Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của n hydroxy 4 (3 hydroxyimino 2 oxo 1 indolinyl) methylcinnamamid và một số dẫn chất

Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [1,2,4].. Hơn n

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khoá luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám

ơn chân thành đến GS.TS Nguyễn Hải Nam - Trưởng bộ môn Hóa Dược và

DS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hoá Dược - trường Đại học Dược Hà Nội,

người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khoá luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hoá Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hoá - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Đào Quang Tùng

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2

1.1.1 Khái niệm về histon deacetylase 3

1.1.2 Phân loại các HDAC 3

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC 5

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 7

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC 7

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 9

1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 10

1.3.1 Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC 10 1.3.2 Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới 11

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 17

2.1.1 Hóa chất 17

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Tổng hợp hóa học 18

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3.1 Tổng hợp hóa học 18

2.3.2 Thử tác dụng sinh học 19

2.3.3 Đánh giá mức độ giống thuốc cuả chất tổng hợp được 22

2.3.4 Nghiên cứu Docking 22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 HÓA HỌC 23

3.1.1 Tổng hợp hóa học 23

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 30

3.1.3 Xác định cấu trúc 31

3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 37

3.2.1 Thử hoạt tính sinh học 37

3.2.2 Đánh giá mức độ giống thuốc 39

3.2.3 Sơ bộ đánh giá khả năng tương tác với HDAC (docking) 41

3.3 BÀN LUẬN 40

3.3.1 Tổng hợp hóa học 41

3.3.2 Tác dụng sinh học 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

AML : Bệnh ung thư bạch cầu dạng tuỷ cấp tính

AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tuỵ

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ carbon (carbon nuclear magnetic resonance)

CTCL : U tế bào lympho T dưới da (Cutaneous T cell lymphoma) DCM : Dicloromethan

DHFR : Dihydrofolat reductase

DMF : Dimethylformamid

DMSO : Dimethyl sulfoxid

HAT : Histon acetyltransferase

HDAC : Histon deacetylase

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (proton nuclear magnetic resonance)

IC50 : Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào giảm xuống một nửa

IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MeOH : Methanol

MS : Phổ khối lượng

NSCLC : Ung thư phổi tế bào tế bào không nhỏ (non-small lung cell) NST : Nhiễm sắc thể

PC-3 : Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

SAHA : Acid sulberoylanillid hydroxamic

SRB : Sulforhodamin B

SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng

TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

Tonc : Nhiệt độ nóng chảy

TSA : Trichosatin A

4 Bảng 1.4: Cấu trúc và tác dụng ức chế HDAC và DHFR của

2 dẫn chất acid hydroxamic khung acid folic (IC50, µM) 16

5 Bảng 3.1: Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid

6 Bảng 3.2: Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to

nc) cuả các chất

9 Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất 3a-d 34

10 Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất 3a-d 36

12 Bảng 3.7: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các chất

13 Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

14 Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 3a-d

11 Bảng 3.10: Kết quả docking của các chất 3a-d với HDAC2 41

15 Bảng 3.11: So sánh hoạt tính kháng tế bào ung thư 3a-d và

IIIa,d,f

44

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1: Cấu trúc của lõi histon với các vị trí ε-N acetyl

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza®, 2006) là chất ức chế histon deacetylase đầu tiên được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T Sau đó, năm 2009 depsipeptid (Romidepsin®) một chất ức chế HDAC khác cũng được FDA cấp phép trong điều trị ung thư tại Mỹ Như vậy có thể thấy, HDAC là một mục tiêu phân tử quan trọng trong điều trị ung thư và các chất ức chế HDAC là các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng

Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội đã thiết

kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [1,2,4] Các nghiên cứu gần đây tại bộ môn về các acid hydroxamic có tác dụng ức chế HDAC cho thấy khi thiết kế nhóm nhận diện bề mặt của của các acid hydroxamic hướng ức chế HDAC bằng

vòng thơm như 3-hydroxyimino-2-oxoindolin cho hoạt tính in vitro rất khả

quan [4] Hơn nữa, một số nghiên cứu cho thấy việc thay đổi cầu nối mạch thẳng của acid hydroxamic bằng cầu nối có chứa nhân thơm mang lại hoạt tính kháng tế bào ung thư cao đồng thời tạo được hợp chất có xu hướng ức chế chọn lọc trên HDAC [9] Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi thiết

kế các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin

với cầu nối 3-phenyl-2-propenamid và tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử tác

-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl)methylcinnamamid và một số dẫn chất” với hai mục tiêu:

1 Tổng hợp N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl)methyl

cinnamamid và 3 dẫn chất

2 Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp

được

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

Quá trình dịch mã ở tế bào eukaryota bị ảnh hưởng bởi trạng thái xoắn của ADN [36] Ở các tế bào trong pha nghỉ, ADN ở trạng thái đóng xoắn để ngăn

sự tiếp cận của các yếu tố dịch mã ADN được gắn vào chromatin, một phức hợp protein - ADN có cấu trúc động và tính tổ chức cao Đơn vị cấu trúc cơ bản của chromatin là nucleosom, gồm một octamer hình đĩa của bốn lõi histon (1 tetramer H3/H4 và 2 dimer H2A/H2B) được bao quanh bởi 146 cặp ADN [36,38] (hình 1.1):

Hình 1.1: Cấu trúc của lõi histon với những vị trí ε-N acetyl lysin ở mạch

nhánh

Sự có mặt của các phân tử lysin bị acetyl hóa ở đuôi histon dẫn đến việc xuất hiện nhiều chromatin ở dạng tháo xoắn và kích hoạt quá trình dịch mã gen, trong khi sự deacetyl hóa ở phần đuôi lysin sẽ tạo nhiều chromatin ở trạng thái đóng xoắn và hạn chế quá trình dịch mã gen Quá trình deactyl hóa histon sẽ làm tăng tương tác ion giữa đầu amin tích điện dương của histon và nhóm phosphat mang điện âm trên ADN khiến cho chromatin ở trạng thái đóng xoắn và làm ức chế quá trình dịch mã gen và tổng hợp protein Mức độ acetyl hóa histon là kết quả của sự cân bằng trong hoạt động của hai enzym

3

histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [18,20,31,35,40]

1.1.1 Khái niệm về histon deacetylase

HDAC là một nhóm các enzym được phát hiện ở nhiều loại sinh vật như vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật, có tác dụng xúc tác quá trình loại bỏ nhóm

acetyl từ ε-N-acetyl lysin amino acid của nhiều cơ chất protein, trong đó có

histon HDAC có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase (HAT) - enzym xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến ε-amino của lysin ở đầu

N của histon [12,45] (hình 1.2):

Hình 1.2: Vai trò cân bằng động của HDAC và HAT

1.1.2 Phân loại các HDAC

Có 18 loại HDAC ở động vật có vú đã được nhận biết và chia thành 4 nhóm dựa trên sự tương đồng cấu trúc của chúng với HDAC của nấm men (hình 1.3) [12,35,36]:

Nhóm I: gồm HDAC 1, 2, 3 và 8; có cấu trúc tương đồng với Rpd3 trong nấm men và nằm trong nhân

Nhóm II: gồm HDAC 4, 5, 6, 7, 9 và 10; có cấu trúc tương đồng với Hda1 của nấm men và có thể được chia thành hai phân nhóm:

Phân nhóm IIa: gồm HDAC 4, 5, 7 và 9

Phân nhóm IIb: gồm HDAC 6 và 10

Nhóm III: Gồm các protein điều hòa chuỗi truyền thông tin:

4

- Chất đồng đẳng của Sir2 trong nấm men Saccharomyces cerevisiae

- Sirtuin trong động vật có vú (SIRT 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7)

Nhóm IV: HDAC 11, có cấu trúc tương đồng với cả nhóm I và II

Các HDAC nằm trong nhóm I, II và IV được gọi là các HDAC “kinh điển” trong khi các HDAC thuộc nhóm III được gọi là các sirtuin [36] Các HDAC

“kinh điển” và sirtuin có cơ chế xúc tác khác nhau Các enzym có bản chất phụ thuộc Zn2+ như cofactor (HDAC nhóm I, II và IV) đều có một vị trí xúc tác với một ion Zn2+ ở đáy túi Vì vậy, các enzym này bị ức chế bởi các hợp chất có khả năng tạo phức chelat với Zn2+ như acid hydroxamic (vorinostat, trichosatin A), thiol Các sirtuin có cấu trúc tương đồng với protein Sir2 của nấm men và chứa enzym phụ thuộc NAD+ thay vì Zn2+ nên chúng không nhạy cảm với các hợp chất tạo phức chelat với Zn2+ [35,36] Thuật ngữ các chất ức chế HDAC thường được sử dụng cho những hợp chất nhằm mục tiêu vào các HDAC kinh điển và những hợp chất này đang được đánh giá dựa trên các thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau

Hình 1.3: Mô tả đặc điểm của các loại HDAC “kinh điển”

5

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC

Sự thay đổi đuôi N tận của protein histon đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định mức độ xoắn của gen và quá trình biểu hiện gen Trong số các thay đổi đó, sự acetyl hóa có hồi phục ở gốc lysin được nghiên cứu nhiều

nhất HAT xúc tác vận chuyển gốc acetyl đến gắn vào vị trí ε-N lysin của đuôi

histon nhờ acetyl-CoA dẫn tới việc trung hòa điện tích của protein histon, từ

đó làm cho NST được tháo xoắn và kích hoạt biểu hiện gen Ngược lại, HDAC loại bỏ nhóm acetyl từ protein histon cũng như protein không phải histon (p53, hsp90 hay tubulin) làm cho NST ở trạng thái đóng xoắn và ức chế quá trình dịch mã Vì vậy, việc acetyl hóa và deacetyl hóa NST đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện gen cũng như hoạt hóa quá trình dịch mã [42] Việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có thể dẫn tới những bất thường về biểu hiện gen và có thể dẫn tới ung thư

HDAC đã được xác định là rối loạn điều hòa trong ung thư Qua những nghiên cứu về vai trò của HDAC trong ung thư, nhiều cơ chế về hoạt động của HDAC trong bệnh ung thư đã được phát hiện Tuy nhiên, phần lớn nghiên cứu tập trung vào sự huy động bất thường của HDAC vào chuỗi điều hòa của gen đích thông qua sự tương tác với protein gắn kết, dẫn tới sự chuyển vị nhiễm sắc thể và tạo ra những khối u ác tính huyết học, ví dụ như trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL) Đặc điểm di truyền đặc trưng của APL là sự chuyển vị nhiễm sắc thể dẫn tới việc sản xuất ra các protein gắn kết giữa α-RAR (retinoic acid receptor-α) với PML (promyelocytic leukemia), PLZF (promyelocytic zinc finger) hoặc một số protein khác Các phức hợp protein gắn kết này sẽ gắn với các yếu tố phản hồi retinoic acid (RAREs - retinoic acid-responsive elements) và huy động phức hợp ức chế HDAC có ái lực cao,

từ đó tăng methyl transferase histon và ức chế tế bào tủy xương tăng sinh và biệt hóa [23] Vì vậy, HDAC là yếu tố quyết định trong việc phát triển của

6

APL Phức hợp protein gắn kết AML1-ETO được tìm thấy trong bệnh bạch cầu tủy bào cấp (AML) cũng có cơ chế tương tự phức hợp α-RAR/PML và α-RAR/PLZF [43] Trong bệnh u tế bào lympho B, gen BCL-6 (B-cell lymphoma 6) bị hoạt hóa và tăng biểu hiện gen do huy động các phức hợp chứa enzym HDAC Sự tăng biểu hiện gen BCL-6 được phát hiện ở 40% số trường hợp u lympho tế bào B lớn khuếch tán [30] Những sự thay đổi được

mô tả ở trên không liên quan tới những thay đổi đặc trưng của biểu hiện gen HDAC Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra một số thay đổi của các HDAC nhất định trong một số mẫu khối u Ví dụ, trong các bệnh ung thư carcinom ở dạ dày, tuyến tiền liệt, đại tràng và vú có sự gia tăng biểu hiện HDAC1 [8,15,44,48] Sự gia tăng biểu hiện của HDAC2 được tìm thấy trong ung thư carcinom ở dạ dày, cổ tử cung và đại trực tràng [17,37,49] Một số nghiên cứu khác tìm thấy nồng độ cao HDAC3 và HDAC6 lần lượt ở ung thư đại tràng và ung thư vú [44,47] Hơn nữa, tác dụng deacetyl hóa của HDAC không chỉ giới hạn ở các protein histon mà còn có tác dụng trên các protein không phải histon Ví dụ như HDAC1 có khả năng tương tác và deacetyl hóa yếu tố ức chế ung thư p53, làm giảm sự ổn định và hoạt hóa protein điều hòa,

từ đó gây ra các thay đổi trong các quá trình phân chia tế bào và chết tế bào theo chương trình [21,26]

Các ví dụ trên cho thấy sự ức chế dịch mã của các gen ức chế ung thư thông qua sự biểu hiện và huy động quá mức HDAC tới vùng điều hòa của chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình khởi phát và phát triển của ung thư Ngoài ra, nghiên cứu của Peinado và cộng sự (2004), Christofori và Semb (1999) và Hajra và Fearon (2002) trên yếu tố dịch mã Snail và yếu tố điều hòa E-cadherin cho thấy việc huy động HDAC đến các yếu tố điều hòa trên có thể đóng vai trò quan trọng trong việc xâm lấn và di căn các tế bào ung thư [10,14,31]

7

Như vậy, sự gia tăng của HDAC ảnh hưởng tới quá trình phiên mã và dịch

mã các yếu tố điều hòa gây ra ung thư và có thể kiểm soát bằng cách ức chế hoạt động của HDAC Các chất ức chế HDAC đã và đang được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu nhằm tìm ra chất có tác dụng ức chế chọn lọc từng loại HDAC để ứng dụng trong điều trị ung thư

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC

Quá trình phát triển các chất ức chế HDAC tổng hợp được bắt nguồn từ việc phát hiện sự ức chế tăng trưởng và biệt hóa tế bào trên chuột của dimethyl sulfoxid (DMSO) từ trước khi hoạt động của HDAC được tìm ra [12,27,28] Cho đến nay, nhiều hợp chất có tác dụng ức chế HDAC đã được tìm ra, trong đó chất có tác dụng ức chế HDAC mạnh nhất là Trichosatin A

(TSA), một sản phẩm lên men của nấm men Streptomyces TSA thuộc nhóm acid hydroxamic và có tác dụng ức chế HDAC in vitro ở nồng độ cỡ nano

mol Tuy nhiên, do việc sản xuất TSA lại tốn kém và đạt hiệu suất thấp (20 bước, hiệu suất 2%) nên việc tổng hợp các chất ức chế HDAC mới là rất quan trọng [36] Hiện nay, đã có 2 chất ức chế HDAC được FDA cấp phép lưu hành trên thị trường để điều trị u lympho tế bào T dưới da là SAHA (vorinostat, Zolina®) và Romidepsin (Istodax®) Ngoài ra, còn 1 số hợp chất khác đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng ở các pha khác nhau (hình 1.4) và được chia làm 4 nhóm theo cấu trúc (bảng 1.1) [12]

CTCL, u lympho không phải Hodgkin, bệnh hồng cầu hình liềm, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi tế bào nhỏ

Belinostat

(PXD101)

I-II (IV, p.o.) nM ung thư buồng trứng, CTCL PCI-24781 I-II (p.o.) µM/nM Sarcoma, u lympho

Givinostat I-II (p.o.) nM U lympho Hodgkin, bệnh bạch cầu hoặc u tủy xương tái phát

Resminostat II (p.o.) nM U lympho Hodgkin, u carcinom tế bào gan, ung thư đại trực

tràng

Benzamid

Etinostat I-II (p.o.)

µM (thời gian bán thải dài)

U lympho Hodgkin, ung thư da, ung thư phổi, ung thư vú

Mocetinostat I-II (p.o.) µM nhiều loại ung thư

Chidamide II (p.o.) nM NSCLC, ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt

Peptid vòng

Romidepsin II-III (IV) nM u tế bào vỏ tái phát, u tế bào

lympho không phải Hodgkin

Acid béo mạch ngắn

Acid valproic II-III (p.o.) mM/µM

ung thư buồng trứng, cổ tử cung, bệnh bạch cầu, u lympho, ung thư đầu, cổ, u tuyến giáp

natri

phenylbutyrat II (p.o.) mM u lympho, u rắn

Pivanex (AN-9) I-II (IV) mM bệnh bạch cầu, u lympho, ung thư da

Nhóm khác

Ghi chú: IV: đường tiêm tĩnh mạch, p.o.: đường uống, NSCLC: carcinom tế bào phổi không nhỏ, CTCL: u lympho da tế bào T

9

Các hợp chất có cấu trúc khác nhau sẽ ức chế các HDAC khác nhau: các acid hydroxamic ức chế không chọn lọc trên tất cả các nhóm HDAC, các hợp chất benzamid như etinostat (MS-275) ức chế nhóm I và các hợp chất acid béo mạch ngắn như acid valproic hay butyrat ức chế 2 nhóm I và IIa Ngoài

ra, các hợp chất có cấu trúc chọn lọc như tubacin, mocetinostat, và PC-34501

có khả năng ức chế chọn lọc lần lượt HDAC6, -1 và -8

Hình 1.4: Các chất ức chế HDAC và nồng độ ức chế HDAC của chúng

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC gồm 3 phần chính [12]:

- Nhóm liên kết với Zn (Zinc-binding group - ZBG): tương tác với Zn2+ ở trung tâm hoạt động của HDAC như acid hydroxamic, dẫn chất benzamid, thiol, sulfamid, triflouromethyl ceton hay trithiocarbonat

- Vùng cầu nối sơ nước: có thể là alkyl mạch thẳng, gốc vinyl hoặc gốc aryl

có chức năng liên kết nhóm khóa hoạt động với nhóm liên kết với Zn2+ Vùng

- Một số cấu trúc còn chứa một nguyên tố xoắn (đơn vị liên kết - connecting unit) để liên kết vùng cầu nối sơ nước với nhóm khóa hoạt động

1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI

1.3.1 Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl-acid hydroxamic đã được biết đến nhiều, ví dụ như SAHA (hình 1.5)

Hình 1.5: Liên k ết giữa SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC

Hiện nay, các cấu trúc tương tự SAHA đều gồm 3 phần chính có liên quan đến tác dụng như sau [7,9]:

- Nhóm khóa hoạt động: liên quan tới hiệu lực của enzym HDAC, thường

là các aryl hoặc các vòng thơm khác Nghiên cứu cho thấy vòng thơm lớn cho

11

tác dụng tốt hơn vòng nhỏ và việc gắn các nhóm thế kỵ nước vào vị trí para của vòng benzen trên nhóm khóa hoạt động có thể làm tăng mức độ hoạt động

ức chế enzym HDAC của các chất

- Cầu nối: liên kết nhóm khóa hoạt động với nhóm liên kết với Zn2+ về mặt cấu trúc và có ảnh hưởng tới hiệu lực và mức độ đặc hiệu của enzym HDAC Nhóm cầu nối thường là các hydrocarbon mạch thẳng với nhiều độ dài khác nhau hoặc có thể là các mạch hydrocarbon chưa bão hòa và có thể được gắn thêm nhân thơm hoặc vòng cyclohexyl Nghiên cứu cho thấy độ dài tối ưu của cầu nối này là từ 6 đến 8 nguyên tử [9]

- Nhóm liên kết với Zn2+: là acid hydroxamic, là phần không thể thiếu để

có tác dụng ức chế HDAC Khi tiến hành thử hoạt tính ức chế HDAC, dẫn chất acid carboxylic có hoạt tính rất thấp trong khi các dẫn chất acid hydroxamic đều cho hoạt tính tốt

1.3.2 Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới

1.3.2.1 Thay đổi nhóm khóa hoạt động

- Các acid hydroxamic mang khung benzimidazol và khung tương tự

MS-275

Các acid hydroxamic tương tự SAHA được thay thế nhóm khóa hoạt động bằng khung benzimidazol và các vòng thơm 4-((2-aminophenyl)carbamo-yl)phenyl, 4-((2-aminophenyl)carbamoyl)phenyl, 4-((2-aminophenyl)-carbamoyl)phenyl tương tự MS-275, một chất thuộc nhóm benzamid đang được tiến hành thử nghiệm trên lâm sàng, đã được nhóm nghiên cứu Zhang

Q.W và cộng sự (2013) tổng hợp và thử hoạt tính in vitro thành công Kết quả

cho thấy các chất tổng hợp được đều có tác dụng ức chế enzym HDAC mạnh hơn SAHA và MS-275 (bảng 1.2) [46]

NH OH

O NH

O NH

O R

13

Trong nghiên cứu trên, khi thay thế nhóm khóa hoạt động phenyl của SAHA bằng các khung 4-((2-aminophenyl)carbamoyl)phenyl, 4-((2-aminophenyl)-carbamoyl)phenyl, 4-((2-aminophenyl)-carbamoyl)phenyl tương tự MS-275

tác dụng ức chế enzym HDAC in vitro đã được tăng lên đáng kể Điều này

cho thấy có thể các dẫn chất acid hydroxamic có khả năng ức chế enzym HDAC cao hơn benzamid do cấu trúc của nhóm gắn kẽm Tuy nhiên, do các dẫn chất benzamid có tác dụng kéo dài (thời gian bán thải dài) nên các hợp chất acid hydroxamic vẫn chưa thể hiện sự vượt trội so với benzamid

- Các acid hydroxamic với khung 3-oximisatin và cầu nối mạch thẳng

Nhóm nghiên cứu của Nam N.H và cộng sự (2013) đã thiết kế và tổng hợp thành công các acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động là bộ khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin và cầu nối heptanamid có độ dài 7 carbon Bảy chất tổng hợp được tiến hành thử tác dụng ức chế enzym HDAC và hoạt tính

kháng các dòng tế bào ung thư in vitro Kết quả thử hoạt tính 7 chất trong

nghiên cứu được trình bày ở bảng 1.3 [29]

Bảng 1.3: Hoạt tính một số acid hydroxamic mang khung 3-oximisatin

N

NH OH O

N O OH

14

Kết quả trên cho thấy bảy chất tổng hợp được đều ức chế HDAC ở nồng độ

10 µg/mL cũng như có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh trên các dòng tế bào ung thư SW620, PC-3 và AsPC-1 so với chất đối chiếu là SAHA Điều này cho thấy việc thay thế khung 3-hydroxyimino tại vị trí khóa hoạt động đã mang lại hoạt tính tốt cho các dẫn chất acid hydroxamic mới

1.3.2.2 Thay đổi cầu nối

Các nghiên cứu về tổng hợp các chất ức chế HDAC chủ yếu tập trung vào thay đổi nhóm khóa hoạt động Cầu nối của các chất được tổng hợp trong những năm gần đây đều có xu hướng giữ cầu nối là carbon mạch thẳng với 5-

6 carbon như của SAHA Một số hướng nghiên cứu mới bao gồm gắn các nhóm thế như methyl, ω-alkoxy, β-lactam vào các vị trí trên nhóm thế hay tạo các amid ngược của SAHA đã mang lại nhiều chất có tác dụng sinh học tốt [9,16,39] Một hướng nghiên cứu khác là thay thế cầu nối mạch thẳng bằng cầu nối có chứa nhân thơm tương tự PXD-101 - một acid hydroxamic đang được thử nghiệm lâm sàng

- Nghiên cứu của Remiszewski và cộng sự (2003) về tổng hợp các dẫn chất N-hydroxy-2-propenamid

NVP-LAQ824

Hình 1.6 Cấu trúc một số dẫn chất N-hydroxy-3-phenyl-2-propenamid

Các tác giả đã tổng hợp được 1 dãy các chất

N-hydroxy-3-phenyl-2-propenamid có tác dụng ức chế enzym HDAC Các chất này đều có tác dụng mạnh trên enzym HDAC (IC50 < 0,4 µM) Hơn nữa các chất này đều có tác dụng mạnh trên 2 dòng ung thư carcinom ở người (IC50 < 0,75 µM) Đặc biệt,

15

khi được tiến hành thử nghiệm liều - đáp ứng trên dòng tế bào ung thư đại tràng HCT116 và ung thư phổi A549, chất NVP-LAQ824 thể hiện tác dụng tốt và đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng vào năm 2002 [34]

1.3.3.3: Thay đổi cầu nối và nhóm nhận diện bề mặt

- Các chất ức chế HDAC có cấu trúc acid folic-acid hydroxamic

Nghiên cứu của Carrasco M.P và cộng sự (2011) đã thiết kế và tổng hợp thành công các dẫn chất acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động là methotrexat (MTX) và acid folic đồng thời thay đổi phần cầu nối dài có chứa mạch thẳng và nhân thơm Các chất tổng hợp được có tác dụng ức chế không chỉ enzym HDAC mà còn có thể kháng dihydrofolat reductase (DHFR), 2 enzym đích đóng vai trò quan trọng trong phát triển thuốc chống ung thư Cấu trúc và hoạt tính trên HDAC và DHFR của 2 chất có tác dụng mạnh nhất được trình bày trong bảng 1.4 [6]

Hai chất khác mang khung folat khác cũng được tổng hợp trong nghiên cứu trên, tuy nhiên hoạt tính kháng HDAC và DHFR của hai dẫn chất này không cao Nghiên cứu này có thể mở ra một hướng nghiên cứu mới là thay thế các nhóm thế đã có sẵn tác dụng ức chế tế bào ung thư trên đích khác HDAC vào

vị trí nhóm khóa hoạt động cùng với cấu trúc của HDAC

16

Bảng 1.4: Cấu trúc và tác dụng ức chế HDAC và DHFR của 2 dẫn chất acid

hydroxamic khung acid folic (IC50, µM)

N

N N

OH COOH

IV

N

N N

H2

OH

N H

NH

O

NH (CH2)5 NHOHO

OH COOH

V

Chất

IC 50 (µM) (1) HDAC8

người HDAC chiết từ HeLa L casei DHFR PC-3

Ghi chú: 1 Nồng độ tối thiểu các chất ức chế 50% sự phát triển của tế bào

Các nghiên cứu trên có thể mở ra xu hướng mới là thay thế nhóm cầu nối mạch thẳng bằng cầu nối có chứa nhân thơm bên cạnh việc tìm kiếm các nhóm khóa hoạt động có cấu trúc mới, đặc biệt là các nhóm đã được nghiên cứu có hoạt tính kháng ung thư cao, để tạo ra các dẫn chất acid hydroxamic có tác dụng sinh học tốt và là các thuốc kháng ung thư trong tương lai

Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy acid hydroxamic là nhóm chất có khả năng ức chế HDAC tốt, một số chất có khả năng gây độc tế bào ở nồng

độ rất thấp Tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC đang là một hướng nghiên cứu mới và có nhiều triển vọng trong việc tìm kiếm các hợp chất có tác dụng kháng tế bào ung thư chọn lọc và có hiệu quả điều trị cao

17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

Các hóa chất dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm Bao gồm:

hydroxylamin hydroclorid

Các hóa chất và dung môi khác: N,N-dimethylformamid (DMF), aceton,

dicloromethan, acid acetic, ethanol, methanol, NaOH, HCl, nước cất, FeCl3

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 mL có nút mài, bình nón, pipet, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy cất quay chân không Buchi R-200

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu

- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm

- Bản mỏng silicagel Merck 70 – 230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng

- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy

- MáyPerkin Elmer để xác định phổ IR

- Máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap để ghi phổ MS

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR và 13C-NMR

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.1.3 Xác định cấu trúc các chất tổng hợp được

19

- Các chất tổng hợp được được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR

- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên Hà Nội trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600 cm-1 Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không

để loại bỏ hơi ẩm

- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap của Viện Hóa học Việt Nam, chế độ phun mù điện tử ESI, dung môi methanol

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMR được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi DMSO-d6 Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội trimethylsilan (TMS)

2.3.2 Thử tác dụng sinh học

2.3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC

a Đánh giá theo phương pháp Western blot

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng (SW620) Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng Chi tiết cách tiến hành dựa trên phương pháp đã được công bố trước đây [29]

b Định lượng nồng độ enzyme HDAC2 bị ức chế

Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Enzym HDAC2 được cung

20

cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) và sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience) Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ KIT thử nghiệm

Tóm tắt các bước như sau: enzym HDAC2 được ủ với KBH-A42 ở nhiều nồng độ khác nhau ở 37oC trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang HDAC developer (tạo chất phát huỳnh quang trong hỗn hợp phản ứng) được thêm vào sau khi ủ và mức độ phát huỳnh quang được ghi bằng máy VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) với bước sóng kích thích 360 nm và bước sóng phát xạ 460 nm Kết quả được ghi lại và giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)

2.3.2.2 Thử độc tính tế bào

* Nguyên tắc thử

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực

hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB và giá trị IC50 được tính dựa trên phương pháp Probits

Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng), PC-3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt) và AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tụy)

Các tế bào ung thư được lấy từ ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Độc tính

tế bào của các chất được thử bằng phương pháp SRB theo các bước sau:

Chuẩn bị tế bào (đĩa A): Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS, 1% glutamin, 1% penicillin/ streptomycin và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 3.105 đến 5.105 tế bào/ mL sau đó thu lấy mỗi giếng 100000 tế bào và phân

21

tán thành 10 mL với môi trường RPMI như trên Sau đó hút 100 µL hỗn hợp

tế bào và môi trường cho vào mỗi giếng để có 9000 tế bào/ giếng Để hàng đầu tiên trống làm mẫu trắng, hàng thứ 2 là mẫu chứng

Chuẩn bị thuốc thử (đĩa B): Thêm 125 µL môi trường RPMI 1640 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng, sau đó thêm 125 µL chất thử hòa tan trong DMSO vào hàng đầu tiên Sau khi trộn đều, chuyển 125 µL vào hàng tiếp theo và lặp lại thao tác đến hàng cuối cùng Như vậy, với mỗi hàng sẽ có một nồng độ chất thử khác nhau Hút 100 µL dung dịch chất thử từ hàng thứ 10 thêm vào hàng cuối cùng của đĩa A và tiếp tục lặp lại đến hàng thứ 3 của đĩa A Sau khi hoàn thành, thêm 100 µL môi trường RPMI 1640 vào hàng mẫu chứng và 200

µL môi trường vào hàng mẫu trắng Sau đó hỗn hợp tế bào - thuốc thử được ủ trong vòng 48 giờ

Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, mỗi giếng được thêm 50 µL dung dịch tricloroacetic 50% (TCA) đã được làm lạnh xuống dưới 4oC để có nồng độ của TCA trong mỗi giếng là 10% Đặt đĩa 96 giếng trong vòng 1 giờ ở 4oC để

tế bào tự tái tạo Chuẩn bị dung dịch 0,4% sulforhodamine B (SRB) trong acid acetic 1% và thêm 70 µL dung dịch này vào mỗi giếng và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Rửa đĩa bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần để loại bỏ SRB tự do Thêm 200 µL dung dịch Trizma base 10 mM vào mỗi giếng để hòa tan SRB liên kết Sau đó đặt đĩa 96 giếng vào máy lắc trong vòng ít nhất

10 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 492 nm [25]

*Tính kết quả:

Giá trị IC50 là nồng độ mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp Probits Trong phương

pháp thử này, IC50 ≤ 20 µg/mL được coi là có hoạt tính

22

2.3.3 Đánh giá mức độ giống thuốc cuả chất tổng hợp được

Tính giá trị logP của các chất tổng hợp được bằng phần mềm EPIsuite cung cấp bởi US Environment Protection Agency’s Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC) Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 11.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP

Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinski [24]:

- Khối lượng phân tử của chất không lớn hơn 500 g/mol

- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10

- Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5

- Giá trị của logP của chất không lớn hơn 5

2.3.4 Nghiên cứu Docking

Việc nghiên cứu sơ bộ tính tương tác của các chất với HDAC (docking) được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc

Để tìm hiểu sợ bộ tương tác của các chất với HDAC, chúng tôi đã tiến hành docking cho các chất tổng hợp được dựa trên cơ sở mạng lưới của HDAC2 tương tác với SAHA Chương trình AutoDock Vina được sử dụng cho nghiên cứu docking của các chất Phức hợp HDAC2-SAHA ban đầu được lấy từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB ID: 4LXZ) và cấu trúc các chất nghiên cứu được lập bởi chương trình GlycoBioChem PRODRG2 Server Khung mô hình tương tác của nghiên cứu docking được dựa trên trung tâm hoạt động của SAHA và có kích thước 26 x 26 x 22 điểm với khoảng cách 1,0 Å sau khi SAHA được loại bỏ khỏi phức hợp

Kết quả của nghiên cứu được minh họa bằng bảng số liệu dự đoán năng lượng tương tác

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng hợp chung

Tác nhân và điều kiện: i) methyl 3-(4-(bromoethyl)phenyl)prop-2-enoat, K 2 CO 3 , DMF, 24

-5 o C, 1,5 - 2 h

3.1.1.1 Tổng hợp methylcinnamamid (3a)

N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl)-a Tổng hợp chất methyl

3-{4-[(2,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)-methyl)phenyl}prop-2-enoat (2a)

Chất methyl

3-{4-[(2,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl)methyl)phenyl}-prop-2-enoat (2a) được tổng hợp từ isatin (1a) qua phản ứng thế ái nhân với

methyl 3-(4-bromoethyl)phenyl)prop-2-enoat có mặt xúc tác là K2CO3 theo sơ

OCH3O R

ii

N

N O

NH O

OH OH

R

3a-d

3a: R = 5-H 3b: R = 5-CH33c: R = 5-OCH33d: R = 5-Br

24

- Hòa tan 0,1470 g (1 mmol) isatin và 0,2461 g (2 mmol) K2CO3 bằng 2

mL DMF trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 mL, sau đó khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1 h

- Thêm tiếp 0,2539 g (1 mmol) methyl enoat đã hòa tan trong 1 mL DMF vào bình phản ứng

3-[4-(bromoethyl)phenyl]prop-2 Tiến hành phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 24 h

- Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với pha động là DCM/MeOH = 9/1

Xử lý phản ứng:

- Trung tính hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl 5% để tạo tủa

- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất cho đến khi dịch lọc trung tính

- Sấy khô tủa ở 60oC

(3a) được tổng hợp bằng phản ứng tạo acid hydroxamic giữa chất 2a với

hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ 3.3 như sau:

NH2OH.HCl, NaOH MeOH, H2O, -5 o C, 1,5 - 2 h

Sơ đồ 3.3: Sơ đồ tổng hợp chất 3a

Tiến hành phản ứng

25

- Hòa tan 0,1602 g (0,5 mmol) chất 2a vào trong bình cầu đáy tròn dung

tích 100 mL bằng 4 mL MeOH Thêm 0,6957 g (10 mmol) NH2OH.HCl vào bình cầu Bình phản ứng được làm lạnh đến -5oC bằng hỗn hợp nước đá - muối

- Hòa tan 0,8032 g (20 mmol) NaOH bằng 4 mL nước cất trong ống nghiệm và làm lạnh đến -5oC, sau đó thêm từ từ vào bình phản ứng Chuyển

từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng

+ Acid hóa 0,1 mL hỗn hợp phản ứng trong ống nghiệm bằng HCl 5%, thêm methanol để hòa tan tủa, kiểm tra bằng TLC với pha động là hỗn hợp dung môi DCM / MeOH / CH3COOH = 90 / 10 / 1 Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy phản ứng đã hết ester ban đầu

Xử lý phản ứng

- Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl 5% lạnh đến pH = 3 - 4,

để lạnh 15 phút để tủa sản phẩm

- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

- Sấy khô tủa ở 60oC

- Kết tinh lại trong hệ methanol - nước tỉ lệ 9 - 1

Kết quả

- Cảm quan: bột kết tinh màu đỏ cam

- Hiệu suất: 65% (0,1095 g)

NH O

OH OH

NH2OH.HCl, NaOH MeOH, H2O, -5 o C, 1,5 - 2 h

Sơ đồ 3.5: Sơ đồ tổng hợp chất 3b

N

N O

NH O

OH OH

H3CO

NH2OH.HCl, NaOH MeOH, H2O, -5 o C, 1,5 - 2 h

29

- tonc = 222,2 - 224,1oC

- Rf = 0,78 (DCM/MeOH = 9/1)

b Tổng hợp chất indolinyl)methylcinnamamid (3d)

N-hydroxy-4-(5-bromo-3-hydroxyimino-2-oxo-1-N

O

O

OCH3O

Br

N

N O

NH O

OH OH

Br

NH2OH.HCl, NaOH MeOH, H2O, -5 o C, 1,5 - 2 h

* Sau khi tổng hợp, 4 chất 3a-d được kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi

methanol - nước để thu được sản phẩm tinh khiết Dưới đây là bảng tổng hợp

các chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các chất 3a-d:

Bảng 3.1: Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester

N

N O

O H

NH O

OH R

bày trong bảng 3.2

* Đo nhiệt độ nóng chảy

Các chất sau khi được kết tinh lại đều có dạng tinh thể rắn, có thể tiến hành

đo được nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Kết

quả trình bày trong bảng 3.2 cho thấy các chất 3a-d đều có nhiệt độ nóng

chảy xác định (khoảng dao động nhiệt độ hẹp từ 1 - 2oC)

Như vậy từ kết quả chạy sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy của 4

dẫn chất 3a-d đã khẳng định các chất tổng hợp được là tinh khiết và có thể sử

dụng cho các bước xác định cấu trúc bằng phương pháp đo các phổ MS, IR,

1H-NMR, 13C-NMR

Bảng 3.2: Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các chất 3a-d

N

N O O

NH

O

OH R

thể được trình bày trong phần phân tích phổ và phần phụ lục

3.1.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất 3a-d

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) của các chất 3a-d được trình bày trong bảng 3.3:

Bảng 3.3: Kết quả phân tích phổ IR của các chất 3a-d

N

N O

O H

NH O

OH R

32

Nhận xét: Dựa trên phổ đồ (phụ lục 1 - 4) và tham khảo một số tài liệu

[5,11], cũng có thể nhận dạng sơ bộ sự hiện diện của một số nhóm chức như

NH, CO thông qua các giá trị của dải hấp thụ, cường độ pic, hình dạng pic

Cụ thể, từ bảng 3.3 và phổ đồ của các chất (phụ lục 1 - 4), có thể nhận thấy

một số đặc điểm về cấu trúc của các chất 3a-d như sau: các chất đều có đỉnh

hấp thụ nằm trong khoảng 3200 - 3150 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm NH, đỉnh hấp thụ nằm gần giá trị 3400 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm OH acid, đỉnh hấp thu đặc trưng cho nhóm C=O ở gần 1640

cm-1, dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-N nằm trong khoảng 1440 - 1360 cm-1 và sự xuất hiện dải hấp thụ xung quanh giá trị 900

cm-1 của liên kết N-C là các liên kết đặc trưng của nhóm chức acid hydroxamic

Hơn nữa, trên phổ đồ của các chất đều thấy xuất hiện các đỉnh hấp thụ đặc trưng của khung và cầu nối như dải kéo căng của liên kết C=C vòng thơm hấp thu trong vùng 1500 - 1600 cm-1, dải kéo căng của Caren-H nằm trong khoảng

3020 - 3060 cm-1, đỉnh hấp thụ nằm trong khoảng 2850 - 2950 cm-1 đặc trưng cho dao động kéo căng của liên kết C-H của nhóm methylen, dải hấp thụ nằm trong khoảng 1722 - 1702 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm C=O trong khung 3-oximisatin, nhưng trên phổ đồ đỉnh hấp thụ của dao động kéo căng C=N của nhóm oxim trên khung isatin không xuất hiện do dao động này thường cộng hưởng với dao động của nhóm C=O [11]

Như vậy, có thể khẳng định rằng dữ liệu phổ IR phù hợp với công thức cấu

tạo dự kiến của 4 chất 3a-d đã tổng hợp được

3.1.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất 3a-d

Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) của các chất 3a-d được trình bày

trong bảng 3.4: