Góp phân nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 166.28

Môi trường tự nhiên rất đa dạng của nước ta là một điều kiện thuận lới cho sự sinh sôi , phát triển của hệ vi sinh vật , trong đó đáng chú ỳ là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp khá

SOUTTHIDA VONGSAVATH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG

HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES

166.28

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

SOUTTHIDA VONGSAVATH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG

HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES

166.28

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Ngươ ̀ i hướng dẫn:

PGS – TS Cao Văn Thu

Nơi thư ̣c hiê ̣n:

Bô ̣ môn Vi sinh - Sinh học Trươ ̀ng Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 2

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.3 Phân loại kháng sinh 3

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3

1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh 4

1.2 Đại cương về xạ khuẩn 5

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 5

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 6

1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 8

1.4 Tuyển chọn , cải tạo và bảo quản giống của xạ khuẩn 9

1.4.1 Chọn lọc ngẫu nhiên 9

1.4.2 Đột biến cải tạo giống 9

1.4.3 Bảo quản giống 9

1.5 Lên men tổng hợp kháng sinh 10

1.5.1 Đại cương 10

1.5.2 Các phương pháp lên men 10

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 12

1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 12

1.6.2 Các phương pháp chiết tách 12

1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 13

1.7.1 phổ tử ngoại – khả kiến ( UV-VIS) 13

1.7.2 Quang phổ hồng ngoại (IR) 13

1.8.1 Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những13

chất hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp trên ong bắp cày ……….13

1.8.2 Tối ưu hóa môi trường lên men chủng Streptomyces Orientalis 4912 sinh

vancomycin …… ……… ……… …………14

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nuyên liệu và thiết bị 15

2.1.1 Chủng xạ khuẩn 15

2.1.2 Ví sinh vật kiểm định 15

2.1.3 Các môi trường 15

2.1.4 Dung môi 17

2.1.5 Một số dụng cụ , máy móc 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống 19

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh 19

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 19

2.3 Phương pháp thực nghiệm 19

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 19

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 20

2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên 21

2.3.4 Đột biến bằng ánh sáng UV 21

2.3.5 Phương pháp đột biến hoá học 23

2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23

2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 24

2.3.8 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24

2.3.9 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 25

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHÂN XÉT 27

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 27

3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 28

3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 29

3.4 Kết quả đột biến hóa học 30

3.5 Kết quả chọn môi trường lên men 31

3.6 Kết quả lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh 32

3.7 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 33

3.8 Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột 33

3.9 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS -TS Cao Văn Thu - Bộ môn Vi sinh – Sinh học người đã tâ ̣n tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ , kỹ thuật viên giảng dạy , công tác ta ̣i Bô ̣ môn Vi sinh - Sinh ho ̣c, Bộ môn Công Nghiệp Dược, Viê ̣n vê ̣ sinh di ̣ch tễ Trung ương, Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Nhân di ̣p này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiê ̣u cùng toàn thể các thầy

cô giáo trường Đa ̣i ho ̣c Dược Hà Nô ̣i đã da ̣y dỗ và ta ̣o mo ̣i điều kiê ̣n thuâ ̣n lợi cho tôi trong thời gian tôi ho ̣c tâ ̣p ta ̣i trường

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiê ̣n khóa luâ ̣n

Do hạn chế về thời gian, điều kiện trang thiết bị và phương tiện nghiên cứu, khóa luâ ̣n này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhâ ̣n được sự góp ý của các thầy cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Soutthida Vongsavath

ADN Acid 2’- deoxyribonucleic

ATCC American Type Culture Collection

(Chương trình Streptomyces quốc tế)

IR Infrared ( hồng ngoại )

KS Kháng sinh

MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể MTth Môi trường thích hợp

SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên SKLM Sắc ký lớp mỏng

VK Vi khuẩn

VSV Vi sinh vật

UV Ultra violet ( tử ngoại)

Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên

Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính KS đột biến lần 1

Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2

Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học

Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men chìm

Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men

Bảng 3.7: Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi Bảng 3.8: kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau sắc kí lần 1 Bảng 3.9: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2

Bảng 3.10: kết quả IR

Bảng 3.11: Kết quả dự đoán từ phổ MS

Hình 1.2: Khuẩn lạc xạ khuẩn

Hình 1.3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

Hình 1.4: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn

Hình 1.5: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Hình 1.6: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

Hình P.1: Hình thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

Hình P.3: Hình thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch

Hình P.3: Hình thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc

Hính P.4: Hình phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV Hính P.5: Kết quả đo phổ UV của kháng sinh tinh khiết thu được Hình P.6: Kết quả đo phổ IR của kháng sinh tinh khiết thu được

Hình P.7: Kết quả đo phổ khối của kháng sinh tinh khiết thu được

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước khí hậu nhiệt đới , tỷ lệ bệnh nhiễm trùng trong cơ cấu bệnh còn rất cao , vì thế kháng sinh là rất quan trọng do kháng sinh là một trong những công cụ đắc lực của các bác sỹ , dược sỹ trong phòng và chữa bệnh, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm , ngoài ra kháng sinh còn được dùng trong chăn nuôi , trông trọt và công nghiệp thực phẩm

Tuy nhiên trên thị trường dược phẩm nước ta hiện nay , hầu hết các kháng sinh đều được nhập khẩu ở dạng thành phẩm và bán thành phẩm , ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa thực sự hình thành Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong các nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới của tổ chức y tế thế giới ( WHO )

Do đó, đẩy mạnh nghiên cứu , sản xuất các kháng sinh có hiệu quả điều trị cao , độc tính thấp và ít bị kháng thuốc là một yêu cầu tất yếu trong phát triển y tê

Môi trường tự nhiên rất đa dạng của nước ta là một điều kiện thuận lới cho sự sinh sôi , phát triển của hệ vi sinh vật , trong đó đáng chú ỳ là các xạ khuẩn có khả

năng sinh tổng hợp kháng sinh , đặc biệt là chi xạ khuẩn Streptomyces vì trong tất cả

các kháng sinh được biết đến hiện nay thì có khoảng 60% nhuồn gốc từ xạ khuẩn và

55% trong số đó thuộc chi Streptomyces

Nắm bắt được xu hướng này , chúng tôi lựa chọn dề tài “ Góp phần nghiên cứu

lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166.28” đề làm khóa luận tốt nghiệp

với các mục tiêu như sau:

 Nghiên cứu cải tạo giống đề nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của

chủng Streptomyces 166.28

 Nghiên cứu điều kiện lên men , chiết tách, tinh chế kháng sinh tốt nhất

 Nghiên cứu 1 vài đặc tính của kháng sinh thu được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Lich sử nghiên cứu kháng sinh

Người đầu tiên đạt nền móng cho khoa học nghiên cứu chất kháng sinh là Alexander Fleming – nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra tác dụng kháng sinh vào tháng 10-1928 [17]

Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ, penicillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành “ một loại thuốc thần kỳ” Năm 1945, A.Fleming , E.Chain và H.W.Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penicillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh.[17]

Những năm 1940-1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu kháng sinh với hàng loạt chất kháng sinh mới liên tiếp được phát hiện như : gramixidin, tiroxidin do Rene’Jules Dubos phát hiện năm 1939, Streptomycin do Waksman phát hiện năm 1941, Erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952 … Cùng với việc phát hiện

ra các chất kháng sinh mới , công nghệ lên men sản xuất chất kháng sinh cũng ra đời

và dần được hoàn thiện [8]

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh

Kháng sinh là những hợp chất cón nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có tác dụng

ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh ( cũng như cả với các

tế bào ung thư ) ở nồng độ thấp mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người ,

động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung [9,15]

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Kháng sinh có thể phân loại theo nhiều cách, theo nguồn gốc, theo cấu trúc hoá học, theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng [15]

Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hoá học là chủ yếu, chia kháng sinh thành các nhóm chất sau đây:

- Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin)

- Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol)

- Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin)

- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin)

- Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin)

- Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin)

- Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B)

- Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin)

- Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (dactinomycin D)

- Các kháng sinh khác : rifampicin … [9,16]

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó Mỗi nhóm kháng

sinh tác dụng lên các đích khác nhau [15]Có 6 kiểu chủ yếu:

- Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào

- Tác dụng lên màng nguyên sinh chất

- Tác dụng lên sự tổng hợp ADN

- Tác dụng lên sự tổng hợp protein

- Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp

- Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.[16]

 Trong trồng trọt: Kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng; ví dụ: Blastincidin, Validamycin [15]

 Trong công nghiệp thực phẩm: Một số kháng sinh được dùng để bảo quản thực phẩm tươi, đóng hộp; ví dụ: Subtilin, Nisin [15]

1.2 Đại cương về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng

rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C>55% Trong mỗi gam

đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn Đại đa số các xạ khuẩn là các vi

sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh Do có thể sinh tổng hợp

được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa

học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.[15]

Trong số hơn 16,000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khảng 60% là

do xạ khuẩn tạo ra Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme

(amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.[15]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:

- Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ

sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn lạc xạ khuẩn

khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng

phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.[5] (Hình 2)

Hình 1.2 : khuẩn lạc xạ khuẩn

- Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm

Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc trồi Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám… [5]

- Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo hình 3.[15]

Hình 1.3 : sơ bộ phân loại xạ khuẩn

1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces

Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có

cấu trúc phức tạp Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng

hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces (Tham khảo phụ lục 1) [7]

- Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty

khí sinh:

+ Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.[6]

Actinomycetes

VSV giống xạ khuẩn Actinomycetales

Actinoplanaceae Streptomycetaceae Actinomycetaceae …

Streptomyces Streptoverticulum Themostreptomyces …

+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ.[6]

+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp) [20]

Hình 4 dưới đây thể hiện các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn

`Hình 1.4 : Các khuẩn ty ở xạ khuẩn

- Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Để

phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành

nitrit Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối thích của chúng là

25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[8,19]

- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại:

sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid

1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Dưới dây giới thiệu sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh [4,9]

Lọc, ly tâm

Chiết bằng dung môi hữu cơ

Dùng cột trao đổi ion…

Nhân giống trên thiết bi ̣ nhân giống Nhân giống trong phòng thí nghiê ̣m

Sinh khối

Lên men tổng hợp kháng sinh

Dịch lên men

Dịch chiết sinh khối

Sản phẩm đã được kiểm nghiê ̣m

Sản phẩm đóng gói Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống của xạ khuẩn

1.4.1 Chọn lọc ngẫu nhiên

Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết , có cả thể có HTKS tăng lên 20-30% so với những cá thể khác , phương pháp này giúp tuyển chọn các cá thể có HTKS cao để tiến hành các nghiên cứu tiếp [9]

1.4.2 Đột biến cải tạo giống

Trong thực tế việc chọn lọc ngẫu nhiên các cá thể có hoạt tính cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, chưa có giá trị áp dụng vào sản xuất Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh người ta áp dụng phương pháp đột biến nhân tạo.[9]

Có 3 nhóm tác nhân gây gây đột biến :

 Tác nhân hóa học : Hydroxylamin, ethylenimin, nitroso-guanidine, HNO2…

 Tác nhân vật lý : Ánh sáng UV, tia X, tia gamma hay electron… Khả năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào cường độ bức xạ, khoảng cách chiếu

và thời gian chiếu

 Tác nhân sinh học : Các yếu tố di truyền động transposan , phage Mu v v Sau khi chi ̣u tác đô ̣ng của các tác nhân đô ̣t biến , phần lớn các VSV chết Trong số các biến chủng số ng sót có biến chủng có hiê ̣u suất sinh tổng hợp KS tăng (đô ̣t biến dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đô ̣t biến âm) Cần cho ̣n lo ̣c ra những biến chủng có hiê ̣u suất sinh KS tăng để nghiên cứu tiếp [12]

1.4.3 Bảo quản giống

Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật có thể kể đến như : bảo quản lạnh, cấy chuyền, làm khô, đông khô, đông lạnh, ổn định trong đất …[13] Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm , cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [14]

1.5 Lên men tổng hợp kháng sinh

1.5.1 Đại cương

Lên men là quá trình phân giải hydrocacbon trong điều kiện thích hợp ( hiếu khí hay kị khí ) và kháng sinh là một trong những sản phẩm quan trọng của quá trình lên men sử dụng xạ khuẩn.[9] Cụ thể hơn , kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần váo lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn ,thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng [15]

Hình 6: giới thiệu đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn nối tiếp: pha tiềm tàng, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy tàn.[15]

Hình 1.6 : Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

1.5.2 Các phương pháp lên men

 Lên men bề mặt

Lên men bệ mặt là thực hiện nuôi cấy VSV trên bề mặt MT dịch thể hoặc rắn, bán rắn VSV hấp thụ các chất của MT và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt MT dinh dưỡng [4]

+ Ưu điểm : đơn giản , dễ thực hiện, chi phí đầu tư trang thiết bị ban đầu thấp + Nhược điểm : hiệu suất thấp, tốn diện tích , khó cơ giới hóa , tự động hóa

+ Nhược điểm: chi phí đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn [13]

 Có 4 kiểu lên men chìm như sau:

+ Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV được nuôi giới hạn trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm [4]

+ Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men [4]

+ Lên men liên tục: Thiết bị được cấu tạo đặc biệt sao cho khi VSV đã phát triển đến một giai đoạn thích hợp thì sẽ lấy đi một thể tích dịch lên men và đồng thời

bổ sung thêm đồng lượng MT mới vào bình [4]

+ Lên men bán liên tục: trong quá trình lên men, việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không được thực hiện liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định [4]

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh

Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu chuẩn cần thiết theo quy định dùng điều trị Công đoạn tinh chế sẽ góp phần quyết định tới giá thành của sản phẩm.[9]

1.6.2 Các phương pháp chiết tách

- Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp giấy lọc (hoặc

bông), bã được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch chui qua do chênh lệch áp suất trên và dưới lớp lọc [1]

- Ly tâm: là phương pháp tách các chất có khối lượng riêng khác nhau, thường

là tách pha rắn khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm [1]

- Chiết bằng dung môi hữu cơ: chuyển kháng sinh cần tách (đang hòa tan trong

dịch lọc) sang pha dung môi hữu cơ [11]

- Các phương pháp sắc ký:

+ Sắc ký lớp mỏng: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ) Chất hấp phụ ở đây được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf [2]

+ Sắc ký lỏng trên cột: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân

bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh [11]

1.7 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh

1.7.1 phổ tử ngoại – khả kiến ( UV-VIS)

Các phân tử chất nghiên cứu hấp phụ năng lượng các bức xạ vùng UV-VIS làm thay đổi mức năng lượng điện tử [1] giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp thụ có quan hệ chặt chẽ , chỉ những phân tử có điện tử dễ bị kích thích hấp phụ năng lượng ánh sáng để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái bị kích thích Phương pháp này thường được sử dụng phối hợp với các phương pháp khác như quang phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân trong việc xác định cấu trúc [18]

1.7.2 Quang phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hấp thụ hồng ngoại của một chất là đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường

độ hấp thụ bức xạ IR của chất đó vào số song hoặc bước sóng [18]

Trong phân tử một chất , khi có một nhóm nguyên tử hấp phụ năng lượng và thay đổi trạng thái dao động thì xuất hiện một dải hấp phụ trên phổ IR Các dải hấp phụ đặc trưng cho các nhóm chức là cơ sở để phân tích cấu trúc phân tử bằng phổ IR [18]

1.7.3 phổ khối ( MS)

Khối phổ ( mass spectrometry – MS ), khác với các kỹ thuật quang phổ , không dùng bước xạ điện tử Đây là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và diện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion được tạo thánh trong buồng ion hóa , được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận tích khối trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra trong thiết bị chân không Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thánh một khối phổ đồ hoặc phổ khối [1]

1.8 Một số nghiên cứu liên quan

1.8.1 Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những

chất hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp trên ong bắp cày [21]

Việc tìm kiếm những kháng sinh mới là rất cần thiết , góp phần giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh đang tiếp diễn

Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra một nguồn giàu tiềm năng cho việc phát hiện các kháng sinh mới là những loài xạ khuẩn sống cộng sinh trên các côn trùng

thuộc bộ Hymenoptera Để chứng minh điều này , các nhà khoa học ở bộ môn vi sinh vật học , trường Đại học Madison – Wisconsin, Mỹ đã nghiên cứu trên hai loài ong bắp cày Sceliphron caementarium và Chalybion californium Họ tiến hành phân lập

làm giàu phân lập từ 33 con ong bắp cày và thu được hơn 200 chủng xạ khuẩn thuộc

chi Streptomyces Nghiên cứu 15 loài trong số những xạ khuẩn phân lập được , phát

hiện 11 chất chuyển hóa bậc hai có cấu trúc khác nhau , trong đó có một chất chứa vàng lactam chưa bão hòa gọi là sceliphrolactam Đồng thời , họ cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của kháng sinh do 15 loài xạ khuẩn này sinh ra Các loài xạ khuẩn sống cộng sinh trên ong bắp cày giúp bảo vệ loài ong này khỏi các vi sinh vật gây bệnh , và chúng có thể là nguồn cung cấp những kháng sinh tự nhiên mới mà các nhà nghiên cứu dược phẩm quan tâm

1.8.2 Tối ưu hóa môi trường lên men chủng Streptomyces Orientalis 4912 sinh

vancomycin [20]

Hiện nay vancomycin được sản xuất bởi xạ khuẩn Streptomyces Orientalis theo

quy mô công nghiệp nhưng hiệu suất còn thấp Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích tối ưu điều kiện nuôi cấy để nâng cao sản lượng sinh khối và tăng cường tích lũy

kháng sinh của Streptomyces Orientalis Nghiên cứu này sử dụng chủng Streptomyces

Orientalis 4912 Xạ khuẩn được nuôi cấy trên một số môi trường khác nhau trong 120

giờ ở 28oC rồi định lượng sinh khối thu được để chọn ra môi trường nhân giống và môi trường lên men thích hợp

Kết quả MT48 được chọn làm môi trường nhân giống và MT11 được chọn làm môi trường lên men Trên cơ sở môi trường 11 , nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần chính là carbon và nitơ Kết quả thu được: nguồn carbon tốt nhất cho sự sinh tổng hợp kháng sinh là sử dụng đường saccaroza , nguồn nitơ tốt nhất là nitơ hữu cơ như pepton Khi nuôi cấy trên MT đã được tối ứu hóa , chất kháng sinh tăng 38,7%, sinh khối tăng 46,6% so với khi nuôi cấy trên MT gốc

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nuyên liệu và thiết bị

2.1.1 Chủng xạ khuẩn

Chủng Streptomyces 166.28 đã qua phân lập và tuyển chọn có khả năng sinh

tổng hợp kháng sinh cao , phổ tác dụng rộng , do bộ môn Vi sinh – Sinh học , trường Đại học Dược Há Nội cung cấp

 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định : được trình bày ở bảng 1

Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn : các môi trường được ký hiệu từ MT1 đến MT3 được trình bày ở bảng 2

Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

 Môi trường lên men : MT lên men trên máy lắc có thành phần tương ứng như

MT nuôi cấy xạ khuẩn , chỉ khác là bỏ thạch và được ký hiệu tương ứng là MT1dt đến MT3dt

- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210

- Cân phân tích Sartorius BP 121 S

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt

- Máy cất quay Buchi Waterbath B480

- Kính hiển vi điện tử

- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm

- Hộp Petri đường kính 9cm

- Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc

có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,…

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội

dung nghiên cứu cụ thể như sau:

2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống

- Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 166.28

- Chọn 2 chủng vi khuẩn (1 vi khuẩn Gr(+), 1 vi khuẩn Gr(-)) để làm VSV kiểm định cho các nghiên cứu về sau

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc

- Đột biến hóa học

2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất

- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất

- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

- Đo phổ IR, phổ UV, phổ khối

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp,

ủ cho phát triển ở 28-29°C

- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2o

C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền