Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 5 (3 bromobenzyliden) 2 thiohydantoin và một số dẫn chất base mannich

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI CÔNG HƯNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA 5-3’- THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN BROMOBENZYLIDEN-2-CHẤT BASE MANNICH KHÓA LUẬN TỐ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI CÔNG HƯNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA 5-(3’-

THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN

BROMOBENZYLIDEN)-2-CHẤT BASE MANNICH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

MAI CÔNG HƯNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA 5-(3’-

THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Vũ

Trần Anh, DS Tô Ái An và PGS TS Nguyễn Quang Đạt đã hết lòng chỉ

bảo, giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của: Ths Đặng Vũ Lương (Phòng NMR- Viện Hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), TS

Trần Thị Như Hằng (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên), TS Đào Thị Nhung (Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa- Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội) và toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa hữu cơ, các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban- Trường Đại học Dược Hà Nội

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng như tài liệu tham khảo nên khóa luận của tôi không thể tránh khỏi những sai sót, khiếm khuyết trong nội dung và hình thức, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

MAI CÔNG HƯNG

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EGFR : Epidermal growth factor receptor

(thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô)

Hep-G2 : Tế bào ung thư gan ở người

34

3.4 Số liệu phổ 13

C-NMR của I và các dẫn chất base Mannich (Ia-c) 35 3.5 Số liệu phổ ESI-MS của I và các dẫn chất base Mannich (Ia-c) 36 3.6 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư

gan Hep-G2 của các chất tổng hợp được (theo phương pháp

SRB)

36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nghiên cứu và phát triển thuốc mới là một lĩnh vực khoa học tự nhiên đã

ra đời rất lâu và ngày càng phát triển Ở Việt Nam trước đây lĩnh vực này chưa phát triển song gần đây nghiên cứu và phát triển thuốc mới đã bắt đầu thu hút được sự chú ý của nhiều nhóm nghiên cứu và một số tập đoàn dược phẩm lớn trong nước

Trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới cần phải tổng hợp một số lượng lớn dẫn chất để: xác định pharmacophore (cấu trúc tác dụng chính); xác định mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng; tìm dẫn chất với tác dụng tốt hơn, tác dụng phụ ít hơn hoặc dược động học tối ưu cho sử dụng trên

Trên thế giới, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu về tổng hợp hóa học, tác dụng sinh học và ứng dụng làm thuốc của các dẫn chất 2-thiohydantoin [9], [14], [30]… Trong đó nhiều dẫn chất của 2-thiohydantoin

có tác dụng chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và ức chế aldose reductase,… đáng quan tâm [16], [20], [21], [23], [36], [39], [40]

Để góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất 2-thiohydantoin có tiềm năng về hoạt tính sinh học, chúng tôi thực hiện khóa luận với các mục tiêu sau:

1 Tổng hợp dẫn chất 5-(3‟-bromobenzyliden)-2-thiohydantoin và một số dẫn chất base Mannich

2 Thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tác dụng sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin

2-thiohydantoin là hợp chất dị vòng được tạo thành nhờ phản ứng ngưng

tụ giữa một amino acid với một dẫn chất của thiocyanat Bản thân thiohydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng sinh học đã được biết đến trong thời gian dài Nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng đa dạng như: kháng tế bào ung thư [1], [5], [10], [39], [40], kháng đột biến gen [30], kháng virus [14], kháng virus HIV [20], kháng khuẩn [21], [23], ức chế enzyme aldose reductase [36]

2-… Ngoài ra 2-thiohydantoin còn được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực khác như sản xuất thuốc trừ sâu [37], thuốc nhuộm [37]…

1.1.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Merbaron là một dẫn chất của 2-thiobarbituric, có tác dụng gây độc tế bào với tế bào ung thư máu và một số tế bào ung thư khác

HN

N H

H N O

O

Merbaron

Dựa trên sự tương tự về cấu trúc của 2-thiohydantoin, Blanc và Cussac

[38] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 2-thiohydantoin (1a-d), thử

tác dụng gây tăng miễn dịch và gây độc tế bào Kết quả thử nghiệm cho thấy

các dẫn chất tổng hợp được 1(a-d) có tác dụng gây tăng miễn dịch yếu, và có

tác dụng trên các tế bào ung thư thử nghiệm

N

S O

Năm 2010, một số dẫn chất của 2-thiohydantoin (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) đã

được tác giả Al-Obaid và các cộng sự [9] nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng invitro về tác dụng chống ung thư trên 60 dòng tế bào người ở 5 nồng độ khác

nhau Kết quả thu được đáng chú ý là chất 2, 7 có tác dụng kháng tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư bạch cầu, các chất 3, 4, 5, 6, 8 có tác dụng ngăn

cản sự phân bào và kìm hãm sự phát triển tế bào thử nghiệm

CH

N H NH O

CH

N H NH O

S

3

Acid 4-ylidenemethyl)-thiophen-2-ylsulfanyl]-benzoic

O

CH

N H NH O

S

4

cyclopenta[b]naphthalen-2-ylmethylen)-2-thioxo-imidazolidin-4-on

N H N O

S

S

Br

O N

5

morpholin-4-ylmethyl-2-thioxo-

5-(5-bromo-thiophen-2-ylmethylen)-3-imidazolidin-4-on

O OAc OAc

AcO

CH

N NH O

3-acetoxy-6-acetoxymethyl-2-[4-(5-O OAc OAc

AcO H AcO

CH

N N O

S Ph

7

Acid triacetoxy-6-acetoxymethyl-tetrahydro-pyran-2-ylsulfanyl)-1,5-dihydro-

2-{5-[5-oxo-1-phenyl-2-(3,4,5-ylsulfanyl}-benzoic

imidazol-4-ylidenemethyl]-thiophen-2-CH

N N O

S

S

Br

O N

O OAc OAc

AcO H AcO

8

2-ylmethylene)-1-morpholin-4-ylmethyl-5-oxo-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-

3,4,5-triacetoxy-6-[4-(5-bromo-thiophen-ylsulfanyl]-tetrahydro-pyran-2-ylmethyl acetat

Nguyên nhân chính của ung thƣ kháng thuốc là do nồng độ quá cao của bơm tống thuốc phụ thuộc ATP khiến cho giảm nồng độ thuốc, trong đó có nồng độ quá cao của chất vận chuyển đa thuốc ABC (ví dụ P-glycoprotein)

Nhiều nhóm chức hóa học có khả năng ức chế loại bơm tống thuốc (loại có chứa P-gp), bao gồm 3 thế hệ điều biến P-gp Các nghiên cứu cho thấy chất 5-(3-methoxy-benzyliden)-3-{3-[4-(2-methoxy-phenyl)-piperazin-1-yl]-

N N

O O

H N O

S

10

Tác giả Spengler và Hadzlik [16] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 5-aryliden-2-(thio)hydantoin và thử tác dụng ức chế bơm tống thuốc của các dẫn chất này Chất 5-(biphenyl-4-yl)methylen-2-thioxo-imidazolidin-4-on

(10) có tác dụng ức chế chất điều biến P-Glycoprotein trong tế bào ung thư

tương tự verapamil

N H

H N O

S

10

Dựa trên đó, tác giả Hadzlik và cộng sự [16] tiếp tục tổng hợp dẫn chất của 5-aryliden-2-(thio)hydantoin theo sơ đồ chuyển hóa:

N H

H N S O

Ar

ArOH

N

H N SCH3O

Ar

CH3I

N HN

HO

N

H N O

HO

Các tác giả đã thử tác dụng ức chế bơm tống thuốc của các dẫn chất đã tổng hợp đƣợc trên các tế bào lympho T đã kháng thuốc của chuột có gen vận chuyển thuốc ABCB1 Kết quả cho thấy một số dẫn chất có tác dụng yếu trên

bơm tống thuốc ở tế bào ung thƣ thử nghiệm, tác dụng yếu hơn chất 4 Hợp

Một số nghiên cứu của tác giả Tô Ái An [1], tác giả Trần Đức Lai [5] gần đây cho thấy một số dẫn chất của 5-aryliden-2-thiohydantoin có tác dụng

