Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh streptomyces 15.29

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại các kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học Bảng 1.2 Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định Bảng 2.2 Các môi trư

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGUYỆT MINH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ

STREPTOMYCES 15.29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGUYỆT MINH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ

STREPTOMYCES 15.29

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu

Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2014

Lời cảm ơn

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS

Cao Văn Thu - người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu nghiên cứu

khoa học đến khi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên đang giảng

dạy và công tác tại Bộ môn Vi sinh-Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược và Viện

hóa học đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu cùng toàn

thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Và cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã

khuyến khích, động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập và làm

khóa luận

Do thời gian thực hiện khóa luận có hạn và kiến thức của bản thân còn hạn chế

nên khóa luận này còn nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến

của các thầy cô và các bạn để khóa luận được chỉnh sửa và hoàn thiện hơn nữa

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10, tháng 5, năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Nguyệt Minh

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa về kháng sinh 2

1.1.2 Phân loại kháng sinh 2

1.1.3 Ứng dụng của kháng sinh 3

1.1.4 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 3

1.2 Đại cương về xạ khuẩn 5

1.2.1 Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 5

1.2.2 Khả năng hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 7

1.2.3 Con đường hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 7

1.3 Phương pháp cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn 8

1.3.1 Mục đích 8

1.3.2 Các phương pháp cải tạo giống 8

1.3.3 Bảo quản giống xạ khuẩn 9

1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 10

1.4.1 Bản chất của quá trình lên men 10

1.4.2 Giống vi sinh vật 10

1.4.3 Các phương pháp lên men 10

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh 11

1.5.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 11

1.5.2 Chiết xuất 11

1.5.3 Tách sản phẩm 12

1.6 Một số phương pháp phổ để xác định cấu trúc kháng sinh 12

1.6.1 Phổ tử ngoại (UV) 12

1.6.2 Phổ hồng ngoại (IR) 13

1.6.3 Phổ khối (MS) 13

1.7 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 - Streptomyces Microflavus 14

1.8 Xây dựng và tối ưu hóa thống kê về môi trường nuôi cấy để nâng cao sự sản

xuất hợp chất kháng khuẩn bởi Streptomyces sp JAJ06 14

1.9 Phân lập và nhận diện phân tử của Streptomyces spp với hoạt tính kháng khuẩn từ vùng Tây Bắc của Iran 15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 17

2.1.1 Nguyên vật liệu 17

2.1.2 Máy móc, thiết bị 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống 20

2.2.2 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh 20

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được 20

2.3 Phương pháp thực nghiệm 20

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 21

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên 21

2.3.4 Đột biến 22

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23

2.3.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 24

2.3.7 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24

2.3.8 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 25

2.3.9 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 25

2.3.10 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 25

2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh khiết thu được 25

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 26

3.2 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 26

3.3 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 28

3.4 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29

3.4.1 Chọn môi trường lên men tốt nhất 29

3.4.2 Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất 30

3.5 Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 31

3.6 Kết quả sắc ký cột 32

3.6.1 Sắc ký cột lần 1 32

3.6.2 Sắc ký cột lần 2 34

3.6.3 Sắc ký cột lần 3 36

3.6.4 Hiệu suất quá trình tách và tinh chế kháng sinh 37

3.7 Kết quả sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 37

3.7.1 Chất tinh khiết 1 37

3.7.2 Chất tinh khiết 2 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid 2’- deoxyribonucleic

CW Cell wall (Thành tế bào)

L-DAP L-diaminopimelat acid

MS Mass spectrometry (Phổ khối)

MT Môi trường

MTdt Môi trường dịch thể

P mirabilis Proteus mirabilis

RAPD Random amplified polymorphic DNA (ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên)

S aureus Staphylococcus aureus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại các kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học

Bảng 1.2 Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp

Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định

Bảng 2.2 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.3 Các môi trường dùng trong nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.4 Các dung môi đã sử dụng

Bảng 3.1 Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên

Bảng 3.2 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1

Bảng 3.3 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2

Bảng 3.4 Kết quả chọn môi trường lên men

Bảng 3.5 Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt

Bảng 3.6 Kết quả chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ

Bảng 3.7 Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1

Bảng 3.8 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 1

Bảng 3.9 Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2

Bảng 3.10 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 2

Bảng 3.11 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 3

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Tên hình Nội dung

Hình 1.1 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Hình 3.1 Đồ thị kết quả thử HTKS các dạng chủng, biến chủng trong lên

men chìm

Phụ lục 1 Hình ảnh 3 bình nón chứa 3 môi trường lên men chìm lần 1

Phụ lục 2 Kết quả thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

Phụ lục 3 Hình ảnh sắc ký cột lần 1

Phụ lục 4 Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên

Phụ lục 5 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1

Phụ lục 6 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2

Phụ lục 7 Phổ UV của chất tinh khiết 1

Phụ lục 8 Phổ UV của chất tinh khiết 2

Phụ lục 9 Phổ IR chất tinh khiết 1

Phụ lục 10 Phổ IR chất tinh khiết 2

Phụ lục 11 Phổ khối chất tinh khiết 1

Phụ lục 12 Phổ khối chất tinh khiết 2

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, là cơ hội cho nhiều loại bệnh phát triển, đặc biệt là nhóm bệnh do vi khuẩn gây ra Nhưng khí hậu Việt Nam đồng thời cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của một hệ sinh thái vô cùng đa dạng và phong phú, trong đó có nhiều loài vi sinh vật hữu ích

Kháng sinh là hoạt chất có tác dụng sinh học rất mạnh, được tổng hợp từ vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm hoặc từ một số thực vật bậc cao Sự phát minh ra kháng sinh là một thành tựu rực rỡ, mở ra một kỷ nguyên mới của nền y học trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Những viên thuốc nhỏ bé đã góp phần chống lại bệnh tật do

vi khuẩn gây ra và bảo vệ sức khỏe cho con người

Nghiên cứu để sản xuất ra kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật luôn là đề tài hấp dẫn các nhà khoa học Trong số hơn 15000 kháng sinh đã được biết đến hiện nay trên thế giới thì khoảng 60% là do xạ khuẩn tạo ra, trong đó chủ yếu là do chi Streptomyces sản xuất Đây là một chi xạ khuẩn lớn, có nhiều tiềm năng sinh tổng hợp kháng sinh và đang được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới tập trung nghiên cứu

Tại Bộ môn Vi sinh-Sinh học trường đại học Dược Hà Nội, tôi chọn đề tài nghiên

cứu: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces

15.29” với các mục tiêu sau:

+ Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng tăng sinh tổng hợp kháng sinh

+ Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp của chủng Streptomyces 15.29, nghiên cứu chiết xuất, tinh chế kháng sinh do Streptomyces 15.29 tạo ra

+ Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được

Ngày nay, kháng sinh không chỉ được tạo ra bởi các vi sinh vật mà còn được tạo ra bằng quá trình bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học, do đó định nghĩa kháng sinh cũng thay đổi

Hiện nay, kháng sinh được định nghĩa như sau: Kháng sinh là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học Với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh [3]

1.1.2 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách để phân loại: dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh, dựa vào cấu trúc hóa học

Dựa vào cấu trúc hóa học chia kháng sinh thành các nhóm chính như bảng 1.1 [3]

Bảng 1.1: Phân loại các kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học

Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể

Beta lactam + Penicilin: Benzylpenicilin, Oxacilin

+ Cephalosporin: Cephalexin, Cefotaxim

+ Các betalactam khác: Carbapenem, Monobactam, Chất

ức chế betalactamase

Aminoglycosid Streptomycin, Gentamicin

Macrolid Erythromycin, Clarithromycin

Lincosamid Lincomycin, Clindamycin

Phenicol Cloramphenicol, Thiamphenicol

Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin

+ Polypeptid: Polymycin

Quinolon Acid nalidixic, Ciprofloxacin

Co-trimoxazol Co-trimoxazol

1.1.3 Ứng dụng của kháng sinh

+ Trong y học: Kháng sinh lần đầu được sử dụng trong y học là penicillin vào năm

1943 Sau đó 1 loạt các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra để điều

trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo, góp phần nâng tuổi thọ con người lên

+ Trong thú y: để điều trị các bệnh nhiễm trùng của động vật

Ví dụ: Griseoviridin chữa bệnh viêm phổi cấp, viêm vú của trâu, bò

Metimycin dùng điều trị các bệnh do Brucella gây ra

+ Trong nông nghiệp: để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng Kháng sinh còn được dùng kích thích hạt nảy mầm

