Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của 5 (4 clorobenzyliden) 2 thiohydantoin và một số dẫn chất base mannich

ĐẶT VẤN ĐỀ Dược phẩm là một trong những lĩnh vực quan trọng trong công cuộc chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Trong lĩnh vực Dược phẩm, các nhà khoa không ngừng tìm tòi, nghiên cứu để phát hiện ngày càng nhiều loại thuốc mới có hiệu quả trong phòng và điều trị bệnh. Thuốc mới được tìm ra có nhiều nguồn gốc khác nhau, trong đó các thuốc được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp và bán tổng hợp đóng vai trò quan trọng. Tổng hợp hóa dược là một chuyên ngành hóa học quan trọng, đã và đang được quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm tạo ra các thuốc có hiệu quả trong công tác phòng và chữa bệnh. Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tạo ra các thuốc mới, các nhà nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có hoạt tính sinh học có triển vọng để tạo ra các chất mới dự đoán có tác dụng tốt hơn, ít độc tính hơn và có hiệu quả hơn trong điều trị. Trên thế giới, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu về tổng hợp hóa học, tác dụng sinh học và ứng dụng làm thuốc của các dẫn chất 2 thiohydantoin 8, 13, 29, 37… Trong đó nhiều dẫn chất của 2 thiohydantoin có tác dụng chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và ức chế aldose reductase,… đáng quan tâm 15, 19, 20, 22, 35. Để góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất 2thiohydantoin có tiềm năng về hoạt tính sinh học, chúng tôi thực hiện khóa luận với các mục tiêu sau: 1. Tổng hợp dẫn chất 5(4‟clorobenzyliden)2thiohydantoin và một số dẫn chất base Mannich. 2. Thử hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư người của các chất tổng hợp được.

TÔ ÁI AN

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA 5-(4’-CLOROBENZYLIDEN)- 2-THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN

CHẤT BASE MANNICH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TÔ ÁI AN

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA 5-(4’-CLOROBENZYLIDEN)- 2-THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Vũ

Trần Anh và Ths Hoàng Thu Trang, PGS TS Nguyễn Quang Đạt đã hết

lòng chỉ bảo, giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của: Ths Đặng Vũ Lương (Phòng NMR- Viện Hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), TS.

Phan Thị Nguyệt Hằng (Viện Dược liệu), TS Trần Thị Như Hằng (Viện

Hóa học các hợp chất thiên nhiên), TS Nguyễn Thị Sơn (Bộ môn Hóa vật

liệu- Khoa Hóa- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội) và toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa hữu

cơ, các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban- Trường Đại học Dược Hà Nội

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng như tài liệu tham khảo nên khóa luận của tôi không thể tránh khỏi những sai sót, khiếm khuyết trong nội dung và hình thức, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Tô Ái An

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.1 Tác dụng sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin 2

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

18

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi 18

2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.4.1 Phương pháp tổng hợp 2-thiohydantoin,

5-(4‟-clorobenzyliden)-2-thiohydantoin và dẫn chất base Mannich

20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13

1

(thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô)

(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

(Heteronuclear Single-Quantum coherence)

thư vú MCF-7, dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và dòng tế bào

ung thư tuyến tiền liệt PC3 của các chất tổng hợp được (theo

phương pháp SRB)

37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dược phẩm là một trong những lĩnh vực quan trọng trong công cuộc chăm sóc sức khỏe cộng đồng Trong lĩnh vực Dược phẩm, các nhà khoa không ngừng tìm tòi, nghiên cứu để phát hiện ngày càng nhiều loại thuốc mới

có hiệu quả trong phòng và điều trị bệnh Thuốc mới được tìm ra có nhiều nguồn gốc khác nhau, trong đó các thuốc được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp và bán tổng hợp đóng vai trò quan trọng

Tổng hợp hóa dược là một chuyên ngành hóa học quan trọng, đã và đang được quan tâm nghiên cứu và phát triển nhằm tạo ra các thuốc có hiệu quả trong công tác phòng và chữa bệnh

Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tạo ra các thuốc mới, các nhà nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có hoạt tính sinh học có triển vọng để tạo ra các chất mới

dự đoán có tác dụng tốt hơn, ít độc tính hơn và có hiệu quả hơn trong điều trị Trên thế giới, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu về tổng hợp hóa học, tác dụng sinh học và ứng dụng làm thuốc của các dẫn chất 2-thiohydantoin [8], [13], [29], [37]… Trong đó nhiều dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và ức chế aldose reductase,… đáng quan tâm [15], [19], [20], [22], [35]

Để góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất 2-thiohydantoin có tiềm năng về hoạt tính sinh học, chúng tôi thực hiện khóa luận với các mục tiêu sau:

1 Tổng hợp dẫn chất 5-(4‟-clorobenzyliden)-2-thiohydantoin và một số dẫn chất base Mannich

2 Thử hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư người của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tác dụng sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin

2-thiohydantoin là hợp chất dị vòng được tạo thành nhờ phản ứng ngưng

tụ giữa một amino acid với một dẫn chất của thiocyanat Bản thân thiohydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng sinh học đã được biết đến trong thời gian dài Nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng đa dạng như: kháng tế bào ung thư [4], [9], kháng đột biến gen [29], kháng virus [13], kháng virus HIV [19], kháng khuẩn [20], [22], ức chế enzyme aldose reductase [35] … Ngoài ra 2-thiohydantoin còn được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực khác như sản xuất thuốc trừ sâu [33], [36], thuốc nhuộm [36]…

2-1.1.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Merbaron là một dẫn chất của 2-thiobarbituric, có tác dụng gây độc tế bào với tế bào ung thư máu và một số tế bào ung thư khác

HN N H

H N O

S O

O

Merbaron

Dựa trên sự tương tự về cấu trúc của 2-thiohydantoin, Blanc và Cussac

[38] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 2-thiohydantoin (1a-d), thử

tác dụng gây tăng miễn dịch và gây độc tế bào Kết quả thử nghiệm cho thấy

các dẫn chất tổng hợp được 1(a-d) có tác dụng gây tăng miễn dịch yếu, và có

tác dụng trên các tế bào ung thư thử nghiệm

N

N

S O

Năm 2010, một số dẫn chất của 2-thiohydantoin (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) đã

được tác giả Al-Obaid và các cộng sự [8] nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng invitro về tác dụng chống ung thư trên 60 dòng tế bào người ở 5 nồng độ khác

nhau Kết quả thu được đáng chú ý là chất 2, 7 có tác dụng kháng tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư bạch cầu, các chất 3, 4, 5, 6, 8 có tác dụng ngăn

cản sự phân bào và kìm hãm sự phát triển tế bào thử nghiệm

CH

N H NH O

5-(5-bromo-thiophen-2-ylmethylen)-2-O OH

S S

CH

N H NH O

S

3

Acid 4-ylidenemethyl)-thiophen-2-ylsulfanyl]-benzoic

2-[5-(5-oxo-2-thioxo-imidazolidin-S S

O

CH

N H NH O

S

4

cyclopenta[b]naphthalen-2-ylmethylen)-2-thioxo-imidazolidin-4-on

N H N O

S

S

Br

O N

5

morpholin-4-ylmethyl-2-thioxo-

5-(5-bromo-thiophen-2-ylmethylen)-3-imidazolidin-4-on

O OAc OAc

AcO

CH

N NH O

3-acetoxy-6-acetoxymethyl-2-[4-(5-O OAc OAc

AcO H AcO

O OH

S S

CH

N N O

S Ph

7

2-{5-[5-oxo-1-phenyl-2-(3,4,5-pyran-2-ylsulfanyl)-1,5-dihydro-

triacetoxy-6-acetoxymethyl-tetrahydro-ylsulfanyl}-benzoic

imidazol-4-ylidenemethyl]-thiophen-2-CH

N N O

S

S

Br

O N

O OAc OAc

AcO H AcO

8

2-ylmethylene)-1-morpholin-4-ylmethyl-5-oxo-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-

