Xác định hàm lượng tạp acid succinic khi định lượng artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC

Làm phản ứng bán định lượng hay áp dụng đối với tạp vô cơ: Trong phương pháp này người ta thường dùng phản ứng tạo mầu hay tạo tủa đục với tạp chất rồi so sánh mầu hay độ đục của dung dị

BỘ Y T Ì TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÂ NỘI

ĐỖ ĐỈNH HẢI

KHI ĐỊNH Linme ARTESUNAT NBUYÊN LIỆU

BẰNG PHưUNG PHẮP HPLC

(KHỐA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOĂ 2001- 2006)

Người hướng dẫn:

PGS.TS Trần Đức Hậu Th.s Trần Thị Lan Hương

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này:

PGS.TS.Trần Đức Hậu, Chủ nhiệm bộ môn Hoá dược.

Th.S.Trần Thị Lan Hương, Giảng viên bộ môn Hoá dược.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, cán bộ của bộ môn Hoá dược đã giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành khoá luận này

Xin được cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, các cán bộ bộ môn Hoá phân tích, Hoá vô cơ

Cuối cùng xin cảm otti gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi trong thời gian qua

Hà nội, tháng 5 năm 2006 Sinh viên : Đỗ Đình Hải

2.1 Đối tượng, thiết bị, hoá chất, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.2.2.1 Đánh giá tính tuyến tính của phưcfng pháp 23

2.22.2 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 242.2.2.3 Đánh giá tính đúng của phương pháp 25

2 1 2 5 Xác định giới hạn định lượng acid succinic theo phương

2.2.2.Ỏ Xây dựng cách xác định acid succinic trong arthesunat

khi không có acid succinic chuẩn 32

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD Limit of detection : Giới hạn phát hiện

LOQ Limit o f quantification : Giới hạn định lượng

ĐẶT VẤN ĐỂ

Sốt rét là một bệnh nguy hiểm mang tính xã hội Điều đáng lo ngại là việc điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn do ký sinh trùng sốt rét đã và đang kháng với các loại thuốc điều trị sốt rét kinh điển như: Cloroquin, Mefloquin, Primaquin [13]

Vào năm 1972, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được artemisinin từ cây Thanh hao hoa vàng Artemisinin có hiệu lực điều trị sốt rét nhanh, mạnh trên các bệnh nhân bị sốt rét do nhiễm chủng p falciparum kháng thuốc và sốt rét thể não [7] Tuy nhiên, artemisinin có hạn chế là: khả năng hoà tan kém, tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao Để khắc phục những hạn chế này người ta đã bán tổng hợp ra artesunat với ưu điểm có hoạt lực điều trị mạnh hơn, lại dễ tan hơn artemisinin Hiện nay aitesunat được sử dụng rộng rãi và là một trong những niềm hy vọng lớn của con người trong cuộc chiến chống lại sốt rét

Cùng với sự gia tăng nhu cầu sử dụng artesunat, việc kiểm tra chất lượng aitesunat trong nguyên liệu và thành phẩm là rất cần thiết

DHA và acid succinic là 2 tạp thường gặp nhất trong artesunat do quá trình sản xuất và bảo quản Các tạp chất này làm giảm chất lượng thuốc, giảm hiệu lực điều trị và ảnh hưởng tới kết quả định lượng artesunat Theo các phưoỉng pháp định lượng artesunat đang áp dụng ở Việt Nam, khi trong chế phẩm cần định lượng có lẫn 1% acid succinic thì kết quả định lượng theo

phương pháp ghi trong tiêu chuẩn cơ sở tăng khoảng 6,5% Khi trong chế

phẩm cần định lượng có lẫn 1% DHA thì kết quả định lượng theo phương pháp ghi trong tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III tăng khoảng 1,4% [4] Vì vậy việc xác định hàm lượng các tạp chất này là rất quan trọng Trong đề tài

này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu “ Xác định hàm lượng tạp acid

succinic khi định lượng artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC”

nhằm đạt hai mục tiêu chính:

1 Dựa trên phương pháp định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC, xác định hàm lượng acỉd succỉnỉc trong nguyên liệu artesunat khi

có hoặc không có acỉd succỉnỉc chuẩn.

