vậy cần lựa chọn các kỹ thuật chiết tách, tinh chế thích hợp để thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao và hoạt lực kháng sinh mạnh [14]

1.6.1 Chiết xuất

Chiết xuất là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác (thường dùng dung môi đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất hỗn hợp cần nghiên cứu [6]

Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào nhau [6]

Khi chiết bằng dung môi hữu cơ thì dung môi phải thỏa mãn các yêu cầu sau [6]:

- Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, ít độc, khó cháy

- Có tính chọn lọc cao, hòa tan tốt hoạt chất, ít hòa tan tạp chất

- Dễ cất thu hồi

1.6.2 Tách, tinh chế sản phẩm:

Tách và tinh chế sản phẩm với mục đích thu lấy chất tinh khiết

Sắc ký: Là phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau trong

hệ hai pha không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động [14]

Phương pháp tách hay dùng trong nghiên cứu tổng hợp kháng sinh là sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp

phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ) Pha

tĩnh trong bản mỏng sắc ký rất đa dạng gồm: chất hấp phụ, chất trao đổi ion, chất

rây phân tử và các dung môi khác nhau trên chất mang [1, 14]

Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf [1]: Rf=

Trong đó:

o a là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm của vết

o b là khoảng cách dung môi chạy

o Rf có giá trị từ 0 đến 1

Kết quả đo Rf phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cách tiến hành, tính chất hoạt

độ của chất hấp phụ, tính chất của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường

chạy sắc ký, lượng chất chấm

Tinh chế là quá trình tạo ra sản phẩm kháng sinh tinh khiết, phục vụ cho các

nghiên cứu tiếp theo Phương pháp hay dùng để tinh chế kháng sinh là sắc ký cột

Trong phương pháp này, một cột chứa chất nhồi dùng làm pha tĩnh Chất nhồi cột

có thể là Silicagel, Nhôm oxyd, Sephadex Đó đều là các chất đã chuẩn hóa để

đảm bào kích thước chuẩn Dung môi trong phương pháp này là pha động Dựa vào

kết quả thăm dò tách các thành phần kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng để lựa chọn

hệ dung môi chạy sắc ký lỏng trên cột cho thích hợp [1]

1.7 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh

1.7.1 Phổ tử ngoại

Các ánh sáng UV có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi mức

năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích Giữa cấu

trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối quan hệ

chặt chẽ Các phân tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả

năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV [2, 20]

Nguyên tắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích

của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu

cơ ở chân không cao (10-6

mmHg) Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc

và định lượng các chất [20]

1.8 Các nghiên cứu liên quan:

1.8.1 Điều chỉnh sinh tổng hợp daunorubicin từ S.peucetius –phản hồi và dự

tính kiểm soát phiên mã

Streptomyces là nhóm vi khuẩn đất quan trọng, sản xuất ra các hợp chất có

tác dụng sinh học như kháng sinh Daunorubicin là tác nhân chữa một số bệnh ung

thư, là chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất từ S.peucetius Do tầm quan trọng

của daunorubicin trong điều trị ung thư, sự hiểu biết về cơ chế phân tử của việc sinh tổng hợp ra nó sẽ góp phần tìm hiểu di truyền học của dãy để có hiệu suất cao hơn Thêm nữa, sự hiểu biết này có thể được áp dụng để thiết kế các kháng sinh lai có

thế được thực hiện invivo nhờ chuyển các gene từ loài Streptomyces này sang loài

khác [22]

Sinh tổng hợp của daunorubicin ở S.peucetius được hoàn thành bởi chức năng của 30 gene mã hóa enzym theo một kiểu phối hợp chuỗi Ngoài những enzym trên, 3 chất điều chỉnh phiên mã DnrO, DnrN và Dnrl điều chỉnh quá trình nhiều

bước này bằng cách tạo ra một mạch điều chỉnh đường vòng đoán trước thông suốt,

có thể hoàn toàn kiểm soát các gene mã hóa enzym Vì daunorubicin là thuốc có khả năng xen giữa ADN, việc duy trì nồng độ thuốc tối ưu trong nội bào là việc then chốt để ngăn ngừa sự tự gây độc Khi bắt đầu của sinh tổng hợp daunorubicin cũng là lúc hoạt hóa cơ chế feedback được thực hiện bởi chất chuyển hóa Khi nồng

độ trong nội bào vượt quá mức, daunorubicin xen giữa vào chuỗi DNA và ngăn cản

sự gắn của các nhân tố phiên mã Sự kiềm chế feedback này được giảm bớt bởi một nhóm các gene tự kháng, điều này đồng thời làm nồng độ daunorubicin cao trong nội bào thoát ra Bài báo này thảo luận chức năng cơ chế của mỗi nhân tố phiên mã

và sự tác động lẫn nhau của chúng trong việc bắt đầu và duy trì sinh tổng hợp

daunorubicin ở S.peucetius [22]

