Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 173.113

Do đó, việc nghiên cứu để phát hiện ra kháng sinh mới có nguồn gốc từ vi sinh vật vẫn là đề tài thu hút các nhà khoa học Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì c

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ TH Ị THU HIỀN

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ TH Ị THU HIỀN

STREPTOMYCES 173.113

Giáo viên hướng dẫn: Ths.VÕ THỊ THU THỦY

Nơi thực hiện: Bộ môn VI SINH – SINH HỌC Đại học Dược Hà Nội

HÀ N ỘI – 2013

Lời cảm ơn

Tôi xin gửu lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo Ths Võ Thị Thu Thủy –người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang

giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà nội đã

tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận tại bộ môn

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên,giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện nghiên cứu cũng như trình độ của bản thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh khỏi còn nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để khóa luận này có thể được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Lê Thị Thu Hiền

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN ……… 2

1.1 Đại cương về kháng sinh … ………2

1.1.1 Lược sử phát triển của kháng sinh ……….……… 2

1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh ………2

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh ……….4

1.1.4 Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất kháng sinh ……….…… 5

1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh ……….……6

1.2 Đại cương về xạ khuẩn ……….…… 6

1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn ……… 7

1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces………7

1.3 Tuy ển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ……….….9

1.3.1 Mục đích ……… 9

1.3.2 Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng SLNN ………….……9

1.3.3 Đột biến cải tạo giống ……….……….9

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn ……….……… 10

1.4 Lên men sinh t ổng hợp kháng sinh ……… 11

1.4.1 Khái niệm lên men ……….11

1.4.2 Các phương pháp lên men ……….11

1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men ……….12

1.5 Chi ết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ……… 13

1.6 Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh ………14

1.6.1 Phổ tử ngoại – khả kiến ………14

1.6.2 Phổ hồng ngoại……… ……….14

1.6.3 Khổi phổ (MS)………15

1.7 M ột số kết quả nghiên cứu về kháng sinh ……… 15

1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên Rapamycin từ Streptomyces hygroscopicus ……… 15

1.7.2 Tối ứu hóa chuyển đổi của Streptomyces sp ATCC 39.366 sản xuất Leptomycin bởi electroporation ……….16

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …… ……… 17

2.1 Nguyên v ật liệu và thiết bị ……….17

2.1.1 Nguyên vật liệu ………17

2.1.2 Máy móc và thiết bị ……….19

2.2 N ội dung nghiên cứu ……… ………….19

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ……… 19

2.2.2 Lên men, tách chiết kháng sinh ……… 20

2.2.3 Sơ bộ xác định tính chất kháng sinh thu được ………20

2.3 Phương pháp thực nghiệm ……….….20

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ……….20

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ……… 20

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên ………21

2.3.4 Phương pháp đột biến ……….22

2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ………23

2.3.6 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc kí lớp mỏng …………24

2.3.7 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không ……… 25

2.3.8 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……….25

2.3.9 Sợ bộ xác định kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……… 26

Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT……….27

3.1 K ết quả sàng lọc ngẫu nhiên ……….… 27

3.2 K ết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ……….……… 27

3.3 K ết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ……….……… 28

3.4 K ết quả đột biến cải tạo giống lần 3 ………29

3.5 K ết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh ……… …….……….30

3.6 K ết quả chọn chủng lên men ……….… 31

3.7 K ết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi ……… …32

3.8 K ết quả sắc kí cột ……….…………32

3.9 K ết quả đo phổ của kháng sinh tinh khiết ……….38

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 K ết luận ……….… 40

2 Ki ến nghị ……… ………40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

S.A Staphylococcus aureus

P mirabilis Proteus mirabilis

ADN Acid deoxyribonucleic

ARN Acid ribonucleic

DMHC Dung môi hữu cơ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học 3

Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 17

Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 18

Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng 18

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 27

Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 28

Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 28

Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3 29

Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men 30

Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men 31

Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 32

Bảng 3.8: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 33

Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn lần1 (hiện hình bằng P mirabilis) 34

Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2 35

Bảng 3.11: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 2 (hiện hình bằng P mirabilis) 36

Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3 37

Bảng 3.13: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 3 (hiện hình bằng P mirabilis) 38

Bảng 3.14: Biện giải các nhóm chức của phổ IR 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood,2007) 2

Hình 1.2: Vị trí tác dụng của một số chất kháng sinh 4

Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh 6

Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 8

Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn ……… 13

Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 1 trên P.mirabilis………… 34

Hình 3.2: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 2 trên P.mirabilis ………….35

Hình 3.3: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 3 trên P.mirabilis ………….36

Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc

Hình P3: Phát hiện viết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV

Hình P4: Sắc kí lớp mỏng

Hình P5: Sắc kí cột

Hình P6: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được

Hình P7: Phổ khối của kháng sinh tinh khiết thu được

Hình P8 : Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tác dụng của kháng sinh được phát hiện năm 1928 và Penicillin được sử dụng vào năm 1943, từ khi ra đời, kháng sinh đã mở ra một kỷ nguyên mới trong lịch sử ngành y – dược Nhờ có nhóm thuốc này mà con người đã dự phòng và điều trị được các bệnh nhiệm khuẩn, nhiễm nấm ,ung thư … Không dừng lại ở đó, ngày nay

phạm vi điều trị của kháng sinh còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và HIV/AIDS cũng cho nhiều kết quả khả quan Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan và không đúng cách làm cho tình trạng kháng kháng sinh xuất hiện và ngày càng trở nên nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm ra kháng sinh mới là điều cần thiết và được cả thế giới quan tâm

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ

của nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng kháng sinh đạt được nhiều thành tựu Do đó, việc nghiên cứu để phát hiện ra kháng sinh mới có nguồn gốc từ vi sinh vật vẫn là đề tài thu hút các nhà khoa học

Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces Đây là cơ sở để tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ

Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp Bởi vậy, trong khóa luận này tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây:

- Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất

- Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được

Chương 1 : TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh

Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander Fleming lần đầu tiên phát hiện ra vòng vô khuẩn kháng sinh và kháng sinh

Penicillin được dùng điều trị và thử nghiệm đầu tiên vào những năm 1940 Ngay sau đó, penillin trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh thế giới thứ II

Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều KS mới được xác định hầu hết từ các xạ khuẩn, và đó là thời kỳ “ vàng son” của hóa liệu pháp KS( Hình 1.1)

Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007)

Việc phát hiện, phát triển và sử dụng KS trong điều trị ở thế kỷ 20 đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn Tuy nhiên từ những từ 1980 số kháng sinh mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn Bên cạnh đó, một hiện trang đáng báo động là ngày càng tăng số lượng VSV gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có Hiện nay, việc kháng của VK phải được khắc phục bằng việc phát hiện ra thuốc mới

Bên cạnh con đường nghiên cứu tìm kiếm các kháng sinh mới có nguồn gốc

tự nhiên thì công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện Đồng thời, việc tổng hợp, bán tổng hợp kháng sinh từ những khung hóa học sẵn có cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của cloramphenicol và cephalosporin…

1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh

 Định nghĩa

Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật …) hay

tế bào ung thư ở nồng độ thấp [11]

 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách phân loại KS: Theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng…Tuy nhiên phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì người nghiên cứu có

thể nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó [11]

 Phân loại KS theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm cấu trúc được trình bày trong bảng 1

Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học [11, 18]

β-lactam Penicillin, Cephalexin…

Phenicol Cholaramphenicol

Aminosid Steptomycin, Tobramycin…

Macrolid Erythromycin, Clarithromycin…

Lincosamid Lincomycin, Lindamycin…

Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin Peptid Vancomycin, Polymycin…

Quinolon Floxacin, Levofroxacin…

Cotrimoxazol Cotrimoxazol…

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Cơ chế tác dụng lên VSV gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc bản chất của kháng sinh đó (Hình 1.2)

Hình 1.2 : Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh

Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào VSV, làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong tế bào VSV đó Mỗi nhóm kháng sinh tác

dụng lên các đích khác nhau [18]

 Có 6 kiểu chủ yếu: [18]

- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào

- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất

- Tác dụng lên sự tổng hợp AND

- Tác dụng lên sự tổng hợp protein

- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp

- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian

1.1.4 Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh

Giới thiệu tổng quát sơ đồ tổng hợp lên men sản xuất kháng sinh trong hình 1.3 [11]

Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh

Bình nhân giống quy mô phòng thí nghiệm Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh

Dịch lên men

Dịch lọc Sinh khối

Sinh khối thô

Dịch chiết sinh khối

1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh

Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau [11]:

 Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh dùng để chữa các bệnh do vi khuẩn, vi

nấm gây ra Ngày nay, một số kháng sinh còn dùng chữa bệnh trong ung thư

 Ngoài lĩnh vực y học: kháng sinh còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác

Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh dùng để chữa bệnh cho động

vật: Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn

được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức

ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt[11]

Trong trồng trọt: Kháng sinh đã được sử dụng để tiêu diệt các bệnh của cây

trồng do vi khuẩn, virus, nấm gây ra.Ví dụ: Vandamycin dùng để diệt nấm

Rhidoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả [11].…

Trong công nghiệp thực phẩm: KS cũng được sử dụng trong công nghiệp

thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp giúp giảm thời gian khử trùng bằng nhiệt, nhiệt độ khử trừng giảm xuống là cho chất lượng sản phẩm tốt hơn, các vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi Ví dụ: kháng sinh subtilin (do

Bacillus subtilis t ạo ra), nisin (từ Bacillus licheniformis) [11]

1.2 Đại cương về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomcetes) là những VK thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ

chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được

Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo

dạng sợi phân nhánh có G + C > 55% [4, 18]

Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như

KS, vitamin, acid hữu cơ, các enzym nên được các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều [7, 19]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ [7, 19]

Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3

μm Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, nâu, trắng … [7]

Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces

Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có

cấu trúc phức tạp Trong tổng số các kháng sinh được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có hơn 55% là do Streptomyces

Actinomycetes

VSV gi ống xạ khuẩn Actinomycetales

Actinoplanaceae Streptomycetaceae Actinomycetaceae …

Streptomyces

Bên cạnh những đặc điểm chung của xạ khuẩn, Streptomyces cũng có những

đặc điểm riêng:

 Đặc điểm hình thái:

Khuẩn lạc xạ khuẩn là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ Khuẩn

lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ

Hệ sợi khuẩn lạc có cả khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ

chất: Mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử [7] Chuỗi bảo tử (sợi bào tử ) có rất nhiều hình dạng khác nhau : thẳng, sóng, móc câu, xoắn…chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử

trần, là sơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn, nhẵn, xù xì da cóc, có gai hoặc có tóc [7, 12]

 Đặc điểm sinh lý:

Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời

thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit

Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối thích của chúng là 30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[7, 12]

25- Khả năng tạo sắc tố:

Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid [7, 12]

 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Có khá nhiều khóa phân loại Streptomyces: Khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại của Gauze,…Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình

Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gottlieb đề xuất năm 1970 đã được sử

dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces Khóa phân loại

này dựa trên các đặc điểm sau:

- Màu của khuẩn lạc

- Màu của khuẩn ty cơ chất

- Sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan

- Hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử

- Khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon

1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

1.3.1 Mục đích

Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên ( bùn, đất, nước,

mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

thấp Do đó, để thu được các chủng có HTKS và hiệu suất sinh tổng hợp cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn lọc giống bằng các phương pháp khác nhau

và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[11,15]

Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10-10

-10-5 trong ống giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau Trong đó có biến chủng có HTKS mạnh hơn 20-30 % những cá thể khác Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [11,15]

1.3.3 Đột biến cải tạo giống

Trong thực tế, việc sàng ngẫu nhiện các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên

cứu ban đầu, nó không có giả trị áp dụng vào sản xuất Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.[ 11 ]

 Phương pháp: Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm:

• Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin, dimethylsulphat…

• Tác nhân vật lý:

- Ánh sáng UV, tia X, tia hay electron

- Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV) Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV

có kích thước nhỏ thì nó có thể xuyên thấu tới màng nhân

- Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ

- Một đặc điểm trong tác động của tia UV là hiện tượng quang phục

hoạt (photoreactivation): Sau khi chiếu tia UV lên tế bào nếu để ngoài ánh sáng thường thì các tổn thương do tia UV gây ra phần lớn được phục hồi

• Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu

Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến , phần lớn các VSV ch ết Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS tăng (đột biến dương ), có biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm ) Cần chọn lọc ra

những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để nghiên cứu tiếp.[ 11 ]

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn

Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học Mục đích cụ

thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi

và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ [14, 16]

Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV:

- Cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới),

- Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng)

- Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh)

- Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và

bảo quản ở nhiệt độ thấp).[14, 16]

Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi

cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong

tủ lạnh 20C và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[14, 16]

1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.4.1 Khái niệm lên men

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của

vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng [4,7,11]

Nuôi cấy VSV để tĩnh hoặc lắc sinh học hay trong bình lên men trong môi trường dịch thể ( lên men chìm ) là các hệ thống đảm bảo sinh trưởng, phát triển của VSV phát triển theo 4 pha đặc thù là pha lag ( pha tiềm tang ), pha log ( pha lũy thừa ), pha cân bằng và pha suy tàn Kháng sinh là sản phẩm bặc 2, tạo ra lúc kết thúc quá trình sinh trưởng, vào pha cân bằng [11, 7]

Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

1.4.2 Các phương pháp lên men

 Lên men bề mặt : Trong phương pháp này, vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng

 Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi hỏi thiết bị phức tạp

 Nhược điểm: Khó cơ giới hóa , tự động hóa , khó vô trùng , tốn diện tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng môi trường thấp

 Lên men chìm: Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí ) được nuôi cấy trong môi trường lỏng

 Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ qui trình, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao

 Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn

 Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung, lên men bán liên tục, lên men liên tục

Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

- Lên men m ẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên

men với 1 thể tích MT xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo

ra sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm.[11]

- Lên men có b ổ sung: Trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi

trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do

đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men [11]

- Lên men liên t ục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã

phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và bổ sung thêm MT mới vào bình [11]

- Lên men bán liên t ục: Trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT

dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định [11]

1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

pH môi trường: Ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực

tiếp của các ion H+

hay OH-đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc

là tác dụng gián tiếp.[14,8]

Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất

trong tế bào Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của VSV Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh

trưởng cũng không giống nhau: Trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí vừa phải là tốt [14, 8]

Nhiệt độ: Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 – 300C, nhưng nhiệt

độ tối ưu cho tổng hợp KS chỉ nằm trong khoảng 22 – 280

C [14,8]

Tu ổi giống: Việc tổng hợp KS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men và

còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất sinh KS cao nhất thường là 36 – 72

giờ tuổi Lượng giống cấy truyền khoảng 2 – 10%.[14,8]

Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn [14, 8]

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

 Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Tùy theo đặc tính của

loài mà KS được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong TB Để thu lấy các

chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách thích hợp

 Một số phương pháp chiết tách thường dùng:

- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ

- Các phương pháp sắc ký (sắc ký trao đổi ion, sắc ký rửa giải trên

cột…)

- Phương pháp tạo phức kết tủa

- Phương pháp chưng cất

- Phương pháp thăng hoa

 Chiết xuất: Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn

hợp Đó là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một pha rắn (cân bằng lỏng- rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng- lỏng, thường một pha là nước)

 Phương pháp sắc ký:

- Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ từ một

hỗn hợp nhiều thành phần Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn Các

chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng

- Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng

lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính

chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

- Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp KS:

• Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản

mỏng Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được pha theo tỷ lệ Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn

hoặc tác động của trọng lực

• Sắc ký rửa giải trên cột: Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực Quá trình rửa giải được thực hiện

bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha động. [11]

1.6 Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh

N, các halogen

1.6.2 Phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó

đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau

Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi

trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR Có mối tương quan

giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ

để nhận biết một nhóm chức nào đó Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc trưng, đây là cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng IR

phổ có thể định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất

1.7 Một số kết quả nghiên cứu về kháng sinh

1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên Rapamycin

từ Streptomyces hygroscopicus

Rapamycin được biết là có các chức năng của là một loại kháng sinh và ức chế

miễn dịch, gần đây nó cũng đã được công nhận là có khả năng làm chậm quá trình lão hóa Những ảnh hưởng của oxy hòa tan (DO) mức sản xuất rapamycin dạng viên của Streptomyces hygroscopicus đã được nghiên cứu trong nghiên cứu này Kết quả cho thấy một mức độ DO cao là cần thiết để tăng cường sản xuất rapamycin Tuy nhiên, tiền đề để có được một sự tập trung rapamycin cao bằng cách sử dụng kiểm soát DO đã được giữ nguyên vẹn trong dạng viện của S

hygroscopicus Nếu mức DO cao đạt được từ sự gia tăng kích động, nó có thể phá

vỡ các hình thái của dạng viên trong các bể lên men và kết quả là giảm sản xuất rapamycin Các rapamycin tối đa đạt được trong nghiên cứu này là khoảng 780 mg /

L trong 5 L dịch lên men hàng loạt với kiểm soát DO hơn 30%, với việc bổ sung oxy tinh khiết trong khí đầu vào, và tốc độ kích động giới hạn đến dưới 200 rpm

DO mức độ cao và hình thái học của dạng bột viên cả hai đều gây bất lợi cho

việc đạt được một sản xuất rapamycin cao của S hygroscopicus trong lên men.[18]

Leptomycin bởi electroporation

Streptomyces sp ATCC 39.366 sản xuất các chất dẫn xuất leptomycin Leptomycin B, một chất ức chế mạnh và cụ thể đối với việc tạo ra các protein hạt nhân, là sản phẩm chính, tuy nhiên, sự ra đời của DNA vào dòng này là gần như không thể, đã cản trở tiếp tục sử dụng nó Chúng tôi phát triển một Streptomyces

sp ATCC 39.366 giao thức chuyển đổi với DNA bên ngoài thông qua electroporation Điều kiện khác nhau đã được kiểm tra, trong đó có phương pháp điều trị của các màng tế bào làm suy yếu các đại lý, các thông số electroporation, và nội dung DNA Chúng tôi thấy rằng chỉ plasmid DNA được phân lập từ một chủng đập ET12567 dẫn đến chuyển đổi thành công Sợi nấm phát triển trong một môi trường men-peptone-dextrose bổ sung 1% glycine ở 28 ° C trên một shaker quay (220 rpm) được phân tán hơn so với những thí nghiệm không có bổ sung và dễ bị electroporation Hiệu quả chuyển đổi tối đa là 8 × 102 CFU / mg DNA plasmid được thu thập ở một lĩnh vực thế mạnh của 13 kV / cm với một thời gian liên tục

của 13 ms (25 μF tụ điện, điện trở song song, 600 Ω) sử dụng electrocuvettes

1-mm Kết quả của những biến đổi của hai loài Streptomyces khác chỉ ra rằng các điều

kiện tối ưu dành cho thành lập trong nghiên cứu này có thể chỉ áp dụng cho

Streptomyces sp ATCC 39.366 Tuy nhiên, đây là báo cáo đầu tiên chuyển đổi thành công của Streptomyces sp ATCC 39.366, và sẽ tạo điều kiện cho việc xây

dựng một loại trực tiếp đột biến gen trong Streptomyces sp ATCC 39.366 để sản

xuất hàng loạt các dẫn xuất leptomycin mới [19]

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173.113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh

học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

 Ch ủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh họctrường ĐH

Dược Hà Nội cung cấp:

Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 1228

Vi khuẩn Gram (-): Proteus mirabilis BV 108

 Môi trường: Gồm các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn, VSV kiểm định

• Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Chú thích: Đơn vị tính theo gram

- Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở 120°C/20 phút

- Các môi trường lên men dịch th ể (MTdt): thành phần tương ứng như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch

• Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Thành phần

 Vật liệu chạy sắc ký

- Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck

- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 3 ở trên

- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,06-0,1mm

2.1.2 Máy móc thiết bị

- Tác nhân gây đột biến: Ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V

- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf

- Tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc

- Tủ lạnh Samsung

- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48

- Tủ sấy SL shellab

- Lò vi sóng Whirlpool

- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210

- Cân phân tích Sartorius BP 121 S

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt

- Máy cất quay Buchi Waterbath B480

- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm

- Hộp Petri đường kính 9cm

- Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong,

cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác…

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến bằng ánh sáng UV và tác nhân hóa học để nâng cao khả năng sinh

tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất

- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn

biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất

- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

Đo phổ nhiệt độ nóng chảy, IR, phổ UV, phổ MS

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích

hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C

- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh

bảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

 Nguyên t ắc:

Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

 Ti ến hành:

 Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2,5 ml

MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn

dịch VSV có nồng độ 106

-108 tế bào/ml

 Cấy hỗn dịch VSV vào môi trường thạch thường đã tiệt trùng và để nguội