2 Đánh giá phương pháp định lượng acid succinic bằng HPLC dưới dạng tạp chất theo các chỉ tiêu của một phương pháp định lượng.

-T ên khác: acid artesunic, Dihydro artemisinin -lOa - hemisuccinat.

- Tính chất:

Tinh thể không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi, rất khó tan trong nước, rất dễ tan trong dicloromethan, dễ tan trong ethanol, methanol và aceton [2]

Điểm chảy: 142®c đến 145°c

Góc quay cực riêng: = +2,5° đến +3,5° (dung dịch artesunat trongdicloromethan)

Hỗn dịch 1% trong nước có pH từ 3,5 đến 4,5 [21]

1.1.2 Nguồn gốc, cách điều chế

+ Nguồn gốci Artemisinin phân lập từ cây Thanh hao hoa vàng có tác

dụng tốt trong điều trị sốt rét kể cả chủng đã kháng Cloroquin Tuy vậy,

artemisinin khó tan và điều trị bằng artemisinin tái phát sớm mặc dù bệnh

nhân sạch ký sinh trùng trong máu

Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bán tổng hợp ra các dẫn chất

của artemisinin, trong đó đáng chú ý là artesunat có tác dụng tốt, tan trong

dung dịch kiềm dùng để pha thuốc tiêm, điều trị bằng artesunat ít bị tái phát

và vì vậy được dùng phổ biến hơn cả

+ Điều chế: Trên cơ sở phương pháp của các nhà khoa học Trung Quốc,

D L Klayman, p Brossi và cộng sự, Đỗ Hữu Nghị và cộng sự tại trường Đại

học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp tổng hợp artesunat

qua hai giai đoạn với hiệu suất cao [12]:

COOH L

c h ,

r

i

H2 OOH

- Tên khoa học: acid butanedioic.

-T ên khác: acid butanedionic, acid amber, asuccin

- Tính chất: Bột kết tinh trắng

Độ tan: 1 g acid succinic hoà tan được trong 13 ml nước lạnh; 1

ml nước sôi; 18,5 ml cồn; 6,3 ml methanol; 36 ml aceton; 20ml glycerol; 113

ml ether Không tan trong benzen, carbon disulffit, dầu ether

Điểm chảy; 185 - 187°c

Có: pKai = 4,16; pKa2 = 5,61

Dung dịch acid succinic 0,1 M CÓ pH = 2,7 [18]

1.2.2 Nguyên nhân gây ra tạp acid succinic trong artesunat

Acid succinic là một trong hai thành phần dùng tổng hợp nên artesunat, mặt khác artesunat là ester của acid succinic và DHA nên nguyên nhân chính gây ra tạp acid succinic trong artesunat nguyên liệu là:

- Tinh chế chưa tốt trong quá trình sản xuất

- Do sự phân huỷ của artesunat trong quá trình bảo quản

1.2.3 Một sô phương pháp xác định tạp chất liên quan trong thuốc

a Làm phản ứng bán định lượng (hay áp dụng đối với tạp vô cơ):

Trong phương pháp này người ta thường dùng phản ứng tạo mầu hay tạo tủa (đục) với tạp chất rồi so sánh mầu (hay độ đục) của dung dịch thử với mầu (hay độ đục) của dung dịch mẫu - dung dịch này chứa một lượng tạp chất đó ở giới hạn cho phép

Tiến hành: chọn 2 ống nghiệm không mầu, cùng đường kính Cho vào ống thứ nhất dung dịch thử - dung dịch này pha theo sự hướng dẫn trong từng chuyên luận của dược điển và ống thứ hai 10 ml dung dịch mẫu Cho vào mỗi ống mọi thuốc thử, trừ thuốc thử chính tạo tủa (hay mầu) với tạp chất Cuối cùng cho thuốc thử chính vào cả 2 ống So sánh mầu (hay độ đục) của 2 ống.Mầu (hay độ đục) của ống thử không được đậm hơn mầu (hay độ đục) của ống mẫu [1], [3]

Phương pháp này đơn giản, song chỉ cho kết quả bán định lượng.

b Đo quang:

Nguyên tắc là làm phản ứng mầu đặc trưng của tạp rồi đo độ hấp thụ của dung dịch mẫu so với độ hấp thụ của dung dịch có chứa tạp đó ở mức tiêu chuẩn trong cùng điều kiện

Phương pháp chỉ xác định mức giới hạn, việc áp dụng hạn chế do phải có phản ứng đặc hiệu

c Sắc ký lớp mỏng:

Pha dung dịch thử của chế phẩm Pha dung dịch so sánh, dung dịch này có chuẩn tạp có nồng độ bằng mức giới hạn quy định tính theo dung dịch thử Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng một lượng thể tích bằng nhau của 2 dung dịch Triển khai sắc ký, lấy ra sấy khô, hiện mầu và so sánh vết tạp của dung dịch chuẩn và vết tạp tương ứng của dung dịch thử Yêu cầu vết tạp của dung dịch thử có diện tích và độ đậm không được lớn hơn vết tạp của dung dịch chuẩn tạp

Nếu không cổ chuẩn tạp thì người ta dùng chính dung dịch thử để pha dung dịch so sánh; dung dịch này có nồng độ bằng mức giới hạn quy định của tạp và cũng tiến hành tương tự như trên, rồi so sánh vết tạp của dung dịch thử

và vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch so sánh [2], [15], [19]

Nhận xét: Khi không có chuẩn tạp người ta đã coi đáp ứng của tạp và chất thử là như nhau Phương pháp này chỉ là phương pháp bán định lượng, dùng để xác định giới hạn cho phép của tạp

d Sắc ký lỏng hiệu năng cao:

- Chuẩn hoá diện tích pic:

Pha dung dịch thử và tiến hành sắc ký, ghi diện tích của tất cả các pic trừ pic dung môi và những pic có đáp ứng rất nhỏ Phần trăm diện tích của mỗi pic được tính là phần trăm khối lượng mỗi chất có trong mẫu thử

Phưcmg pháp này cho kết quả khá chính xác nhưng đã xem đáp ứng của các pic là như nhau khi nồng độ bằng nhau và tất cả các chất có trong mẫu thử đều cho đáp ứng trên sắc ký đồ Để xác định đúng hàm lượng phần trăm của mỗi chất (tạp chất) trong mẫu thử, cần xác định liên quan tỉ lệ phần trăm diện tích pic với phần trăm hàm lượng giữa các chất, thường xem hoạt chất có tỉ lệ này bằng 1 Vì vậy cần xác định hệ số biến đổi phần trăm diện tích pic ra phần trăm hàm lượng (hệ số F) Khi đó phần trăm tạp được tính như sau:

ỵs,.F ,

/=1

- So sánh với chuẩn tạp (khi cần xác định giới hạn cho phép của tạp):

Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn tạp có hàm lượngbằng giới hạn quy định và ghi đáp ứng các pic Diện tích pic tạp của dung dịch thử tương ứng pic chuẩn tạp không được lớn hơn diện tích của pic chuẩn tạp

- So sánh với chuẩn thử:

Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn, dung dịch này được pha từ dung dịch thử, có nồng độ so với dung dịch thử bằng giới hạn cho phép của tạp Diện tích của bất kỳ pic tạp nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử không được lớn hofn diện tích pic chính của dung dịch chuẩn [1], [2], [15\Nhận xét: Các phương pháp trên khi không có hệ số đáp ứng đã coi hệ số đáp ứng bằng 1, trường hợp này rất khó xảy ra

Các phương pháp này chỉ dùng để xác định giới hạn cho phép của tạp

1.3 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1.3.1 Nguyên tắc

Phưoỉng pháp HPLC là một phương pháp phân tích hoá lý, dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hçfp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hoà lẫn vào nhau: pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn

8

hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tuỳ thuộc bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi

ta bơm dung môi pha động qua bcfm với áp suất cao thì tuỳ thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in [6]

1.3.2 Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký Nếu ghi quá trình tách sắc

ký của hỗn hợp nhiều thành phần, chúng ta có một sắc ký đồ gồm nhiều pic Nếu quá trình tách sắc ký tốt, thì hỗn hợp mẫu có bao nhiêu chất sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc ký đồ [6], [11]

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm

7 bộ phận chính sau đây:

a Hệ thống bơm:

Để bơm pha động vào cột tách Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 -

400 bar)

b Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi:

Bình chứa dung môi thường bằng thuỷ tinh hoặc thép không gỉ Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 |Lim ) và đuổi khí hoà tan

c Hệ tiêm mẫu:

Để đưa mẫu phân tích vào cột, Có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ tiêm mẫu tự động

d Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao:

Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar Cột tách có nhiều cỡ khác nhau tuỳ thuộc vào mức độ sắc

ký Nói chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 1 0 -2 5 cm, đường kính trong từ 2 - 5 mm

e Detector trong HPLC:

Là bộ phận phát hiện chất phân tích Tuỳ theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp Detector hay được sử dụng nhất là detector hấp thụ u v - VIS

g Hệ điều khiển: Computer.

/ Bộ phận ghi tín hiệu: gồm có Recorder [1], [11].

1.3.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng

• Thời gian lưu (Í ịị ): tjỊ là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm

mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ

• Thể tích lưu (V ịị ): Vr là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển

chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ

= Ír X Fc(Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian)

tjỊ và Vr là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan, vì vậy các đại lượng này phụ thuộc vào: Tính chất pha tĩnh, bản chất pha động, tốc độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ

• Thời gian chết (Í q ): to là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởipha tĩnh

10

• Thời gian lưu thực ( t \ ): t \ = tR - íq.

• Hệ sô'phân bố K:

K = k C s/C ,

Cs và là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ số

phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột

K phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ

• Thừa số dung lượng K \’

Là một đại lượng dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất

k ' = =z ~ ^ 0 = Ỉ A _ Ị

Í q Í q ( q

k ’ phụ thuộc vào bản chất của các pha, bản chất của chất tan, nhiệt độ và đặc điểm của cột Với một chất k ’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp Nếu k’ lớn, pic bị doãng, độ nhạy kém Nếu k’ nhỏ thì ír cũng nhỏ và sự tách kém Trong thực tế k’ nằm trong khoảng từ 2 - 5 là tốt nhất Hai chất chỉ được tách

ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị k’ khác nhau

Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1< k < 8

Nếu k’ < 1 thì pic ra sớm dễ lẫn với pic tạp

Nếu k > 8 thì thời gian phân tích sẽ quá dài

• Thừa số chọn lọc a (selectivity-factor):

“ = = (vớik’,> k ', )

a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 - 2

11

• Độ phân giải (resolution):

Đặc trưng cho mức độ tách của 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc

ký Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức:

Trong đó: Wji 2 0 là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic

a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép

đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

12

AF càng gần 1 thì peak càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả

tính diện tích peak càng chính xác

Trong phép định lượng yêu cầu: 0,9<AF<2 [2], [15], [19^.

1.3.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

a Lựa chọn cột (pha tĩnh):

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất Bản chất chính của sự tách sắc ký hấp phụ là dựa trên tính chất hấp phụ bề mặt của pha tĩnh Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ.Sắc ký hấp phụ gồm có 2 loại:

• Sắc ký hấp phụ pha thuận (normal phase-HPLC): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất ít phân cực

• Sắc ký hấp phụ pha đảo (reverse phase-HPLC): pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực Trong sắc ký pha đảo các chất phân cực ra trước rồi tới các chất ít và không phân cực ra sau

Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC:

• Phải trơ và bền vững trong môi trường sắc ký

13

• R là các nhóm ít phân cực: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl; được điều chế bằng cách alkyl hoá các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl -R của mạch carbon (C2, Cg, Cjg) hay các gốc carbon vòng (phenyl)

Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực Silica đã alkyl hoá được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion [6], [17\

b Lựa chọn pha động cho HPLC:

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu

tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp Pha động có thể là nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ nhất định

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc

ký như: độ chọn lọc a, thời gian lưu Ir, hiệu lực tách của cột, độ phân giải

Rs, độ rộng của pic sắc ký Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng

Yêu cầu của một pha động:

• Phải trơ với pha tĩnh

• Hoà tan được chất cần phân tích

• Bền vững theo thời gian,

• Có độ tinh khiết cao

• Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

14

• Phù hợp với detector.

• Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân cực (kỵ nước) như: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform, Các pha động này thưòfng được bão hoà nước

Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực như; nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng Các dung môi này

có thể hoà tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ [6], [17]

Có 4 yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưcfng tới kết quả tách của một hỗn hợp mẫu:

• Bản chất của dung môi để pha pha động

• Thành phần của các chất trong pha động

• pH của pha động

• Tốc độ dòng của pha động

c Chọn đệm pH:

Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan

có tính acid hay base thường phải thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc

ký Thông thường chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid nhưng cũng có trưòíng hợp đặc biệt, còn trong sắc ký tạo cặp ion thì pH tuỳ từng trường hợp [17]

a Định tính và thử độ tinh k h iế t: thời gian lưu của chất thử trên sắc đồ phải

tưoỉng ứng với thời gian luu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ [6]

b Sắc ký điều chế: qua quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải

được hứng riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất [6]

c Định lượng:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất

Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc; nồng

độ của chất tỷ lệ vói chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC:

• Phưcmg pháp chuẩn ngoại (extemal Standard method): Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả 2 mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Sau đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ

• Phương pháp chuẩn nội (intemal Standard method): Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc

ký Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội

• Phương pháp chuẩn hoá diện tích pic (area normalisation):

Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều

thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần

Yêu cầu: Tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện.

Tất cả các thành phần đều có đáp ứng như nhau với detector.Khi đó hàm lượng chất thử được tính như sau:

^,.100 _ ^,.100

+^y +5'r +•••

/=1

16

Tuy vậy trong sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp ứng pic như nhau là rất khó Khắc phục nhược điểm này, trong sắc ký lỏng người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần Để xây dựng hệ số đáp ứng ta chọn 1 thành phần làm chuẩn có hệ số đáp ứng bằng 1 Các thành phầnkhác có hệ số đáp ứng tính theo công thức sau: F = ^

- Cách 1: Dựa vào phương trình tuyến tính ở nồng độ khảo sát của mỗi

chất và tính ra hệ số đáp ứng theo biến đổi toán học Nếu chất A có phương trình tuyến tính là = kiX^ + bi, B có phương trình tuyến tính y = kjXg + bj thì khi Ya= Yb => Fg= x^/Xb= kj/kjH- (bj- bi)/kjXB với Xg nằm trong khoảng khảo sát ta tính được giá trị gần đúng của F

- Cách 2: Xác định giá trị của độ hấp thụ riêng của từng chất và tính hệ số đáp ứng dựa vào độ hấp thụ riêng Ví dụ: có 2 chất A và B, A được chọn làm chất chuẩn có hệ số đáp ứng là 1, khi đó hệ số đáp ứng của B sẽ là:

F = E\^/E*,b

- Cách 3: Tính hệ số đáp ứng dựa vào kết quả đo tại từng điểm rồi tính hệ

số hiệu chỉnh trung bình của các điểm Ví dụ có 2 chất A và

/>