Chiết tách tinh chế tạo chế phẩm protease từ chủng mucor hiemalis để ứng dụng trong dược và thực phẩm chức năng

Hoạt độ protease ngoại bào của Mucor hiemalỉs được nuôi cấy trong các môi trường có nồng độ NaCl khác nhau Bảng 3.3.. Hoạt độ protease ngoại bào của Mucor hiemalỉs được nuôi cấy trong

1 Bộ môn hóa sinh

2 Bộ môn công nghiệp Du’Ọ'c

HÀ NỘI - 2010 _ *

Đồng thời tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị

kỹ thuật viên trong bộ môn Hóa sinh, bộ môn Vi sinh - Công nghiệp dược

- trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tội trong quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo cùng toàn thể các cán

bộ trưòng Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình năm năm tôi được học tại đây

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 8 tháng 05 năm 2010

Sinh viên

Vũ Mạnh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cưong về protease 2

1.1.1 Khái niệm protease 2

1.1.2 Phân loại protease 2

1.1.3 Protease nguồn gốc động vật 4

1.1.4 Protease thực vật 5

1.1.5 Protease vi sinh vật 6

1.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và chiết tách, tinh chế protease ngoại bào 13

1.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh v ậ t 13

1.2.2 Thu nhận và tinh chế protease ngoại bào 14

1.3 Tổng quan về Mucor hiemalỉs 18

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚXJ 20

2.1 Nguyên vật liệu, thiết b ị 20

2.1.1 Nguyên vật liệ u 20

2.1.2 Dụng cụ máy móc 21

2.2 Nội dung nghiên cứ u 21

2.2.1 Nuôi cấy Mucor hiemalis 21

2.2.2 Tách chiết và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy 22

2.2.3 Định lượng protein - enzym và xác định hoạt độ protease dựa trên nguyên tắc của phản ứng Biuret 22

2.3 Phương pháp thực nghiệm 22

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy 22

2.3.2 Phương pháp chiết tách và tinh chế protease từ môi trường

nuôi cây Mucor hỉemalis 23

Chương 3 THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng protein 31

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng họp protease của Mucor hỉemalis 32

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ Saccharose trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease của Mucor hiem alis 33

3.4 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ của protease Mucor hiemalis 35

3.5 Các giai đoạn chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalỉs 37

3.5.1 Giai đoạn thu nhận protease từ dịch nuôi cấy bằng (NH4)2S0 4 ở nồng độ 85% bão h ò a 37

3.5.2 Giai đoạn tinh chế protease bằng cồn tuyệt đ ố i 37

3.6 Bàn luận 39

3.6.1 Nuôi cấy Mucor hỉemalis 39

3.6.2 v ề chiết tách và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalis 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42

HđP %: Hoạt độ protein tính theo %.

HđP riêng: Hoạt độ riêng của protein (nK/mg hoặc nK/ml)

Kat: Đơn vị hoạt độ protease (1 Katal = 1 mol/s)

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC C H Ữ VIẾT TẲT

Bảng 1.1 Tên và nguồn gốc một số chế phẩm protease

Bảng 1.2 Một số tính chất của protease v s v

Bảng 1.3 Một số v s v có khả năng tổng hợp mạnh protease

Bảng 1.4 Những phương pháp sắc ký

Bảng 1.5 Hệ thống phân loại khoa học của Mucor hiemalis

Bảng 3.1 Ket quả xây dựng đượng chuẩn casein

Bảng 3.2 Hoạt độ protease ngoại bào của Mucor hiemalỉs được nuôi cấy

trong các môi trường có nồng độ NaCl khác nhau

Bảng 3.3 Hoạt độ protease ngoại bào của Mucor hiemalỉs được nuôi cấy

trong các môi trường có nồng độ Saccharose khác nhau

Bảng 3.4 Hoạt độ protease ở các pH khác nhau

Bảng 3.5 Hoạt độ protease ở các nhiệt độ khác nhau

Bảng 3.6.Tóm tắt quá trình chiết tách và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy

Mucor hiemalis

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Hình 2.1 Sơ đồ quy trinh chiết tách protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalỉs

Hình 3.1 Đồ thị tương quan giữa nồng độ protein và mật độ quang

Hình 3.2 Ảnh hưởng cùa nồng độ NaCl đến khả năng sinh protease

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ Saccharose đến khả năng sinh protease Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH đến HđP

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến HđP

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ồ THỊ

ĐẶT VẤN ĐÈ

Protease là loại enzym đã và đang được dùng rất phổ biến trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống như: công nghiệp chế biến, nông nghiệp, y dược Khoa học càng phát triển thì càng tìm thấy nhiều ứng dụng của protease, vì vậy việc nghiên cứu phát hiện thêm các protease mới có những đặc tính đặc biệt phục vụ cho lợi ích của con người vẫn đang thu hút được sự quan tâm đặc biệt của đông đảo các nhà khoa học

Protease được thu nhận từ ba nguồn là: động vật, thực vật và vi sinh vật Trong các nguồn đó, nguồn vi sinh vật giữ vai trò đặc biệt quan trọng Nguồn enzym này đang dần dần thay thế enzym từ động vật và thực vật do hàng loạt nhưng ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và kỹ thuật sản xuất [8] Hiện nay, hầu hết các enzym ứng dụng trong công nghiệp đều do vi sinh vật tạo ra [3\

Mucor hiemalis là chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng họp protease

ngoại bào mạnh Protease của Mucor hỉemalis đã và đang cung cấp những giá

trị thưong mại to lớn Để góp phần nâng cao khả năng sinh tổng hợp và thu

nhận, tinh chế protease từ Mucor hiemalỉs chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu chiết tách, tinh chế, tạo chế phẩm Protease của chủng Mucor

hiemalis ứng dụng trong dược và thực phẩm chức năng”, với các mục

tiêu:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường đến khả

năng sinh tống hợp protease ngoại bào của Mucor hiemalis.

- Chiết tách, tinh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hỉemalis.

- Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ của protease thu

nhận được

Chương 1 TỎNG QUAN

1.1 Đại cương về protease

1.1.1 Khải niệm protease

Ngày nay, danh từ Protease dùng để chỉ những enzym xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptid (giữa các L - acid amin) trong chuỗi polypeptid hoặc trong phân tử protein thành các peptid phân tử thấp và các L - acid amin

Protease còn gọi là proteinase hoặc peptidase hoặc c - N hydrolase Phản ứng thủy phân liên kết peptid có xúc tác của protease không cần cung cấp năng lượng từ bên ngoài [10\

1.1.2 Phân loại protease

1.1.2.1 Dựa vào nguồn gốc phát sinh, người ta chia p rotease thành 2 nhóm\

- Frotase nội bào (enzym ở trong tế bào) ví dụ cathepsin chứa trong các

bào quan (lysosom)

- Protease ngoại bào (enzym được xuất tiết ra khỏi tế bào vào môi trường xung quanh) như các enzym của đường tiêu hóa (pepsin, trypsin v.v )

1.1.2.2 Dựa vào vị trí tác dụng đặc hiệu với cơ chất, protease cũng cỏ thể chia thành 2 loại:

-Endopeptiđase: enzym thủy phân liên kết peptid ở phần giữa mạch polypeptid

- Exopeptidase: enzym phân cắt liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid

1.1.2.3 Dựa vào p H tối ưu, người ta chia protease thành 3 loại:

- Protease trung tính: ví dụ như papain, bromelain, ficin.

- Protease acid: như pepsin, rennin

- Protease kiềm: như trypsin, a - chymotrypsin

1.1.2.4 Dựa vào nhỏm chức trong trung tâm hoạt động của enzym

Protease được chia ra thành 4 nhóm, tên của các nhóm này bao gồm têncủa acid amin hoặc kim loại có vai trò quan trọng xúc tác trong trung tâm hoạt động:

- Protease serin: ví dụ như trypsin, substilopeptidase ( EC 3 4 21)

-Protease cystein: ví dụ như papain, bromelain, ficin ( EC 3 4 2 2)

- Protease aspartic; VÍ dụ như pepsin, rennin ( EC 3 4 23)

- Protease chứa kim loại: ví dụ như carboxypeptidase, aminopeptidase

1.1.2.5 Dựa vào nguồn thu enzym

- Protease động vật.

- Protease thực vật

- Protease vi sinh vật

-Protease nấm men [10]

Bảng 1.1 Tên và nguồn gốc một số chế phẩm protease [10]

A - Protease động vậtPancreatin

Pepsin

Chymosin

Tụy lợn hoặc bò

Dạ dạy lợn hoặc bò Màng mỏng dạ dày bê

8,0

1 , 5 -2,0 6,0 - 7,0

3 ,0 -5 ,0

5 ,5 -6 ,0

B - Protease thực vậtPapain

4,5 - 6,5

c - Protease vi khuẩnProtease kiêm

Subtilisin

Protease trung tính

Pronase

Bacillus subtilis Bacillus

B thermoprotealytỉcus Streptomyces grỉseus

7 0 -1 1 ,0

6 0 -9 ,0

7,5 - 9,5 6,0 - 8,0

D - Protease nấm sợiProtease acid

A.oryzae Mucor pusillus Rhizopus chinensis

3 ,0 -4 ,0

5 5 -7 ,5 6,0 - 9,5

3 5 -4 ,5 5,0

5.07.0 7,0 - 8,0

pepsin, rennin, nhóm protease chứa kim loại (EC 3.4.24) carboxypeptidase, aminopeptidase Protease động vật có cả 2 loại endopeptidase và exopeptidase.

ở môi trường thích hợp, các protease có nguồn gốc động vật như pepsin, trypsin và chymotĩypsin là các endopeptidase có khả năng thủy phân protein thành các polypeptid nhỏ hơn nhưng hầu như chưa phải là acid amin Trong một vài trường hợp có thể phải dùng loại protease khác thay thể hoặc hỗ trợ

để thủy phân protein thành sản phẩm thích hợp và hiệu quả hơn về những protease động vật dùng trong điểu trị tiêu hóa kém, trypsin ngoài tác dụng trực tiếp thủy phân protein còn có vai trò hoạt hóa những enzym khác Sau đó, những enzym này hoạt động thủy phân protein thành acid amin ở giai đoạn tiếp theo [10\

1.1.4 Protease thực vật

Protease thực vật hay được gọi là protease cystein vì chúng có chứa nhóm thiol của cystein trong trung tâm hoạt động Nhóm này có vị trí đặc biệt trong chức năng của phân tử enzym vì có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều loại biến đổi hóa học như acid hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa và alkyl hóa Vai trò của nhóm thiol trong phân tử enzym đa dạng: tạo phức chất trung gian enzym - cơ chất; phức hợp cơ chất với cofactor; duy trì ổn định các cấu dạng hoạt động của enzym [19\

Protease cystein thường hoạt động mạnh ở pH trung tính, có tính đặc hiệu rộng Protease chỉ hoạt động được khi nhóm thiol trong trung tâm hoạt động không bị bao vây Do đó các chất như cystein, acid ascorbic ở nồng độ xác định thưòng có tác dụng làm bền và hoạt hóa enzym này Protease cystein

bị ức chế bởi một số muối kim loại nặng, đặc biệt là các muối thủy ngân như

p - chloromecurybenzoat và các dẫn chất khác như iodoacetamid Các protease này còn bị oxy hóa dưới tác dụng của các chất oxy hóa như:

hydrogen peroxyd, iod Acid ethylendiaminotetraacetic (EDTA) CÓ khả năng kết hợp với các ion kim loại có trong dung dịch, vì vậy thường làm tăng độ bền của protease cystein [10'.

Như vậy các enzym nhóm này có độ bền nhiệt khá cao, tính đặc hiệu cơ chất rộng So với các protease nguồn gốc động vật, protease thực vật có khả năng thủy phân sâu hơn, vì vậy có thể được dùng để phân giải tiếp các liên kết

còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay Chymotrypsin.

