Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học của cây crinum SP6 , amaryllidaceae phần 1

Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học của cây crinum SP6 , amaryllidaceae phần 1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học của cây crinum SP6 , amaryllidaceae phần 1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học của cây crinum SP6 , amaryllidaceae phần 1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học của cây crinum SP6 , amaryllidaceae phần 1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học của cây crinum SP6 , amaryllidaceae phần 1

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

—oỏo—

HÔ THUỲ MINH

¡V<flIIÊN CỨU RỄ CÂY MỨC HOA TKẨN«

(HOLARKUKNA ANTIDYSKÌVTIỈRICA WALL.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩK H O Á 2002- 2007

Người hướng dẫn: GS TS Phạm Thanh Kỳ

ThS Phí Tùng Lâm Nơi thực hiện: Bộ môn dược liệu

Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: 02- 5 / 2007

HÀ NỘI, 5/2007

LÙI c ả m ƠH

Trong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự quan tâm giúp

đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị trong các bộ môn của trường.Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn

GS.TS Phạm Thanh Kỳ

ThS Phí Tùng Lâm

Những người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn trân trọng tới:

PGS.TS Chu Đình Kính - Viện hoá học - Viện khoa học và công nghệViệt Nam

Tập thể cán bộ Bộ môn Dược liệu- Trường Đại học Dược Hà Nội

Tập thể cán bộ phòng thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội Gia đình, thầy cô và bè bạn

Đã luôn tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2007

Sinh viên

Hồ Thuỳ Minh

2.2.1 Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học 10

2.2.2 Chiết xuất các chất trong dược liệu 17

2.2.3 Định lượng cắn các phân đoạn 192.2.4 Định tính cắn c và cắn D bằng SKLM 202.2.5 Phân lập Aavonoid và alcaloid bằng sắc ký cột 24

2.2.5.1 Phân lập Aavonoid 24

2.2.5.2 Phân lập alcaloid 262.2.6 Nhận dạng các chất HMjVà RM2 28

2.2.6.1 Nhận dạng chất HM J 282.2.6.2 Nhận dạng chất RM2 29

PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHU LUC

TrangBảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong vỏ rễ Mức 16

hoa trắng bằng phản ứng hoá học

Bảng 2.2: Kết quả định tính các cắn A, B, c, D 19Bảng 2.3: Hàm lượng các chất trong phân đoạn A, B, c, D 20Bảng 2.4: Kết quả định tính flavonoid trong cắn c bằng SKLM 21Bảng 2.5: Kết quả định tính alcaloid trong cắn D bằng SKLM 23Bảng 2.6: Kết quả định tính HMj bằng SKLM 25Bảng 2.7: Bảng số liệu cộng hưởng từ hạt nhân của HMj 28

DANH MỤC CÁC HÌNH

TrangHình 2.1 : Sơ đồ chiết suất các chất trong vỏ rễ Mức hoa trắng 18Hình 2.2: Ảnh sắc ký đồ cắn c khai triển ở hệ dung môi IV 22Hình 2.3: Ảnh sắc ký đồ cắn D khai triển ở hệ dung môi I 23Hình 2.4: Ảnh sắc ký đồ của HMj khai triển ở 3 hệ dung môi khác 25nhau

Hình 2.5: Ảnh sắc ký đồ của HMj, Ftp khai triển ở hệ dung môi IV 25Hình 2.6: Cấu trúc hoá học của HMl 28Hình 2.7: Cấu trúc hoá học của RMj 29

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MUC CÁC CHỮ VIẾT TẮT0

'^C-NMR: Carbon (13) Nuclear magnetic resonanceDC: Dịch chiết

Tro từ gỗ mức hoa trắng giàu chất Kali gồm 17,5% chất tan có: K2CO3

(10,82%), KCl (4,2%), K2SO4 (2,48%) và chất tro không tan 80,24% [1], [16], [2 2]

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG.

1.3.1 Tác dụng dược lý [I],{17], [21],[22].

■ Alcaloid toàn phần của mức hoa trắng có tác dụng sau:

o Thí nghiệm trên ống nghiệm, thuốc có tác dụng diệt Entamoeba moskowskii

o Thí nghiệm trên mèo, thuốc gây hạ huyết áp và ức chế tim, tác dụng này yếu so với emetin

o Liều lượng lớn của thuốc trên súc vật thí nghiệm gây co giật trước khi chết

■ Cao cồn chiết từ quả mức hoa trắng có tác dụng chống ung thư và ức chế tế bào Carcinom epidermoid từ họng hầu trên môi trường nuôi cấy

■ Cao chiết từ quả có tác dụng hạ đường huyết trên chuột cống trắng

■ Cao chiết bằng chloroform và methanol từ hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus

■ C onessin[l],[16],[22]:

Chất conessin rất ít độc Với liều cao, tác dụng gần giống morphin, nó gây liệt trung tâm hô hấp, giai đoạn đầu là kích thích, tiếp theo làm giảm hô hấp, dùng với liều ngộ độc làm ngừng thở trước khi tim ngừng đập

Nếu tiêm dưới da chuột lang, conessin gây tê tại chỗ (mạnh gấp 2 lần so với cocain) nhưng lại kèm theo hiện tượng hoại thư nên tác dụng này không được sử dụng trên lâm sàng Đối với ếch, tiêm dưới da, thuốc có tác dụng gây mê

Đối với hệ tim mạch, conessin dùng liều lớn có tác dụng giống quinin, phong bế dẫn truyền nhĩ- thất, gây hạ huyết áp và giảm nhịp tim

Conessin dùng đường uống có tác dụng ức chế hoạt động các men ptyalin, pepsin và trypsin

Conessin kích thích sự co bóp ruột và tử cung

Ngoài ra, conessin còn có tác dụng diệt côn trùng bằng cách làm bất dục và gây biếng ăn, conessin có tác dụng trừ giun đối với chuột bạch

Conessin có tác dụng diệt amip, thí nghiệm ngoài cơ thể nồng độ có hiệu quả đối với Entamoeba histolytica của conesssin là: 1:71000 - 1:45000, còn của emetin là: 1: 200000 - 1: 300000 Trên lâm sàng, người ta dùng conessin chlohydrat hay bromhydrat chữa lỵ amíp Nó tác dụng cả đối với kén và amip, còn emetin chỉ tác dụng đối với amip Hiện tượng không chịu thuốc rất ít hoặc không đáng kể Kết quả cho thấy tác dụng diệt amíp của conessin kém hơn emetin, conessin có tác dụng diệt cả Trichomonas vaginalis và Trichomonas intestinalis

■ Kurchỉcin:

Chất kurchicin thí nghiệm trên động vật cũng có tác dụng ức chế tim, đặc biệt là phong bế sự dẫn truyền bó Hiss, làm hạ huyết áp Nó còn có tác dụng kích thích cơ trơn, gây tăng co bóp đối với ruột và tử cung cô lập [2 2]

^ Định tính flavonoid và alcaloid trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng, dùng bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) đã tráng sẵn.

^ Phân lập bằng sắc ký cột, chất hấp phụ là Silicagel có kích thước hạt 40 -

60 |am (Merck) và kích thước 15-40 ỊLim (Merck)

^ Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào số liệu các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

❖ Phản ứng với PeCls 5% :

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd PeClg 5% thấy xuất hiện màu xanh đen

❖ Phản ứng với AICI3 3% trong cồn:

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd AICI3 3% trong cồn thấy xuất hiện màu vàng ánh xanh

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có Aavonoid.

2.2.13 Định tính Saponin

❖ Hiện tượng tạo bọt:

Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 5 ml nước, đun sôi nhẹ, lọc nóng Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước Lắc mạnh trong

5 phút theo chiều dọc ống nghiệm Để yên, quan sát thấy cột bọt không bền sau 15 phút

❖ Quan sát hiện tượng phá huyết:

Cho Ig bột dược liệu vào 20ml dung dịch NaCl 0,9%, đun cách thuỷ trong

30 phút, lọc nóng lấy dịch lọc để làm thí nghiệm sau:

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống Iml dung dịch máu 2%

Ống 1: thêm 2ml dịch lọc trên

Ống 2: thêm 2ml dung dịch NaCl 0,9%

Lắc đều cả 2 ống nghiệm Quan sát thấy cả 2 ống nghiệm đều không có cắn

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có Saponin.

2.2.1.4 Định tính Anthranoỉd:

❖ Phản ứng Borntrager;

Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thêm 50 ml dd H2SO4

10%, đun sôi cách thuỷ trong 15 phút Lọc nóng vào bình gạn Để nguội rồi lắc với 5 ml ether ethylic Gạn lấy phần ether cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống Iml dịch chiết

• Ống 1: Thêm 1 ml NH4OH 10% - > 2 lớp dung môi trong suốt

• Ống 2: Thêm 1 ml NaOH 10% - > 2 lớp dung môi trong suốt

11

❖ Vi thăng hoa;

Cho khoảng Ig bột dược liệu vào một nắp nhôm Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi bay hoi hết nước trong dược liệu Đặt lên miệng nắp nhôm một lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh, Đốt nắp nhôm trên ngọn lửa đèn cồn Sau 5-10 phút, lấy lam kính ra để nguội Soi dưới kính hiển vi, không thấy có tinh thể

Kết quả: Vỏ rễ dược liệu không có anthranoid.

❖ Phản ứng Liebermann:

Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thuỷ đến cắn Thêm Iml anhydrid acetic, lắc đều cho đến khi tan hết cắn Đặt nghiêng ống nghiệm 45°, thêm từ từ theo thành ống Iml dd H2SO4 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm

chia thành 2 lớp Thấy xuất hiện 1 vòng tím đỏ ỏ mặt phân cách giữa hai lớp

Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dd Natri nitroprussiat 1%

và 2 giọt dd NaOH 10% Lắc đều, không thấy xuất hiện màu đỏ

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có Glycosid tim.

12

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có Coumarin.

2.2,1.7 Định tính Tanỉn

Cho vào ống nghiệm Ig bột dược liệu, thêm 10 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp, Dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết

*> Phản ứng với chì acetat:

• Ống 3: Thêm 2-3 giọt dd chì acetat 10% thấy xuất hiện tủa

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có tanin

2.2.1.8 Định tính Acid hữu cơ

Cho Ig bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm lOml nước cất Đun sôi trực tiếp 10 phút, để nguội, lọc Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể NajCOj Quan sát thấy có bọt khí COj

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có acid hữu cơ.

2.2.1.9 Định tính Acid amin

Cho Ig bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm lOml nước cất, đun sôi 5 phút Lọc nóng, lấy 2ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm khác, thêm 2-3 giọt TT Ninhydrin 3%, đun cách thuỷ sôi 10 phút, không thấy xuất hiện màu tím

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có acid amin.

2.2.1.10 Định tính đường khử

Cho 2ml dịch chiết nước vào ống nghiệm, thêm 3 giọt TT Fehling A và

3 giọt TT Fehling B Đun cách thuỷ 10 phút, thấy có tủa đỏ gạch

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có đường khử.

2.2.1.11 Định tính chất béo

Cho lOg bột dược liệu vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hoả, ngâm qua đêm, lọc Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung môi, không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có chất béo.

2.2.1.12 Định tính Steroid

Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết ether dầu hoả Bốc hơi dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 45° rồi thêm Iml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, thấy mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng có màu xanh

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có hợp chất steroid.

14

2.2.1.13 Định tính caroten

Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết ether dầu hoả, bốc hơi cách thuỷ đến

cắn Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy ống nghiệm chuyển sang

màu xanh da trời

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có caroten.

2.2.1.14 Định tính polysaccharìd

Cho 2g bột dược liệu vào một cốc có mỏ, thêm lOml nước cất, đun cách thuỷ sôi 5 phút, lọc nóng Cho vào 2 ống nghiệm:

• Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT Lugol ( I2/K I)

• Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt TT Lugol

Quan sát thấy ống 1 có màu đỏ đậm hơn ống 2

Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có polysaccharid.

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong vỏ rễ mức hoa trắng được tóm tắt ở bảng 2 1

Nhân xét: Qua các phản ứng định tính, chúng tôi thấy:

Trong vỏ rễ Mức hoa trắng có chứa: alcaloid, flavonoid, tanin, acid hữu

cơ, đường khử, steroid, polysaccharide Trong đó: alcaloid và flavonoid là 2nhóm chất chính Do đó, hướng nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào nhóm flavonoid và alcaloid trong vỏ rễ cây Mức hoa trắng

15

Bảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong vỏ rễ mức hoa

Có

Ghi chứ: (-): Phản ứng âm tính (+): Phản ứng dương tính

(++): Phản ứng dương tính rõ (+++): Phản ứng dương tính rất rõ

16

Cân khoảng 20g bột dược liệu, chiết bằng methanol trong Soxhlet đến khi dịch chiết trong suốt Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thuỷ đến cắn Hòa cắn thu được nhiều lần trong nước nóng, lọc qua bông và giấy lọc thu được dịch chiết nước Dịch chiết thu được lắc với các dung môi có

độ phân cực tăng dần theo sơ đồ hình 2 1 trang 18

2.2.2 Chiết xuất các chất trong dược liệu

17

Hình 2.1: Sơ đồ chiết xuất các chất trong dược liệu

18

Các cắn của bốn phân đoạn trên được định tính ílavonoid và alkaloid Kết quả được trình bày ở bảng 2 2

Bảng 2.2: Kết quả định tính các cán A, B, c, DSTT Nhóm

2.2.3 Định iượng cắn các phân đoạn:

Cân chính xác 50g bột dược liệu đã xác định độ ẩm Chiết xuất theo sơ đồ

ở hình 2.1 Cắn A, B, c, D thu được đem sấy ở 60° c tới khối lượng không đổi Cân cắn và tính ra hàm lượng trong các phân đoạn theo công thức:

a X 100F% =

Hệ II: Ethylacetat: Acid formic: H2O (8: 1: 1).

