Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất 1 (2 mercapto 1,2,2,4 oxadiazol 5 YL) methyl 1h benzodimidazol

ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc bao tan ở ruột là dạng thuốc có khả năng hạn chế lượng thuốc giải phóng tại dạ dày do đó làm giảm kích ứng dạ dày và giảm sự phân hủy của thuốc, tăng cường tác dụng điều trị. Dạng thuốc bao tan ở ruột đã được áp dụng với nhiều dược chất khác nhau qua việc lựa chọn màng bao thích hợp. Việc lựa chọn loại polyme, chất hóa dẻo tương ứng và độ dày màng bao phù hợp sẽ giúp kiểm soát được sự giải phóng của dược chất tại dạ dày và ruột. Mặt khác, pellet là một dạng bào chế với kích thước hạt nhỏ, cầu, tương đối đồng đều thuận lợi để bao tan ở ruột sẽ giảm được dao động sinh khả dụng giữa các cá thể và tạo điều kiện giải phóng, hấp thu nhanh chóng dược chất tại ruột non so với dạng viên nén. Khi bào chế dạng pellet bao tan ở ruột sẽ kết hợp được ưu điểm 2 dạng bào chế trên. Aspirin là một dược chất thuộc nhóm NSAIDs được sử dụng từ những năm đầu của thế kỷ 20 svới tác dụng là hạ sốt, giảm đau, chống viêm; gần đây có rất nhiều bằng chứng về tác dụng chống huyết khối, giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim thứ phát và đột quỵ trên bệnh nhân có tiền sử về bệnh này 13, 33, 39. Tuy nhiên, aspirin ít tan trong nước đồng thời rất dễ bị thủy phân, quá trình được xúc tác bởi nhiệt và ẩm. Đồng thời, aspirin và sản phẩm thủy phân của nó có tính acid mạnh dễ gây kích ứng đường tiêu hóa. Vì vậy, gần đây, aspirin đã được nghiên cứu lựa chọn tập trung vào bao tan ở ruột, tuy nhiên chủ yếu vẫn tập trung ở dạng thuốc viên nén 19, 30 12 9, 15, 31 24. Các nghiên cứu về pellet aspirin bao tan ở ruột lại chưa được nghiên cứu và công bố nhiều. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế pellet aspirin bao tan ở ruột” với mục tiêu: 1. Xây dựng công thức bào chế pellet aspirin có tỉ lệ tạp phân hủy thấp 2. Xây dựng công thức màng bao tan ở ruột cho pellet aspirin

ĐẶNG MẠNH CƯỜNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT

1-[(2-MERCAPTO-1,3,4-OXADIAZOL-5- BENZO[d]IMIDAZOL

YL)METHYL]-1H-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2014

ĐẶNG MẠNH CƯỜNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT 1-[(2-MERCAPTO-1,3,4-OXADIAZOL-5-

BENZO[d]IMIDAZOL

YL)METHYL]-1H-KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Do đó, tôi cần phải cảm ơn rất nhiều người tuyệt vời vì sự cống hiến quý báu của họ trong việc hoàn thành đề tài khóa luận này

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn

Đình Luyện, Ths Phạm Thị Hiền những người đã nhiệt tình hướng dẫn, cho tôi những

lời khuyên quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược đặc biệt

là Ths Nguyễn Văn Giang, TS Nguyễn Văn Hải và CN Phan Tiến Thành của tổ môn

Tổng hợp Hóa dược đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học – Viện Công nghệ Sinh học của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ môn Vi Sinh - Sinh học - Trường Đại học Dược Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô trong trường, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, tôi xin chân thành cảm ơn!

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến bố mẹ và bạn bè - những người luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập!

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Đặng Mạnh Cường

1.3.1 Đóng vòng tạo nhân 1H-benzo[d]imidazol và các dẫn chất _ 13

1.3.2 Đóng vòng tạo dẫn chất 1,3,4-oxadiazol 15 1.3.3 Phản ứng alkyl hóa 16 1.4 Lựa chọn hướng tổng hợp và thử tác dụng sinh cho đề tài _ 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU _ 18

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 18 2.1.1 Hóa chất và dung môi 18 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ đã sử dụng trong thực nghiệm 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết _ 21 2.3.2 Xác định cấu trúc _ 22 2.3.3 Thử tác dụng sinh học 22

3.4 Thử tác dụng sinh học _ 34 3.4.1 Thử hoạt tính kháng khuẩn 34 3.4.2 Thử hoạt tính kháng nấm _ 36 3.4.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào _ 38 3.5 Bàn luận 41 3.5.1 Về tổng hợp hóa học _ 41 3.5.2 Về xác định cấu trúc của các hợp chất trung gian và sản phẩm 42 3.5.3 Về tác dụng sinh học _ 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT _ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO _ 46

A549 Dòng tế bào ung thư phổi

ACN Acetonitril

ATTC American Type Culture Collection

BuOH n-Butanol

CTCT Công thức cấu tạo

EC50 Nồng độ tác dụng 50% (Half maximal effective concentration) ECA Ethylcloroacetat

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

LU-1 Dòng tế bào ung thư phổi

MCF7 Dòng tế bào ung thư vú

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration)

MS Phổ khối (Mass spectroscopy)

MT Môi trường

MTCC Microbial Type Culture Collection

Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor)

T0nc Nhiệt độ nóng chảy

TLC Sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatography)

VSV Vi sinh vật

ν Dao động hóa trị

Bảng 1.1 MIC (μg/ml) của các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang

khung oxadiazol trong nghiên cứu của Desai N C

8

Bảng 1.2 Một số dẫn chất trong nghiên cứu của Shadia A G 9 Bảng 1.3 MIC(μg/ml) của các dẫn chất trong nghiên cứu của Patel R V 12 Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất 18 Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị, dụng cụ 19 Bảng 2.3 Công thức các chất dự kiến tổng hợp được 20 Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học 29 Bảng 3.2 Rf và t0nc của 6 chất tổng hợp được 30 Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của 3, 4, 4a, 4b 31 Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng của 4, 4a, 4b 32 Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-

NMR của 3, 4, 4a, 4b

32

Bảng 3.6 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn 36 Bảng 3.7 Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư LU-1 40 Bảng 3.8 Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF7 40

Hình 1.2 Các phân tử sinh học có cấu trúc “6+5” 2 Hình 1.3 Các ví dụ về tác dụng sinh học của dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol 3 Hình 1.4 Các dẫn chất benzo[d]imidazol được tổng hợp bởi Ansari 3 Hình 1.5 Công thức cấu tạo các chất trong nghiên cứu của

Hình 1.6 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Afaf H El 5 Hình 1.7 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol trong nghiên cứu của

Hình 1.8 Công thức cấu tạo các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung

oxadiazol trong nghiên cứu của Desai N C 7

Hình 1.9 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Patel R V 11 Hình 1.10 Công thức cấu tạo các dẫn chất trong nghiên cứu của

vi sinh, hóa sinh, bào chế, hóa dược…, trong đó tổng hợp hóa dược luôn giữ vai trò rất quan trọng

Hướng nghiên cứu và phát triển thuốc mới dựa vào thuốc sẵn có hoặc các chất

có tác dụng sinh học đáng kể đang chiếm một tỉ lệ chủ yếu trong ngành tổng hợp hóa dược

Không nằm ngoài sự phát triển chung đó, nhiều công trình nghiên cứu gần đây

đã cho thấy các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol là nhóm hợp chất dị vòng có tác dụng

sinh học đa dạng như: kháng khuẩn, kháng nấm, diệt virus, chống ung thư, chống lao, chống co giật… [7, 13]

Với những triển vọng khả quan đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tổng

hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-1H-benzo[d]imidazol” với các mục tiêu sau:

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Khái quát chung về 1H-benzo[d]imidazol và dẫn chất

1H-benzo[d]imidazol là một hợp chất hóa học thơm, có cấu trúc là một hệ vòng

bicyclic, bao gồm vòng benzen 6 cạnh kết hợp với dị vòng 5 cạnh imidazol

Hình 1.1 Cấu trúc vòng 1H-benzo[d]imidazol

Cấu trúc “6+5” này đã được biết đến trong công thức cấu tạo của purin Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng trong số các hợp chất mang cấu trúc này, có rất nhiều thành phần quen thuộc, đồng thời là phân tử sinh học quan trọng như adenin, guanin,

2 trong số 4 acid nucleic, acid uric và cafein

Hình 1.2 Các phân tử sinh học có cấu trúc “6+5”

Như vậy, từ cấu trúc cơ bản này, có thể dự đoán các hoạt tính sinh học của benzo[d]imidazol và các dẫn chất Các nghiên cứu thực tế đã chứng minh các tác

1H-dụng kháng khuẩn, kháng nấm, diệt kí sinh trùng, chống ung thư, chống viêm của

1H-benzo[d]imidazol và các dẫn chất [7, 13, 16, 29]

Hình 1.3 Các ví dụ về tác dụng sinh học của dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol:

Kháng khuẩn, kháng nấm: a Chống viêm: b Chống khối u: c

1.2 Tổng quan về tác dụng sinh học của 1H-benzo[d]imidazol

1.1.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Năm 2009, Ansari cùng cộng sự đã tổng hợp được một số dẫn chất

1H-benzo[d]imidazol mang khung oxadiazol (1a÷1l), các dẫn chất này đều thể hiện hoạt

tính kháng khuẩn tốt với vi khuẩn Gram(+) và hoạt tính yếu với vi khuẩn Gram(-), một số có hoạt tính trung bình với các chủng nấm [9]

Hình 1.4 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol được tổng hợp bởi Ansari

Các chất tổng hợp được thử tác dụng ức chế in vitro vi sinh vật theo phương

pháp pha loãng liên tiếp Tác dụng kháng khuẩn được thử với 3 dòng Gram(+):

Staphylococcus aureus ATCC 29213, Bacillus subtilis MTCC 121, Streptococcus

mutans MTCC 890 và 3 dòng vi khuẩn Gram(-) là: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa MTCC 741, Salmonella typhi MTCC733 Ciprofloxacin

và ampicillin được sử dụng làm thuốc đối chiếu Trong khi đó tác dụng chống nấm

được thử với nấm: Candida albicans MTCC 1637, Aspergillus niger, Aspergillus

flavus

Kết quả được đánh giá qua nồng độ ức chế tối thiểu, và cho thấy các chất đều

có tác dụng kháng khuẩn tốt với MIC<64 𝜇g/ml, trong đó phải kể đến là chất

{[5-(4-clorophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-2-methyl-1H-benzo[d]midazol (1g) và chất {[5-(4-methoxyphenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (5k)

1-(MIC= 2 𝜇g/ml đối với S aureus) Hầu hết các chất đều cho tác dụng tốt với vi khuẩn

Gram(+), tuy vậy lại không có chất nào có tác dụng với E coli cũng như P

aeruginosa và S typhii Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các dẫn chất có chứa nhóm thế

ở vị trí para trên vòng benzen có tác dụng tốt hơn so với các chất còn lại

Đối với tác dụng kháng nấm, các chất 1a, 1g, 1l, 1k cho tác dụng tốt hơn với

nấm C albicans Bên cạnh đó, các chất còn lại ít có tác dụng đối với A niger và A

flavus

Cũng trong năm 2009, Vijgayaraghavan S và cộng sự đã nghiên cứu và thử

tác dụng sinh học của một số dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol Kết quả các hợp chất

2a, 2c, 2d có tác dụng tốt chống lại vi khuẩn Staphylococcus aureus, đặc biệt hợp

chất 2f có tác dụng khá mạnh Các hợp chất 2b, 2e, 2g cho tác dụng trung bình trên

các dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Pseudomonas

aeruginosa Tuy vậy, tất cả các hợp chất được thử đều không có tác dụng chống lại

E coli Nghiên cứu cũng cho thấy vai trò quan trọng của nhân thơm trên vòng

oxadiazol trong tác dụng kháng khuẩn [27]

Hình 1.5 Công thức cấu tạo các dẫn chất trong nghiên cứu của

Vijgayaraghavan S

Năm 2000, Afaf H El cùng cộng sự đã tiến hành tổng hợp và thử tác dụng

của các dẫn chất 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol trên các chủng vi khuẩn Gram(+):

Bacillus cereus, Gram(-): Escherichia coli, nấm men: Saccharomyces cerevisae và

nấm mốc: Aspergillus niger, thực hiện theo phương pháp khuếch tán trên thạch với

thuốc đối chiếu là gentamycin và ampicillin

Hình 1.6 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Afaf H El

Kết quả cho thấy 3a là chất có hoạt động rất mạnh chống lại vi khuẩn Bacillus

cereus, nhưng có tác dụng yếu trên Escherichia coli Hợp chất 3c hoạt động tốt chống

lại Bacillus cereus, trong khi hợp chất 3b, 3d chỉ có tác dụng yếu trên Bacillus cereus

Nhưng tất cả hợp chất đã được thử nghiệm cho thấy không có tác dụng chống lại

Saccharomyces cerevisae và Aspergillus niger [6].

Năm 2012, nghiên cứu của Salahuddin cùng cộng sự trong việc tổng hợp và

đánh giá tác dụng sinh học các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol mang khung benzo[d]imidazol trên các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

1H-và nấm men Candida albicans, Aspergillus flavus, thực hiện theo phương pháp

khuếch tán trên thạch (ofloxacin và ketoconazol được dùng làm thuốc đối chiếu) [21]

Hình 1.7 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol trong nghiên cứu của Salahuddin

Kết quả thu được cho thấy hầu hết các hợp chất đều có tác dụng kháng khuẩn,

trong đó các chất 4d, 4f, 4h có tác dụng mạnh nhất chống lại vi khuẩn E coli ở nồng

độ 100 μg/ml, các hợp chất 4d, 4f, 4l hoạt động tốt chống lại S aureus cũng ở nồng

độ này

Về khả năng chống nấm, các chất tổng hợp 4d, 4f, 4l có hoạt tính mạnh nhất

chống lại nấm A flavus và C albicans ở nồng độ 100 μg/ml

Thí nghiệm cho thấy các hợp chất có các nhóm thế hút điện tử: -NO2; -Br; -Cl

trên vòng oxadiazol đều không cho tác dụng với E coli và S aureus, ngược lại với

nhóm thế -CH3 lại có tác dụng mạnh nhất Thêm vào đó nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dẫn chất có chứa nhóm thế -Cl, -NO2, -Br, -CH3 trên vòng oxadiazol cho tác dụng rất

khả quan trên chủng nấm A flavus và C albicans

Gần đây nhất, năm 2014, Desai N C cùng Kotadiya G M đã tổng hợp được

một số dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung 1,3,4-oxadiazol, đồng thời thử tác dụng ức chế sinh vật in vitro theo phương pháp pha loãng Tác dụng kháng khuẩn được thử với 2 dòng vi khuẩn Gram(+): Staphylococcus aureus MTCC 96,

Staphylococcus pyogenes MTCC 442, 3 dòng vi khuẩn Gram(-): Escherichia coli

MTCC 443, Pseudomonas aeruginosa MTCC 1688 Tác dụng kháng nấm được thử với 3 dòng: Candida albicans MTCC 227, Aspergillus niger MTCC 282, Aspergillus

clavatus MTCC 1323 Chất đối chiếu được dùng là cloramphenicol và griseofulvin

Đánh giá các dẫn chất tổng hợp cho kết quả khả quan Đặc biệt với vi khuẩn

E coli và nấm A clavatus, dẫn chất 5h cho MIC rất thấp, lần lượt là 6,25 μg/ml và

12,5 μg/ml, thấp hơn chất đối chiếu rất nhiều lần (với cloramphenicol có MIC=50 μg/ml, griseofulvin có MIC=100μg/ml) Nghiên cứu về liên quan định lượng giữa cấu trúc đến tác dụng (QSAR – quantitative structure activity relationship) cho thấy mật độ điện tử trên vòng benzen đính kèm dị vòng oxadiazol và vị trí các nhóm thế

là yếu tố quan trọng liên quan đến tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Các hợp chất

5b, 5c, 5d, 5g, 5h với nhóm thế hút điện tử (nitro, fluoro) cho thấy hoạt tính kháng

khuẩn, kháng nấm mạnh, trong đó tác dụng sinh học mạnh nhất khi các nhóm thế này

ở vị trí para hoặc meta 5d, 5h [11]

Hình 1.8 Công thức cấu tạo các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung

oxadiazol trong nghiên cứu của Desai N.C

Bảng 1.1 MIC(μg/ml) của các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung

oxadiazol trong nghiên cứu của Desai N C

Hợp

chất R S a S p E c P a C a A n A c 5a H 500 250 500 500 1000 500 500

S a: Staphylococcus aureus MTCC 96, S p: Staphylococcus pyogenes MTCC

442

E c: Escherichia coli MTCC 443, P a: Pseudomonas aeruginosa MTCC 1688

C a: Candida albicans MTCC 227, A n: Aspergillus niger MTCC 282,

A c: Aspergillus clavatus MTCC 1323

1.1.2 Tác dụng diệt virus

Năm 2013, Reyila W và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng ức chế

coxsackievirus B3 (CVB3) và coxsackievirus B6 (CVB6) của các dẫn chất thế ở vị trí

1, 4, 5 trên nhân 1H-benzo[d]imidazol với các nhóm thế là các dị vòng như:

1,3,4-oxadiazol; 1,3,4-thiadiazol; 1,2,4-triazol; 2’-pyridyl …

Kết quả cho thấy các dẫn chất đều có tác dụng diệt virus, trong đó các dẫn chất

có nhóm thế ở vị trí 4, 5 trên nhân 1H-benzo[d]imidazol cho tác dụng rất tốt, với

CBV3: IC50 < 10μg/ml, với CBV6: IC50 < 13μg/ml, tốt hơn nhiều khi so sánh với chất đối chiếu có IC50 = 384,90 μg/ml Thêm vào đó, nổi bật lên là dẫn chất 6a có hoạt

tính rất cao (với CBV3: IC50= 1,08 μg/ml, CBV6: IC50= 3,25 μg/ml), và chọn lọc (EC50 lần lượt là 66,67 và 61,7) Như vậy, đây là một tác nhân mới rất mạnh, ít có tác dụng có hại lên lên tế bào chủ [20]

1.1.3 Tác dụng chống ung thư

Năm 2012, Shadia A G cùng cộng sự đã tổng hợp và đánh giá hoạt tính gây

độc tế bào của 17 dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang vòng oxadiazol Nghiên cứu

cụ thể trên hai dòng tế bào MCF7 (dòng tế bào ung thư vú) và A549 (dòng tế bào ung thư phổi) theo phương pháp của Alamar Blue

Bảng 1.2 Một số dẫn chất trong nghiên cứu của Shadia A G

Những kết quả nghiên cứu cho thấy hầu hết các dẫn chất

5-thio-1,3,4-oxadiazol-2-yl ở vị trí số 5 của vòng 1H-benzo[d]imidazol đều có tác dụng gây độc

tế bào Các dẫn chất 7a, 7c-7e, 7h-7j cho tác dụng trung bình và dẫn chất 7i cho tác

dụng tốt ức chế sự phát triển của cả hai dòng tế bào ung thư MCF7 và A-549 (IC50

lần lượt là 1,2μg/ml và 1,9μg/ml) [23]

Năm 2012, tại học viện Hamdard, Mohd R cùng cộng sự đã tổng hợp thành

công và thử tác dụng chống ung thư của 25 dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang

khung 1,3,4-oxadiazol Tất cả các dẫn chất đã được nghiên cứu tác dụng chống ung

thư với 60 dòng tế bào Trong đó dẫn chất 8a cho hoạt động chống ung thư là tốt nhất

Liên quan định lượng giữa cấu trúc đến tác dụng (QSAR – quantitative structure activity relationship), nghiên cứu cho thấy vai trò quan trọng của các nhóm đẩy điện

tử (-NH2, -2-Cl, -2,4-diCl-) trên vòng phenyl ở vị trí số 5-oxadiazol trong tác dụng chống ung thư Còn các nhóm thế trên methyl như: -N(C2H5)2, -O-C6H5 ở vị trí số 5-oxadiazol làm cải thiện hoạt tính chống ung thư Các nhóm thế hút điện tử như -COOH, -C=O không cho thấy vai trò rõ ràng của mình [17]

1.1.4 Tác dụng chống lao

Năm 2012, Patel R V cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và thử tác dụng

kháng vi khuẩn lao H37Rv với 22 dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol tổng hợp được Dưới

đây là các dẫn chất thuộc nhóm này:

Hình 1.9 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Patel R V

Kết quả nghiên cứu tác dụng in vitro ức chế sự phát triển vi khuẩn lao H37Rv của các hợp chất theo phương pháp Lowensteine Jensen được tổng hợp ở bảng sau

Nghiên cứu cho thấy chất 9i có triển vọng cao, trong khi các chất 10d, 10i, 9c cho tác

dụng trung bình, các dẫn chất còn lại cho tác dụng yếu [19]

Bảng 1.3 MIC(μg/ml) của các dẫn chất trong nghiên cứu của

OC2H5 9j 50 10j 50 NHCOCH3 9k 100 10k 50

1.1.5 Tác dụng chống co giật

Năm 2010, Shingalapur R V và cộng sự đã tổng hợp thành công một số dẫn

chất 2-1H-benzo[d]imidazol và thử đặc tính chống co giật theo phương pháp Maxima

ElectroShock (thuốc đối chiếu là phenyltoin)

Hình 1.10 Công thức cấu tạo các dẫn chất trong nghiên cứu của

Shingalapur R V

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự tồn tại của nhóm kị nước, nhóm thế đẩy điện tử và liên kết hydro đóng vai trò cần thiết trong đặc tính chống co giật Liên quan định lượng giữa cấu trúc đến tác dụng (QSAR – quantitave structure activity relationship),

các hợp chất 11c, 11d, 11g, 11i mang nhóm thế hydroxy ở vị trí 2, 4 trên vòng phenyl

đều có tác dụng tốt, ngược lại khi thay thế nhóm hydroxy bằng nhóm cloro, methyl,

thì các hợp chất bị mất tác dụng hoàn toàn 11b, 11e [24]

1.3 Các phản ứng tổng hợp các dẫn chất

1.3.1 Đóng vòng tạo nhân 1H-benzo[d]imidazol và các dẫn chất

Nghiên cứu cho thấy hầu hết các phương pháp tổng hợp 1H-benzo[d]imidazol

và dẫn chất đều đi từ benzen với các nhóm thế của N2 ở vị trí ortho

1.3.1.1 Đi từ o-phenylendiamin

a) Phản ứng với acid carboxylic và các dẫn xuất

o-phenylendiamin phản ứng với hầu hết các acid carboxylic cho các dẫn chất

1H-benzo[d]imidazol tại vị trí C2 với hiệu suất rất tốt Hơn nữa, o-phenylendiamin

cũng phản ứng được với các dẫn xuất của acid carboxylic như các anhydrid, ester, amid… để tạo các hợp chất tương ứng [26]

b) Phản ứng với vòng lacton

Valerolacton được ngưng tự với o-phenylendiamin cho dẫn chất 1, methyltrimethyl) 1H-benzo[d]imidazol với hiệu suất thấp [14]

2-(1-c) Phản ứng với các nitril

Sử dụng phương pháp của Leonard cùng cộng sự để tạo ra dẫn chất benzo[d]imidazol với hiệu suất cao Phản ứng được thực hiện bằng cách trộn một tỷ

2-nitro-1H-lệ thích hợp các chất phản ứng trong môi trường EtOH-H2O, đun nóng ở nhiệt độ

700C trong vòng 1h [26]

d) Phản ứng với các aldehyd

Phản ứng giữa o-phenylendiamin và các aldehyd cần có chất oxy hóa làm xúc

tác, các chất oxy hóa thường dùng như: nitrobenzen, MnO2, KHSO3, benzoquinon, natri metasulfid, thủy ngân (I) oxyd, Cu (II) acetat [12]

Năm 2013, Vyankat A S và cộng sự đã nghiên cứu hiệu suất phản ứng với chất xúc tác cụ thể là silica- acid periodic, với những ưu điểm vượt trội như cho hiệu suất cao, phản ứng diễn ra nhanh và không gây ô nhiễm môi trường [28]

Hợp chất o-aminoazo được ngưng tụ với aldehyd để tạo các basơ nitơ, sau đó

các base nitơ này được chuyển dạng đồng phân (bằng cách đun sôi với acid acetic)

1.3.2.1 Phản ứng loại H 2 O của diacyhydrazin

Một trong những phương pháp phổ biến nhất của phản ứng này là sử dụng tác nhân phosphoryl clorid (tuy nhiên đã dần được thay thế do là chất rất độc), ngoài ra các tác nhân khác cũng hay được sử dụng như: acid sulfuric, acid phosphoric, acid trifluoroacetic, phosphoryl pentaclorid, thionyl clorid, phosphoryl pentoxid [10]…

1.3.2.2 Phản ứng oxy hóa đóng vòng từ N-acylhydrazon

Tác nhân được sử dụng nhiều là brom trong acid acetic Có thể thay thế tác nhân này bằng LiClO/MeCN [10]

1.3.2.3 Đóng vòng oxadiazol bằng phản ứng giữa acylhydrazid và carbon disulfid

Phản ứng xảy ra trong môi trường kiềm, dung môi phản ứng là EtOH [10]

1.3.2.4 Các phương pháp tổng hợp khác

Có thể kể đến một số phương pháp khác như tổng hợp một giai đoạn từ acid carboxylic và hydrazid sẵn có, phản ứng giữa hydrazid với orthoester hoặc đi từ tetrazol [10]

Alcol thường dùng để alkyl hóa các amin hoặc alcol khác Sản phẩm

là các amin hoặc ester

Các ester

của acid vô

cơ chứa oxy

Gồm các dialkyl sulfat, alkyl nitrat, alkyl phosphat, dialkyl carbonat Tác nhân được sử dụng nhiều nhất là dimethyl sulfat Tác nhân này có thể alkyl hóa nhóm –OH phenol trong môi trường kiềm,

nước, nước-alcol, thậm chí cả trong môi trường acid Các alkyl nitrat rất ít khi sử dụng vì dễ gây nổ

1.4 Lựa chọn hướng tổng hợp và thử tác dụng sinh cho đề tài

Như vậy, thông qua các tài liệu tham khảo được, chúng tôi nhận thấy rằng các

dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung 1,3,4-oxadiazol đều có nhiều các tác

dụng sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, chống co giật, diệt virus, chống lao…Tiếp nối các nghiên cứu đó, chúng tôi dự kiến tổng hợp các dẫn chất thế

của 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-1H-benzo[d]imidazol và thử tác

dụng kháng khuẩn, kháng nấm, gây độc tế bào của chúng

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Khóa luận đã sử dụng một số hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa Dược – Bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược

Hà Nội

2.1.1 Hóa chất và dung môi

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất STT Dung môi, hóa chất Nguồn gốc

2 Aceton nitril Merck-Đức

3 Acid acetic băng Merck-Đức

4 Acid hydrocloric đặc (37%) Trung Quốc

5 Acid hydrobromic Trung Quốc

6 Acid sulfuric Trung Quốc

7 Benzyl clorid Trung Quốc

8 Carbon disulfid Trung Quốc

10 Dicloroethan Trung Quốc

12 Ethyl acetat Trung Quốc

13 Ethyl cloroacetat Trung Quốc

14 Hydrazin hydrat Trung Quốc

15 Kali carbonat khan Trung Quốc

16 Kali hydroxyd Trung Quốc

18 Natri sulfat khan Trung Quốc

20 o-phenylendiamin Merck-Đức

21 p-N-acetylamionphenol (paracetamol) Việt Nam

22 Dung dịch amoniac (25%) Việt Nam

23 Tetrahydrofuran Merck-Đức

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ đã sử dụng trong thực nghiệm

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị, dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị Xuất xứ

7 Bộ lọc hút chân không Trung Quốc

8 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ nhạy 10-2 Thụy Sỹ

9 Cốc có mỏ 50mL, 100mL, 250mL Merk-Đức

15 Máy cất quay chân không Buchi R210 Thụy Sỹ

16 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ

17 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-500MHz Mỹ

18 Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer Mỹ

19 Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS - Xevo TQ Mỹ

20 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Merk-Đức

21 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc

22 Ống đong 25mL, 50mL Trung Quốc

26 Pipet chia vạch 1mL, 5mL, 10mL Merk-Đức

28 Sinh hàn hồi lưu Merk-Đức

2.2 Nội dung nghiên cứu

Tổng hợp các chất theo sơ đồ sau :

1-[(2-benzylsulfanyl-1,3,4-1H-benzo[d]imidazol (4a)

N-{4-[({2-[(2-methyl-1H-

benzo[d]imidazol-1-yl)methyl]-yl}sulfanyl)butoxy]phenyl}acetam

1,3,4-oxadiazol-5-id (4b)

Kiểm tra độ tinh khiết của 6 chất 1, 2, 3, 4, 4a, 4b bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc các chất 3, 4, 4a, 4b tổng hợp được bằng phổ hồng ngoại

IR, phổ khối lượng MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR

Thử tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn với các chất 3, 4, 4a, 4b

Thử tác dụng chống ung thư với chất 4a, 4b

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

Sử dụng phương pháp tổng hợp hóa học, dựa trên các phản ứng:

1 Phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol

2 Phản ứng thế N1 tạo ester ethyl (2-methyl-1H-benzo[d]imidazol)acetat

3 Phản ứng hydrazid hóa ethyl (2-methyl-1H-benzo[d]imidazol)acetat

4 Phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)]-2-methyl-1H-benzo[d]imidazol

5 Phản ứng mở vòng tetrahydrofuran

6 Phản ứng tách loại hydrobromid từ paracetamol và 1,4-dibrommobutan

7 Phản ứng S-alkyl hóa benzo[d]imidazol

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)]-2-methyl-1H-Dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi tiến triển của phản ứng, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt

2.3.2 Xác định cấu trúc

Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

 Phổ hồng ngoại (IR):

Tại phòng phân tích cấu trúc phân tử Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, các chất 3, 4, 4a, 4b đã được ghi phổ hồng ngoại (IR)

trên máy với kỹ thuật viên nén KBr ghi trong vùng 4000-400 cm-1 [1, 3]

 Phổ khối lượng (MS)

Tại phòng phân tích khối phổ của Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam các chất 4, 4a, 4b được ghi phổ khối lượng trên máy

LC/MS-Xevo TQ với chế độ đo ESI [4]

 Thử hoạt tính gây độc tế bào:

Tại Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt

Nam theo phương pháp của Monk (1991), hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI- National Cancer Institute)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN

LUẬN

3.1 Tổng hợp hóa học

Thông qua các tài liệu tham khảo và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)]-2-methyl-

1H-benzo[d]imidazol theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.1 Các giai đoạn tổng hợp các dẫn chất

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-1H-benzo[d]imidazol

Điều kiện phản ứng: a) acid acetic, HCl đặc, 45 phút; b) Ethyl cloroacetat, aceton

khan, K 2 CO 3 , 15h; c) hydazin hydrat, EtOH, 90 0 C, 4h; d) CS 2 , EtOH, 90 0 C, 5h; e) benzyl clorid, aceton, K 2 CO 3 , KI, 60 0 C, 2h; f) HBr, H 2 SO 4 , 3h ;g) acetonitril,

K 2 CO 3 , 60 0 C, 12h; h: aceton, K 2 CO 3 , KI, 60 0 C, 3h

3.1.1 Tổng hợp 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (1)

Sơ đồ phản ứng:

Sơ đồ 3.2 Tổng hợp 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (1)

Tiến hành:

Thêm 5,4g (0,05mol) o-phenylendiamin, 8,5ml dung dịch HCl đặc và 8,5ml

(0,09mol) acid acetic băng vào bình cầu 100ml Lắp sinh hàn và đun hồi lưu hỗn hợp trên trong 45 phút ở 1400C, kết hợp khuấy từ

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động ethylacetat: n-hexan= 7:2, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm

Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được đổ từ từ vào cốc có mỏ có chứa 50ml nước đá Sau đó, điều chỉnh về pH =7-8 bằng dung dịch ammoniac đặc trong điều kiện 0-100C, kết hợp khuấy từ Để lạnh hỗn hợp trong vòng 30 phút sẽ thu được tủa Lọc thu lấy tủa, sấy ở nhiệt độ 60-700C, rồi kết tinh lại trong cồn 10% Lọc qua phễu Buchner thu được tinh thể hình kim, rửa tinh thể 3 lần với 10ml, hút kiệt và sấy khô thu sản phẩm

Kết quả:

- Khối lượng: 4,63g (Hiệu suất 70,2%)

- Cảm quan: tinh thể hình kim màu trắng

Tiến hành:

Hòa tan hỗn hợp gồm 4,0g (0,03mol) 2-methyl-1H-benzo[d]imidazol và

20ml aceton khan trong bình cầu 100ml Thêm tiếp 4,0g K2CO3 khan, cuối cùng thêm

từ từ 3,2ml ECA (d= 1,1450g/ml) vào hỗn hợp trên Lắp dụng cụ làm khan có gắn CaO, sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12h Sau đó, đun hồi lưu hỗn hợp trên trong vòng 3h

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động cloroform: methanol= 9:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm

Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp phản ứng được lọc loại bỏ muối vô cơ, cất quay đến kiệt Cắn thu được hòa tan trong cồn tuyệt đối, tẩy màu bằng than hoạt Sau đó dịch lọc được cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm, kết tinh lại trong nước Lọc tủa rồi rửa bằng nước cất 3 lần với 10ml, hút kiệt và sấy ở nhiệt độ 600-700C thu sản phẩm rắn

Kết quả:

- Khối lượng: 4,20g (Hiệu suất 60,9%)

- Cảm quan: tinh thể màu trắng

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động n-BuOH: AcOH: H2O = 9:2:2,5, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm

Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được làm lạnh trong vòng 30 phút, xuất

hiện sản phẩm tủa (3) màu trắng, lọc qua phễu Bucher và rửa tủa 2 lần với 10ml nước

lạnh Sấy ở nhiệt độ 60-700C thu sản phẩm

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-methyl-1H-Sơ đồ phản ứng

Sơ đồ 3.5 Tổng hợp 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-methyl

-1H-benzo[d]imdazol (4)

Tiến hành:

Thêm 2,10g (9,76mmol)

2-(2-methyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)ethanhydrazid, 10ml EtOH tuyệt đối và 1,09g (19,5mmol) KOH vào trong bình cầu 100ml Thêm tiếp 3ml H2O, sau cùng nhỏ từ từ 0,61ml (9,76mmol) CS2 vào hỗn hợp phản ứng Lắp sinh hàn, đun hồi lưu trong 5giờ

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động n-butanol: methanol: nước = 10:1:3, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm

Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh hỗn hợp và trung hòa về pH= 5-6 bằng dung dịch acid hydrocloric 1M, tiếp tục khuấy trong vòng 1h, xuất hiện tủa trắng Lọc thu tủa qua phễu Buchner, kết tinh lại trong EtOH

1-[(2-benzylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-methyl-1H-Sơ đồ phản ứng

Sơ đồ 3.6 Tổng hợp

1-[(2-benzylsulfanyl-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-methyl-1H-benzo[d]imidazol (4a)

Tiến hành:

Thêm 0,2g (0,77mmol)

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-methyl-1H-benzo[d]imidazol; 0,5g K2CO3; 0,15g KI và 10ml aceton khan vào trong bình cầu 100ml Khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ thường trong vòng 1 giờ Sau đó, nhỏ từ

từ 0,08ml (0,77mmol) benzyl clorid vào hỗn hợp trên Lắp sinh hàn và đun hồi lưu trong 2h (sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng)

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng TLC với pha động cloroform: methanol = 20:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm

Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ muối vô cơ, tẩy màu bằng than hoạt,

cô bớt aceton rồi thêm 15ml H2O nước, xuất hiện tủa Lọc tủa qua phễu Buchner, sấy

ở nhiệt độ 60-700C Chất rắn 4a được kết tinh lại trong EtOH

Kết quả:

- Khối lượng: 0,19g (Hiệu suất 70,1%)

- Cảm quan: chất rắn màu nâu

Sơ đồ 3.8 Tổng hợp N-[4-(4-bromobutoxy)phenyl]acetamid

 Điều chế 1,4-di bromobutan (5)

Thêm vào bình cầu 142 ml acid hydrobromid 40%, tiếp theo nhỏ từ từ 34,5 ml acid sulfuric đặc, sau đó thêm 17,2 ml tetrahydrofuran và vài viên đá bọt Lắc nhẹ và lắp bình cầu vào bếp ôm với hệ thống sinh hàn thích hợp Tiến hành hồi lưu trong 3 giờ

Sau khi phản ứng kết thúc, bình phản ứng được để nguội và đổ tất cả hỗn hợp phản ứng sang bình chiết 250 ml, gạn lấy lớp dưới vào cốc có mỏ, rửa 2 lần với khoảng 70 ml nước cất Sau đó rửa 2 lần tiếp với 70 ml natri carbonat bão hòa, rửa

tiếp với khoảng 70ml nước cất đến khoảng pH= 7 Gạn lấy pha hữu cơ vào bình nón 50ml, làm khan bằng Na2SO4 và đậy nắp kín Bảo quản trong tủ hút

 Điều chế N-[4-(4-bromobutoxy)phenyl]acetamid (6)

Hòa tan trong bình cầu 100ml hỗn hợp sau: 1,0g (0,0132mol) paracetamol, 6,0g

K2CO3, 25ml acetonitril Khuấy hoạt hóa trong 1 giờ Tiếp theo nhỏ từ từ 9,0ml dibrombutan Lắp sinh hàn, tiến hành đun hồi lưu trong 5h

1,4-Sau khi phản ứng kết thúc, lọc loại bỏ muối vô cơ Cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm, thêm 20ml n-hexan, khuấy trong vòng 15 phút rồi lọc thu lấy tủa

Sau đây là bảng tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học:

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học

Stt Chất Cảm quan Hiệu suất

1 1 Tinh thể hình kim màu trắng 70,2%

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng sắc kí lớp mỏng và nhiệt

độ nóng chảy như sau:

+ TLC được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel GF254 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

- Dung môi hòa tan: EtOH 960, aceton

- Hệ dung môi: n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5); cloroform: methanol (9: 1); cloroform: methanol (20: 1) và n-BuOH: MeOH: H2O= 10: 1 :3

+ Đo nhiệt độ nóng chảy các chất

Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (t0

nc) của các chất được tóm tắt trong bảng

Bảng 3.2 R f và t 0 nc của 6 chất tổng hợp được

Chất Hệ dung môi khai triển R f T 0

Nhận xét: Với các hệ dung môi đã khai triển, các chất đã tổng hợp được cho 1 vết

tròn rõ, không có vết lạ, và các chất có nhiệt độ nóng chảy xác định, dao động trong khoảng hẹp 2-40 Từ đó, kết luận sơ bộ các chất tổng hợp được là tinh khiết Tiến hành đo phổ để xác định cấu trúc

3.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

Tiến hành đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) các chất 3, 4, 4a, 4b để xác định cấu trúc

3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)