ức chế tế bào ung thƣ gan Hep-G2 ví dụ:

(5-(4’-clorobenzyliden)-2-thiohydantion (IC50= 4,66 µg/ml),

đại tràng HTC116 ( 5-(2’-clorobenzyliden)-2-thiohydantion (IC50= 24,40

Escherichia coli (RCMB 000106) (Gram âm) Các chất tổng hợp đƣợc thử tác

dụng kháng nấm trên các chủng Aspergillus fumigates (RCMB 002006),

Geotrichum candidum (RCMB 005008), Candida albicans (RCMB 005003), Syncephalastrum racemosum (RCMB 005004) Kết quả cho thấy các chất

tổng hợp đƣợc đều có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Chất

5-oxo-2-thioxo-1-(2-p-tolyl-ethylideneamino)-imidazolidin-4-yl acetat (12) có tác

dụng tốt nhất trên chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm Chất

1-acetyl-3-[(p-tolylethyliden)amino]-2-thiohydantoin (13) và chất [(p-tolylethyliden)amino]-2-thiohydantoin (14) có tác dụng trung bình Chất

5-thiophen-2-yliden-3-1-acetyl-3-[(p-tolylethyliden)amino]-5-thiophen-2-yliden-2-thihydantoin (15)

có tác dụng tốt trên chủng vi khuẩn và tác dụng trung bình trên chủng nấm thử nghiệm

N H

N S O

N

CH3

N H

N S O

S

O

15

Năm 2010, tác giả Abd El Fattah [8] đã tổng hợp một số dẫn chất của

thiohydantoin và thử hoạt tính trên 4 dòng vi khuẩn là: Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas species và 1 dòng vi

nấm là Candida albicans Kết quả thu đƣợc cho thấy các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng tốt trên dòng vi khuẩn Pseudomonas sp; các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng yếu trên dòng Escherichia coli; 18, 19 tác dụng rất tốt trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus; 16, 17, 19, 20 tác dụng rất tốt trên dòng vi nấm

Candida albicans

N N N

2-[(3-acetyl-5-oxo-2-thioxo-NH N

N Br

5-acetyl-3-[(5-bromo-2-hydroxy-N N N

oxo-2-thioxo-imidazolidin-1-

4-bromo-2-[(3,4-diacetyl-4-bromo-5-ylimino)-methyl]-phenyl acetat

NH N

N H Br

OH H2NHN

H2NHN

19

imidazolidin-1-ylamino)-methyl]-phenol

4-bromo-2-[(2,5-dihydrazino-NH N

N Br

3-[(5-bromo-2-hydroxy-benzyliden)-Tác giả Trần Đức Lai[5] đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất của 5-aryliden-2-thiohydantoin, kết

quả cho thấy có một số chất có tác dụng kháng chủng vi khuẩn B.Subtilis (MIC=25-50µg/ml), đó là các chất (5-(2’-clorobenzyliden)-2-thiohydantion,

đến chuyển hóa lipid và carbonhydrat như đái tháo đường typ 2, biệt hóa tế bào mô mỡ, bệnh Hodgkin, bệnh bạch cầu, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến…

OTol

HN N

N HN O

O

O

O TolO

OTol

HN N

R

O OH

H2N

S

NH S

O R

+ thiết bị đun cách acid ở nhiệt độ không đổi

Phản ứng này cho hiệu suất khác nhau ứng với các amino acid khác nhau

và điều kiện phản ứng khác nhau Hiệu suất cao nhất khi sử dụng điều kiện đun cách dầu, dao động từ 70% đến gần như 100% [22], [37]

1.2.1.2 Phản ứng của các α-amino acid với amonium thiocyanat

Năm 1913, Treat Johson và Water Scott [19] tìm ra phản ứng giữa amino acids với amonium thiocyanat trong môi trường anhydrid acetic khan Sản phẩm trung gian thu được là acylthiohydantoin, sản phẩm trung gian này

α-bị thủy phân trong môi trường acid ở nhiệt độ cao sẽ sinh ra 2-thiohydantoin

N H

H N S O

CH3O

Trong bài báo này, tác giả đã thực hiện phản ứng tổng hợp thiohydantoin

và dẫn chất từ 7 acid khác nhau là: acid aceticphtalamic, acid

p-methoxyhippuric, acid carbethoxyaminoacetic, acid m-nitrohippuric,

acetyldibromphenylalanin, benzoylalanin, acid phenylsulfonaminoacetic Năm 2006, Samuel Reyes và cộng sự [28] đã tiến hành tổng theo phương pháp trên và thu được kết 2-thiohydantoin Năm 2011, Sandrine Gosling và cộng sự [15] cũng đã xây dựng qui trình tổng hợp 2-thiohydantoin theo sơ đồ như trên và chúng tôi lựa chọn thực hiện tổng hợp 2-thiohydantoin theo qui trình này

1.2.1.3 Phản ứng của glycin ethyl ester thiocyanat với acid amin

Glycin ethyl ester thiocyanat kết hợp với acid amin, đun hồi lưu trong cloroform trong 4 giờ được dẫn chất thế ở vị trí 3 của uredoacetic ethyl ester, sau đó đun hồi lưu trong ethanol/acid hydrochloric (nồng độ 10N, tỷ lệ 1:1) thu được 2-thiohydantoin có nhóm thế ở vị trí 3 như mong muốn [37]

H N

O

H N R S

Từ cấu trúc phân tử 2-thiohydantoin cho thấy nhiều khả năng phản ứng chuyển hóa để tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau của 2-thiohydantoin [12], [23], [37]… Các phản ứng thực hiện theo hướng chính sau:

- Phản ứng thế vào vị trí nitơ N-1 và N-3

- Phản ứng của nhóm methylen hoạt động ở C-5

H R OH

S

O C

H R

Phản ứng ngưng tụ có thể thực hiện ở các điều kiện khác nhau: dưới điều kiện phản ứng với aldehyd thơm, xúc tác natri acetat, acid acetic băng [21], [36]; ngưng tụ với các aldehyd thơm, xúc tác ethanolamin/EtOH [23], [25], xúc tác piperidin/EtOH [14], dưới điều kiện vi sóng [26]…

Về cơ chế phản ứng Knoevenagel [3], [24]

Phản ứng ngưng tụ các aldehyd thơm và một số hợp chất dị vòng chứa nhóm aldehyd với 2-thiohydantoin xảy ra theo cơ chế phản ứng Knoevenagel tương tự như với các hợp chất có nhóm methylen hoạt động khác

Với xúc tác ethanolamin là amin bậc 1, có thể trình bày cơ chế phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với 2-thiohydantoin theo cơ chế Knoevenagel theo các bước sau:

- Aldehyd thơm ngưng tụ với ethanolamin tạo arylidenimin:

Ar C

H O H2N CH2CH2OH Ar

H C OH

N H

HN NO

S

O H

C Ar N

H

NH S

O H

C Ar NH

C Ar NH

Nhóm methylen ở vị trí 5 của 2-thiohydantoin rất hoạt động, nguyên tử

H ở đây dễ dàng tách khỏi carbon (khi có xúc tác base) và anion (II) đƣợc tạo thành là một tác nhân ái nhân mạnh:

N H

NH S

O

N H

NH S

NH S

O H CH Ar O

Ion alcolat (IV) tạo thành lại lấy một proton của BH, trả lại xúc tác B(-) :

N

NH S

O H HC Ar

O (IV)

H

NH S

O H HC Ar OH (V)

+

- Giai đoạn ngưng tụ loại nước:

N H

NH S

NH

CH Ar

NH C

H Ar

N H

NH O

O Ar-CHO

3 4 5

N H

NH O

O

1 3 4 5Ar

+

- H2O AcOH, AcONa

Phương pháp của Wheeler và Hoffman được sử dụng để tổng hợp nhiều dẫn chất thế ở C-5 của hydantoin Một nhược điểm của phương pháp trên là phải sử dụng một lượng lớn acid acetic và natri acetat

Năm 1992, Chazeau V., và cộng sự [40] đã xây dựng qui trình tổng hợp một số dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin dựa trên nghiên cứu của Wheeler

và Hoffman

Năm 1993, János Marton [23] sử dụng xúc tác có tính base mạnh là ethanolamin để tiến hành phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với hydantoin trong dung môi là hỗn hợp nước:ethanol (1:1), phản ứng tiến hành ở nhiệt độ hồi lưu trong 4 giờ Tác giả đã sử dụng một số aldehyd thơm (p-

clorobenzaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-hydroxybenzaldehyd, ), hiệu suất phản ứng 44-89%.

NH O O

R = Alkyl, alkoxy (-OR), -NR, -OH, -X, -CN, -CF3, -NO2

Chúng tôi sử dụng xúc tác natri acetat trong dung môi acid acetic để tổng hợp 5-aryliden-2-thiohydantoin ( 5-(3‟-bromobenzyliden)-2-thiohydantion )

đi từ aldehyd 3-bromobenzaldehyd

1.2.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất base Mannich

Phản ứng Mannich là phản ứng aminomethyl hóa các hợp chất hữu cơ có nguyên tử H linh động bằng tác dụng của formaldehyd (hoặc các aldehyd khác) và các amin bậc 1, amin bậc 2 hoặc amoniac [24], [32]

Trong môi trường acid, phản ứng xảy ra qua hai bước theo cơ chế sau:

- Bước 1: Amin phản ứng với formaldehyd tạo dẫn chất hydroxymethyl, dẫn xuất này gắn proton và loại một phân tử nước để tạo ra cation aminomethyl:

- H+

+ Trường hợp hợp chất có hydro linh động không có khả năng enol hóa (như trường hợp hydro linh động ở các liên kết N-H, S-H, Se-H, P-H hoặc ở liên kết C-H ở nhân indol, pyrol…) thì cation aminomethyl phản ứng với nguyên tử mang H linh động tạo ra sản phẩm base Mannich:

- H+

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi

2.2 Thiết bị thí nghiệm

- Dụng cụ thủy tinh (bình cầu 3 cổ dung tích 100ml, 250ml, 500ml, sinh hàn, ống đong, cốc có mỏ các loại, bình lọc hút… )

- Dụng cụ sứ (phễu buchner)

- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật)

- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)

- Bơm hút chân không VRL mode 200-7.0 (Mỹ)

- Máy cất quay Büchi R-210 (Thụy sỹ)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Tủ sấy chân không Shellab (Đức)

- Máy khuấy từ và bếp đun IKA-RCT (Đức)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ)

- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer và máy FTIR 1S, tại Phòng Hóa vật liệu, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Afinity Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC) ghi trên máy AVANCE, Bruker AV500 tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng (LC/MS) ghi trên máy LC-MSD-Trap-SL tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy LTQ Orbitrap XL™ Hybrid Ion Trap tại Phòng Hóa vật liệu, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp và xác định cấu trúc dẫn chất 5-(3‟-bromobenzyliden)- thiohydantoin và một số dẫn chất base Mannich

2 Thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư gan Hep2 G2 của các chất tổng hợp được

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tổng hợp 5-(3’-bromobenzyliden)-2-thiohydantoin và dẫn chất base Mannich

- Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến

- Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được

- Dùng SKLM để theo dõi phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết

2.4.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Các phương pháp phổ (IR, 1

H-NMR, 13C-NMR, MS) được sử dụng để khẳng định cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được Các số liệu phổ của các chất tổng hợp được đối chiếu với tài liệu

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được theo phương pháp SRB [18], [29], [33]

Nguyên tắc:

Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót

của tế bào Tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng

Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành aminoxanthin có màu hồng, được các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu Càng nhiều tế bào sống, sự hấp thu càng nhiều Các tế bào sống, sau đó được cố định Định lượng các chất màu được tế bào hấp thu bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 495-515 nm Từ đó tính được số lượng tế bào sống sót Phương pháp này hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National

Cancer Institution - NCI)

- Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến

vi lượng 96 giếng đối với phương pháp SRB

- Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử được ủ trong tủ ấm CO2/370C để tế bào tiếp tục phát triển

- Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ-72 giờ (37oC, 5% CO2)cho phép chất thử phát huy tác dụng

b/ Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp SRB [29]

- Tế bào sau khi được ủ từ 48-72 giờ được cố định bằng TCA ở 40C trong 1 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước và để khô tự nhiên

- Thêm 50 μl dung dịch sulphorhodamin B (SRB) vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy, nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Rửa sạch dung dịch sulphorhodamin B (SRB) dư bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần

- Hoàn trả sulphorhodamin B đã được nhuộm vào tế bào Lắc kỹ để hòa tan hoàn toàn

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên đƣợc đƣa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình  độ lệch tiêu chuẩn của phép thử đƣợc lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan nhƣ sau

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tổng hợp hóa học

Trong khóa luận này chúng tôi tiến hành tổng hợp bromobenzyliden)-2-thiohydantion và một số dẫn chất base Mannich của nó bao gồm các công việc sau:

5-(3‟ Tổng hợp 25-(3‟ thiohydantoin bằng phản ứng giữa glycin và amonithiocyanat trong anhydrid acetic theo quy trình của Sandrine Gosling [15] và János Marton [23]

O Glycin 1-acetyl-2-thiohydantoin (A) 2-thiohydantoin (BT)

- Tổng hợp 5-(3‟-bromobenzyliden)-2-thiohydantion (I) bằng phản ứng ngưng tụ 2-thiohydantoin (BT) với 3-bromobenzaldehyd:

- Tổng hợp các dẫn chất base Mannich của

5-(3‟-bromobenzyliden)-2-thiohydantion (Ia-c) theo sơ đồ phản ứng sau:

1 5 3 4 2

CTPT: C5H6N2O2S, KLPT: 158,18

Tiến hành:

Cho vào bình cầu 46,00g (0,613mol) glycin, 46,60g (0,613mol) amoni thioacetat, thêm 174 ml anhydrid acetic, đun cách dầu và khuấy đều hỗn hợp phản ứng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với dung môi khai triển là Hexan/EtOAc (7:3) Phản ứng được tiến hành ở 1000C trong 30 phút Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được rót vào 500 ml nước đá, để lạnh trong 4 giờ

Chất rắn màu vàng xuất hiện được lọc, rửa bằng nước lạnh 3 lần, mỗi lần 150ml

Khối lượng sản phẩm: 59,27g Hiệu suất: 61,09%

Nhiệt độ nóng chảy: 172-1730C (tài liệu [23], t0

H N S

O

3 4 5

CTPT: C3H4N2OS, KLPT: 116,14

Tiến hành:

59,27g (0,375mol) chất A được phân tán trong 294ml HCl 10% Đun hồi

lưu trong vòng 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CH2Cl2/MeOH (14:1) Kết thúc phản ứng cho than hoạt vào hỗn hợp phản ứng và lọc nóng Dịch lọc được để lạnh qua đêm, thu được kết tủa, lọc tủa, rửa nước đến hết acid (thử bằng giấy quỳ) Sấy khô tủa thu được Kết tinh lại trong nước

Khối lượng sản phẩm: 19,12g chất rắn màu cam Hiệu suất: 43,99%

Nhiệt độ nóng chảy: 229-2300C (tài liệu [23], t0

C= 230-2320C; Catalogue Sigma Aldrich, t0C= 229-2310C)

Rf = 0,68 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (14:1))

1

H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): xem phụ lục 2.2, bảng 3.2

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 5-(3’-bromobenzyliden)-2-thiohydantion (I)

Công thức:

CH Br

N H NH O

S

1' 2' 3'

4'

3 4 5

CTPT: C10H7BrN2OS, KLPT: 283,14

Tiến hành:

Cho vào bình cầu phản ứng 2,32g (0,020mol) chất BT, 3,70g (0,020mol)

3-bromobenzaldehyd, 7,54g (0,092mol) natri acetat khan và 44ml acid acetic băng Khuấy đều cho hỗn hợp tan hoàn toàn và đun nóng hỗn hợp, đun hồi lưu Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CH2Cl2 : MeOH (14:1) Xác định thời gian phản ứng là 2 giờ Để nguội, đổ hỗn hợp ra cốc có mỏ, ngâm lạnh 15 phút sau đó để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Rửa tủa vài lần bằng cồn lạnh Lọc hút kiệt, rửa tủa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi hết acid acetic (thử bằng giấy quỳ) Sấy khô sản phẩm thô thu được Kết tinh lại sản phẩm thô bằng EtOH

Khối lượng sản phẩm: 4,41g chất rắn màu vàng Hiệu suất: 77,87%

Nhiệt độ nóng chảy: 216-2170

C

Rf = 0,82 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1))

Rf = 0,60 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi Hexan: Aceton (3:2))

5-(3’-bromobenzyliden)-Trong phần tổng quan, chúng tôi đã trình bày về phản ứng Mannich Căn

cứ trên các kết quả nghiên cứu đã công bố, chúng tôi chọn điều kiện tiến hành

phản ứng Mannich của 5-(3‟-bromobenzyliden)-2-thiohydantion (I) là nhiệt

độ 850C với tỷ lệ số mol dẫn chất 2-thiohydantoin : formaldehyd : amin là

1:1:1 Chúng tôi tiến hành tổng hợp một số dẫn chất Mannich của chất I bằng cách cho chất I tác dụng với formaldehyd và 3 amin (morpholin, piperidin, N-

methylpiperazin)

Quy trình tổng hợp chung:

Cho vào bình phản ứng 0,0025 mol chất I, thêm 15ml EtOH, khuấy ở

nhiệt độ phòng cho phân tán đều trong 15 phút Cho tiếp 0,0025 mol formaldehyd (0,21ml formol) và 0,0025 mol amin, 3-4 giọt CH3COOH băng, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Sau đó đun cách thủy nâng dần nhiệt độ tới 850C để hỗn hợp tan hoàn toàn Sau đó, tiếp tục khuấy và giữ nhiệt độ hồi lưu Theo dõi SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1) trên bản mỏng silicagel 60 GF254, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Sau

6 giờ phản ứng đạt tối ưu Đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ, để nguội đến nhiệt độ phòng, để tủ lạnh trong 24 giờ Sau đó cạo thành cốc thật kỹ để tạo tủa tốt Lọc hút, rửa tủa bằng EtOH lạnh thu được sản phẩm thô Kết tinh lại trong dung môi thích hợp, sấy khô ở 600C trong tủ sấy chân không trong 3h thu được sản phẩm

Sau đây là các trường hợp cụ thể:

1) 5-(3’-bromobenzyliden)-3-morpholinomethyl-2-thiohydantoin (Ia)

Công thức

CH Br

N H

O

S

1' 2' 3'

4'

5' 6'

1 23 4 5

1''

2'' 3''

4'' 5'' 6''

CTPT: C15H16BrN3O2S; KLPT: 382,28

Tiến hành:

0,71g (0,0025mol) chất I, 0,21ml formol (0,0025mol formaldehyd),

0,22g (0,0025mol) morpholin, 15ml hỗn hợp EtOH, 3 giọt acid acetic băng

Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CH2Cl2/MeOH

(14:1) Đun hồi lưu trong vòng 6 giờ, kết tinh lại trong 8 ml EtOH

Sản phẩm thu được là 0,45g chất kết tinh màu vàng Hiệu suất 47,09%

Nhiệt độ nóng chảy: 158-1590

C

Rf = 0,94 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1))

Rf = 0,77 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi H2O : AcOH : MeOH (5:1:4))

N H

O

S

1' 2' 3'

4'

3 4

2'' 3''

4''

CTPT: C16H18ClN3OS; KLPT: 380,3

Tiến hành:

0,71g (0,0025mol) chất I, 0,21ml formol (0,0025mol formaldehyd),

0,21g (0,0025mol) piperidin, 15ml hỗn hợp EtOH, 3 giọt acid acetic băng Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CH2Cl2/MeOH (14:1) Đun hồi lưu trong vòng 2 giờ, kết tinh lại trong 12ml EtOH

Sản phẩm thu được là 0,65g chất kết tinh màu vàng Hiệu suất 68,37%

Nhiệt độ nóng chảy: 165-1660

C

Rf = 0,93 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1))

Rf = 0,75 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi H2O : AcOH : MeOH (5:1:4))

IR (KBr, υ max (cm -1 )): xem phụ lục 5.1, bảng 3.3

Công thức:

CH Br

N H

O

S

1' 2' 3'

4' 5' 6'

1 23 4

2'' 3''

0,71g (0,0025mol) chất I, 0,21ml formol (0,0025mol formaldehyd),

0,25g (0,0025mol) N-methylpiperazin, 15ml hỗn hợp EtOH, 3 giọt acid acetic Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển

CH2Cl2/MeOH (14:1) Đun hồi lưu trong vòng 6 giờ, kết tinh lại trong 12ml EtOH

Sản phẩm thu được là 0,37g chất kết tinh màu vàng Hiệu suất 37,44%

Nhiệt độ nóng chảy: 137-1380

C

Rf = 0,94 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1))

Rf = 0,78 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi H2O : AcOH : MeOH (5:1:4))

Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer và máy FTIR 1S với kỹ thuật viên nén với KBr tại Bộ môn Hóa vật liệu, Khoa hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 4 phổ đồ được ghi ở các phụ lục 3.1 † 6.1 Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại được ghi ở bảng 3.3

Afinity-3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, 13C và phổ tương tác hai chiều NMR) được ghi trên máy phổ AVANCE Spectrometer AV500 (BRUKER,

(2D-Đức) trong dung môi DMSO-d6, chất chuẩn nội TMS tại Viện Hóa học - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 7 phổ 1H được ghi ở các phụ lục

1 † 2, 3.2 † 6.2, 4 phổ 13C được ghi ở các phụ lục 3.3 † 6.3 Kết quả phân tích

số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và 13C được ghi ở bảng 3.2, 3.3, 3.4

3.2.3 Phổ khối lượng

Các chất tổng hợp được ghi phổ khối lượng theo phương pháp phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy LTQ Orbitrap XL™ Hybrid Ion Trap, Bộ môn Hóa vật liệu, Khoa hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và máy LC-MSD-Trap-SL tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 4 phổ đồ được ghi ở các phụ lục 3.4 † 6.4 Kết quả

phân tích phổ MS của 4 chất (I, Ia-c) được trình bày ở bảng 3.5

3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư người được tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm-Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên

(Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Tại Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) 4 chất do chúng tôi tổng hợp

(I, Ia-c) đã được thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng dòng tế bào ung thư

gan Hep-G2 theo phương pháp SRB Kết quả được trình bày ở bảng 3.5

Kết quả cho thấy cả 4 chất là chất I (IC50= 3,22 µg/ml); chất Ia (IC50=

3,33 µg/ml); chất Ib (IC50= 3,16 µg/ml); chất Ic (IC50= 4,65 µg/ml) có hoạt

tính ức chế tế bào ung thư gan Hep-G2

Bảng 3.1: Kết quả tổng hợp 2-thiohydantoin (BT) và các dẫn chất của nó (I, Ia-c)

Dung môi kết tinh lại

Nhiệt độ nóng chảy (t 0 C)

R f Hiệu suất

(%)

1 BT

N H

H N S

S

1' 2' 3'

4'

5' 6'

1 2 3 4

1 2 4 5

1'' 2'' 3''

O

S

1' 2' 3' 4' 5' 6'

1 2 3 4

5 1''

2'' 3'' 4''

S

1' 2' 3'

4'

5' 6'

1 3

2'' 3'' 4''

5'' 6''

CH3

Ghi chú: *Hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (14:1); **Hệ dung môi: Hexan: MeOH (3:2);

***Hệ dung môi H2O : AcOH : MeOH (5:1:4)