Hệ III; Toluen: Ethylacetat: Acid formic (5: 6: 2, 5)

Hệ IV: Toluen: Ethylacetat: Acid formic : HjO (5: 6: 1, 5 :1)

Hệ V: n-Butanol: Acid acetic: HjO (4: 1: 2, 5)

Hệ VI: Chloroform: Methanol (9: 1)

Hệ VII: Ethylacetat: Qiloroform: Acid formic (5:5: 1)

Bản sắc ký được sấy nhẹ 15 phút cho bay hết hơi dung môi

❖ Hiện màu: Amoniac đặc Sau đó quan sát dưới ánh sáng thường và đèn

tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm.

Khai triển sắc ký qua 7 hệ dung môi chúng tôi nhận thấy hệ IV tách tốt nhất

Kết quả SKLM chạy ở hệ dung môi IV được trình bày ở bảng 2.4 và hình 2.2.

Bảng 2 4 Kết quả định tính flavonoid trong cán c bằng SKLM

u v 366nm Ánh sáng thường Hơi NH 3

Hình 2.2 : Sắc ký đồ cắn c khai triển ở hệ dung môi IV

Cắn D được hoà tan trong methanol để chấm sắc ký

❖ Chất hấp phụ: Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) hoạt hoá ở 110®c trong 1 giờ Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

❖ Hệ dung môi: Chấm dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng Sấy nhẹ

cho khô Triển khai sắc ký vói các hệ dung môi sau:

Hệ I: Chloroform: Methanol: NH4OH (50: 9: 1)

Hệ II: Chloroform: Aceton: Methanol: Amoniac 25% (20: 20: 3: 1)

Hệ III: Chloroform: Methanol: NH4OH (9: 1: 1)

Hộ IV; n-Buthanol: acid acetic: H2O (4: 1: 5)

Hệ V: Chloroform: Methanol: NH4OH (19: 1: 0, 5)

Hệ VI: Chloroform: Methanol (9: 1)

❖ Hiện màu: Bản sắc ký để ở nhiệt độ phòng cho bay hết hơi dung môi Phun hiện màu bằng TT Dragendorff quan sát dưói ánh sáng thường.Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ I tách tốt nhất Kết quả SKLM vói hệ dung môi I được trình bày ở bảng 2.5 và hình 2.3

22

Bảng 2.5: Kết quả định tính alcaloid trong cắn D bằng SKLM triển khai

2.2.5 Phân lập flavonoid và alcaỉoid bằng sắc ký cột

Rửa giải flavonoid trong cột bằng chloroform và ethylacetat, tăng dần tỷ lệ ethyacetat

Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm, mỗi ống 1.5 ml

Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM, thu được kết quả như sau

• Từ ống 17 đến ống 22; Thu được 1 vết, ký hiệu HM3

• Từ ống 23 đến ống 34: Thu được 2 vết, ký hiệu HM4, HM5

• Từ ống 35 đến ống 38: Thu được 1 vết, ký hiệu HMị

• Từ ống 39 đến ống 42: Thu được 2 vết HM| và HM2

• Từ ống 43 đến ống 48: Thu được 1 vết, ký hiệu HM2

Gộp các ống nghiệm đã kiểm tra có một vết cùng Rf với nhau Để bay hơi tự nhiên, kết tinh lại nhiều lần thu được 1 chất HM|

24

Kiểm tra độ tinh khiết của HMj phân lập được bằng SKLM:

Chấm dung dịch HMi lên bản mỏng, khai triển bằng 3 hệ dung môi

Hệ I: Chloroform: aceton: acid acetic (80: 20: 5)

Hệ IV: Toluen: Ethylacetat: Acid formic : HjO (5: 6: 1, 5 :1)

Hệ V: n-Butanol: Acid acetic: H2O (4: 1: 2, 5)

Lấy các tấm sắc ký ra, sấy nhẹ cho bay hết hoi dung môi, quan sát dưới ánh sáng thường Kết quả cho thấy HMi chỉ xuất hiện một vết màu vàng nâu

Do đó có thể kết luận HMi tương đối tinh khiết Kết quả triển khai SKLM ở 3

hệ dung môi khác nhau được trình bày ở bảng 2.6 và hình 2.4

25