1.1.5 Protease vi sinh vật

1.1.5.1 Đặc tính protease vỉ sinh vật

Các công trình nghiên cứu protease v s v ngày càng nhiều Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi v s v cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích họp các nhà khoa học đã phân loại các protease v s v thành 4 nhóm như sau:

Trong 4 nhóm protease kể trên, các protease - serin và protease - thiol

có khả năng phân giải ester và liên kiết amid của các dẫn xuất acid của amio acid Ngược lại, các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của amino acid Nhiều protease

ngoại bào cùa v s v đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một

số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử cùa các enzym này tương đối bé, nhất là các protease - serin.Các protease - serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000 - 27.000dalton Tuy nhiên, cũng có một số protease - serin có trọng lượng phân

tử lớn hon như các enzym của Pénicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp

oryzae OUT 5038 (52000) Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn

hơn so với protease - serin (vào khoảng 33.800 - 48.400) Protease - thiol và nhiều protease acid cũng có khối lượng phân tử vào khoảng 30000 - 40000

octa-Kim loại hóa trị 2

Trungtính

1.1.5.2 Nguồn protease từ vỉ sinh vật

Nhiều v s v có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzym này có thể

ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy Một số protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học [8]

Các loài VSVcó khả năng tổng mạnh protease được trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số v s v có khả năng tổng ho’p mạnh protease [8]

Vi sinh vât Ghi chú

carboxypeptidase), 2 protease: protease - serin.

Asp.oryzae Protease - kim loại protease serin, có

Asp.satoy 3 loại protease acid, protease trung

tính, protease kiềm Protease acid (aspergilopepti-dase A)

Asp.fumigatus Hai protease: protease acid và

Pen.janthinellum Protease acid có tác dụng làm đông

Pen.cyaneo fulvum sữa đã được dùng ở Nhật để thay thế

1.1.5.3 ứng dụng của protease vi sinh vật

Các protease nói chung cũng như protease v s v nói riêng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y dược học, nghiên cứu khoa học

Trong công nghiệp, protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm như: chế biến cá, thịt, sữa, trong quá trình làm bánh mỳ, trong công nghiệp nước giải khát và trong một số ngành công nghiệp nhẹ như:

kỹ nghệ thuộc da, công nghiệp dệt

Trong quá trình chế biến cá: khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá đưa thêm protease từ ngoài vào sẽ làm tăng rõ rệt quá trỉnh thủy phân, rút ngắn thời gian chế biến, quá trình loại mỡ, loại xuơng khỏi thịt cá (trong sản xuất bột cá) được dễ dàng hơn, lượng mắm cốt thu được cũng nhiều hon hẳn so với mẫu đối chứng, cho hiệu quả hơn hẳn là các protease v s v

Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được sử dụng để làm mềm thịt

và tăng hưong vị sau khi chế biến.Để làm mềm thịt có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau: a) Ngâm thịt vào trong dung dịch có chứa hỗn họp protease, giữ pH và nhiệt độ xác định, b) Tẩm bột làm mềm thịt (có chứa protease, muối, mì chính), c) Tiêm dung dịch enzym vào mô thịt, d) Tiêm enzym vào

Trong công nghiệp nước giải khát, protease được sử dụng làm trong quy trình làm bia và nước hoa quả, ở đây nó sẽ phân giải các protein có tác dụng kìm hãm amylase do đó sẽ làm tăng quá trình đường hóa tinh bột.

Trong kỹ nghệ phim ảnh, protease được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu như: phim điện ảnh, giấy ảnh, phim rơnghen, hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý [5],[17],[2 2;

Trong nông nghiệp, protease được sử dụng trong chăn nuôi để phân giải

sơ bộ protein trong thức ăn của động vật, hoặc sử dụng để sản xuất các dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm

Trong công nghiệp dược phẩm và y học, protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm chữa nghẽn tĩnh mạch, tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị bệnh tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzym Protease cũng được sử dụng để phân giải mạnh các protein đã bị chết, protease cũng được dùng để làm tiêu mủ vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô h ấp [13],[14] Protease cũng được dùng để phân giải các protein tạp lẫn với kháng thể trong huyết thanh miễn dịch mà không làm giảm hoạt tính của kháng thể [6]

Trong nghiên cứu khoa học, protease được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc phân tử protein nhờ vào tính đặc hiệu của các protease Dưới tác dụng của protease v s v protein bị phân giải sâu sắc hơn tạo thành các acid amin

1.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Để có chế phẩm protease từ v s v cũng như các enzym khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp bề mặt (phương pháp nổi) và phương pháp nuôi bề sâu (phương pháp cấy chìm) Phương pháp bề mặt thường dùng

để nuôi cấy nấm mốc, phương pháp nuôi cấy chìm thường dùng đối với vi khuẩn và xạ khuẩn [8]

1.2.1.2 Phương pháp nuôi bề sâu

Trong phương pháp nuôi cấy bề sâu, người ta thường sử dụng môi trường lỏng và được thực hiện trong các thùng lên men [8] Chuẩn bị môi trường thích hợp ngay trong thùng lên men đã khử trùng Sau khi làm lạnh cấy vi sinh vật vào với tỉ lệ 1 - 10% Sau một thời gian nuôi cấy, tiến hành kiểm tra hoạt độ enzym của dịch môi trường nuôi cấy Khi hoạt độ đã đạt đến

cực đại cần nhanh chóng tách enzym khỏi tể bào vi sinh vật bằng cách ly tâm haylọc[l],[5],[18]

1.2.2 Thu nhận và tỉnh chếprotease ngoại bào

Enzym thường chứa ở các tế bào sinli vật gọi là các enzym trong tế bào (intracellular), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống Đó là các enzym ngoài tế bào (extracellular) Enzym v s v thường chiết

là enzym ngoại bào [4]

Đe thu nhận enzym ngoại bào, nếu nuôi cấy v s v theo phương pháp nuôi cấy chim, sau khi kết thúc giai đoạn nuôi cấy, thường lọc hoặc ly tâm để loại sinh khối Dịch lọc đem thu nhận enzym bằng các phương pháp khác nhau[5]

1.2.2.1 Các phương pháp thu nhận chế phẩm emym thô

■ Làm khô trực tiếp từ dịch môi trường bằng phưoTig pháp sấy phun Trong trường hợp này chế phẩm enzym có chứa toàn bộ chất khô có trong môi trường Chế phẩm nhận được ở dạng bột khô

■ Cô đậm dịch môi trường dưới áp suất giảm Dùng phương pháp này nhận được chế phẩm enzym ở dạng nước Trong quá trình cô đặc, hoạt độ protease có bị giảm một ít nhưng cũng loại được một số tạp chất [5], [22]

■ PhưoTig pháp kết tủa

Kết tủa là phương pháp dựa trên nguyên tắc, enzym là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương

Kết tủa âm là sự kết tủa protein tạp Phần protein cần thiết nằm trong

dung dịch chứ không nằm trong phần tủa

Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm

trong phần kết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch [8]

Phương pháp kết tủa bằng muổỉ: Muối nồng độ cao có tác dụng với

phân tử nước bao quanh protein enzym và làm chuyển hóa điện tích làm thay đổi tính hòa tan của enzym Có thể dùng các muối NaCl, (NH4)2S0 4, K 2 S O 4

để tủa protein - enzym Tuy nhiên, trong công nghiệp enzym, người ta thường dùng muối amoni Sulfat (NH4)2S0 4 [8],[10] Nếu dùng (NỈỈ4)2S0 4 để kết tủa enzym thường sử dụng ở nồng độ bão hòa 65%, chế phẩm nhận được có hoạt

độ khoảng 97% hoạt độ ban đầu [5],[22]

Phương pháp kêt tủa bằng dung môi hữu cơ: Khi cho dung môi hữu cơ

vào dung dịch enzym sẽ làm giảm khả năng tan của nước bao quanh enzym Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của dung môi, đẩy một lượng lón nước, do đó protein - enzym bị kết tủa Trong công nghiệp sản xuất enzym, người ta thường sử dụng ethanol và aceton để kết tủa enzym Khi tiến hành kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý nhiệt độ Do enzym rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc aceton, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzym phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzym Người ta thường tiến hành kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ 3 - 10°c Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzym được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzym và từng nồng độ enzym có trong dung dịch enzym

Phương pháp kết tủa enzym bằng polymer: Polymer được sử dụng rất

rộng rãi để kết tủa enzym cả trong nghiên CÚTJ và sản xuất theo quy mô công nghiệp Nhiều tác giả cho rằng cơ chế lắng của chúng gần giống dung môi hữu cơ Các polymer được sử dụng nhiều là polyethylenamine và polyethylene glycol với những phân tử khác nhau Trong công nghiệp người

ta thường sử dụng polymer khoảng 15 - 2 0% để kết tủa enzym [8]

1.2.2.2 Các phương pháp tinh sạch enzym

Enzym thường chiếm một tỉ lệ rất nhỏ trong tế bào hoặc các cơ quan và

có lẫn nhiều tạp chất do đó việc tinh chế là rất cần thiết Trong những trường họp nhất định cần phải tinh chế enzym để sử dụng cho mục đích riêng như papain tinh khiết để tách mô tế bào [7]; tinh chế Chymotrypsin để điều chế thuốc tiêm (chống viêm, giảm phù nề) hoặc dùng trong nghiên cứu [15’

Protease có bản chất cấu tạo là protein do đó các phưoTig pháp tinh chế enzym cũng là các phương pháp tinh chế protein Nguyên lý tinh chế là dựa vào tính chất lý hóa của enzym Có ba phương pháp tinh sạch enzym đang được sử dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất:

■ Phương pháp điện di

Thường dùng để xác định độ tinh khiết của protein hơn là tinh chế Dựa vào sự khác nhau của mật độ điện, sự phân bố điện tích, hình dạng và kích thước của các phân tử nên các protein khác nhau có độ di chuyển khác nhau Phương pháp này dùng để tách một protein ra khỏi protein khác [10

■ Phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký là phương pháp cơ bản quan trọng nhất để làm sạch enzym Các phương pháp sắc ký được tóm tắt trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Các phương pháp sắc ký

4 Săc ký lọc gel Khuêch tán qua lô lọc Kích thước phân tử

6 Săc ký đông hóa trị Liên kêt đông hóa trị Phân cực

7 Săc ký tạo vòng kim loại Tạo phức Câu tạo phân tử

Phương pháp sắc kỷ lọc gel: Theo phương pháp này, các gel được nạp

vào trong cột dùng để tách enzym Trong lọc gel, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng

Phương pháp sắc ký trao đổi ỉon: Phương pháp này dựa trên sự tích điện

của phân tử protein [8] Sử dụng các chất có khả năng trao đổi ion (cation hoặc anion) làm chất giá cần lựa chọn chất giá ưu nước có điện tích ngược với điện tích trên protein Rửa giải bằng cách thay đổi hàm lượng muối hoặc

pH của dung dịch, ư u điểm của phương pháp này là có thể dùng phân tách riêng enzym trong một hỗn hợp protein Có thể tái sắc ký để tăng độ tinh khiết cho enzym [10]

Phương pháp sắc kỷ nước: Phương pháp này dựa trên sự tương tác của

các vùng kỵ nước của phân tử nước với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trình phân đoạn với muối Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với nhưng enzym đã được làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối (NH4)2S0 4

,1 ' ì

Phương pháp sắc kỷ đồng hóa trị: Liên kết đồng hóa trị được tạo thành

giữa các protein ở trạng thái tĩnh [8’

Phương pháp sắc kỷ ái lực: Tinh chế enzym dựa vào sự tạo phức hợp

hấp phụ lập thể Đây là phương pháp đặc hiệu để phân biệt các enzym Mỗi enzym tạo phức họp hấp phụ với chất có tính đặc hiệu lập thể, phù hợp với trung tâm hoạt động Chất giá không tan gắn với nhóm đặc hiệu của enzym Khi di chuyển qua chất giá, vì tương tác với các nhóm đặc hiệu đó nên enzym

di chuyển chậm hơn các protein khác Sau đó enzym được rửa giải khỏi cột bằng cách thay đổi nồng độ ion, pH hoặc hằng số điện môi của dung môi rửa giải [10]

Trong thực tế người ta đã sử dụng các phương pháp hòa tan - kết tủa, hấp phụ, phương pháp trao đổi ion, lọc gel để thu các chế phẩm enzym: papain, ficin, pancretin Dùng phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế trypsin, Chymotrypsin [15]

1.3 Tổng quan về Mucor hiemalis

Bảng 1.5 Hệ thống phân loại khoa học của Mucor hiemalis

- Phân lập: Thức ăn gia súc.

- Điều kiện nuôi cấy: