Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol bằng điện di mao quản

Rất nhiều thuốc trên thị trường có hoạt chất là các chất hoạt quang, được sử dụng ở dạng racemic là hỗn hợp của hai đồng phân đối quang, với tỷ lệ thường là 50:50, hoặc ở dạng đơn đồng p

VŨ NGÂN BÌNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

VŨ NGÂN BÌNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ATENOLOL BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới TS Phạm

Thị Thanh Hà – Bộ môn Hoá phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược

Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn

thành khoá luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, anh/ chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Hóa

phân tích và độc chất- Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất

về cơ sở vật chất để em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, các phòng ban,

bộ môn và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 12 tháng 06 năm 2015 Sinh viên

Vũ Ngân Bình

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i

1.1 Phân tích đồng phân đối quang 2

1.1.2 Phân tích đồng phân đối quang 4

1.3 Tổng quan về phân tích đồng phân đối quang atenolol 10 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu, hoá chất, trang thiết bị 14

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol

2.2.2 Thẩm định phương pháp 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di 16 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 17 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 19 Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu và các dung dịch

3.2.1 Một số điều kiện ban đầu 21 3.2.2 Lựa chọn cột mao quản 21 3.2.3 Lựa chọn dung dịch điện ly nền 23 3.2.4 Lựa chọn điện thế áp vào hai đầu mao quản 24 3.2.5 Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang 26 3.2.6 Xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân (R)- và (S)-atenolol 27 3.2.7 Xác định hàm lượng đồng phân (R)- và (S)- atenolol trong chuẩn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BGE (Background Electrolyte) Dung dịch điện ly nền

GC (Gas Chromatography) Sắc ký khí

HPLC (High Performance Liquid

Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao I.D (inner diameter) Đường kính trong

kl/tt Khối lượng trên thể tích

Le (effective length) Chiều dài hiệu dụng

ppm (part per million) Phần triệu

Rs (Resolution) Độ phân giải

RSD (Relative Standard Deviation ) Độ lệch chuẩn tương đối

SD (Standard Deviation) Độ lệch chuẩn

TLC (Thin Layer Chromatography) Sắc ký lớp mỏng

tm (migration time) Thời gian di chuyển

amimomethan

mẫu chế phẩm

35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

cyclodextrin mang điện âm Tương tác tĩnh điện khiến phức 1

bền hơn phức 2 (K1>K2) [4]

8

mao quản dài 48,5 cm

đồng phân quang học của atenolol vào giá trị điện thế sử

dụng

25

nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang a) CM-β-CD 6 mM; b)

(R,S)-atenolol; d) mẫu viên nén atenolol STADA 50 mg

31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều thuốc có chứa hoạt chất là các đồng phân quang học Các đồng phân đối quang có thể có hoạt tính sinh học rất khác nhau Một xu hướng phổ biến trong nghiên cứu thuốc là chuyển hoạt chất từ dạng hỗn hợp racemic sang dạng đơn đồng phân, nếu đồng phân đó có tác dụng chính và độc tính thấp hơn đồng phân còn lại Phân tích các đồng phân đối quang có ý nghĩa ngày càng quan trọng, do có thể giúp phân biệt đặc điểm dược động học và dược lực học của hai đồng phân và phân tích tạp đối quang

Atenolol là dẫn chất của aryloxypropanolamin, có tác dụng ức chế chọn lọc trên thụ thể β1- adrenergic dùng điều trị tăng huyết áp [2] Atenolol có hai đồng phân đối quang là (S)-atenolol và (R)-atenolol, trong đó (S)-atenolol có vai trò chính

ức chế beta giao cảm đồng thời độc tính cũng thấp hơn so với (R)-atenolol [22],[29] Do đó atenolol cũng là một đối tượng tiềm năng của sự chuyển dạng đồng phân từ hỗn hợp racemic sang đơn đồng phân (S)-atenolol Điều này đòi hỏi phải xây dựng phương pháp phân tách và định lượng được từng dạng đơn đồng phân trong hỗn hợp racemic của atenolol

Hiện nay, kỹ thuật điện di mao quản được dùng phổ biến để tách các đồng phân quang học do tính linh hoạt, hiệu lực tách cao, lượng mẫu sử dụng ít Tuy nhiên

