Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 155.16

Thực tế, có khoảng trên 80% số kháng sinh đang sử dụng được sinh tổng hợp từ xạ khuẩn, trong đó 55% do chi Streptomyces tạo ra; 50% trong số 20 000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính

1 Bộ môn Vi sinh – Sinh học

2 Viện sốt rét – kí sinh trùng trung

ương

HÀ NỘI - 2013

Quang Phúc đã trực tiếp hướng dẫn, ân cần chỉ bảo tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, viện sốt rét – kí sinh trùng trung ương, khoa Hóa – trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học đã tạo điều kiện, giúp đỡ trong thời gian tôi thực hiện khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng các thầy cô giáo trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Do điều kiện hạn hẹp về thời gian, về phương tiện nghiên cứu và trình độ bản thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được các ý kiến đóng góp từ thầy cô và bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20/05/2013 Sinh viên Vương Thị Thắm

1.1.Đại cương về kháng sinh.……….2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh ……….……….2

1.1.2 Đặc tính của kháng sinh … 2

1.1.3 Phân loại kháng sinh ……….2

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh……… 3

1.1.4 Ứng dụng của kháng sinh……… 3

1.2 Đại cương về xạ khuẩn……… …….4

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn ……… ……4

1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptpmyces ……… …….5

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn ……… 6

1.3.Tuyển chọn, cải tạo giống và bảo quản giống xạ khuẩn……… …7

1.3.1 Mục đích ………7

1.3.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng phép sàng lọc ngẫu nhiên …………7

1.3.3 Đột biến cải tạo giống ……… … 7

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn ……… … 8

1.4.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ……… …… 8

1.4.1 Đại cương …… ……… ……… 8

1.4.2 Các phương pháp lên men ……… …… 9

1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ……… 10

1.5.1 Lọc và chiết xuất……… 10

1.5.2 Tách và tinh chế ……… 10

1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ……….11

1.6.1 Phổ tử ngoại - khả kiến……… … ……….11

1.6.2 Phổ hồng ngoại ……… 11

1.6.3 Phổ khối… ……… 11

1.7.2 Phân lập, định tên và tối ưu hóa quá trình sản xuất kháng sinh từ xạ

khuẩn Streptomyces phân lập từ đất vùng Wady El Natron- Ai Cập ……12

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………… 14

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị ……… 14

2.1.1 Chủng xạ khuẩn… ……… 14

2.1.2 Chủng vi sinh vật kiểm định ……….14

2.1.3 Môi trường ……… 14

2.1.4 Dung môi ……… 15

2.1.5 Vật liệu chạy sắc ký: ………16

2.1.6 Máy móc thiết bị ……… 16

2.2 Nội dung nghiên cứu ……… 17

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ………17

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích ……… 17

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được ……17

2.3 Phương pháp nghiên cứu ……… 18

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn trong ống nghiệm… ………18

2.3.2 Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên ……… 18

2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán … 18

2.3.4 Đột biến bằng ánh sáng UV…… ……… … 19

2.3.4 Phương pháp đột biến hóa học ……….20

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ……… 21

2.3.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ……21

2.3.7 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng…… 22

2.3.8 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay ……… …23

2.3.9 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ……… 23

2.3.10 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được………23

3.1.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ……… 25

3.1.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ……… 26

3.1.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 ……… 27

3.1.5 Kết quả chọn môi trường lên men chìm ……… 28

3.1.6 Kết quả chọn chủng lên men ……….28

3.2 Chiết tách, tinh chế kháng sinh ………29

3.2.1 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi… ……… 29

3.2.2 Kết quả tinh chế kháng sinh bằng SK cột…… ………29

3.3 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết … ………34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ……… 36

KẾT LUẬN ………36

ĐỀ XUẤT ………37

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CFU Colony Forming Unit

NMR Nuclear magnetic resonance

rRNA ribosome Ribonucleic Acid

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.3: Các dung môi sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên

Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 1

Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 2

Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 3

Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men chìm

Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men

Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký

Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 1

Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 2(cho hỗn hợp 1) Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 2(cho hỗn hợp 2) Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm sau sắc kí cột lần 3