3,4,5-triacetoxy-6-[4-(5-bromo-thiophen-ylsulfanyl]-tetrahydro-pyran-2-ylmethyl acetat

Nguyên nhân chính của ung thư kháng thuốc là do nồng độ quá cao của bơm tống thuốc phụ thuộc ATP khiến cho giảm nồng độ thuốc, trong đó có nồng độ quá cao của chất vận chuyển đa thuốc ABC (ví dụ P-glycoprotein)

Nhiều nhóm chức hóa học có khả năng ức chế loại bơm tống thuốc (loại có chứa P-gp), bao gồm 3 thế hệ điều biến P-gp Các nghiên cứu cho thấy chất 5-(3-methoxy-benzyliden)-3-{3-[4-(2-methoxy-phenyl)-piperazin-1-yl]-

N N

O O

H N O

S

10

Tác giả Spengler và Hadzlik [15] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 5-aryliden-2-(thio)hydantoin và thử tác dụng ức chế bơm tống thuốc của các dẫn chất này Chất 5-(biphenyl-4-yl)methylen-2-thioxo-imidazolidin-4-on

(10) có tác dụng ức chế chất điều biến P-Glycoprotein trong tế bào ung thư

tương tự verapamil

N H

H N O

S

10

Dựa trên đó, tác giả Hadzlik và cộng sự [15] tiếp tục tổng hợp dẫn chất của 5-aryliden-2-(thio)hydantoin theo sơ đồ chuyển hóa:

N H

H N S O

Ar

ArOH

N

H N SCH3O

Ar

CH3I

N HN

HO

N

H N O Ar

N N

HO

Các tác giả đã thử tác dụng ức chế bơm tống thuốc của các dẫn chất đã tổng hợp được trên các tế bào lympho T đã kháng thuốc của chuột có gen vận chuyển thuốc ABCB1 Kết quả cho thấy một số dẫn chất có tác dụng yếu trên

bơm tống thuốc ở tế bào ung thư thử nghiệm, tác dụng yếu hơn chất 4 Hợp

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Tác giả Herba [16] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của thiohydantoin và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm trên các chủng vi

khuẩn: Staphylococcus aureus (RCMB 000108) và Bacillus subtilis (RCMB 000109) (Gram dương), Pseudomonas aeruginosa (RCMB 000103) và

Escherichia coli (RCMB 000106) (Gram âm) Các chất tổng hợp được thử tác

dụng kháng nấm trên các chủng Aspergillus fumigates (RCMB 002006),

Geotrichum candidum (RCMB 005008), Candida albicans (RCMB 005003), Syncephalastrum racemosum (RCMB 005004) Kết quả cho thấy các chất

tổng hợp được đều có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Chất

5-oxo-2-thioxo-1-(2-p-tolyl-ethylideneamino)-imidazolidin-4-yl acetat (12) có tác

dụng tốt nhất trên chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm Chất

1-acetyl-3-[(p-tolylethyliden)amino]-2-thiohydantoin (13) và chất [(p-tolylethyliden)amino]-2-thiohydantoin (14) có tác dụng trung bình Chất 1-acetyl-3-[(p-tolylethyliden)amino]-5-thiophen-2-yliden-2-thihydantoin (15)

5-thiophen-2-yliden-3-có tác dụng tốt trên chủng vi khuẩn và tác dụng trung bình trên chủng nấm thử nghiệm

N H

N S O

N

CH3

O 13

N H

N S O

N

CH3S

14

N

N S O

Năm 2010, tác giả Abd El Fattah [6] đã tổng hợp một số dẫn chất của

thiohydantoin và thử hoạt tính trên 4 dòng vi khuẩn là: Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas species và 1 dòng vi

nấm là Candida albicans Kết quả thu được cho thấy các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng tốt trên dòng vi khuẩn Pseudomonas sp; các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng yếu trên dòng Escherichia coli; 18, 19 tác dụng rất tốt trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus; 16, 17, 19, 20 tác dụng rất tốt trên dòng vi nấm

Candida albicans

N N N

2-[(3-acetyl-5-oxo-2-thioxo-NH N

N Br

5-acetyl-3-[(5-bromo-2-hydroxy-N N N

oxo-2-thioxo-imidazolidin-1-

4-bromo-2-[(3,4-diacetyl-4-bromo-5-ylimino)-methyl]-phenyl acetat

NH N

N H Br

OH H2NHN

H2NHN

19

imidazolidin-1-ylamino)-methyl]-phenol

4-bromo-2-[(2,5-dihydrazino-NH N

N Br

3-[(5-bromo-2-hydroxy-benzyliden)-1.1.3 Các tác dụng khác

Trong US patent 6.826.924 tác giả Pfahl [26] đã tổng hợp các dẫn chất của 2-thioxo-4-imidazolidindion có tác dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến chuyển hóa lipid và carbonhydrat như đái tháo đường typ 2, biệt hóa tế bào mô mỡ, bệnh Hodgkin, bệnh bạch cầu, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến…

HN N

N HN O

O

O

O TolO

OTol

HN N

O

O

CHO 1.(Me3Si)2NH/(NH4)2SO4

H2N

S

NH S

O R

trong bình hồi lưu dưới 4 điều kiện khác nhau:

Phản ứng này cho hiệu suất khác nhau ứng với các amino acid khác nhau

và điều kiện phản ứng khác nhau Hiệu suất cao nhất khi sử dụng điều kiện đun cách dầu, dao động từ 70% đến gần như 100%

1.2.1.2 Phản ứng của các α-amino acid với ammonium thiocyanat

Năm 1913, Treat Johson và Water Scott [18] tìm ra phản ứng giữa amino acids với amonium thiocyanat trong môi trường anhydrid acetic khan Sản phẩm trung gian thu được là acylthiohydantoin, sản phẩm trung gian này

α-bị thủy phân trong môi trường acid ở nhiệt độ cao sẽ sinh ra 2-thiohydantoin

N H

H N S O

CH3O

Trong bài báo này, tác giả đã thực hiện phản ứng tổng hợp thiohydantoin

và dẫn chất từ 7 acid khác nhau là: acid aceticphtalamic, acid

acetyldibromphenylalanin, benzoylalanin, acid phenylsulfonaminoacetic Năm 2006, Samuel Reyes và cộng sự [27] đã tiến hành tổng theo phương pháp trên và thu được kết 2-thiohydantoin Năm 2011, Sandrine Gosling và cộng sự [14] cũng đã xây dựng qui trình tổng hợp 2-thiohydantoin theo sơ đồ như trên và chúng tôi thực hiện theo qui trình này

1.2.1.3 Phản ứng của glycine ethyl ester thiocyanat với acid amin

Glycin ethyl ester thiocyanat kết hợp với acid amin, đun hồi lưu trong cloroform trong 4 giờ được dẫn chất thế ở vị trí 3 của uredoacetic ethyl ester,

sau đó đun hồi lưu trong ethanol/acid hydrochloric (nồng độ 10N, tỷ lệ 1:1) thu được 2-thiohydantoin có nhóm thế ở vị trí 3 như mong muốn [36]

R O

H N

O

H N R S

1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin

Công thức cấu tạo 2-thiohydantoin (2-thioxoimidazolidin-4-on) như sau:

HN NHS O

Từ cấu trúc phân tử 2-thiohydantoin cho thấy nhiều khả năng phản ứng chuyển hóa để tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau của 2-thiohydantoin [11], [22], [36]… Các phản ứng thực hiện theo hướng chính sau:

O C

H R OH

HN NHS

O C

H R

Phản ứng ngưng tụ có thể thực hiện ở các điều kiện khác nhau: dưới điều kiện phản ứng với aldehyd thơm, xúc tác natri acetat, acid acetic băng [20], [35]; ngưng tụ với các aldehyd thơm, xúc tác ethanolamin/EtOH [22], [24], xúc tác piperidin/EtOH [13], dưới điều kiện vi sóng [25]…

Về cơ chế phản ứng Knoevenagel [2], [23]

