Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất 52 (1h benzodmidazol 2 YL) ethyl11,3,4 oxydiazol 2 thiol

ĐẶT VẤN ĐỀ Dị vòng benzimidazol là một nhóm dẫn chất rất được quan tâm trong tổng hợp hóa dược. Khung này được dùng để phát triển nên các phân tử dược học và sinh học quan trọng. Năm 1872, Hobrecker báo cáo đã tổng hợp thành công những benzimidazol đầu tiên là 2,5 và 2,6dimethylbenzimidazol, ông không ngờ rằng sau này khung benzimidazol sẽ trở thành một cấu trúc ưu việt như vậy 30. Khung benzimidazol giành được sự quan tâm trong giới hóa học là do sự phát hiện ra N ribosyldimethylbenzimidazol là một hợp chất của benzimidazol nổi bật nhất trong tự nhiên, nó đóng vai trò như là một phối tử cho cobalt trong vitamin B12 5. Sau nhiều năm nghiên cứu, benzimidazol và các dẫn xuất của nó được xem là những cấu trúc quan trọng trong hóa dược với tác dụng sinh học đa dạng như: diệt ký sinh trùng (đặc biệt là giun sán như: albendazol, mebendazol); chống loét (ức chế bơm proton (PPI): omeprazol); hạ huyết áp (kháng thụ thể angiotensin II: candesartan, telmisartan); kháng histamin (đối kháng thụ thể H1: bilastin); chống ung thư (các mù tạc nitơ, bendamustin), thuốc chống nônchống loạn tâm thần (droperidol) 19, 27, 29. Các dẫn chất benzimidazol được gắn thêm các dị vòng thơm khác như: oxadiazol, triazolo,… sẽ làm tăng cường các tác dụng sinh học, tác dụng thường được quan tâm đến là tác dụng kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư 15, 20. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất 52(1Hbenzodimidazol2yl)ethyl1,3,4oxadiazol” với hai mục tiêu sau: 1. Tổng hợp được một số dẫn chất của 52(1Hbenzodimidazol2 yl)ethyl1,3,4oxadiazol. 2. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẬU THỊ GIANG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

ĐẬU THỊ GIANG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

Luyện, ThS Nguyễn Văn Giang, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, cho tôi

những lời khuyên quý báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược, đặc biệt

là: TS Nguyễn Văn Hải, ThS Phạm Thị Hiền và CN Phan Tiến Thành của Tổ môn

Tổng hợp Hóa dược Bộ môn Công nghiệp dược đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ của bộ môn

Vi sinh-Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, cán bộ Phòng Phân tích phổ-Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Công nghệ Sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội, tôi xin chân thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Đậu Thị Giang.

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ - 1

Chương 1 TỔNG QUAN - 2

1.1 Một số tác dụng sinh học của các dẫn chất benzimidazol - 2

1.1.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm - 2

1.1.2 Tác dụng trên ký sinh trùng - 3

1.1.3 Tác dụng ức chế bơm proton - 4

1.1.4 Tác dụng chống viêm, giảm đau - 6

1.1.5 Tác dụng gây độc tế bào ung thư - 7

1.1.6 Tác dụng khác - 8

1.2 Tác dụng của dẫn chất mang cả khung benzimidazol và oxadiazol - 8

1.2.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư - 9

1.2.2 Tác dụng kháng khuẩn - 10

1.3 Tổng hợp các dẫn chất của benzimidazol - 11

1.3.1 Phản ứng tạo vòng benzimidazol - 11

1.3.2 Phản ứng tạo vòng 1,3,4-oxadiazol - 12

1.3.3 Phản ứng S-alkyl hóa - 13

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 14

2.1 Nguyên liệu, thiết bị - 14

2.1.1 Hóa chất - 14

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ - 15

2.2 Nội dung nghiên cứu - 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu - 17

2.3.1 Tổng hợp hóa học - 17

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của chất tổng hợp được - 17

2.3.3 Xác định cấu trúc - 17

2.3.4 Thử tác dụng sinh học - 18

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN - 19

3.1 Tổng hợp hóa học - 19

3.1.1 Tổng hợp acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic (I) - 20

3.1.2 Tổng hợp acid 3-(5-nitro-1H-benzo[d]midazol-2-yl)propanoic (II) - 20

3.1.3 Tổng hợp Ethyl 3-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)propanoat (III) - 21

3.1.4 Tổng hợp 3-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)propanehydrazid (IV) 22

3.1.5 Tổng hợp 5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-thiol (V) - 22

3.1.6 Tổng hợp N-(4-(4-(5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-ylthio)butoxy)phenyl)acetamid (VIa) - 23

3.1.7 Tổng hợp 2-(benzylthio)-5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)-1,3,4-oxadiazol (VIb) - 23

3.1.8 Tổng hợp 2-((1H-benzo[d]imidazol-2-yl)methylthio)-5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)-1,3,4-oxadiazol (VIc) - 24

3.1.9 Tổng hợp tác nhân thế - 25

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết - 28

3.3 Xác định cấu trúc các chất sản phẩm - 29

3.3.1 Phổ hồng ngoại (IR) - 29

3.3.2 Phổ khối lượng (MS) - 29

3.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) - 30

3.4 Thử tác dụng sinh học - 31

3.4.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm - 31

3.4.2 Thử tác dụng gây độ tế bào ung thư - 36

3.5 Bàn luận - 38

3.5.1 Về tổng hợp hóa học - 38

3.5.2 Về kết quả phổ. - 40

3.5.3 Về tác dụng sinh học - 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT - 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO - 43

PHỤ LỤC - 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H nuclear magnetic

resonance) ADN Acid 2’-deoxynucleic

ATCC American Type Culture Collection

IR Phổ hồng ngoại (infrared spectrum)

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration) MeOH Methanol

MRSA S aureus kháng methicilin

MS Phổ khối (mass spectroscopy)

PPA Acid polyphosphoric

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

nc của các chất tổng hợp được 28

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Tr

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Tr

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dị vòng benzimidazol là một nhóm dẫn chất rất được quan tâm trong tổng hợp hóa dược Khung này được dùng để phát triển nên các phân tử dược học và sinh học quan trọng Năm 1872, Hobrecker báo cáo đã tổng hợp thành công những benzimidazol đầu tiên là 2,5- và 2,6-dimethylbenzimidazol, ông không ngờ rằng sau này khung benzimidazol sẽ trở thành một cấu trúc ưu việt như vậy [30] Khung benzimidazol giành được sự quan tâm trong giới hóa học là do sự phát hiện ra N-ribosyl-dimethylbenzimidazol là một hợp chất của benzimidazol nổi bật nhất trong

tự nhiên, nó đóng vai trò như là một phối tử cho cobalt trong vitamin B12 [5] Sau nhiều năm nghiên cứu, benzimidazol và các dẫn xuất của nó được xem là những cấu trúc quan trọng trong hóa dược với tác dụng sinh học đa dạng như: diệt ký sinh trùng (đặc biệt là giun sán như: albendazol, mebendazol); chống loét (ức chế bơm proton (PPI): omeprazol); hạ huyết áp (kháng thụ thể angiotensin II: candesartan, telmisartan); kháng histamin (đối kháng thụ thể H1: bilastin); chống ung thư (các mù tạc nitơ, bendamustin), thuốc chống nôn/chống loạn tâm thần (droperidol) [19, 27, 29]

Các dẫn chất benzimidazol được gắn thêm các dị vòng thơm khác như: oxadiazol, triazolo,… sẽ làm tăng cường các tác dụng sinh học, tác dụng thường được quan tâm đến là tác dụng kháng khuẩn và gây độc tế bào ung thư [15, 20] Do đó,

chúng tôi thực hiện đề tài: “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn

chất 5[2-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl]-1,3,4-oxadiazol” với hai mục tiêu sau:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất của

5-[2-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl]-1,3,4-oxadiazol

2 Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

Staphylococus aureus ACTT 9144, Staphylococus epidermidis ACTT 155, Klebsiella pneumoniae ACTT 29665, Escherichia coli ACTT 25922 và vi nấm Candida albicans ACTT 2091, Aspergilus niger ACTT 9029 bằng phương pháp khuếch tán trên thạch,

nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định bằng phương pháp pha loãng trên thạch nhiều lần liên tiếp Kết quả, tất cả các hợp chất đều có tác dụng ức chế với các VSV

thử nghiệm Đặc biệt, hợp chất 1a có hoạt tính kháng VSV tốt nhất, MIC trên các

chủng E.coli, K.pneumoniae, S.aureus, S.epidermidis, C.albicans và A.niger lần lượt

là: 15, 17, 19, 9, 11 và 15 µg/ml [23]

Hình 1.1 Công thức các chất theo nghiên cứu của Panneer Selvam

Vi ống là bào quan có mặt trong tất cả các tế bào nhân thật và đóng một vai trò quan trọng vì đây là một thành phần không thể thiếu trong qua trình nguyên phân của tế bào Các dẫn chất của benzimidazol có phổ kháng nấm tương đối rộng, nó thể hiện tác dụng này do nó ngăn cản quá trình trùng hợp của 2 tiểu phân α-tubulin và β-tubulin làm gián đoạn chức năng của vi ống trong các tế bào nhân thực của các vi sinh vật như: nấm, động vật nguyên sinh, giun sán [14] Năm 2005, G Hakan cùng

cộng sự đã tiến hành tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn in vitro trên các chủng

vi khuẩn S aureus và S aureus kháng methicilin (MRSA), E coli, E faecalis, kháng nấm C albicans của 22 dẫn chất 1,2 của 1H-benzimidazol-N-alkyl-5-carboxamidin

Kết quả cho thấy hợp chất

1-(2,4-diclorobenzyl)-2(3,4-diclorophenyl)-N-(2-diethylaminoethyl)-1H-benzimidazol-5-carboxamidin (2) có hoạt tính kháng khuẩn

khá mạnh, với MIC= 3,12 mg/ml đối với S aureus và có tác dụng tốt trên E coli, E

faecalis, C albican, MRSA [34]

2

Các thuốc chứa nhân benzimidazol được dùng rộng rãi trong phòng và điều trị nhiễm ký sinh trùng, các hợp chất đang được dùng trên thị trường như: parbendazol (PAR), cambendazol (CAM), mebendazol (MBZ) và oxibendazol (OXI) Các hợp chất này được đặc trưng bởi hiệu quả điều trị cao và độc tính thấp Tuy nhiên, chúng

ít được sử dụng trong điều trị nhiễm ký sinh trùng nội mô do khả năng hòa tan và hấp thu kém [7]

Một loạt các dẫn chất của 2-(trifluoromethyl)-1H-benzo[d]midazol (3a-3i) đã

được tổng hợp bằng cách ngưng tụ các dẫn chất của 1,2-phenylendiamin và acid

trifluoroacetic Các chất tổng hợp được thử tác dụng chống các loại đơn bào ký sinh

như: Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis và

Leishmania meixicana Kết quả cho thấy, các dẫn chất này đều có tác dụng trên ba

ký sinh trùng Giardia intestinalis, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis Các dẫn chất này cũng được mang thử in vitro và in vivo diệt giun xoắn Các hợp chất

3b, 3c, 3e diệt được tất cả các ký sinh trùng gây bệnh khi thử in vitro Khi thử in vivo

diệt giun xoắn, ở giai đoạn giun trưởng thành dẫn chất 3b, 3e cho tác dụng cao nhất (liều thử 75 mg/Kg) Tuy nhiên ở giai đoạn ấu trùng chỉ chất 3f thể hiện tác dụng diệt

chất của benzimidazol, ở vị trí số 2 gắn nhóm thế 2-pyridinmethylsulfinyl nhưng khác nhau ở nhóm thế gắn vào các vị trí R1, R1’, R2’, R3’

Hình 1.3 Công thức chung các thuốc ức chế bơm proton

Bảng 1.2 Các thuốc ức chế bơm proton Hoạt chất R 1 R 1 ’ R 2 ’ R 3 ’

Omeprazol -OCH3 -CH3 -OCH3 -CH3

Esomeprazol -OCH3 -CH3 -OCH3 -CH3

Lansoprazol -CH3 -OCH2CF3

Pantoprazol -OCHF2 -OCH3 -OCH3

Rabeprazol -CH3 -OCH2CH2CH2OCH3

Năm 2002, một loạt các dẫn chất của ylsulfinyl]methyl-3-alkylquinazolin-4-(3H) được Avinash Patil và các cộng sự tổng

2-[5-alkyl-1-H-benzo[d]imidazol-2-hợp và thử tác dụng chống viêm loét dạ dày Kết quả, các 2-[5-alkyl-1-H-benzo[d]imidazol-2-hợp chất 4k và 4n cho hiệu

quả tốt nhất và tương tự như khi dùng omeprazol ở liều thử 10 và 20 mg/kg Hợp chất

4a, 4d, 4i, 4l và 4o cho thấy tác dụng vừa phải ở liều tương tự Các hợp chất 4i, 4k, 4n tại liều 20 mg/kg cho thấy giảm được loét Hầu hết các hợp chất 4d, 4i, 4l, 4n và 4o ở liều 10 mg/kg và hợp chất 4i, 4k, 4n, 4o và 4l ở liều 20 mg/kg đều có tác dụng

ức chế tiết acid [3]

Hình 1.4 Công thức các dẫn chất theo nghiên cứu của Avinash Patil và cộng sự

1.1.4 Tác dụng chống viêm, giảm đau

Năm 2010 C S Kavitha cùng các cộng sự đã tổng hợp một loạt các dẫn chất

của 2-methylaminobenzimidazol bằng phản ứng của

2-(cloromethyl)-1H-benzimidazol với các amin thơm bậc nhất

Sơ đồ 1.1 Phản ứng tổng hợp các chất theo nghiên cứu C S Kavitha

Các chất tổng hợp được sàng lọc tác dụng giảm đau, chống viêm do acid acetic

gây ra đau trên chuột nhắt và carrageenan gây ra viêm ở chân chuột Các hợp chất 5g

và 5b cho tác dụng giảm đau mạnh (89% ở liều 100 mg/kg thể trọng) và chống viêm

tốt (100% ở liều 100 mg/kg thể trọng), tác dụng giảm đau được so với thuốc đối chiếu

nimesulid (100% ở mức 50 mg/kg thể trọng) Các hợp chất khác cho thấy tác dụng

giảm đau và các hoạt động chống viêm tốt [4]

Hình 1.5 Công thức một số chất theo nghiên cứu C S Kavitha

1.1.5 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Năm 2010 Seref Demirayak cùng các cộng sự đã tổng hợp thành công các dẫn chất của 1,3-diarylpyrazinobenzimidazol và thử tác dụng gây độc tế bào ung thư Theo đó, các dẫn chất của 2-aryloybenzimidazol phản ứng với 2-bromoacetophenon

trong aceton thu được 1-(2-aryl-2-oxyethyl)-2-aryloybenzimidazol (7a-7o) Các chất

tổng hợp được tiếp tục cho phản ứng với ammonium acetat trong acid acetic thu được

các hợp chất 8a-8o Các chất tổng hợp được được thử hoạt tính gây độc tế bào, một

số các hợp chất có tác dụng chống ung thư đáng chú ý [8]

Hình 1.6 Công thức các chất theo nghiên cứu Seref Demirayak và cộng sự

Wang Xiu-Jun cùng các cộng sự đã thiết kế và tổng hợp một loạt các dẫn xuất

bis-benzimidazol Các chất này được mang thử in vitro, tác dụng gây độc tế bào ung

thư, kết quả các chất này đều thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư trên các dòng

tế bào ung thư đã chọn Trong số đó, hợp chất 9 có tác dụng tốt nhất trên các dòng tế

bào ung thư, giá trị IC50 của nó là 5,95 mmol/l (dòng tế bào khối u đơn nhân (U937))

và 5,58 mmol/L (tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa)) Sử dụng phương pháp huỳnh

quang và UV-VIS cho thấy hợp chất 9 có thể gắn kết vào các rãnh nhỏ của ADN

[33]

Hình 1.7 Công thức chất 9 và cách gắn kết của nó vào các rãnh ADN

1.1.6 Các tác dụng khác

Ngoài các tác dụng đã nêu ở trên còn có rất nhiều các nghiên cứu khác chỉ ra tác dụng khác của dẫn chất benzimidazol như: tác dụng hạ áp [16], chống co giật [26], chống virus [10, 28, 32]…

1.2 Tác dụng của dẫn chất mang cả khung benzimidazol và oxadiazol

Nghiên cứu các hoạt chất mới trong điều trị ung thư đang là một nhiệm vụ quan trọng của hóa dược Ung thư là một bệnh của chu kỳ tế bào, trong đó các tế bào bất thường nguyên phân một cách không có kiểm soát Rất nhiều các hợp chất

dị vòng và dị vòng ngưng tụ đã được xác định thông qua sinh học phân tử, sàng lọc thực nghiệm và phát triển thuốc hợp lý để tìm ra các hoạt chất mới gây độc tế bào ung thư Bên cạnh các dị vòng benzimidazol với tác dụng sinh học đa dạng thì các lớp dị vòng như: oxadiazol và triazolo – thiadiazol cũng thu hút được sự quan tâm trong hóa dược vì có một loạt các hoạt chất mang các dị vòng này có tác dụng

kháng khuẩn và chống khối u [13, 25]

1.2.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Năm 2012, Asif Husain và các cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất benzimidazol

mang khung oxadiazol (10a-10l) Các dẫn chất này được tổng hợp từ

4-(1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-4-oxobutan hydrazid với mục đích tổng hợp các chất chống ung thư Các chất tổng hợp được nghiên cứu in vitro tác dụng gây độc tế bào ung thư

trên tất cả 60 dòng tế bào của người Kết quả cho thấy tác dụng trên tế bào ung thư là

đáng kể Đặc biệt trong đó có chât 10j ức chế sự tăng trưởng đáng kể và vẫn thể hiện

tác dụng khi pha loãng ở 5 nồng độ khác nhau (0,01; 0,1; 1; 10 và 100 µM) với các giá trị GI50 từ 0,49 đến 48,0 µM,đặc biệt 10j cho kết quả tốt trên các tế bào ung thư

phổi dòng không nhỏ (HOP-92) [15]

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ tổng hợp theo nghiên cứu Asif Husain và các cộng sự

Năm 2013, Mohammad Shaharyar và các cộng sự đã tổng hợp và thử tác dụng trên 60 dòng tế bào ung thư của các dẫn chất 2-(naphthalen-1-ylmethyl)naphthalen-

2-yloxymethyl)-1-[5-(phenyl)-[1,3,4]oxadiazol-2-ylmethyl]-1H-benzimidazol Kết

quả, các hợp chất tổng hợp thể hiện tác dụng từ trung bình đến thấp trên các dòng tế

bào thử nghiệm Riêng chất 11 là có hoạt tính tốt nhất trong các chất, đặc biệt hoạt

động ức chế mạnh trên MDA-MB-468 (ung thư vú) và SK-MEL-28 (khối u ác tính),

2 hợp chất 12,13 thể hiện tác dụng ức chế ít hơn và thể hiện tốt trên dòng tế bào

NCI-H522 (ung thư phổi không nhỏ) và UO-31(ung thư thận) , các dẫn chất khác thể hiện tác dụng kém hơn [21]

2-(phenoxymethyl)-1H-1-yl] acetohydrazid Nhóm hydrazid này được tạo vòng oxadiazol với nhiều acid thơm với xúc tác POCl3 thu được các hợp chất 14a-p Các hợp chất tổng hợp được thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm Kết quả cho thấy, các hợp chất 14d, 14f,

14h và 16d có tác dụng trên Escherichia coli và 14h và 14l có tác dụng trên

Staphylococcus aureus Các hợp chất 14d, 14f và 14l nhạy cảm nhất đối với Candida

albicans và Aspergillus flavus [20]

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp các chất theo nghiên cứu Salahuddin và các cộng sự 1.3 Tổng hợp các dẫn chất của benzimidazol

1.3.1 Phản ứng tạo vòng benzimidazol

Có nhiều phương pháp khác nhau để tạo vòng benzimidazol Phần lớn tác giả

đi từ nguyên liệu o-phenylendiamin và dẫn chất Sau đây là một số cách tạo vòng benzimidazol từ o-phenylendiamin:

1 Phản ứng với acid

Thông thường, o-phenylendiamin được ngưng tụ với các acid mono

carboxylic, trong điều kiện phản ứng loại nước, sử dụng các acid như acid polyphosphoric (PPA), acid hydrocloric, acid boric hoặc acid p-toluensulfonic tạo ra các nhóm thế khác nhau ở vị trí số 2 trên nhân benzimidazol Tuy nhiên việc sử dụng tác nhân yếu hơn đặc biệt là acid Lewis, muối vô cơ, acid vô cơ cải thiện cả hiệu suất

và độ tinh khiết của sản phẩm [9]

Sơ đồ 1.4 o-phenylendiamin ngưng tụ với acid carboxylic thơm

Từ năm 1995, nhiều dẫn chất benzimidazol đã được tổng hợp theo công nghệ

vi sóng Năm 2007, Dubey và Moorthy đã tổng hợp các chất alkyl và arylbenzimidazol theo phương pháp này Thời gian phản ứng giảm đến phút, hiệu suất tăng 10-50% so với phương pháp trước đây [9]

2-R= H, CH3, C6H5, 4-NH2C6H4, 4-ClC6H4

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp 2-alkyl và 2-arylbenzimidazol theo phương pháp vi

sóng

2 Phản ứng với anhydrid acid

Phản ứng của anhydrid acid với o-phenylendiamin sẽ tạo thành benzimidazol

hoặc N,N-diacylphenylen diamin phụ thuộc vào điều kiện tiến hành Khi cho

o-phenylendiamin phản ứng với anhydrid của dicarboxylic sẽ thu được dẫn chất acid

của khung bezimidazol Ví dụ o-phenylendiamin đun hồi lưu với anhydrid succinic

trong vài giờ tạo thành acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic [31]

Phản ứng như sau :

Sơ đồ 1.6 Sơ đồ tổng hợp acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic

1.3.2 Phản ứng tạo vòng 1,3,4-oxadiazol

Các dẫn chất hydrazin thường được đóng vòng bởi acid xúc tác POCl3 hoặc

CS2 trong môi trường kiềm mạnh để thu được các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol Một số

ví dụ tổng hợp vòng 1,3,4-oxadiazol như sau:

Năm 2011, Shelly Gapil và các cộng sự đã tổng hợp 2- thiol bằng cách cho benzoyl hyrazin phản ứng với CS2 (tỷ lệ mol 1:2) trong dung môi ethanol, xúc tác KOH, đun hồi lưu 4h Hiệu suất phản ứng 78 % [24]

5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-Sơ đồ phản ứng như sau:

Sơ đồ 1.7 phản ứng tạo vòng oxadiazol theo Shelly Gapil và cộng sự

Trong nghiên cứu của Salahuddin và cộng sự, vòng oxadiazol được tạo thành

bằng cách cho 2-[2 -(phenoxymetyl)-1H-benzimidazol-1-yl] acetohydrazid phản ứng

với các acid thơm, xúc tác POCl3,đun hồi lưu, sau phản ứng được cho vào nước lạnh

và trung hòa bằng NaHCO3, xuất hiện tủa, lọc tủa thu được sản phẩm Hiệu suất của các phản ứng này từ 58% đến 86% [20]

Sơ đồ 1.8 Phản ứng tạo vòng oxadiazol theo Salahuddin và cộng sự

1.3.3 Phản ứng S-alkyl hóa

Phản ứng S-alkyl hóa thường được tiến hành bằng cách cho các dẫn chất thiol tác dụng với các dẫn chất của halogen và thực hiện trong môi trường khan của dung môi như sau: acetonitril, ethyl acetat, THF, DMF, DMAc, với sự có mặt của xúc tác như: pyridin, triethylamin, K2CO3 khan, Ví dụ, năm 2012 Kai Liu, Xiang Lu đã thực hiện phản ứng S-akyl hóa 5-phenyl-1,3,4-oxadiazole-2-thiol bới tác nhân benzyl bromid (tỷ lệ mol 1: 1,1) trong EtOH 800, xúc tác KOH Hiệu suất phản ứng 96%

Sơ đồ phản ứng như sau:

Sơ đồ 1.9 Phản ứng S-akyl hóa 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-thiol

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị

Thực hiện khóa luận này chúng tôi đã sử dụng hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược- Bộ môn Công nghiệp Dược, bao gồm:

2.1.1 Hóa chất

Các hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm đã được thống

kê trong bảng 2.1 sau:

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất, dung môi

TT Tên hóa chất, dung môi Xuất xứ

2 Acid cloroacetic Trung Quốc

3 Acid hydroclorid Trung Quốc

4 Acid nitric Trung Quốc

5 Acid sulfuric Trung Quốc

6 Amoni hydroxyd Việt Nam

7 Benzyl clorid Trung Quốc

9 Cloroform Trung Quốc

10 Carbon disulfid Trung Quốc

11 Dicloromethan Trung Quốc

12 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc

13 Kali carbonat Trung Quốc

14 Kali hydroxyd Trung Quốc

15 Kali iodid Trung Quốc

16 Methanol Trung Quốc

17 N,N-dimethylformamid (DMF) Trung Quốc

16 Natri hydroxid Merck, Đức

18 Natri carbonat Trung Quốc

19 Natri acetat Việt Nam

20 Nước cất Việt Nam

Bảng 2.2 Danh mục máy móc, thiết bị, dụng cụ

TT Tên máy móc, dụng cụ Xuất xứ

10 Đèn hồng ngoại Trung Quốc

11 Máy cất quay Buchi B480 Thụy Sỹ

12 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Đức

13 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ

14

Máy đo phổ MS LC/MS/MS - Xevo TQMS tại Phòng

Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mỹ

15

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Brucker

AV-500MHz tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa

học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mỹ

16

Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer tại Phòng

Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mỹ

17 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc

18 Ống đong 20ml, 25ml, 100ml Trung Quốc

19 Phễu lọc Buchner Trung Quốc

20 Pipet 0,5mL, 1mL, 5mL, 10mL Đức

21 Ống nghiệm Trung Quốc

22 Sinh hàn hồi lưu Đức

2-((1H-yl)ethyl)-1,3,4-oxadiazol

2 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học

- Thực hiện các phản ứng hóa học đã tham khảo tài liệu ở tên như: phản ứng đóng

vòng benzimidazol, đóng vòng oxadiazol, phản ứng S-alkyl hóa…cũng như phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để tổng hợp các chất dự kiến

- Dùng SKLM để theo dõi tiến triển của phản ứng Soi đèn tử ngoại ở bước sóng

254 nm để nhận biết vết sắc ký

Sau khi tổng hợp xong được xác định độ tinh khiết bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy Chất được đánh giá sơ bộ là tinh khiết nếu khi chạy trên hệ dung môi thích hợp thu được vết sắc ký là 1 vết gọn, rõ, không có vết phụ và nhiệt độ nóng chảy dao động trong khoảng hẹp

2.3.3 Xác định cấu trúc

Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ

hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR)

Phổ hồng ngoại (IR):

Được ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1 Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại

bỏ hơi ẩm [1, 2]

Phổ khối lượng phân tử (MS):

Được ghi theo phương pháp ESI trên máy LC/MS/MS-Xevo TQMS tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H - NMR):

Được ghi trên máy Brucker AV-500MHz tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.4 Thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm: được tiến hành theo phương pháp

khuếch tán trên thạch, thực hiện tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học của Trường Đại học

Dược Hà Nội

Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư: tại viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn

lâm Khoa học Việt Nam theo phương pháp phương pháp của Monks (1991) Hiện đang được áp dụng tại Viên nghiên cứu ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI)

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp hóa học

Các chất được tổng hợp theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng hợp các chất dự kiến

3.1.1 Tổng hợp acid 3-(benzo[d]imidazol-2-yl)propanoic (I)

+ Quy trình tổng hợp:

 Hòa tan hỗn hợp gồm: 5,4g (0,05mol) 1,2-phenylen diamin và 30 ml xylen trong bình cầu 250mL Thêm tiếp 10g (0,1mol) anhydrid succinic Lắp sinh hàn và đun hồi lưu, kết hợp khuấy từ trong 3h

Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2:2,5

 Xử lý, tinh chế: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được làm lạnh, gạn lấy tủa Hòa tan tủa thu được trong 60ml HCl 1M (ở 600C) Làm lạnh, lọc lấy dịch qua phễu lọc Buchner Dịch lọc được thêm 1g than hoạt, dùng đũa thủy tinh khuấy ở 600C trong 10 phút Lọc qua phễu lọc Buchner, rửa 2 lần với 10ml nước nóng Dịch lọc được đổ vào cốc có mỏ, làm lạnh và trung hòa dịch lọc bằng natri acetat đến pH= 6 thì xuất hiện tủa màu trắng Để trong 12h để tủa hết sản phẩm Lọc qua phễu lọc Buchner, rửa tủa 3 lần với 10ml nước lạnh, thu được 6,65g sản phẩm thô Kết tinh lại sản phẩm trong EtOH 700, thu được tinh thể trắng, hình kim, nhẹ

+ Kết quả:

 Khối lượng: 7,03g (hiệu suất 74,0%)

 Cảm quan: tinh thể màu trắng, hình kim, nhẹ

 Cho 10 ml dung dịch H2SO4 đặc vào bình cầu 1 cổ 100mL, làm lạnh bên ngoài

bằng nước đá Thêm 5,0 g (26,18 mmol) chất I, khuấy đều rồi thêm từ từ 2,5

ml dung dich HNO3 đặc (27,04 mmol), khuấy trong 2h ở nhiệt độ phòng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2:2,5

 Xử lý, tinh chế: đổ hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ 250mL chứa 30 ml nước cất được làm lạnh bên ngoài bằng nước đá Khuấy đều, thêm từ từ dung dịch

NaOH 30% đến pH= 4 -5, xuất hiện kết tủa Để yên khoảng 30 phút Lọc tủa, rủa bằng nước cất, sấy dưới đèn hồng ngoại thu được sản phẩm màu vàng + Kết quả:

 Khối lượng: 5,5 g (hiệu suất 89,1%)

Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2: 2,5

 Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Làm lạnh bằng đá, thêm 30ml nước lạnh và trung hòa bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH= 6-7 thì sẽ xuất hiện tủa màu vàng nhạt Lọc thu tủa qua phễu Buchner Rửa tủa 2 lần với 10ml nước, hút kiệt và sấy khô dưới đèn hồng ngoại

3.1.4 Tổng hợp 3-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)propanehydrazid (IV)

+ Quy trình tổng hợp:

 Hòa tan 2,0 g (7,60 mmol) chất III vào 20 ml ethanol tuyệt đối trong bình cầu

100mL Sau đó, thêm 10 ml (103,1 mmol) hydrazin monohydat 50% Lắp sinh hàn và đun hồi lưu kết hợp khuấy từ trong 5h

Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dm pha động CHCl3:MeOH= 9:1

 Xử lý, tinh chế: sau phản ứng hỗn hợp được mang cất quay chân không để loại bớt ethanol, để nguội và thêm 10ml nước lạnh thấy xuất hiện kết tủa, lọc tủa bằng phễu lọc Buchner, rửa tủa hai lần bằng nước, mang sấy tủa dưới đèn hồng ngoại Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH 500

5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-+ Quy trình tổng hợp:

 Hòa tan 1,0g (4,02 mmol)

3-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)propanehydrazid (IV) vào 40 ml EtOH 960 trong bình cầu 100mL, thêm 0,23g (4,10 mmol) KOH Sau đó cho từ từ 0,25ml (4,02 mmol) dung dịch CS2 Lắp sinh hàn đun hồi lưu trong 3h, sau đó tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng qua

đêm

Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động BuOH:MeOH:H2O= 10:1:3

 Xử lý, tinh chế: thêm 10 ml H2O vào hỗn hợp sau phản ứng, sau đó dung dịch này được trung hòa tới pH= 5-6 bằng dung dịch HCl 1M, xuất hiện kết tủa, tiếp tục khuấy 30 phút, lọc tủa sấy dưới đèn hồng ngoại Tinh chế bằng kết

tinh lại trong EtOH

+ Kết quả:

 Khối lượng: 0,96 g (hiệu suất 82,1%)

 Cảm quan: chất rắn màu vàng tươi

 Rf= 0,76 (BuOH: MeOH: H2O= 10:1 :3)

 T0

nc= 271-2740C

3.1.6 Tổng hợp oxadiazol-2-ylthio)butoxy)phenyl)acetamid (VIa)

N-(4-phản ứng, đun hồi lưu trong 3h

Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dm pha động CH2Cl2:MeOH=20:1

 Xử lý, tinh chế: sau phản ứng mang lọc loại K2CO3, dịch lọc được cô chân không loại bớt aceton, thêm 10ml H2O thấy xuất hiện kết tủa, khuấy thêm 30 phút, lọc tủa, sấy dưới đèn hồng ngoại Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH

+ Kết quả:

 Khối lượng: 0,25 g (hiệu suất 72,9%)

 Cảm quan: chất rắn màu trắng hơi vàng

 Rf= 0,23 (CH2Cl2:MeOH=20:1)

 Tnc0= 290-2920C

3.1.7 Tổng hợp 1,3,4-oxadiazol (VIb)

2-(benzylthio)-5-(2-(5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)ethyl)-+ Quy trình tổng hợp:

 Hòa tan 0,2g (0,69 mmol) chất V trong 10ml aceton, thêm 0,5g (3,6 mmol)

bột K2CO3 khan Khuấy hoạt hóa trong 1h, thêm 0,08ml (0,74 mmol) benzyl

clorid Lắp sinh hàn, sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, đun hồi lưu trong 2h

Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dm pha động CH2Cl2:MeOH=20:1

 Xử lý, tinh chế: sau phản ứng mang lọc loại K2CO3, dịch lọc được cô chân không loại bớt aceton, thêm 10 ml H2O thấy xuất hiện kết tủa, khuấy thêm 30 phút, lọc tủa, sấy dưới đèn hồng ngoại Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH

2-((1H-benzo[d]imidazol-2-yl)methylthio)-5-(2-(5-nitro-1H-+ Quy trình tổng hợp:

 Hòa tan 0,2g ( 0,69 mmol) chất V trong 7 ml DMF, thêm 0,5g (3,6 mmol) bột

K2CO3 khan Khuấy hoạt hóa trong 1h, thêm 0,16 g (0,69 mmol)

2-cloromethyl-5-nitro-1H benzo[d]imidazol Lắp sinh hàn, sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, đun hồi lưu trong 2,5h

Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dm pha động CH2Cl2:MeOH=20:1

 Xử lý, tinh chế: sau phản ứng mang lọc loại K2CO3, dịch lọc được cất quay chân không loại bớt DMF,trong quá trình cất quay thêm EtOH nhiều lần,sau

đó thêm 10 ml H2O thấy xuất hiện kết tủa, khuấy thêm 30 phút, lọc tủa, sấy dưới đèn hồng ngoại Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong EtOH

3.1.9 Tổng hợp tác nhân thế

Trong đề tài có dùng 3 tác nhân thế là: N-(4-bromobutoxy)phenyl acetamid,

benzyl clorid, 2-cloromethyl-5-nitro-1H-benzo[d]imidazol Benzyl clorid là hóa chất

có sẵn trong phòng thí nghiệm 2 tác nhân còn lại được tổng hợp như sau:

Tổng hợp N-(4-bromobutoxy)phenyl acetamid:

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tổng hợp N-(4-bromobutoxy)phenyl acetamid

Cho 1,0 g (6,6 mmol) 4-acetylaminophenol phản ứng với 6,3 ml dibromobutan (52,8 mmol) trong 30 ml acetonitril, xúc tác 5,46 g (39,6 mmol)

1,4-K2CO3 ở 400C trong 5 h Sau phản ứng loại loại bỏ K2CO3, cất chân không đến thể tích không đổi Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi pha động cloroform:methanol = 9:1 Sau phản ứng cho n-hexan vào bình cất, khuấy thấy xuất hiện kết tủa, lọc tủa Hòa tan tủa trong ethyl acetat, rửa bằng NaOH để loại hết 4-acetylaminphenol Cất chân không loại ethyl acetat thu được sản phẩm là bột màu trắng

Kết quả: - Khối lượng: 1,54 g (hiệu suất 81,54%)

Giai đoạn 1: tổng hợp 2-cloromethyl benzo[d]imidazol

Cho 2,16g (0,02 mol) o-phenylendiamin đun hồi lưu 3h với 2,84g (0,03 mol)acid

cloroacetic trong 20 ml acid HCl 4N Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2:2,5 Hỗn hợp sau phản ứng được thêm 20

ml nước, trung hòa một cách từ từ bằng dung dịch amonium hydroxyd tới pH=6-7, xuất hiện kết tủa, lọc tủa sấy bằng đèn hồng ngoại

Kết quả:

- Cảm quan: chất rắn thu được có màu vàng

- Khối lượng: 2,5 g (hiệu suất 76,3%)

- T0

nc = 143-145 0C

Giai đoạn 2: nitro hóa 2-cloromethyl benzo[d]imidazol

Cho 5 ml dung dịch H2SO4 đặc vào bình cầu 1 cổ 100mL, làm lạnh bên ngoài bằng nước đá Thêm 2,0 g (12,06 mmol) sản phẩm ở trên, khuấy đều rồi thêm từ từ 1,2 ml dung dich HNO3 đặc (13,04 mmol), khuấy trong 3 h ở nhiệt độ phòng.Theo dõi phản ứng bằng SKLM với pha động n-BuOH:AcOH:H2O = 9:2:2,5 Đổ hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ 100mL chứa 15 ml nước cất được làm lạnh bên ngoài bằng nước đá Khuấy đều, thêm từ từ dung dịch NaOH 30% đến pH= 4 -5, xuất hiện kết tủa Để yên khoảng 30 phút Lọc tủa, rửa bằng nước cất, sấy dưới đèn hồng ngoại thu được sản phẩm màu vàng

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học

Stt Chất Công thức hóa học R Cảm

quan

Hiệu suất (%)

1 I

Tinh thể hình kim, trắng

82.1

6 VIa

Chất rắn màu trắng vàng

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các chất đã tổng hợp được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy cụ thể là:

+ SKLM:

- SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel GF254 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại 254 nm

- Dung môi hòa tan: EtOH

- Hệ dung môi pha động: thích hợp tùy thuộc từng chất

+ Đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt: 8 chất sau khi tinh chế đều có dạng chất rắn, được sấy khô và đo nhiệt độ nóng chảy

Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của từng chất được trình bày trong bảng sau:

Bảng 3.2: Kết quả giá trị Rf và T0nc của các chất tổng hợp được

Stt Chất Hệ dung môi khai triển R f T 0 nc ( 0 C)

 Nhiệt độ nóng chảy của các chất dao động trong khoảng hẹp 2÷3 0C

Sơ bộ kết luận được các chất tổng hợp được là tinh khiết

Tiến hành đo phổ để xác định cấu trúc của các chất sản phẩm V, VIa, VIb, VIc

3.3 Xác định cấu trúc các chất sản phẩm

3.3.1 Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ đồ của các chất được trình bày ở phụ lục: 1, 2, 3, 4

Số liệu phân tích phổ được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất sản phẩm

Nhận xét: trên phổ IR xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức, các

nhóm chức này phù hợp với công thức dự kiến của các chất V, VIa, VIb, VIc

3.3.2 Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng được trình bày ở phụ lục 5, 6, 7, 8

Kết quả phân tích phổ khối lượng được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối của các chất sản phẩm

Nhận xét: từ các dữ liệu phân tích phổ ở bảng 3.4 và phổ đồ (phụ lục 5, 6, 7, 8, 9) cho

thấy các chất có pic khối lượng phù hợp với khối lượng phân tử dự kiến của các hợp

chất V, VIa, VIb, VIc