Ví dụ: Griseofulvin dùng chống lại bệnh do Botrytis gây ra (bệnh rỉ sét ở lúa mì)

+ Trong chăn nuôi: kháng sinh được dùng bổ sung vào thức ăn nhằm kích thích tăng

trọng: Terravit, Biovit, Monenzin

+ Trong công nghiệp thực phẩm: để bảo quản thực phẩm đóng hộp [5]

1.1.4 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Hình 1.1 giới thiệu sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh [5]

Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Lọc, ly tâm

Cô, tinh chế

Kiểm nghiệm

Đóng gói

Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí nghiệm

nghiệmnghiệm nghiệm

Nhân giống quy mô thí nghiệm

Nhân giống trong thiết bị nhân giống

Lên men tổng hợp kháng sinh

Dịch lên men

Sinh khối

Dịch chiết sinh khối Dịch lọc

Dịch chiết

Sản phẩm tinh chế

Sản phẩm đã được kiểm nghiệm

Sản phẩm đóng gói

1.2 Đại cương về xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các Gr (+), có tỷ lệ G + C >55%

Đại đa số xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn

Xạ khuẩn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzym (amylase, cellulase, protease, glucoizomerase ) cũng như các hợp chất khác

1.2.1 Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

a) Đặc điểm của chi Streptomyces [6], [8]

+ Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2 µm

+ Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử Ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử Bào tử không có khả năng di động

+ Chuỗi bào tử có thể mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như: thẳng, uốn cong, móc câu-đơn hoặc kép và xoắn lò xo

+ Bào tử trần của họ xạ khuẩn này có các hình dạng: hình cầu, hình elipsoid-bầu dục, hình trụ

+ Bề mặt bào tử có thể là nhẵn, sần sùi da cóc, có gai hoặc có tóc

+ Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của họ xạ khuẩn này

+ Một số ít loài hình thành chuỗi bào tử ngắn trên khuẩn ty cơ chất

+ Hiếu khí, không nhuộm acid - cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính

+ Thường có khả năng khử nitrat thành nitrit, phân hủy adenin, esculin, casein, gelatin, hypoxanthin, tinh bột và L-tyrosin

+ Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon

+ Nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25-350 C, pH tối thích là 6,5-8,0 [6],[8]

b) Cấu tạo tế bào của chi Streptomyces [6]

Cấu tạo tế bào của Streptomyces chia làm 3 phần: thành tế bào, màng tế bào

chất, tế bào chất

+ Thành tế bào có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 cm

Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào được chia vào nhóm CWI: có chứa DAP (L- diaminopimelic acid) và glycin

L-+ Màng tế bào chất của xạ khuẩn dày khoảng 7,5-10 nm Chúng có cấu trúc và chức năng giống của vi khuẩn nói chung

+ Mesosome: nằm ở phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay hình ống

c) Phân loại chi Streptomyces [6]

+ Có khá nhiều khóa phân loại đã được các nhà khoa học nghiên cứu phát triển

Khóa phân loại Streptomyces thuộc Chương trình Streptomyces quốc tế (International Streptomyces Project) do Shirling và Gotlieb đề xuất (1970) đã được

sử dụng rộng rãi để để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae Trong khóa phân loại này, các đặc trưng phân loại được sử

dụng bao gồm:

Màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử, tiêu thụ đường arabinose, tiêu thụ đường xylose, tiêu thụ đường inositol, tiêu thụ đường mannitol, tiêu thụ đường fructose, tiêu thụ đường rhamnose, tiêu thụ đường saccarose, tiêu thụ đường raffinose

+ Ngày nay việc áp dụng kỹ thuật xác định trình tự gen 16S rADN để phân loại xạ khuẩn đã và đang được áp dụng, nhất là ở các phòng thí nghiệm tiên tiến

1.2.2 Khả năng hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn

Các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có

cấu trúc phức tạp Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp được thì có tới 60% là từ Streptomyces

Bảng 1.2 giới thiệu một số kháng sinh do Streptomyces tổng hợp [6], [10]

Bảng 1.2: Các kháng sinh do chi Streptomyces tổng hợp

1.2.3 Con đường hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh Một

số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại trong môi trường tự nhiên Số khác cho rằng, sự hình thành chất kháng sinh là do

sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh

là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng

Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định

+ Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym

+ Chất kháng sinh được hình thành từ hai hay ba chất chuyển hóa khác nhau

+ Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polymer hóa các chất chuyển hóa sơ cấp Sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor [9]

1.3 Phương pháp cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn

1.3.1 Mục đích

Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng VSV có khả năng tạo chất kháng sinh mong muốn với hàm lượng đủ để thỏa mãn yêu cầu của sản xuất công nghiệp VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thiên nhiên thường có hoạt tính rất thấp Vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau

và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp [5]

1.3.2 Các phương pháp cải tạo giống

a) Sàng lọc ngẫu nhiên

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong các ống giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20-30 % các cá thể khác

Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp

Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất [5]

b) Đột biến nhân tạo

Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến:

+ Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ, dimethylsulphat, hydroxylamin

+ Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia α hay tia β Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV) Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách đột biến, thời gian và cường độ bức xạ

+ Tác nhân sinh học gây đột biến gen như phage Mu, transposon

Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất, làm giảm khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh mẽ (đột biến dương) [12]

1.3.3 Bảo quản giống xạ khuẩn

Các giống vi sinh vật rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất Vì vậy việc bảo quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng, không chỉ ở trung tâm giữ giống quốc gia mà ngay ở các phòng thí nghiệm cũng rất cần thiết

Nhiệm vụ của công tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các thao tác kĩ thuật cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn định

và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác

Thông thường có 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:

+ Bảo quản trong lọ hoặc ống MT trong tủ lạnh 20C, định kỳ cấy chuyền sang ống (hoặc lọ) MT mới

+ Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng)

+ Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh)

+ Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp từ -780C đến -200C) [13]

1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.4.1 Bản chất của quá trình lên men

Lên men thực chất là phản ứng oxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác của các enzym do VSV tổng hợp với mục đích cung cấp năng lượng và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men [5], [13]

1.4.2 Giống vi sinh vật

Trong lên men công nghiệp, kỹ thuật là công cụ tác động và điều khiển lên quá trình sinh học còn giống là khâu quan trọng đầu tiên, quyết định giá trị kinh tế của quá trình sản xuất Giống vi sinh vật dùng trong quá trình lên men phải là các tế bào sinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất cao nhất Do đó trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống cấp I, II, III [5], [13]

1.4.3 Các phương pháp lên men

 Phương pháp lên men bề mặt

a) Đặc điểm: quá trình nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường rắn, đặc hay lỏng VSV hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô

hấp trên bề mặt môi trường

b) Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến

c) Nhược điểm: tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng không gian thấp, khó cơ giới hóa

tự động hóa

d) Ứng dụng: chỉ sử dụng trong chọn giống và giữ giống trong phòng thí nghiệm [7]

 Phương pháp lên men chìm

a) Đặc điểm: VSV phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường lỏng Phương pháp này dùng cho cả VSV hiếu khí và kị khí Đối với VSV kị khí trong quá trình lên men không cần sục khí, còn VSV hiếu khí thì phải vừa khuấy trộn vừa sục khí liên tục

b) Ưu điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa, tự động hóa

c) Nhược điểm: phải có thiết bị chuyên dụng, chi phí đầu tư lớn, đòi hỏi phải làm trong điều kiện vô trùng tuyệt đối

d) Phân loại: Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính

+ Lên men mẻ

+ Lên men có bổ sung

+ Lên men liên tục

+ Lên men bán liên tục [7]

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh

1.5.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

Đây là giai đoạn rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường kém bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp

Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị Công đoạn tinh chế sẽ góp phần quyết định tới giá thành của sản phẩm [5]

1.5.2 Chiết xuất

+ Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không đồng tan để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu [2], [4]

+ Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau [2], [4]

+ Nếu chiết bằng dung môi hữu cơ thì dung môi cần thỏa mãn các điều kiện sau [5]

 Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, không độc, khó cháy

 Có tính chọn lọc cao: hòa tan tốt hoạt chất, ít hòa tan tạp chất

 Dễ cất thu hồi

1.5.3 Tách sản phẩm

+ Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp đơn giản tách riêng từng chất [2], [4]

+ Trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh, phương pháp sắc ký được sử dụng để tách sản phẩm Các phương pháp sắc ký thường được dùng:

 Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản mỏng (bản kính, bản nhôm ) Pha động là một hệ dung môi đa thành phần được pha theo

tỷ lệ Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực [11]

 Sắc ký cột: Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha động [1]

1.6 Một số phương pháp phổ để xác định cấu trúc kháng sinh

1.6.1 Phổ tử ngoại (UV)

+ Nguyên tắc: Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng lượng điện tử của phân tử Các điện tử ở trạng thái cơ bản E0 chuyển sang trạng thái kích thích E1, E2 Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại [4]

+ Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết đơn, liên kết bội, hệ thống thơm… hay cặp electron tự do không tham gia liên kết của O,

N, S [2]

1.6.2 Phổ hồng ngoại (IR)

+ Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau

+ Nguyên tắc: Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và

thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR Có mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng phổ IR

+ Vùng bức xạ hồng ngoại sử dụng trong các máy quang phổ IR thông thường là 600-4000 cm-1 [2]

1.6.3 Phổ khối (MS)

+ Phổ khối là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối lượng của carbon 12C) hoặc bằng Dalton (1 dalton Da bằng khối lượng của nguyên

tử hydro)

+ Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector Tất cả quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không, áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng 1 số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất [2]

1.7 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 - Streptomyces Microflavus

Trong số các kháng sinh chúng tôi phân lập được từ cơ chất Việt Nam có

Streptomyces 15.29 là chủng xạ khuẩn có độ ổn định di truyền học tốt, có khả năng

sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng và có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực phòng bệnh và chữa bệnh

Kết quả phân loại theo ISP và giải trình tự gien 16rADN chúng tôi đã cơ bản

xác định được Streptomyces 15.29 có tên khoa học là Streptomyces microflavus Cải

tạo giống qua sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến ánh sáng UV kết hợp với sàng lọc sau đột biến đã làm tăng trưởng được hiệu suất tổng hợp kháng sinh của chủng Biến

chủng Streptomyces 15.29.21.23 là biến chủng tốt nhất hiện nay mà chúng tôi tạo

được Lên men chìm trên máy lắc và trong bình lên men 5 lít và 500 lít được thực hiện và kết quả là lên men trên máy lắc cho kết quả tốt nhất, còn lên men trên bình lên men 5 lít và 500 lít cho kết quả tương đương, tuy nhiên kém hơn lên men trên máy lắc nhiều Từ dịch lọc lên men kháng sinh chiết được tốt nhất bằng ethylacetat

ở pH 5,0 Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột cho thấy hỗn hợp kháng sinh có ít nhất 4 thành phần Trong đó thành phần chính được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, cột oxyt nhôm, YMC và cột Sephadex có hiệu suất 66% Bước đầu xác định giá trị MIC

của kháng sinh này khá thấp: từ 0,11- 0,30 µg/ml đối với S aureus, P mirabilis, S.flexneri, S.typhi [14]

1.8 Xây dựng và tối ưu hóa thống kê về môi trường nuôi cấy để nâng cao sự

sản xuất hợp chất kháng khuẩn bởi Streptomyces sp JAJ06

Streptomyces sp JAJ06 là chủng sản xuất kháng sinh phụ thuộc nước biển,

trước đây được phân lập và mô tả từ ruộng muối ven biển Ấn Độ Bài báo này báo cáo sự thay thế nước biển bằng một công thức muối được xác định trong môi trường sản xuất, sau đó tối ưu hóa phương tiện thống kê để đảm bảo phù hợp cũng như cải

thiện sự sản xuất kháng sinh bởi Streptomyces sp JAJ06 Chủng xạ khuẩn này được

quan sát kĩ để sản xuất hợp chất kháng sinh với công thức hóa học hợp nhất của

muối natri clorua thay vì nước biển trong môi trường sản xuất

Thí nghiệm thiết kế Plackett-Burman đã được áp dụng, và ba thành phần, tinh bột, KBr và CaCO3, được công nhận là có ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất kháng

sinh của Streptomyces JAJ06 ở mức độ riêng rẽ Sau đó, phương pháp bề mặt đáp

ứng với thiết kế Box-Behnken được sử dụng để tối ưu hóa các thành phần ảnh

hưởng này nhằm cải thiện việc sản xuất kháng sinh của Streptomyces sp JAJ06

Tổng cộng có 17 thí nghiệm đã được tiến hành với việc xây dựng một mô hình bậc hai và một phương trình đa thức bậc hai Mức độ tối ưu của các thành phần trung bình thu được từ việc phân tích các mô hình và phương pháp tối ưu hóa số học Khi chủng JAJ06 được nuôi trong môi trường tối ưu hóa, hoạt tính kháng sinh đã tăng lên đến 173.3 U/ml, tăng 26,8% so với ban đầu (136,7 U/ml) Nghiên cứu này tìm

ra một cách hữu hiệu để nuôi cấy Streptomyces sp JAJ06 nhằm tăng cường sản xuất

các hợp chất kháng sinh [18]

1.9 Phân lập và nhận diện phân tử của Streptomyces spp với hoạt tính kháng

khuẩn từ vùng Tây Bắc của Iran

Từ 140 chủng phân lập được thu thập từ khắp miền tây bắc của Iran, 12 chủng

phân lập Streptomyces biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn cao với tác nhân vi khuẩn

được phân loại qua PCR để xác định trình tự gen 16 rDNA và phân tích mẫu ADN

đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD)

Phân tích đặc điểm hình thái, hóa sinh và trình tự gen 16S rDNA chỉ ra rằng

tất cả 12 chủng phân lập thuộc về các chi Streptomyces Ngoài ra, sàng lọc các

chủng liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn của chúng chống lại các vi khuẩn chỉ thị cũng như phân loại của chúng sử dụng phân tích RAPD tiết lộ rằng G614C1 và

K36C5 có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể và cao tương ứng với Streptomyces coelicolor và Streptomyces albogriseolus

Vì nhiều chủng phân lập trong nghiên cứu này cho thấy tác dụng ức chế chống lại vi khuẩn gây bệnh, đất ở miền tây bắc Iran có thể được sử dụng như một nguồn

phong phú để khám phá các chủng Streptomyces với khả năng cao sản xuất ra

kháng sinh [17]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

+ Chủng xạ khuẩn: chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.29 được phân lập từ đất miền

Bắc Việt Nam do bộ môn Vi sinh-Sinh học trường đại học Dược Hà Nội cung cấp + Giống VSV kiểm định: các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh-Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Các chủng VSV kiểm định

Staphylococcus aureus ATCC 1228 Proteus mirabilis BV 108

+ Môi trường

Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định được giới thiệu ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần

MT

NaCl (g)

Cao thịt (g)

Pepton (g)

Thạch (g)

+ Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn được giới thiệu ở bảng 2.3

Bảng 2.3: Các môi trường dùng trong nuôi cấy xạ khuẩn

 Dung môi chạy sắc ký: các DM ở trên

 Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,040-0,063mm

2.1.2 Máy móc, thiết bị

+ Đèn UV (λ = 254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V,

+ Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030,

+ Cân kỹ thuật Sartorius TE 210,

+ Cân phân tích Sartorius BP 121S,

+ Tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc,

+ Tủ lạnh Deawoo, Sanyo,

+ Tủ cấy vô trùng Aura VF 48,

+ Tủ sấy SL shellab,

+ Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf,

+ Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt,

+ Máy đo UV-VIS HiTaChi U-1900,

+ Máy đo phổ MS-Xevo TQMS,

+ Máy đo phổ IR Impact 410-NicoLet-USA (Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam),

+ Kính hiện vi điển tử…

+ Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm,

+ Đĩa Petri, buret, pipet,

+ Patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, cốc có mỏ, que cấy, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác, que đục thạch, que chang, giấy lọc, giấy thử pH, bông…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống

+ Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn các dạng chủng có HTKS cao nhất,

+ Đột biến bằng ánh sáng UV để nâng cao hoạt tính của Streptomyces 15.29

2.2.2 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh

+ Từ 3 MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất, chọn một MT lên men chìm tốt nhất

+ Từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn chủng (biến chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

+ Tìm hệ DM khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

+ Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết DM hữu cơ

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được

Xác định nhiệt độ nóng chảy, đo phổ IR, phổ UV-VIS, phổ khối MS

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

Cấy zigzag xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28-29oC Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2oC, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

+ Nguyên tắc: kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, ức chế sự phát triển của VSV tạo thành vòng vô khuẩn

 Đưa mẫu thử vào MT kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:

 Đánh giá kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm Đánh giá kết quả dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:

= s =

Trong đó:

(mm): đường kính trung bình vòng vô khuẩn,

(mm): đường kính vòng vô khuẩn thứ i,

s: độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n: số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n = 3)

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên

+ Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 15.29 cho vào