1.8.2 Sự xuất hiện và sinh tổng hợp C-demethylactinomycin (C-DMA) từ S.chrysomallus và S.parvulus sinh actinomycin

Streptomyces chrysomallus và Streptomyces parvulus sản xuất C-DMA mới

bên cạnh actinomycin thông thường của nó khi được cung cấp 3-hydroxyanthranilic

acid (3-HA) [19]

Trong trường hợp C-DMA thiếu 1 nhóm methyl, sự ngưng tụ được đặc thù hướng phần 3-HA vào phía α của chất mang màu phenoxiazino Ngạc nhiên là, C-DMA (0,8%) cũng được tìm thấy trong hỗn hợp actinomycin của môi trường

streptomyces không được bổ sung sau thời gian cấy dài, điều đó chỉ ra sự hiện diện

tự nhiên của 3-HA Khi cung cấp 3-hydroxykynurenine (3-HK) cũng tạo ra DMA, chứng tỏ rằng 3-HK là nguồn của 3-HA [19]

C-Phân tích các chất chuyển hóa tryptophan trong nội bào của streptomyces, sử dụng 5-(3)H-tryptophan là chất phóng xạ đánh dấu, phát hiện ra sự hình thành 4-MHA, nhưng không có 3-HA Điều đó cho thấy rằng 3-HK nội bào phần lớn được chuyển hóa thành 3-hydroxy-4-methylkynurenine (4-MHK), tiền chất trực tiếp của 4-MHA Mặc dù vậy, lượng nhỏ 3-HK có được từ con đường tạo ra 4-MHA có thể

đã được chuyển hóa thành 3-HA trong suốt quá trình nuôi cấy của streptomyces, từ

đó tạo ra C-DMA tự nhiên [19]

1.8.3 Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của actinomycete phân lập từ chất lắng ở biển

Trong nghiên cứu này, ADN được phân lập và vùng ITS của 16s rARN được khuếch đại bởi phản ứng chuỗi polymerase, sử dụng 2 prime vi khuẩn quốc tế: 1492R (5'-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3') cùng với Eubac27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3') Sản phẩm khuếch đại được làm tinh khiết bởi bộ kít mini TIANgel, gắn với vector đơn MD18-T (TaKaRa), và vận chuyển tới các tế bào khả biến của E.coli DH5α Mảnh gene 16S rRNA được tạo chuỗi nhờ primer chuyển tiếp M13F (-47) và primer đảo ngược M13R (-48) Việc tìm kiếm các chuỗi tương đồng (thuật toán BLAST) được tìm thấy trái ngược với cơ sở dữ

liệu chuỗi nucleotid không dư thừa đang tồn tại, do đó, được đặt tên là Streptomyces

sp SU, Streptomyces rubralavandulae dòng SU1, Streptomyces cacaoi dòng SU2, Streptomyces cavourensis dòng SU3, Streptomyces avidinii dòng SU4, Streptomyces globisporus dòng SU5, Streptomyces variabilis dòng SU6, Streptomyces coelicolor dòng SU7 Trong 8 chất phân lập, actinomycete Streptomyces avidinii dòng SU4 được lựa chọn để nghiên cứu sâu hơn [21]

Kết quả: Dịch chiết thô của actinomycet phân lập ức chế dòng tế bào Hep-2

và VERO với giá trị IC50 lần lượt là 64,5 và 250 µg Giá trị đó rất gần với tiêu chí gây độc tế bào của các dịch chiết thô, được thiết lập bởi Viện Ung thư quốc gia Hoa

Kỳ (NCI) là IC50< 30 µg/ml Phân tích sắc ký khí – khối phổ (GC-MS) cho thấy chất có hoạt tính có thể là 1,2-benzenedicarboxylic acid, bis(2-methylpropyl) ester (12,17%), isooctyl phthalate (15,29%) với thời gian lưu tương ứng là 15,642 và 21,612 [21]

Kết luận: Nghiên cứu chứng minh rõ ràng rằng chất lắng từ biển có

actinomycet với chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học có thể cung cấp chất liệu sinh học chất lượng cao cho chương trình sinh hóa chống ung thư Những kết quả này giúp chúng ta kết luận rằng tiềm năng của việc sử dụng các chất chuyển hóa và

hệ gen sau tiến gần tới việc phân lập nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học và việc áp dụng vào thương mại là chuyện không còn xa nữa [21]

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

• Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 168.27 do Bộ môn Vi sinh – Sinh

học trường Đại học Dược Hà Nội phân lập đã qua sàng lọc và cải tạo giống trước đó

1 năm Lấy chủng ĐB1.13 tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo

• Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp

Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtilis ATCC 6633

Vi khuẩn Gram(-): Proteus mirabilis BV 108

Các MT nuôi cấy VSV kiểm định: thành phần MT được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm

định đều được tiệt trùng bằng nhiệt ẩm ở 121°C trong 30 phút

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 4 ở trên

- Bình chạy sắc ký, cột sắc ký (đường kính 1 cm, dài 50cm), Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,2mm

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V (ánh sáng UV (λ=254nm))

Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf, tủ ấm Memmert, Binder, tủ lạnh, tủ cấy vô trùng Aura VF 48, tủ sấy SL shellab, nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030, cân kỹ thuật Sartorius TE 210, cân phân tích Sartorius BP 121 S, máy cất quay Buchi Waterbath B480

Buret, bình chiết, hộp petri, thước kẹp Palmer, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,…

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện các mục tiêu, đề tài được tiến hành với các nội dung cụ thể như

sau:

– Tiến hành cải tạo giống theo các phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến nhân tạo sử dụng cả tác nhân vật lý và hóa học

– Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh, khảo sát độ bền pH, độ bền nhiệt

của hoạt chất Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế kháng sinh do Streptomyces 168.27

tổng hợp

– Xác định phổ UV, phổ IR, phổ khối và nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh thu được

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

Cấy zigzag xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp,

ủ cho phát triển ở 28-29°C Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

• Nguyên tắc: mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định,

kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV

kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

• Tiến hành:

– Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2.5 ml

MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106

– Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:

+ Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới 500

C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định

+ Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định

+ Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên MT đã cấy VSV kiểm định Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng

– Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với

vi khuẩn) Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định

• Đánh giá kết quả:

Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer có độ chính xác 0,02mm Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:

D (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i,

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n: Số thực nghiệm tiến hành song song (Thông thường n=3)

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên

Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 168.27, cho

vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1

(định ước) Sau đó, pha loãng tương tự đến nồng độ 10-6

Chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn các khuẩn lạc phát triển đa dạng, mọc riêng rẽ sau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

2.3.4 Đột biến

Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 168.27, tiến

hành tương tự như ở SLNN để được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1

(định ước) Sau đó dung 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6

làm mẫu chứng Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1

đựng trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 5 phút), sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

bằng nước vô trùng

Đột biến bằng tác nhân hóa học: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1

cho thêm 0,07g NaNO2 Điều chỉnh pH xuống 4- 4,5 bằng dd HCl 0,1N, để yên 2 – 3 phút Sau đó điều chỉnh lên pH 7 – 8 bằng dd NaOH 0,1N, tiếp tục pha loãng đến nồng độ 10-5

loãng làm 3 đĩa song song Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:

N m: Số khuẩn lạc sau đột biến

N o: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng

10-k: Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử sử dụng

Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên Làm song song mẫu chứng Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:

% biến đổi hoạt tính = i 100%

o

D D

Trong đó: D i: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB

o

D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng

Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến

chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh

• Nguyên tắc: sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy bề mặt tối

thích cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường lỏng tương ứng

• Tiến hành:

Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 168.27 sau khi nuôi cấy trên

thạch nghiêng (MT2) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa

100ml MT2dt bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h

Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MT khác nhau

để chọn MT lên men tốt nhất Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10 Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h

2.3.6 Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men

• Mục đích: xác định khả năng chịu nhiệt của kháng sinh và mức độ ảnh hưởng của

các pH khác nhau lên độ bền vững của kháng sinh Từ đó có những chú ý trong quá trình làm thực nghiệm, bảo quản, xử lý và tinh chế kháng sinh

• Tiến hành:

Thử độ bền nhiệt: Dịch lọc được phân vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 7ml Một ống được đun sôi trực tiếp 10 phút, một ống được đun sôi cách thủy 30 phút, một ống để ở nhiệt độ bình thường Sau khi ba ống trở về nhiệt độ bình thường, đem thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch

Thử độ bền pH: Dịch lọc được cho vào 5 ống nghiệm (làm 3 dãy song song), mỗi ống khoảng 7ml Điều chỉnh pH trong các ống lần lượt là 3, 5, 7, 9, 11, bảo quản trong tủ lạnh Sau 1 ngày và 5 ngày, chỉnh pH mỗi ống về pH trung tính, thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch Theo dõi sự thay đổi HTKS

2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ

• Mục đích: Xác định dung môi và pH chiết tối ưu cho dịch lọc