Phản ứng ngưng tụ các aldehyd thơm và một số hợp chất dị vòng chứa nhóm aldehyd với 2-thiohydantoin xảy ra theo cơ chế phản ứng Knoevenagel tương tự như với các hợp chất có nhóm methylen hoạt động khác

Với xúc tác ethanolamin là amin bậc 1, có thể trình bày cơ chế phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với 2-thiohydantoin theo cơ chế Knoevenagel theo các bước sau:

- Aldehyd thơm ngưng tụ với ethanolamin tạo arylidenimin:

H C

HN NO

S

R

HN NHO

S

HN NHO

S

NH2HOH2CH2C H

S

O H

C Ar N

H

NH S

O H

C Ar NH

H

HO(H2C)2+ H2O

- OH

- Hợp chất trung gian tách amin tạo thành hợp chất thiohydantoin

S

O H

C Ar NH

Nhóm methylen ở vị trí 5 của 2-thiohydantoin rất hoạt động, nguyên tử

H ở đây dễ dàng tách khỏi carbon (khi có xúc tác base) và anion (II) được tạo thành là một tác nhân ái nhân mạnh:

N H

NH S

O

N H

NH S

O

(II)

nhóm carbonyl của aldehyd tạo sản phẩm cộng hợp (IV):

HC N H

NH S

O H CH Ar O

N

NH S

O H HC Ar

O (IV)

H

NH S

O H HC Ar OH (V)

+

- Giai đoạn ngưng tụ loại nước:

N H

NH S

NH CH

Ar

O

S (V)

NH C

H Ar

N H

NH O

O Ar-CHO

1 23 4 5

N H

NH O

O

1 3 4 5

Ar

+

- H2O AcOH, AcONa

Phương pháp của Wheeler và Hoffman được sử dụng để tổng hợp nhiều dẫn chất thế ở C-5 của hydantoin Một nhược điểm của phương pháp trên là phải sử dụng một lượng lớn acid acetic và natri acetat

Năm 1992, Chazeau V., và cộng sự [39] đã xây dựng qui trình tổng hợp một số dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin dựa trên nghiên cứu của Wheeler

và Hoffman

ethanolamin để tiến hành phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với hydantoin trong dung môi là hỗn hợp nước:ethanol (1:1), phản ứng tiến hành ở nhiệt độ hồi lưu trong 4 giờ Tác giả đã sử dụng một số aldehyd thơm (p-clorobenzaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-hydroxybenzaldehyd, ), hiệu suất phản ứng 44-89%

O O

R = Alkyl, alkoxy (-OR), -NR, -OH, -X, -CN, -CF3, -NO2

1.2.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất base Mannich

Phản ứng Mannich là phản ứng aminomethyl hóa các hợp chất hữu cơ có nguyên tử H linh động bằng tác dụng của formaldehyd (hoặc các aldehyd khác) và các amin bậc 1, amin bậc 2 hoặc amoniac [23], [32]

Trong môi trường acid, phản ứng xảy ra qua hai bước theo cơ chế sau:

- Bước 1: Amin phản ứng với formaldehyd tạo dẫn chất hydroxymethyl, dẫn xuất này gắn proton và loại một phân tử nước để tạo ra cation aminomethyl:

+ Trường hợp hợp chất có hydro linh động có thể tạo enol (hydro linh động nằm bên cạnh nhóm carbonyl của phân tử) thì cation aminomethyl là tác nhân ái điện tử tấn công vào liên kết đôi C=C của dạng enol tạo ra hợp chất chứa nhóm aminomethyl (base Mannich):

- H+

+ Trường hợp hợp chất có hydro linh động không có khả năng enol hóa (như trường hợp hydro linh động ở các liên kết N-H, S-H, Se-H, P-H hoặc ở liên kết C-H ở nhân indol, pyrol…) thì cation aminomethyl tấn công vào nguyên tử mang H linh động tạo ra sản phẩm base Mannich:

- H+

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi

2.2 Thiết bị thí nghiệm

- Dụng cụ thủy tinh (bình cầu 3 cổ dung tích 100ml, 250ml, 500ml, sinh hàn, ống đong, cốc có mỏ các loại, bình lọc hút… )

- Dụng cụ sứ (phễu buchner)

- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật)

- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)

- Bơm hút chân không VRL mode 200-7.0 (Mỹ)

- Máy cất quay Büchi R-210 (Thụy sỹ)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Tủ sấy chân không Shellab (Đức)

- Máy khuấy từ và bếp đun IKA-RCT (Đức)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ)

- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer, tại Phòng Hóa vật liệu, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

trên máy AVANCE, Bruker AV500 tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng (LC/MS) ghi trên máy LS-MSD-Trap-SL tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp 2-thiohydantoin

- Tổng hợp và xác định cấu trúc dẫn chất 5-(4‟-clorobenzyliden)-

2-thiohydantoin và một số dẫn chất base Mannich

- Thử hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư người của các chất tổng hợp được

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tổng hợp 2-thiohydantoin, thiohydantoin và dẫn chất base Mannich

5-(4’-clorobenzyliden)-2 Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến

- Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được

- Dùng SKLM để theo dõi phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được theo phương pháp SRB [17]

Nguyên tắc:

Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót

của tế bào Tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng

Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành aminoxanthin có màu hồng, được các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu Càng nhiều tế bào sống, sự hấp thu càng nhiều Các tế bào sống, sau đó được cố định Định lượng các chất màu được tế bào hấp thu bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 495-515 nm Từ đó tính được số lượng tế bào sống sót Phương pháp này hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National

Cancer Institution - NCI)

Dòng tế bào thử nghiệm:

3 dòng tế bào:

- Dòng tế bào MCF-7 (tế bào ung thư vú)

- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan)

- Dòng tế bào PC3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt)

vi lượng 96 giếng đối với phương pháp SRB

- Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử

huy tác dụng

b/ Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp SRB [28]

trong 1 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước và để khô tự nhiên

- Thêm 50 μl dung dịch sulphorhodanin B (SRB) vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy, nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Rửa sạch dung dịch sulphorhodanin B (SRB) dư bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần

- Hoàn trả sulphorhodanin B đã được nhuộm vào tế bào Lắc kỹ để hòa tan hoàn toàn

- Đọc mật độ quang ở bước sóng 492-515 nm Mật độ quang sẽ phản ánh

số lượng tế bào sống sót

d Tính kết quả

* Tính tỷ lệ tế bào sống sót (giá trị CS)

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng Dựa trên kết quả đo được của chứng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức sau:

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên được đưa vào tính toán

lần theo công thức của Ducan như sau

Độ lệch tiêu chuẩn  =  ( xi - x )2

n - 1

* Tính giá trị IC 50

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS<50%) sẽ được chọn ra để thử

Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tổng hợp hóa học

Trong khóa luận này chúng tôi tiến hành tổng hợp clorobenzyliden)-2-thiohydantion và một số dẫn chất base Mannich của nó bao gồm các công việc sau:

5-(4‟ Tổng hợp 25-(4‟ thiohydantoin bằng phản ứng giữa glycin và

O Glycin 1-acetyl-2-thiohydantoin (A) 2-thiohydantoin (BT)

- Tổng hợp dẫn chất 5-(4‟-clorobenzyliden)-2-thiohydantion (I) bằng phản ứng ngưng tụ 2-thiohydantoin (BT) với 4-clorobenzaldehyd theo sơ đồ

S

I

N H NH O

S +

BT

- Tổng hợp các dẫn chất base Mannich của

5-(4‟-clorobenzyliden)-2-thiohydantion (I) bằng phản ứng giữa 5-(4‟-clorobenzyliden)-2-5-(4‟-clorobenzyliden)-2-thiohydantion

với aldehyd formic và các amin theo sơ đồ phản ứng:

Cl CH

N H NH O

CH3O

1 5 3 4 2

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 46,00g (0,613mol) glycin, 46,60g (0,613mol) amoni thioacetat, thêm 174 ml anhydrid acetic, đun cách dầu và khuấy đều hỗn hợp phản ứng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với dung môi khai triển là

thúc phản ứng, hỗn hợp được rót vào 500 ml nước đá, để lạnh trong 4 giờ

Chất rắn màu vàng xuất hiện được lọc, rửa bằng nước lạnh 3 lần, mỗi lần 150ml

Khối lượng sản phẩm: 59,27g Hiệu suất: 61,09%

(phù hợp với tài liệu tham khảo [14])

H N S

O

1 2

3 4 5

Tiến hành:

59,27g (0,375mol) chất A được phân tán trong 294ml HCl 10% Đun hồi

lưu trong vòng 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai

phản ứng và lọc nóng Dịch lọc được để lạnh qua đêm, thu được kết tủa, lọc tủa, rửa nước đến hết acid (thử bằng giấy quỳ) Sấy khô tủa thu được Kết tinh lại trong nước

Khối lượng sản phẩm: 19,12g chất rắn màu cam Hiệu suất: 43,99%

1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): xem phụ lục 2.2, bảng 3.2

2

4 1

3 5 1'

2' 3' 4' 5' 6'

Dựa trên những tài liệu tham khảo, chúng tôi tổng hợp

5-(4‟-clorobenzyliden)-2-thiohydantion (I) theo 2 phương pháp:

- Phương pháp A: dùng xúc tác ethanolamin trong dung môi ethanol

theo qui trình của tác giả János Marton và cộng sự [22]

Tiến hành:

Cho vào bình cầu phản ứng 1,16g (0,010mol) chất BT, 10ml EtOH, khuấy đều thu được hỗn hợp (a) Cân 1,41g (0,010mol) 4-clorobenzaldehyd

và hòa tan bằng 10ml EtOH trong cốc có mỏ, sau đó thêm 0,9ml ethanolamin

thu được hỗn hợp (b) Thêm từ từ từng giọt (b) vào bình phản ứng (a), sau đó

thêm 20ml EtOH, khuấy đều ở nhiệt độ phòng 15 phút Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 30 phút Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi

mỏ, để kết tinh trong tủ lạnh qua đêm Chất rắn được lọc hút kiệt, rửa tủa bằng EtOH lạnh, rửa tiếp bằng nước nóng, sau đó rửa lại bằng EtOH lạnh Sấy khô sản phẩm thô thu được Kết tinh lại sản phẩm thô bằng EtOH/DMF (17:1)

Khối lượng sản phẩm: 1,77g chất rắn màu cam Hiệu suất: 74,21%

Nhận xét: Sản phẩm có điểm chảy thấp hơn tài liệu [22] và sắc ký lớp

mỏng có vết phụ

- Phương pháp B: dùng xúc tác natri acetat trong dung môi acid acetic

theo qui trình tác giả Chazeau V., và cộng sự [39]

Tiến hành:

Cho vào bình cầu phản ứng 1,16g (0,010mol) chất BT, 1,41g (0,010mol)

4-clorobenzaldehyd, 3,77g (0,0460mol) natri acetat khan và 22ml acid acetic băng Khuấy đều cho hỗn hợp tan hoàn toàn và đun nóng hỗn hợp, đun hồi

MeOH (14:1) Xác định thời gian phản ứng là 2 giờ Để nguội, đổ hỗn hợp ra cốc có mỏ, ngâm lạnh 15 phút sau đó để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Lọc hút kiệt, rửa tủa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi hết acid acetic (thử bằng giấy quỳ) Rửa tiếp vài lần bằng cồn lạnh Sấy khô sản phẩm thô thu được Kết tinh lại sản phẩm thô bằng EtOH/DMF (4:1)

Khối lượng sản phẩm: 1,72g chất rắn màu vàng Hiệu suất: 72,12%

Nhận xét: Phương pháp B cho sản phẩm tinh khiết bằng SKLM, điểm

chảy trùng với số liệu trong tài liệu [22], nên chúng tôi lựa chọn phương pháp

B làm mẻ lớn để tạo nguyên liệu đầu

Mẻ lớn: Dùng 6,96g (0,060mol) chất BT, 8,43g (0,060mol)

4-clorobenzaldehyd, 22,64g (0,276mol) natri acetat, 132ml acid acetic băng Thu được 11,41g sản phẩm Hiệu suất 79,73%

ESI - MS, (m/z, %): xem phụ lục 3.4, bảng 3.5

3.1.3 Tổng hợp một số dẫn chất base Mannich của 2-thiohydantion (Ia-c)

5-(4’-clorobenzyliden)-Trong phần tổng quan, chúng tôi đã trình bày về phản ứng Mannich Căn

cứ trên các kết quả nghiên cứu đã công bố, chúng tôi chọn điều kiện tiến hành

phản ứng Mannich của 5-(4‟-clorobenzyliden)-2-thiohydantion (I) là nhiệt độ

Chúng tôi tiến hành tổng hợp một số dẫn chất Mannich của chất I bằng cách cho chất I tác dụng với formaldehyd và 3 amin (morpholin, piperidin, N-

methylpiperazin)

Quy trình tổng hợp chung:

Cho vào bình phản ứng 0,0025 mol chất I, thêm 15ml EtOH, khuấy ở

nhiệt độ phòng cho phân tán đều trong 15 phút Cho tiếp 0,0025 mol

khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Sau đó đun cách thủy nâng dần nhiệt độ

sóng 254 nm Sau 2-3 giờ phản ứng đạt tối ưu Đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc

có mỏ, để nguội đến nhiệt độ phòng, để tủ lạnh trong 24 giờ Sau đó cạo thành cốc thật kỹ để tạo tủa tốt Lọc hút, rửa tủa bằng EtOH lạnh thu được sản phẩm

C trong tủ sấy chân không trong 3h thu được sản phẩm

Sau đây là các trường hợp cụ thể:

1) 5-(4’-clorobenzyliden)-3-morpholinomethyl-2-thiohydantoin (Ia)

Công thức

Cl CH

N H N O

S

1 2

4 3 N O

2' 1'

5' 4'

3'

6'

5''

2'' 1''

3'' 4''

6''

Tiến hành:

0,60g (0,0025mol) chất I, 0,21ml formol (0,0025mol formaldehyd),

0,22g (0,0025mol) morpholin, 17ml hỗn hợp EtOH/DMF (17:1), 3 giọt acid acetic băng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển

S

1 2

4 3 N

2' 1'

5' 4'

3'

6'

1''

3'' 2''

0,60g (0,0025mol) chất I, 0,21ml formol (0,0025mol formaldehyd),

0,21g (0,0025mol) piperidin, 17ml hỗn hợp EtOH/DMF (17:1), 3 giọt acid acetic băng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển

MeOH/H2O (5:2) Đun hồi lưu trong vòng 2 giờ, kết tinh lại trong 12ml EtOH

Sản phẩm thu được là 0,28g chất kết tinh màu vàng Hiệu suất 33,38%

Công thức:

Cl CH

N H N O

S

1 2

4 3 N N2'

1'

5' 4'

5'' 6''

Tiến hành:

0,60g (0,0025mol) chất I, 0,21ml formol (0,0025mol formaldehyd),

0,25g (0,0025mol) N-methylpiperazin, 17ml hỗn hợp EtOH/DMF (17:1), 3 giọt acid acetic Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển

3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

(2D-NMR) được ghi trên máy phổ AVANCE Spectrometer AV500 (BRUKER,

Đức) trong dung môi DMSO-d6, chất chuẩn nội TMS tại Viện Hóa học - Viện

C được ghi ở các phụ lục 3.3 † 6.3 Kết quả phân tích

3.4

3.2.3 Phổ khối lượng

Các chất tổng hợp được ghi phổ khối lượng theo phương pháp phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy LC-MSD-Trap-SL, tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 4 phổ đồ được ghi ở các phụ lục 3.4 †

6.4 Kết quả phân tích phổ MS của 4 chất (I, Ia-c) được trình bày ở bảng 3.5

3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ

Thử hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư người được tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm-Viện Hóa học các hợp chất thiên

nhiên (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