Bảng 3.12: Kết quả dự đoán từ phổ MS

Bảng 3.13 : Kết quả IR

Hình P1: Kết quả thử HTKS các biến chủng sau ĐBHH bằng phương pháp khối

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bước sang thế kỷ 21, con người vẫn tiếp tục phải đối mặt với nguy cơ tử vong cao đến từ các bệnh nhiễm khuẩn Việc kiểm soát các bệnh này vấp phải những tác động bất lợi do tình trạng kháng kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt ở các quốc gia đang phát triển Nhu cầu về việc tìm ra loại thuốc kháng sinh mới với phổ tác dụng rộng, độ an toàn cao, có thể làm giảm chi phí y tế, vẫn luôn là mối quan tâm của cả cộng đồng Tuy nhiên việc nghiên cứu này đang bị bỏ ngỏ, thậm chí bởi cả các hãng dược phẩm lớn do vấn đề về kinh phí Do đó đặt ra yêu cầu tìm ra loại kháng sinh mới tận dụng các nguồn lực sẵn có để chi phí sản suất là thấp nhất Thực tế, có khoảng trên 80% số kháng sinh đang sử dụng được sinh tổng hợp từ xạ

khuẩn, trong đó 55% do chi Streptomyces tạo ra; 50% trong số 20 000 chất chuyển

hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học được sản xuất từ xạ khuẩn có nguồn gốc từ đất

Trong đó được phân lập dễ nhất từ đất là chi xạ khuẩn Streptomyces

Từ những nghiên cứu ban đầu cho thấy, chủng xạ khuẩn Streptomyces 155.16

do bộ môn Vi sinh – Sinh học – trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp, cho kháng sinh có hoạt tính mạnh, ổn định, có nhiều tiềm năng trong thực tế, nên chúng tôi lựa

chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces

155.16” Khóa luận mong muốn đạt những mục tiêu sau đây:

1 Nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh thông qua chọn lọc cải tạo giống

2 Xác định được các điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh với hiệu suất cao, chi phí thấp

3 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh thu được

Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp, chỉ được sinh tổng hợp mạnh ở giai đoạn phát triển sau của sinh trưởng VSV.[13]

Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nhưng không được gọi là kháng sinh (rượu ethylic, các acid hữu cơ, …) vì chúng tác dụng lên vi sinh vật khác không mang tính chọn lọc và ở nồng độ cao.[9]

1.1.2 Đặc tính của kháng sinh:

Kháng sinh có thể do các VSV tiết ra môi trường xung quanh, như: penicillin, streptomycin, tetracyclin…hoặc được tích lũy trong tế bào VSV và được giải phóng khi tế bào bị phá vỡ, như : gramycidin…

Các kháng sinh có cấu trúc hóa học đa dạng, do đó các tính chất lý, hóa học cũng khác nhau: độ tan trong các dung môi, độ bền nhiệt, độ bền trong các môi trường có pH khác nhau

Tính chọn lọc của các kháng sinh khác nhau lên các VSV là khác nhau, có kháng sinh phổ rộng ( tác dụng trên cả VK Gram(+) và VK Gram (-) ), có kháng sinh phổ hẹp ( chỉ tác động trên VK Gram (+) hoặc Gram (-))

Kháng sinh được tích lũy cực đại khi các VSV được phát triển trong các điều kiện môi trường tối ưu Vì vậy để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cần tạo điều kiện phát triển thích hợp nhất cho VSV

1.1.3 Phân loại kháng sinh:

Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của

vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất, bao gồm:[8,9,14]

- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin)

- Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)

- Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)

- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)

- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)

- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)

- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)

- Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin)

- Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (actinomycin D)

- Các kháng sinh khác ( rifampicin)[8]

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh:

Cơ chế tác dụng của kháng sinh là một quá trình phức tạp, bắt đầu bằng sự tương tác của các phân tử kháng sinh với các vị trí đích trên các tế bào VSV mẫn cảm Từ đó làm thay đổi các chức năng tế bào quan trọng, ức chế sự phát triển của

tế bào VSV, thông qua việc:

- Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn

- Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn

- Ức chế tổng hợp acid nucleic

- Thay đổi tính thấm của màng tế bào

- Kháng chuyển hóa ( ức chế tổng hợp acid folic)

- Ức chế trao đổi chất hô hấp.[7,13,14]

1.1.4 Ứng dụng của kháng sinh:[9]

 Trong y học: kháng sinh được sử dụng để dự phòng và điều trị các bệnh nhiễm trùng, các bệnh nấm trên da, tóc, niêm mạc(nystatin, amphotericin ); dùng để điều trị ung thư (actinomycin D, doxorubicin…)

 Trong nông nghiệp: với các đặc tính: tác dụng nhanh, dễ phân hủy, tính đặc hiệu cao, kháng sinh đang được nhiều nước trên thế giới sử dụng để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra

Hiện có khoảng 30 chất kháng sinh đã được sử dụng trong nông nghiệp, như : Validamycin dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa;

griseofulvin chống bệnh rỉ sắt ở lúa mỳ do Botrytis gây ra…

 Trong chăn nuôi: kháng sinh được sử dụng để tăng trọng, tăng sản lượng trứng của đàn gia súc, gia cầm : Five- Terravit Egg: Oxytetracillin + các loại vitamin

 Trong công nghiệp thực phẩm: dùng kháng sinh để tiêu diệt VSV trong thực

phẩm, làm tăng thời gian bảo quản thực phẩm : subtilin (do Bacillus subtilis tạo

ra)…

1.2 Đại cương về xạ khuẩn:

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), là các vi khuẩn Gram (+), có tỷ lệ G+C >55% Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh.[4,5,13]

Xạ khuẩn phân bố rất rộng trong tự nhiên, trong đất, nước, rác, bùn, phân chuồng…, trong 1gam đất có khoảng 29 000 – 2 400 000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9 – 45% tổng số VSV.[7]

Xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi, hệ sợi được chia thành khuẩn ty cơ chất

và khuẩn ty khí sinh Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn [13]

 Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ

 Khuẩn ty xạ khuẩn thường không có vách ngăn với màu sắc hết sức phong phú: da cam, đen đỏ, nâu, trắng, vàng, xám …

Xạ khuẩn sinh sản nhờ các bào tử : chuỗi bào tử ( họ Streptomycetaceae ), bào tử di động ( họ Actinoplanaceae), bào tử hình cầu do phân cắt hệ sợi đã già ( họ Actinomycetaceae).[13]

Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như: Kháng sinh, enzym, vitamin…có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hoặc được tiết ra môi trường

Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo sơ đồ dưới đây

Hình 1.1 : Sơ đồ phân loại xạ khuẩn

1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces

Streptomyces là một chi thuộc bộ Actinomycetale Streptomyces có mặt trong

đất, nước và bào tử của chúng còn được tìm thấy trong không khí.[22,23]

Các xạ khuẩn thuộc chi này có khả năng sản xuất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học như chống nấm, chống virus, chống tăng huyết áp, ức chế miễn dịch và đặc biệt là kháng sinh [17] Có khoảng 55% kháng sinh được sản xuất

Actinoplanaceae Streptomycetaceae Actinomycetaceae …

Streptomyces Streptoverticulum Themostreptomyces …

+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ

+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí + Chuỗi bào tử (sợi bào tử) là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn

Hình 1.2 : Các loại khuẩn ti ở xạ khuẩn

- Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao

Năng lượng được tạo ra bằng cách phân giải các hydratcarbon, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit

Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối ưu của chúng là

25-30°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5

- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:

sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid.[5,6,22]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn

- Nhiệt độ : nhiệt độ tối thích cho sự sinh tổng hợp kháng sinh là từ 18 – 280C.[27]

- pH môi trường : thường là trung tính, môi trường quá acid hay kiềm đều ức chế tổng hợp kháng sinh.[13]

- Thông khí : xạ khuẩn là VSV hiếu khí, yêu cầu có độ thông khí cao.[9,10]

- Thành phần dinh dưỡng trong môi trường lên men:

+ Nguồn C : thích hợp nhất là tinh bột, ngoài ra có thể tùy chủng xạ khuẩn để thay thế bằng các đường như : glucose, fructose, maltose…[24]

+ Nguồn N : thường yêu cầu cả Nito hữu cơ và Nito vô cơ (các muối amoni) + Nguồn phosphate : có ý nghĩa quan trọng đối với quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn cũng như hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh Nếu thiếu phosphate, xạ khuẩn sinh trưởng kém, hiệu suất lên men thấp Nếu thừa phosphate sẽ kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp kháng sinh.[24,27]

+ Nguyên tố vi lượng : cần chú ý tới khả năng tạo phức của một số kháng sinh với các nguyên tố vi lượng trong môi trường nếu quá thừa.[9]

1.3.1 Mục đích

Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên, thường chỉ sản xuất ra một lượng nhỏ các chất kháng sinh với HTKS thấp Do đó, để thu được các chủng có HTKS cao, đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[9,24]

1.3.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng phép sàng lọc ngẫu nhiên

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20-30 % so với những cá thể khác Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [9]

Tuy nhiên, trong thực tế, để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo

1.3.3 Đột biến cải tạo giống

Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:[9,24]

- Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin, dimethylsulphat…

- Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia γ, chùm hạt α Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV) Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ

- Tác nhân sinh học: Transposon (Tn) hoặc Bacteriophage Mu.[13]

Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các vi sinh vật Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất hoặc giảm khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh (đột biến dương)

Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp gây đột biến[9]

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn

Mục đích: để giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ

Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: bảo quản trong tủ lạnh, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới; làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng); đông khô (phân tán

tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh); đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp)

Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong

bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc chính pha cân bằng.[9,13]

Quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh là quá trình lên men hiếu khí

1.4.2 Các phương pháp lên men

- Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn

hay thể lỏng VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên bề mặt MT [9]

Ưu điểm: thao tác đơn giản, không đòi hỏi thiết bị tân tiến

Nhược điểm : tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống

và giữ giống

- Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3

chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn [3,9]

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:[3,21]

+ Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi trong bình lên men với

1 thể tích MT xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm

+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng sao hiệu quả

sử dụng bình lên men

+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men, đồng thời

bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình

+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

Kết thúc quá trình lên men, KS có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men cùng với nhiều chất phụ, tạp chất Do đó cần thực hiện chiết tách, tinh chế

để thu được kháng sinh đạt tiêu chuẩn cần thiết theo tiêu chuẩn điều trị

- KS nội bào được thu từ sinh khối, thường bằng phương pháp chiết rút sử dụng dung môi hữu cơ.[7]

1.5.2 Tách và tinh chế:

- Mục đích : để tách riêng từng chất trong một hỗn hợp

Phương pháp sắc kí thường được sử dụng để tách và tinh chế kháng sinh Ngoài

ra, phương pháp kết tinh cho phép thu được kháng sinh có độ tinh khiết cao

- Các phương pháp sắc ký:

+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ) Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf Các chất sau khi tách ra sẽ tạo ra các vết khác nhau trên bản mỏng sắc kí Các vết này

có thể được phát hiện nhờ màu sắc của các chất hoặc được hiện hình bằng chất tạo màu thích hợp hay hiện hình nhờ VSV (như các chất kháng sinh)

+ Sắc ký lỏng phân bố : Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.[1]

1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh

1.6.1 Phổ tử ngoại - khả kiến

Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn nên có khả năng làm thay đổi mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích Giữa cấu trúc hóa học của phân tử chất cần nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ (Ví dụ: Những phân tử nào càng có nhiều liên kết đôi thì sự hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn, đặc biệt là các hệ liên hợp) Các phân tử có đặc điểm: nối đôi liên hợp, nhân thơm, dị tố N, S, O có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng UV-VIS.[1]

1.6.2 Phổ hồng ngoại

Các nhóm nguyên tử trong phân tử chất hấp thụ năng lượng từ các bức xạ hồng ngoại làm thay đổi trạng thái dao động của phân tử, đồng thời tạo nên một dải hấp phụ trên phổ IR Phổ IR được sử dụng để phát hiện các nhóm chức đặc biệt trong phân tử Mỗi bước sóng hấp phụ cực đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức.[1,2]

1.6.3 Phổ khối:

Phổ khối là tập hợp các tín hiệu tương ứng với các ion- được thể hiện dưới dạng các pic có cường độ khác nhau Các tín hiệu này thu được khi các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối của máy khối phổ Phổ khối cho phép xác định chính xác khối lượng các ion, phân tử; xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu; hoặc dùng trong phân tích định lượng.[1]

1.7.1 Phân loại, lên men, tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của kháng

sinh Sparsomycin- được sản xuất bởi Streptomyces sp.AZ-NIOFD1.[16]

Năm chủng xạ khuẩn được phân lập từ nước sông Nile - Ai Cập, được sàng lọc trên môi trường nitrate- tinh bột ở 300C trong 5 ngày, từ đó chọn ra chủng có khả

năng sản xuất chất kháng sinh có phổ rộng - Streptomyces sp AZ-NIOFD1 Xạ

khuẩn được phân loại theo ISP Tiến hành cô lập gen, khuếch đại, giải trình tự của

gen 16S - rRNA Sử dụng chương trình BLAST đánh giá sự tương tự về ADN Lên men trong bình 250ml chứa 75 ml môi trường lên men, lắc trên máy lắc ở 300C, tốc

độ 200 vòng/phút trong 5 ngày Dịch lọc thu được sau khi ly tâm dịch lên men, loại

bỏ sinh khối, được điều chỉnh về pH = 7, sử dụng dung môi n- butanol để chiết tách kháng sinh với tỷ lệ V dịch lọc : V dung môi = 1 : 1 Pha dung môi hữu cơ được gộp lại và cất quay đến khô ở T0

< 500C Kháng sinh thô được tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi chloroform : methanol (24:1) và sắc ký cột với hệ dung môi chloroform : methanol (8:2), lấy 50 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5 ml Nhận thấy

từ phân đoạn 20- 30 cho hoạt tính kháng sinh mạnh nhất Cấu trúc kháng sinh tinh chế được, được xác định nhờ phổ IR, UV, MS, NMR

Kết quả : xạ khuẩn đã phân lập có các đặc điểm tương tự tới 99% với

Streptomyces violaceusniger Kháng sinh thu được tan trong aceton, methanol,

chloroform, ethanol, DMSO; nhưng không tan trong benzen, n-hexan Kháng sinh

có Ton/c = 2050C, MW = 361,3, công thức phân tử : C13H21N3O6S2, có phổ tác dụng trên cả vi khuẩn Gr (+), Gr(-), một số vi nấm và sinh vật đơn bào khác

1.7.2 Phân lập, định tên và tối ƣu hóa quá trình sản xuất kháng sinh từ xạ

khuẩn Streptomyces phân lập từ đất vùng Wady El Natron- Ai Cập.[20]

Các chủng xạ khuẩn dùng trong nghiên cứu phân lập từ đất mặn và đất kiềm vùng Wady El Natron- Ai Cập, được phát triển trên môi trường tinh bột - nitrat có

bổ xung nystatin ở 280C trong 5 ngày 55 xạ khuẩn phân lập được, chia làm 4 nhóm theo màu sắc : xám 50%, trắng 20%, xanh 28%, đỏ 2% Sử dụng khóa phân loại theo ISP, xác định được tên của 4 loại xạ khuẩn sinh kháng sinh có hoạt tính cao,

bao gồm : Streptomyces coelicolor, Streptomyces flaveous, Streptomyces plicatus, Streptomyces griseo yamaguchi Thử hoạt tính của kháng sinh sinh tổng hợp bởi

các xạ khuẩn này trên vi khuẩn Gram(+), Gram(-), nấm Chọn môi trường thích hợp cho sự sinh tổng hợp kháng sinh : xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau như: thạch nền có tinh bột- nitrat, thạch nền có glycerol - asparagin, thạch nền có tinh bột - muối vô cơ, thạch nền có cao thịt cá, thạch nền có yến mạch, thạch nền có cao nấm men Sau đó thử hoạt tính kháng sinh được sinh tổng hợp

trên các môi trường này Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh bởi xạ khuẩn phân lập được.Các yếu tố được nghiên cứu là: nguồn C, nguồn nito, phosphat, các nguyên tố vi lượng : Zn, Fe, Mn ,các yếu tố như thời gian sinh trưởng, pH ban đầu, sự thông khí Kết quả được đo lường dựa trên sự phát triển của

xạ khuẩn- đo trọng lượng sinh khối, định lượng kháng sinh sinh ra

Kết quả : nguồn C tốt nhất là tinh bột, nguồn N tốt nhất là từ KNO3, Ca(NO3)2, (NH4)2SO4, nguồn P : sử dụng HPO42- là tốt nhất pH cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp kháng sinh, pH thích hợp xác định được theo nghiên cứu là 7,6 Thời gian

nuôi cấy: Streptomyces plicatus sinh kháng sinh tối đa sau 3 ngày nuôi cấy Nồng

độ oxi cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Chủng xạ khuẩn:

Chủng Streptomyces 155.16 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học

Dược Hà Nội cung cấp

2.1.2 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp:

- Chủng Gram (+): Bacillus pumilus ATCC 10241 (BP)

- Chủng Gram (-) : Shighella flexneri DT 112 (Shi)

Chú ý: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định

đều được tiệt trùng ở 118-120°C trong 30 phút

Bảng 2.1: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần NaCl (%) Cao thịt

(%)

Pepton (%)

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.3: Các dung môi sử dụng trong nghiên cứu

Dung môi Khối lượng

riêng (g/ml)

Nhiệt độ sôi (°C)

Acetonitril 0,782-0,783 80-82

Butylacetat 0,880-0,885 117-118 Cloroform 1,470-1,480 60-62

Ethanol 0,789-0,791 78,3 Ethylacetat 0,889-0,901 70,4

Methanol 0,791-0,793 64,5 Triethylamin 0,726-0,728 90

2.1.5 Vật liệu chạy sắc ký:

- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck

- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 2.3 ở trên

- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,1mm

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210

- Cân phân tích Sartorius BP 121 S

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt

- Máy cất quay Buchi Waterbath B480

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến bằng ánh sáng UV 2 lần kết hợp với đột biến hóa học để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích

- Chọn MT lên men chìm tốt nhất

- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

- Lọc, chiết kháng sinh từ dịch lọc, dịch lên men

- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu đƣợc

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

- Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn trong ống nghiệm

- Làm thạch nghiêng : pha MT1, chỉnh pH về 7,0 – 7,2, đun sôi, phân đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5-6 ml Đậy kín các ống MT bằng nút bông và tiến hành tiệt trùng ở 118 – 1200C, 1atm trong 30 phút Sau đó, đặt nghiêng các ống MT

đã tiệt trùng

- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng, ủ cho phát triển ở 28-29°C

- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

2.3.2 Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên:

- Tạo hỗn dịch bào tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử xạ khuẩn cho vào 10ml nước vô trùng, lắc để bào tử phân tán đều, được hỗn dịch bào tử có nồng độ 10-1

( quy ước) Pha loãng hỗn dịch bào tử trên đến các nồng độ 10-4, 10-5, 10-6

- Cấy bào tử: Cấy 0,1ml hỗn dịch ở 3 nồng độ 10-4, 10-5, 10-6 ở trên lên đĩa petri, tiến hành cấy song song 3 đĩa petri cho mỗi nồng độ, để ở tủ ấm ( 28-290

C) trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển

- Sàng lọc ngẫu nhiên : Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển đặc thù, đem cấy sang môi trường 1- đã được phân vào các đĩa petri; ủ ở 28- 290

C Sau 6 ngày đem thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

- Tiến hành:

+ Tạo hỗn dịch VSV kiểm định: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 16-24h

+ Cấy hỗn dịch VSV kiểm định vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng

và để nguội đến 45-50°C với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào các đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa