Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 155 21

Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men ... Phụ lục 2: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch và phương pháp giế

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

STREPTOMYCES 155.21

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Cao Văn Thu

Nơi thực hiện : Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học

Trường Đại Học Dược Hà Nội

Hà N ội, 05/2013

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo PGS -TS Cao Văn Thu - người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại học Dược Hà Nội , Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thâ n còn có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy

cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 16, tháng 5, năm 2013

Sinh viên

NGUYỄN HUY TRÌNH

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.2 Phân loại kháng sinh 2

1.1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 3

1.1.4 Ứng dụng của kháng sinh 4

1.2 Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 5

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 5

1.2.3 Phân loại xạ khuẩn 6

1.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 6

1.4 Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn 7

1.4.1 Chọn chủng có hoạt tính cao nhờ sàng lọc ngẫu nhiên 7

1.4.2 Đột biến cải tạo giống 7

1.4.3 Bảo quản giống xạ khuẩn 8

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8

1.6 Chiết tách và tinh chế sản phẩm 9

1.7 Một số phương pháp phổ để xác định cấu trúc kháng sinh 10

1.7.1 Ph ổ hồng ngoại (IR) 10

1.7.2 Ph ổ tử ngoại (UV) 10

1.7.3 Kh ối phổ (MS) 11

1.8 Một số nghiên cứu liên quan 11

1.8.1 Tối ưu hóa thống kê của quá trình lên men để tăng cường hoạt tính kháng sinh của

Streptomyces sp.CS392 11

1.8.2 M ột chủng Streptomyces sp với nhiều đặc điểm mới hứa hẹn thúc đẩy sự phát triển cúa nông nghiệp dịch bệnh 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.1.1 Nguyên vật liệu 13

2.1.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp thực nghiệm 16

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống 16

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 16

2.3.3 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 17

2.3.4 Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên 17

2.3.5 Phương pháp đột biến 18

2.3.6 Phương pháp lên men mẻ 19

2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men 20

2.3.8 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ 20

2.3.9 Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 20

2.3.10 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 22

2.3.11 Phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23

3.1 Kết quả quá trình chọn lọc ngẫu nhiên 23

3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 24

3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 25

3.4.Kết quả cải tạo giống lần 3 bằng tác nhân hóa học 27

3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 28

3.6 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 30

3.7 Kết quả chọn dung môi chiết xuất kháng sinh 31

3.8 Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 32

3.9 Kết quả sắc ký cột 33

3.10 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và sơ bộ xác định các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid 2’- deoxyribonucleic

CLNN Chọn lọc ngẫu nhiên

CW Thành tế bào - Cell wall

MTdt Môi trường dịch thể

MTth Môi trường thích hợp

TĐC Trao đổi chất

VSV Vi sinh vật

UV Tử ngoại – Ultraviolet

B subtilis Bacillus subtilis

P mirabilis Proteus mirabilis

G(+) Gram dương

G(-) Gram âm

SK Sắc ký

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học

Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 3: Các môi trường kiểm định

Bảng 4: Các dung môi đã sử dụng

Bảng 5: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Streptomyces 155.21

Bảng 6: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến UV lần 1

Bảng 7: Kết quả hoạt tính KS sau đột biến UV lần 2

Bảng 8:Kết quả hoạt tính KS sau đột biến hóa học

Bảng 9: Kết quả chọn môi trường lên men

Bảng 10: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt

Bảng 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc

Bảng 12: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày

Bảng 13: Kết quả chiết kháng sinh bằng 4 DMHC ở 5 pH khác nhau

Bảng 14: Kết quả SK lớp mỏng chọn hệ dung môi (hiện hình VSV bằng P

mirabilis)

Bảng 15: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1

Bảng 16: Kết quả SK lớp mỏng các phân đoạn 1-15 (hiện hình bằng P mirabilis)

Bảng 17: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2

Bảng 18: Kết quả SK lớp mỏng các phân đoạn 1-15 (hiện hình bằng P mirabilis)

Bảng 19: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3

Bảng 20: Kết quả SK lớp mỏng các phân đoạn 1-10 (hiện hình bằng P mirabilis)

Bảng 21: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau chạy cột lần 4

Bảng 22: Kết quả SK lớp mỏng các phân đoạn từ 1-4 ( hiện hình bằng P.mirabilis)

Hình 1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Biến chủng Streptomyces 155.21 được cấy zizag trên ống thạch nghiêng

vào đĩa Petri cho vào tủ ấm và đĩa Petri chứa biến chủng Streptomyces 155.21 sau 6

ngày nuôi cấy trong tủ ấm

Phụ lục 2: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch và phương pháp giếng thạch

Phụ lục 3: Bình lên men được đặt trong máy lắc khi bắt đầu quá trình nhân giống

cấp 1, bình nhân giống cấp 1 và bình chứa sản phẩm lên men khi kết thúc quá trình lên men

Phụ lục 4: Cột sắc ký trong quá trình chạy cột lần 1 và kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau quá trình chạy cột

Phụ lục 5: Phổ MS chất kháng sinh KS1 phân lập được

Phụ lục 6: Phổ UV chất kháng sinh KS1 phân lập được

Phụ lục 7: Phổ IR chất kháng sinh KS1 phân lập được

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tác dụng của kháng sinh được phát hiện vào tháng 10/1928 và Penicillin được sử dụng vào năm 1943, đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học lâm sàng và ngành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh

Ngoài được sử dụng trong dự phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm, bệnh ung thư cho người, kháng sinh còn được dùng trong chăn nuôi, trồng trọt và trong công nghiệp thực phẩm Do được sử dụng tràn lan và không đúng cách nên tình trạng kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trọng

Kháng sinh là lớp hoạt chất hữu ích có tác dụng sinh học rất mạnh, được

tổng hợp từ vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm hoặc từ một số thực vật bậc cao Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng kháng sinh đạt được những thành tựu rực rỡ Con người không chỉ tìm kiếm những chủng vi sinh vật sinh kháng sinh từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền, công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng

hợp Trong số hơn 15000 kháng sinh hiện nay đã được biết đến trên thế giới thì khoảng 60% là do xạ khuẩn tạo ra, trong đó khoảng 55% do chi Streptomyces sản

xuất Đây là chi xạ khuẩn lớn, gồm nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, một số loài có khả năng sinh tổng hợp các chất chữa ung thư, điều trị HIV Do đó, chi xạ khuẩn này đang được trong nước và thế giới tập trung nghiên

cứu

Tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường ĐH Dược Hà Nội, chúng tôi đã chọn

đề tài “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces

155.21” với các mục tiêu như sau:

- Nghiên cứu cải tạo giống theo hướng tăng sinh tổng hợp kháng sinh và lựa

chọn môi trường lên men thích hợp của chủng Streptomyces 155.21

- Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh

Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh

Theo định nghĩa kinh điển hẹp: Kháng sinh là những hợp chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus…) hay cả t ế bào ung thư, ở nồng độ thấp [6]

Định nghĩa rộng hơn: Kháng sinh phải bao hàm c ả các chất tổng hợp bằng hóa học có tác dụng diệt khuẩn như các dẫn chất quinolon (pefloxacin, norfloxacin…).[7]

1.1.2 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách để phân loại các kháng sinh : theo nguồn gốc theo phổ tác dụng (phổ rộng hay chọn lọc), theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học…

Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học (bảng 1)

Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học [3]

1.1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Hình 1 : Giới thiệu sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh [6]

Hình 1: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh

Sản phẩm tinh chế

Dịch chiết Dịch lọc

Nhân giống trong thiết bị nhân giống Nhân giống quy mô thí nghiệm Giống xạ khuẩn lưu giữ trong phòng thí nghiệm

Sinh khối

Lên men tổng hợp kháng sinh

Dịch lên men

Dịch chiết sinh khối

Sản phẩm đã được kiểm nghiệm

Sản phẩm đóng gói

1.1.4 Ứng dụng của kháng sinh

 Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn, nấm gây ra Ngày nay , một số kháng sinh còn được dùng trong điều trị bệnh ung thư ( mitoxantrone, actinomycin D……) [15]

 Ngoài lĩnh vực y học: Kháng sinh còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác

 Trong chăn nuôi: Kháng sinh được dùng để điều trị các bệnh cho động vật (Griseoviridin trị bệnh viêm phổi cấp , viêm vú trâu , bò Metimyxin hoặc

chloramphenicol dùng điều trị các bệnh do Brucella gây ra…) Kháng sinh được sử

dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, kích thích tăng sản lượng trứng ở gà, vịt

 Trong trồng trọt : Để xử lý hạt , đất trồng Ngâm hạt giống trong dung dịch kháng sinh trước khi gieo để kích thích hạt nả y mầm và tiêu diệt nấm và các VK gây bệnh cho cây trồng (validamycin, blastixidin, kasugamycin,…)

 Kháng sinh dùng trong công nghiệp thực phẩm : Thực phẩm đóng hộp dùng chất kháng sinh để bảo quản giúp giảm thời gian khử trùng bằng nhiệt, nhiệt độ khử trùng giảm xuống làm cho chất lượng sản phẩm tốt hơn , các vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi (subtilin, nisin).[6]

1.2 Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm VK thật (Eubacteria) phân bố rất

rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí

cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Theo Waksman trong 1 g đất có khoảng 29000 - 2400000 xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV

Xạ khuẩn là các vi khu ẩn Gr(+), có tỷ lệ G +C >55% trong ADN, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh

Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như kháng sinh, vitamin, acid hữu cơ , các enzym…nên được các nhà khoa h ọc nghiên cứu rất nhiều [7]

1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn

Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn

ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản còn k huẩn ty khí sinh phát triển mạnh hay yếu , thậm chí hầu như không phát triển tùy từng chi, từng loài

Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi từ 0,3-1,0 µm đến 2-3 µm Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn rất phong phú , có thể gặp các màu trắng, vàng, xám, da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu…Khuẩn ty cơ chất có thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố , có sắc tố tan trong nước , có loại phụ thuộc pH, có loại chỉ tan trong dung môi hữu cơ Trong môi trường đặc hiệu, có loại xạ khuẩn có thể tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen

Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành các khuẩn ty khí sinh Người ta gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp bắt đầu phát triển từ các bào tử nảy mầm

Khuẩn lạc xạ khuẩn là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc , xù xì, có dạng da , dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ

Đối với các xạ khuẩn thuộc họ Streptomycetaceae sau một thời gian phát

triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗ i bào tử Các chuỗi bào tử có thể mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như: thẳng, uốn cong, móc câu

- đơn hoặc kép, và xoắn lò xo Bào tử trần của họ xạ khuẩn này có các hình dạng : hình cầu, hình bầu dục, hình trụ…Bề mặt bà o tử có thể là nhẵn , sần sùi da cóc, có gai hoặc có tóc [7]

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự VK Gr(+), có một số khác biệt sau:

 Thành TB xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới , dày khoảng 10-20 nm, có chức năng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào Căn cứ vào thành phần hóa học thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm: CW1, CW2, CW3 CW4 Các

xạ khuẩn chi Streptomyces được xếp vào nhóm CW 1, thành tế bào có chứa L-DAP

 Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt phosphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Sudan III ), các hạt polysacharid (bắt màu với dung dịch Lugol).[12]

1.2.3 Phân loại xạ khuẩn

Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được các nhà KH nghiên cứu phát triển để phân loại xạ khu ẩn, phải kể đến khóa phân loại của Waksman , khóa phân loại Krassilnhikov, khóa phân loại của Gauze…Các khóa phân loại chia lớp xạ khuẩn

(Actinomycetes) thành bộ Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn Bộ

Actinomycetales được c hia thành các họ : Actinoplanaceae, Actinomycetaceae,

Streptomycetaceae, Micromonosporaceae, Nocardiaceae…[7]

Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế (ISP)

do Shirling và Gotlieb đề xuất năm 1970 được sử dụng rộng rãi để phân loại các xạ

khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae Trong khóa phân loại

này, các đặc trưng phân loại được sử dụng bao gồm : màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn

ty cơ chất , sắc tố melanoid , sắc tố hòa tan , hình dạng chuỗi bào tử , bề mặt bào tử , khả năng tiêu thụ các nguồn hydratcarbon.[13]

1.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh

Để phân lập VSV sinh KS người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau : đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, đất nền ở chuồng gia súc, gia cầm, bùn, nước ở sông, hồ…Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những VSV sinh kháng sinh mà ta

mong muốn bằng các phương pháp đặc trưng và trên các môi trường chọn lọc (MT1, MT2 đối với xạ khuẩn) [6]

 Các phương pháp phân lập xạ khuẩn:

 Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch

 Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa VSV kiểm định

 Phương pháp làm giàu đất bằng VSV kiểm định

 Phương pháp thêm KS vào trong MT phân lập

1.4 Tuyển chọn, cải tạo, bảo quản giống xạ khuẩn

VSV tổng hợp KS phân lập được từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt tính rất thấp Vì vậy để thu được các chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo , chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp

1.4.1 Chọn chủng có hoạt tính cao nhờ sàng lọc ngẫu nhiên

Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10-10

- 10-5 trong ống giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau Trong đó có biến chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20-30 % những cá thể khác Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.[6]

1.4.2 Đột biến cải tạo giống

 Trong thực tế việc chọn lọc ngẫu nhiên các cá thể có hoạt tính cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, chưa có giá trị áp dụng vào sản xuất Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh cần áp dụng phương pháp đột biến nhân tạo.[6]

 Các tác nhân gây đột biến bao gồm:

 Các tác nhân hóa học : acid nitrơ (HNO2), ethylenimin (CH2NHCH2), dimethyl sulfat ((CH3)2SO4), hydroxylamin (H3NO),…

 Các tác nhân vật lý : Ánh sáng UV, tia Rơnghen và các bức xạ ion hóa khác Khả năng gây đột biến c ủa ánh sáng UV phụ thuộc vào cường độ bức xạ , khoảng cách chiếu và thời gian chiếu

 Các tác nhân sinh học: Các yếu tố di truyền vận động : TnA, đoạn xen hay IS (insertion sequene), phức hay gen nhảy (tranposon).[18]

 Để tạo ra các bi ến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS cao phải tiến hành đột biến bậc thang , kết hợp với các ph ương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp

giả hữu tính các gen, kỹ thuật tạo và dung hợp TB trần

Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến , phần lớn các VSV chết Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có h iệu suất sinh tổng hợp KS tăng (đột biến dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm) Cần chọn lọc ra những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng cao, chọn lọc để nghiên cứu tiếp.[6]

1.4.3 Bảo quản giống xạ khuẩn

Việc cải tạo thành công chủng VSV sẽ không có ý nghĩa nếu chủng giống không được bảo quản tốt để có thể sống sót và duy trì các tính trạng thu được Do đó việc bảo quản giống VSV là việc có ý nghĩa hết sức quan trọng [19]

Các phương pháp bảo quản giống VSV có thể kể đến như : Bảo quản lạnh,

cấy chuyền, làm khô, đông khô, đông lạnh [20]

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Có 2 phương pháp lên men chính:

 Lên men bề mặt : Trong phương pháp này , vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng

 Ưu điểm: Thao tác đơn giản , dễ thực hiện , dễ xử lý cục bộ , không đòi hỏi thiết bị phức tạp

 Nhược điểm: Khó cơ giới hóa , tự động hóa, khó vô trùng, tốn diện tích, tốn nhân công, hiệu suất sử dụng trường không gian thấp, tiêu hao lớn.[6]

 Lên men chìm: Vi sinh vật (hiếu khí và kị khí) được nuôi cấy trong toàn bộ môi trường lỏng

 Ưu điểm: Dễ cơ giới hóa, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ qui trình , tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao

 Nhược điểm: Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn.[10]

 Các phương pháp lên men chìm: Lên men mẻ, lên men có bổ sung, lên men bán liên tục, lên men liên tục.[15]

1.6 Chiết tách và tinh chế sản phẩm

 Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Tùy theo đặc tính của loài mà KS được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong TB Để thu lấy các chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết tách thích hợp

 Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:[1]

 Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ

 Các phương pháp sắc ký (sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng,…)

 Phương pháp tạo phức kết tủa

 Chiết xuất:

Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp Đó là quá trình phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một pha rắn (cân bằng lỏng-rắn) hoặc giữa hai pha lỏng (cân bằng lỏng-lỏng, thường một pha là nước, pha còn lại là dung môi có độ phân cực phù hợp) [6]

 Phương pháp sắc ký:

 Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các chất riêng rẽ từ một

hỗn hợp nhiều thành phần Nguyên lý tách chung là mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động, được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn Các chất tan là thành

phần của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau phụ thuộc tương tác

giữa pha tĩnh, pha động và chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lượng.[8]

 Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của

chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

 Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh:

- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Pha tĩnh là chất hấp phụ, được cố định trên bản

mỏng (bản kính, bản nhôm, ) Pha động là một hệ dung môi đa thành phần được pha theo tỷ lệ Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực [17]

- Sắc ký rửa giải trên cột (CC): Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục lượng mới của pha động.[9]

1.7 Một số phương pháp phổ để xác định cấu trúc kháng sinh

1.7.1 Phổ hồng ngoại (IR)

 Nguyên t ắc: Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng

lượng và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR

 Phổ hồng ngoại là phương pháp đo sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR) khi nó

đi qua một lớp chất cần thử ở các số sóng khác nhau Có mối tương quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ nên có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm chức nào đó Nhiều nhóm chức có các dải phổ hấp thụ đặc trưng, đây là

cơ sở của việc phân tích cấu trúc bằng phổ IR.[4]

1.7.2 Phổ tử ngoại (UV)

 Nguyên t ắc: Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng

lượng điện tử của phân tử Các điện tử ở trạng thái cơ bản E0 chuyển sang trạng thái kích thích E1, E2 Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại.[5]

 Các electron tham gia vào hiệu ứng này có thể là các electron trong liên kết đơn, liên kết bội, hệ thống thơm…, hay cặp electron tự do không tham gia liên kết

của O, N, các halogen.[1]

1.7.3 Khối phổ (MS )

 Nguyên t ắc: Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích

của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu

cơ ở chân không cao (10-6mmHg) Trong quá trình đó chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh Các tín hiệu thu được tương ứng với các ion sẽ thể hiện bằng

một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ [9]

 Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất

1.8 Một số nghiên cứu liên quan

1.8.1 Tối ưu hóa thống kê của quá trình lên men để tăng cường hoạt tính kháng sinh của Streptomyces sp.CS392 [23]

Nghiên cứu một chủng vi sinh vật đất mới được phân lập là Streptomyces

sp CS392 cho thấy nó có hoạt tính kháng sinh trên một số vi khuẩn Gr(+) như

Staphylococcus aureus và Enterococcus Hoạt tính kháng sinh của các chủng được tối ưu hóa bằng cách sử dụng một chương trình tối ưu hóa thống kê đa biến, hai giai đoạn dựa trên phương pháp lên men bề mặt ở quy mô phòng thí nghiệm Nhiều

thành phần dinh dưỡng của dịch lên men đã được tối ưu hóa cùng nhau trong giai đoạn đầu tiên, trong khi các điều kiện nuôi cấy lên men được tối ưu hóa trong giai đoạn tiếp theo Dựa trên mô hình thực nghiệm bắt nguồn từ khung tối ưu hóa thống

kê hai giai đoạn, hoạt tính kháng sinh đã tăng thêm 39,79% với các thông số tối ưu của quá trình lên men: thành phần chất dinh dưỡng tối ưu: 29,82g glucose, 7,6g peptone, 4,678g MgCl2 và 0,5005g / l axit casamino và điều kiện lên men tối ưu: Thời gian lên men 47,55 h; ủ nhiệt độ 29,15°C và pH 8,36

Đây là hướng nghiên cứu mở ra cho việc nghiên cứu sâu về chủng

Streptomyces 155.21 sau này để tăng cường hoạt tính kháng sinh bằng quy trình tối

ưu hóa thành phần dinh dưỡng và điều kiện tham gia quá trình lên men

1.8.2 Một chủng Streptomyces sp với nhiều đặc điểm mới hứa hẹn thúc đẩy

sự phát triển cúa nông nghiệp dịch bệnh [22]

Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp CIMAP-A1 được phân lập từ rễ Phong lữ

và đã được xác định bằng các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân tích gen (trình tự gen 16S rDNA) Theo sơ đồ cây di truyền, chủng CIMAP-A1 có mối liên

hệ chặt chẽ nhất với xạ khuẩn S vinacendrappus, biến chủng NRRL-2363 (trùng

khớp 99% trình tự gen) Qua nghiên cứu in-vitro chủng CIMAP-A1 có hoạt tính

kháng sinh tiềm năng chống lại nhiều loại nấm thực vật như Stemphylium sp,

Botrytis cinerea, Sclerotina sclerotiorum, Colletotrichum spp, Curvularia spp, Corynespora casicola, Thielavia basicola Các chất chuyển hóa trung gian ngoại bào được tạo ra bởi chủng trong dịch lọc lên men ức chế đáng kể sự nảy mầm bào

tử, phát triển của ống mầm của các bào tử nảy mầm và quá trình phát triển xuyên tâm của Alternaria alternata, Colletotrichum acutatum, Curvularia andropogonis

và Fusarium moniliforme Việc chiết xuất từ dịch lọc lên men với các dung môi và

lọc bằng phương pháp VLC và phương pháp PTLC đã tách được một lượng nhỏ của

10 hợp chất có hoạt tính chống lại nhiều loại nấm gây bệnh trên thực vật Biến

chủng có thể tạo ra siderophores và axit indole-3-acetic Cũng nghiên cứu này cho

thấy chủng CIMAP-A1 đã tăng cường sự tăng trưởng và sản xuất sinh khối của

Phong lữ Nó đã làm tăng 11,3% sinh khối chồi tươi của Phong lữ và 21,7% sản lượng dầu cần thiết

Từ nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng xạ khuẩn để tăng cường sức đề kháng cũng như tăng năng suất thu hoạch cho một số thực vật Đây là một gợi ý mở

ra cho việc trồng cây không dùng thuốc trừ sâu cũng như thuốc kích thích tăng trưởng, giảm giá thành đồng thời nâng cao được sức khỏe cho con người

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: Chủng xạ khuẩn Streptomyces 155.21 đã được

phân lập và hiện nay được lưu giữ tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, trường Đai học Dược Hà Nội

 Giống VSV kiểm định: Các chủng VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh - Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtilis ATCC 6633

Vi khuẩn Gram(-): Proteus mirabilis BV 108

 Môi trường nuôi cấy: Gồm các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (Bảng 2), môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (Bảng 3)

Bảng 2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 3: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Chú thích: - Đơn vị tính theo gram

- Tiệt khuẩn môi trường bằng hơi nước ở 120°C/20 phút

- Các môi trường lên men dịch th ể (MTdt): thành phần tương ứng như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch

 Dung môi sử dụng (Bảng 4) được mua tại các công ty hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích

Bảng 4: Các dung môi đã sử dụng

Dung môi Khối lượng riêng (g/ml) Nhiệt độ sôi (°C)

 Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Aluofolien 60 F254 (Merck) Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel (Merck), cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm

DC-2.1.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ

- Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn Toshiba 60W, 220V

- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf

- Tủ ấm Memmert, Binder; Tủ sấy SL shellab

- Tủ lạnh Samsung; Lò vi sóng Whirlpool

- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL303; Tủ cấy vô trùng Aura VF 48

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210; Cân phân tích Sartorius BP 121 S

- Máy cất quay Buchi R220, bơm chân không Waterbath B480

- Kính hiển vi điện tử

- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm

- Hộp Petri đường kính 9cm

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt

- Các dụng cụ khác như: Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,…

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Ch ọn lọc, cải tạo giống

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến bằng ánh sáng UV kết hợp bằng tác nhân hoá học từ 2 đến 3 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc

 Lên men, chi ết tách kháng sinh

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất

- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến

chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

- Tìm pH và dung môi hữu cơ chiết xuất dịch lọc của dịch lên men tốt nhất

- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

- Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống

Chủng Streptomyces 155.21 được cấy zigzag trên ống thạch nghiêng , cho

vào tủ ấm 28-300

C Sau 6-10 ngày chủng phát triển tốt , cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2-40C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

 Nguyên tắc: Chất kháng sinh khuếch tá n vào môi trường dinh dưỡng đặc đã cấy VSV kiểm định, tạo các vùng ức chế VSV gọi là vòng vô khuẩn

- Phương pháp khoanh giấy lọc (dùng cho mẫu dung môi hữu cơ): Đặt các khoanh giấy lọc Φ=6,0 mm đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ và sấy khô lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định

 Các hộp Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm 370

D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn,

D i: Đường kính vòng vô khuẩn thứ i,

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n: Số thí nghiệm làm song song (không có hướng dẫn khác thì n =3)

2.3.3 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp

Trong tủ cấy vô trùng, Streptomyces 155.21 được cấy zigzag lên các môi trường

nuôi cấy xạ khuẩn trong hộp Petri, để vào tủ ấm 6 ngày ở 28-300

C Sau đó thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch Dựa vào kết quả chọn ra MT cho hoạt tính kháng sinh cao nhất là môi trường nuôi cấy thích hợp (MTth)

2.3.4 Phương pháp chọn chủng có hoạt tính cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên

 Pha hỗn dịch bào tử : Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 155.21 cho

vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10-1 (định ước) Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 bằng nước cất vô trùng

 Phân tán hỗn dịch bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-5 đến 10-6 nhỏ vào đĩa Petri chứa MTth Dùng que chang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch Mỗi nồng độ tiến hành trên 3 đĩa Cho các đĩa đã phân tán bào tử vào tủ ấm

 Sàng lọc ngẫu nhiên: Sau 6 ngày để trong tủ ấm , các khuẩn lạc xạ khuẩn đã phát triển Chọn các khuẩn lạc phát triển đa dạng , mọc riêng rẽ cấy zigzag lên đĩa

Petri có môi trường thạch, để vào tủ ấm 6 ngày ở 28-300

C rồi thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch

2.3.5 Phương pháp đột biến

 Bằng ánh sáng UV:

 Pha hỗn dịch bào tử: chuẩn bị như mục 2.3.4 Sau đó hút 0,1 ml hỗn dịch bào tử độ pha loãng 10-6

, nhỏ vào hộp Petri có môi trường thạch , dàn đều bằng que chang vô trùng, để vào tủ ấm làm mẫu chứng

 Đột biến bằng ánh sáng UV : 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10-1 đổ ra đĩa Petri vô trùng Chiếu ánh sáng UV (λ=254 nm) vào đĩa Petri có hỗn dịch bào tử nồng độ 10-1 đặt cách nguồn sáng 60 cm, trong thời gian 5 phút Lấy ra để vào chỗ tối 2 giờ, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

% độ sống sót =

0

N

N m

x 10-6+k x 100%

Nm: Số khuẩn lạc sau đột biến

N0: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng

-k : Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử sử dụng

 Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sau đột biến , cấy ra hộp Petri

Làm song song cả mẫu chứng Sau 6 ngày để trong tủ ấm, thử hoạt tính kháng sinh Tính % biến đổi hoạt tính theo công thức:

% biến đổi hoạt tính =

0

D

D i

x 100%

D i: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB

D0: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng

 Sau đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

 Bằng tác nhân hoá học acid nitrơ (HNO2)

Nguyên tắc: HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2

 Pha hỗn dịch bào tử: Chuẩn bị như mục 2.3.5 - pha hỗn dịch bào tử

 Đột biến bằng acid nitrơ: 9 ml còn lại trong ống nồng độ 10-1

cho thêm 0,07g NaNO2 Điều chỉnh pH xuống 4-4,5 bằng dung dịch HCl 0,1N, để yên trong 2-3 phút Sau đó điều chỉnh pH lên 7-8 bằng dung dịch NaOH 0,1N, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

 Phân tán bào tử sau đột biến, tính toán kết quả, chọn lọc ngẫu nhiên các biến chủng thực hiện như đột biến bằng ánh sáng UV

2.3.6 Phương pháp lên men mẻ

 Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 155.21 nuôi cấy trên thạch

nghiêng MT phân lập được 6 ngày, được cấy vô trùng sang bình nón 500 ml có 100

ml MT2dt bằng 10 ml nước vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28±0,10

C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h

 Chọn môi trường lên men tốt nhất : Sau 48h trên máy lắc , giống cấp 1 được cấy vô trùng sang các bình nón 500 ml chứa các môi trường dịch thể khác nhau với

tỉ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10 Các bình lên men lắc ở nhiệt độ 28±0,10

C, tốc độ quay

140 vòng/phút trong 120 giờ Sau đó lọc hoặ c li tâm , rồi thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp giếng thạch

 Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất : Các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính dịch lên men bằng phương pháp giếng thạch

2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men

 Xác định độ bền nhiệt : Lấy 3 ống dịch lọc dịch lên men, mỗi ống khoảng 7ml Một ống đun sôi trực tiếp 10 phút, một ống đun sôi cách thủy 30 phút, một ống để ở nhiệt độ thường Đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch

5- Xác định độ bền pH: Lấy 5 ống dịch lọc dịch lên men, mỗi ống khoảng 5 ml Chỉnh pH dịch lên men trong ống về pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 0,1N

và HCl 0,1N Thử hoạt tính dịch trong ống sau 1 ngày, và sau 5 ngày

2.3.8 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ

Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối được chỉnh về pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 0,1N và HCl 0,1N Dịch lọc và dung môi hữu cơ được cho vào bình gạn với tỷ lệ 5:1 (v:v), lắc 1- 3 phút, để phân lớp 1h sau đó gạn riêng lớp dung môi và lớp nước Thử hoạt tính của lớp dung môi và lớp nước sau mỗi lần chiết bằng phương pháp khoanh giấy lọc Có thể chiết một lần hoặc chiết lặp để chiết kiệt được kháng sinh trong dịch lọc

2.3.9 Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký

 Sắc ký lớp mỏng:

 Chuẩn bị:

- Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 1100

C trong 30 phút

- Dung môi pha đúng theo tỷ lệ , đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá

1 cm), để bão hòa trong 30 phút

- Dùng mao quản chấm dịch chiết DMHC hoặc các phân đoạn quá trình sắc ký cột lên bản mỏng , cách mép dưới 1,5 cm, cách 2 mép bên 1 cm Để khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, lặp lại 3-5 lần

 Khai triển sắc ký : Đặt bản mỏng vào bình sắc ký , khi dung môi chạy đến ¾ bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy

 Hiện sắc đồ : Sấy khô bản mỏng , sau đó soi đèn UV hoặc hiện hình bằng vi sinh vật

- Soi đèn UV : Bản mỏng sắc ký tráng sẵ n đã trộn với một chất phát huỳnh quang khi chiếu ánh sáng UV (thường sử dụng bản mỏng silica gel 60 GF254 hãng Merck) Nên vết chất sẽ tương ứng với vết huỳnh quang sẫm màu

- Hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng , đổ thạch có cấy VSV kiểm định phủ lên, để ở tủ 370

C trong 18-24h Vết kháng sinh được xác định dựa vào vòng vô khuẩn

Tính Rf: Rf =

dm

v

d d

d v: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết

d dm: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến đường dung môi chạy

 Sắc ký cột:

 Chuẩn bị:

- Mẫu thử: Bột KS thô thu được sau cất quay dịch chiết DMHC

- Dung môi: pha đúng theo tỷ lệ

- Cột: đường kính 1 cm, dài 50 cm, rửa sạch, tráng cồn, sấy khô

- Chất nhồi cột: Silica gel 60 F254 Merck cỡ hạt 0,06-0,1mm Cân khoảng 6-8

g hạt, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút Hòa thành hỗn dịch với hệ dung môi hữu cơ chạy cho đến khi hết bọt khí rồi đưa lên cột

- Đưa mẫu thử lên cột : Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol, sau đó trộn với khoảng 1-2 g silicagel đã hoạt hóa Sấy ở 500

C cho bay hết methanol thì cho lên cột đã ổn định cột trong 30 phút

 Chạy cột: Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch (đã tráng cồn để khô), mỗi phân đoạn 5-10 ml

 Xác định phân đoạn chính chứa kháng sinh cần tách:

Thử hoạt tính KS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc Các phân đoạn có hoạt tính KS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất Phân đoạn chính là các phân đoạn có những vết có Rftương đương và có hoạt tính kháng sinh mạnh

2.3.10 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết

Các phân đoạn chính sau chạy cột được gộp vào bình cầu , cất quay chân không ở nhiệt độ 50 - 600C đến khô , cạo thu bột kháng sinh tinh kh iết vào ống nghiệm sạch Kết tinh kháng sinh nhiều lần bằng hỗn hợp dung môi hữu cơ thích hợp Lọc, sấy, thu được kháng sinh tinh khiết

2.3.11 Phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được

Bột KS tinh k hiết đem đi đo các thông số : Nhiệt độ nóng chảy , phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, khối phổ để sơ bộ dự đoán cấu trúc KS thu được