ở Việt Nam kỹ thuật này vẫn còn được áp dụng khá hạn chế

Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng đồng

phân đối quang atenolol bằng điện di mao quản” với hai mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng điện di mao quản

2 Ứng dụng phương pháp này định lượng các đồng phân đối quang của atenolol trong chế phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Phân tích đồng phân đối quang

1.1.1 Đồng phân đối quang

Đồng phân đối quang là một đồng phân lập thể được hình thành do sự sắp xếp không gian đối nghịch nhau của các nhóm thế trên một nguyên tử bất đối, thường gặp nhất là nguyên tử carbon Hầu hết các tính chất lý hoá của hai đồng phân đối quang tương tự nhau, trừ khả năng làm quay mặt phẳng ánh sánh phân cực theo hai góc bằng nhau nhưng ngược chiều nhau

Đồng phân đối quang làm quay mặt phẳng ánh sang phân cực theo chiều cùng

chiều với kim đồng hồ được gọi là đồng phân (+) hoặc d (tiếng Latin dextro),

đồng phân đối quang là quay mặt phẳng ánh sáng phân cực theo chiều ngược

chiều với kim đồng hồ được gọi là đồng phân (-) hoặc l (tiếng Latin là levo)

Ngoài ra tuỳ theo thứ tự sắp xếp của các nhóm chức trong không gian xung quanh vị trí nguyên tử bất đối mà đồng phân đối quang có thể được gọi là đồng phân (R) hoặc (S), (D) hoặc (L) Do danh pháp d, l và (D), (L) dễ bị nhầm lẫn, các đồng phân đối quang thường được gọi là đồng phân (+), (-) hoặc (R), (S) Tuy tính chất lý hoá của hai đồng phân rất giống nhau, hoạt tính sinh học của hai đồng phân đối quang có thể rất khác nhau Rất nhiều thuốc trên thị trường có hoạt chất là các chất hoạt quang, được sử dụng ở dạng racemic (là hỗn hợp của hai đồng phân đối quang, với tỷ lệ thường là 50:50), hoặc ở dạng đơn đồng phân Việc nghiên cứu các đặc tính dược lực học, dược động học của hai đồng phân đối quang là quan trọng, do chúng có thể có những đặc điểm hoàn toàn khác nhau và khác với hỗn hợp racemic

Về đặc điểm dược lực học, tác dụng của hai đồng phân đối quang có thể thuộc một trong bốn trường hợp như sau:

- Có cùng tác dụng dược lý và cùng mức độ tác dụng Có rất ít dược chất thuộc nhóm này Ví dụ: promethazine [19]

- Có cùng tác dụng dược lý nhưng khác mức độ tác dụng và/hoặc độc tính Hầu hết các dược chất thuộc nhóm này Ví dụ levofloxacin có tác dụng kháng khuẩn mạnh gấp hàng chục lần dextrofloxacin, hai đồng phân đối quang của lamivudin có tác dụng trên HIV tương đương nhau, nhưng (-) lamivudin có độc tính trên tế bào thấp hơn so với (+) lamivudin [10]

- Chỉ có một đồng phân có tác dụng dược lý Ví dụ (S)-ketoprofen có tác dụng chống viêm còn đồng phân (R)-ketoprofen thì không có tác dụng này [23]

- Có tác dụng dược lý hoàn toàn khác nhau: ví dụ dextropropoxyphen có tác dụng chống viêm, còn levopropoxyphen có tác dụng chống ho [18]

Đặc điểm dược động học thể hiện qua 4 quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hoá, thải trừ Trong bốn quá trình này, có những quá trình mang tính chọn lọc đối quang, tức là ưu tiên tương tác trên một đồng phân đối quang hơn là đồng phân còn lại do sự tương thích về cấu trúc không gian, do đó làm cho đặc điểm dược động học của hai đồng phân đối quang khác nhau Ví dụ Levodopa (L-dopa) được hấp thu nhiều hơn D-dopa [10]

Do các đặc điểm dược lực học và dược động học của các đồng phân đối quang

có thể rất khác nhau và khác racemic, việc nghiên cứu riêng các đặc điểm này của hai đồng phân đối quang là quan trọng Trên thế giới, Cơ quan Dược phẩm

Châu Âu (European Medicinal Agency – EMEA) [15] đã ra hướng dẫn với các

thuốc mới cần xác định sự có mặt của các đồng phân đối quang Nếu có, cần nghiên cứu tách các đồng phân đối quang và tác dụng riêng rẽ của từng đồng

phân này Từ đó đưa ra giải thích cho việc lựa chọn đơn đồng phân hoặc dạng racemic cho chế phẩm

Phần lớn những hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên hoặc bán tổng hợp tồn tại ở dạng đơn đồng phân đối quang Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp, mặc dù một đồng phân có tác dụng chính, vẫn được sử dụng chủ yếu ở dạng racemic Từ kết quả nghiên cứu về sự khác nhau giữa đặc điểm dược lực học và đặc điểm dược động học của hai đồng phân đối quang, từ những năm 1990 bắt đầu xuất hiện trào lưu mới, chuyển hoạt chất từ dạng hỗn hợp racemic sang đơn đồng phân (“chiral switch”) Ví dụ esomeprazole (S-omeprazol), S-salbutamol, levofloxacin… Đối với những thuốc mới việc nghiên cứu chuyển từ dạng racemic sang đơn đồng phân là một xu hướng khá phổ biến Việc chuyển từ dạng racemic sang đơn đồng phân có những ưu điểm sau [18]:

- Tăng tác dụng điều trị và chọn lọc với liều giữ nguyên hoặc giảm liều

- Giảm độc tính và tác dụng không mong muốn

- Giảm tương tác giữa các đồng phân đối quang và với các thuốc khác

- Dược lực học và dược động học có độ lặp lại tốt hơn

- Quan hệ liều – đáp ứng đơn giản hơn

Tuy nhiên không phải trường hợp chuyển dạng đồng phân nào cũng thành công

Ví dụ R-thalidomid đã bị thu hồi chỉ một thời gian ngắn sau khi đưa ra thị trường

do không làm giảm tác dụng không mong muốn so với dạng racemic như dự

đoán [27]

1.1.2 Phân tích đồng phân đối quang

Nhu cầu phát triển phương pháp cho phân tích đồng phân đối quang ngày càng tăng Trong nghiên cứu dược, việc phân tích các đồng phân đối quang có ý nghĩa đặc biệt quan trọng do có thể thực hiện được các nhiệm vụ sau:

- Phân biệt dạng đơn đồng phân và racemic

- Phân tích tạp đồng phân đối quang

- Phân biệt dược động học và dược lực học của hai dạng đồng phân

Do các đồng phân quang học rất giống nhau về tính chất lý hóa nên áp dụng các phương pháp tách thông thường không đem lại kết quả Để tách được hai đồng phân đối quang, cần biến đổi chúng thành những sản phẩm có tính chất lý hoá khác nhau, hoặc dùng những chất có khả năng tương tác chọn lọc với một trong hai đồng phân Việc tách các đồng phân đối quang được thực hiện theo một trong hai phương pháp: phương pháp gián tiếp và phương pháp trực tiếp [4]

Phương pháp gián tiếp

Nguyên tắc của phương pháp này là cho hai đồng phân đối quang phản ứng với một hợp chất bất đối tạo thành một hỗn hợp hai đồng phân lập thể không đối quang, sau đó phân tách bằng các phương pháp tách thông thường như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc điện di mao quản (CE) Tuy nhiên phương pháp này có nhiều nhược điểm như tốn thời gian xử lý mẫu, thuốc thử bất đối phải có độ tinh khiết cao, hai đồng phân racemic cần có cùng tốc độ và mức độ phản ứng, detector cần có đáp ứng như nhau với hai dẫn xuất tạo thành…

Phương pháp trực tiếp

Đây là phương pháp thông dụng hơn Các đồng phân đối quang tuy có tính chất

lý hoá tương tự nhau nhưng do cấu trúc không gian khác nhau, chúng có khả năng tương tác khác nhau với các tác nhân chọn lọc hoạt quang (chiral selectors) Khi mức độ khác biệt của quá trình tương tác với chất chọn lọc hoạt quang đủ lớn, các đồng phân đối quang sẽ được tách ra khỏi nhau Các tương tác giữa hai đồng phân đối quang và chất chọn lọc đối quang là liên kết hydro, tương tác kỵ nước, liên kết π-π, lưỡng cực - lưỡng cực

Các chất chọn lọc hoạt quang có bản chất hóa học khá đa dạng, được chia thành

các nhóm chính sau [4], [8]:

- Có bản chất protein: α1-acid glycoprotein, albumin huyết thanh, ovalbumin

- Dẫn chất polysaccarid: dẫn xuất cellulose, amylase

- Chất chọn lọc đối quang dựa trên cấu trúc tạo thành "hốc" chọn lọc đối quang (các cyclodextrin và dẫn xuất, ether vòng, polymer)

- Chất chọn lọc đối quang dựa trên tương tác giữa nhóm cho điện tử π và nhóm nhận điện tử π (chất chọn lọc kiểu Pirkle)

- Nhóm trao đổi ion (đồng tạo phức với nhóm hoạt quang)

Các phương pháp phân tích các hợp chất đối quang là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký khí (GC), và điện di mao quản (CE) Trong đó HPLC và CE là hai kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất [16]

Nguyên lý HPLC

HPLC là kỹ thuật tách các chất dựa trên tương tác khác nhau của chất phân tích với pha tĩnh và pha động, làm cho chất phân tích di chuyển với tốc độ khác nhau

và được phân tách ra khỏi nhau [3]

Trong HPLC các đồng phân quang học trong hỗn hợp racemic có thể được tách bằng một trong ba cách sau:

- Tạo dẫn xuất hoạt quang trước khi phân tích

- Thêm vào pha động tác nhân chọn lọc hoạt quang

- Sử dụng cột tách chọn lọc đối quang (chiral stationary phases): Tác nhân chọn lọc hoạt quang được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh

Trong đó sử dụng cột pha tĩnh hoạt quang là phương pháp phổ biến nhất do tính tiện lợi, nhanh chóng và chính xác Tuy nhiên một cột sắc ký hoạt quang thường chỉ tách được một vài nhóm chất và chi phí của những cột này khá cao

Nguyên lý CE

Điện di là kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào sự di chuyển với vận tốc khác nhau của các phần tử mang điện dưới tác động của điện trường Điện di mao quản là quá trình điện di được thực hiện trong mao quản có kích thước rất nhỏ, dưới 100 µm Dưới tác dụng của dòng điện di và dòng điện thẩm, các chất phân tích được di chuyển trong ống mao quản [3], [4]

Dòng điện di là dòng điện tạo ra do các ion hoặc các phần tử điện di chuyển dọc theo mao quản về phía cực trái dấu dưới tác dụng của lực điện trường

Dòng điện thẩm EOF là dòng dung dịch chảy trong mao quản dưới tác dụng của điện trường do thể zeta tạo ra trên giao diện tiếp xúc giữa bề mặt mao quản và dung dịch trong mao quản

Các đồng phân đối quang được phân tích bằng điện di mao quản phần lớn là theo phương pháp trực tiếp: thêm chất chọn lọc đối quang vào dung dịch điện ly nền (Background Electrolyte – BGE) hoặc gắn vào thành của điện di mao quản hoặc pha tĩnh

Khi phân tích đồng phân đối quang bằng HPLC thường sử dụng các cột hoạt quang rất đắt tiền, và một cột hoạt quang chỉ phân tích được một vài chất nhất định Trong khi đó với CE có thể thay đổi linh hoạt hệ điện ly nền sử dụng nhiều loại chất chọn lọc đối quang khác nhau và hệ đệm khác nhau để ứng dụng tách nhiều nhóm chất khác nhau Chi phí sử dụng các chất hoạt quang này với nồng

độ nhỏ trong điện di thấp hơn nhiều so với chi phí của cột sắc ký hoạt quang Như vậy CE giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời tính linh hoạt cũng cao hơn HPLC Chất chọn lọc đối quang được sử dụng rộng rãi nhất trong kỹ thuật điện di mao quản là các cyclodextrin

Tổng quan về các cyclodextrin

Cyclodextrin (CD) là các hợp chất thu được từ phân huỷ tinh bột bằng enzym

Về mặt cấu tạo, các cyclodextrin là oligosaccharid mạch vòng, gồm 6 đến 12 đơn

vị D(+)-glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-(1,4)-glucosid Trong số đó, các CD có 6,7,8 đơn vị D(+)-glucose (tương ứng với α, β, γ-CD) là được sử dụng phổ biến [11] CD có hình dạng như một hình nón cụt rỗng với một hốc kỵ nước,

và mặt ngoài thân nước do sự có mặt của các nhóm hydroxyl (vị trí 2, 3 và 6 của glucopyranose) Các chất phân tích có thể tương tác với các CD tạo thành các phức lồng Cấu trúc của α, β, γ-CD được mô tả trong hình 1.1

Hình 1.1: Cấu trúc và kích thước của các cyclodextrin tự nhiên [11]

Kích thước hốc kỵ nước của β-CD phù hợp với nhiều hợp chất hoá học Độ tan của β-CD là tương đối thấp hơn so với α- và γ-CD, tuy nhiên có thể được cải thiện bằng cách tạo các dẫn xuất không mang điện tích như dẫn xuất methylat-, hydroxy- ethylat-, hydroxypropylat- và các dẫn xuất mang điện tích như dẫn xuất carboxymethylat-, sulphat-, phosphat-…Các dẫn xuất này có thể làm tăng sự chọn lọc trong phân tích đồng phân đối quang như làm tăng độ tan, khả năng tạo các liên kết thứ cấp…Ngoài ra khi tác nhân chọn lọc đối quang mang điện tích

có chiều chuyển động ngược với chất phân tích sẽ làm tăng độ phân giải vì làm tăng sự khác biệt về linh độ giữa chất phân tích tự do và chất phân tích trong

phức lồng (hình 1.2) [4], [16] Quá trình phân tích đồng phân đối quang có thể bị tác động bởi nhiều yếu tố như loại và nồng độ của CD, pH, thành phần BGE, điện thế, chiều dài cột mao quản, đường kính trong mao quản (I.D.)…

Hình 1.2 Tương tác giữa chất phân tích mang điện dương và cyclodextrin

1.2 Tổng quan về atenolol

- Tên khoa học

(2-{4-[2-hydroxy-3-(propan-2-ylamino)propoxy]phenyl}acetamid)

- Khối lượng phân tử 266,3

- Atenolol có một nguyên tử carbon bất đối và đo đó tồn tại dưới dạng hai đồng phân đối quang (S)- atenolol và (R)- atenolol (hình 1.3)

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của hai đồng phân đối quang Atenolol

Tính chất lý hoá [21]:

- Là bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng

- Tan trong methanol, acid acetic, tan trong ethanol, ít tan trong aceton, thực tế không tan trong acetoniril, chloroform

Như vậy trong hai đồng phân đối quang của atenolol, chỉ đồng phân (S)-atenolol

có tác dụng chẹn beta giao cảm Đồng phân (R)-atenolol không những không có tác dụng dược lý này, thậm chí còn có nhiều tác dụng không mong muốn hơn đồng phân (S)-atenolol Do đó atenolol cũng là một đối tượng tiềm năng của sự chuyển dạng đồng phân như đã đề cập ở trên [30]

1.3 Tổng quan về phân tích đồng phân đối quang atenolol

Các nghiên cứu ở nước ngoài

Các đồng phân đối quang của atenolol được định tính và định lượng chủ yếu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng cột sắc ký hoạt quang hoặc tạo dẫn xuất

hoạt quang (bảng 1.1) Những nghiên cứu này sử dụng detector huỳnh quang và

cột sắc ký hoạt quang đắt tiền Việc tạo dẫn xuất đòi hỏi xử lý mẫu khá phức tạp Một số nghiên cứu dùng cột Chiral AGP khi phân tích atenolol racemic từ chế

phẩm viên nén pic các đồng phân quang học của atenolol chưa tách khỏi nhau hoàn toàn [12]

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu phân tích đồng phân đối quang Atenolol bằng HPLC

Kỹ thuật điện di mao quản được ứng dụng rộng rãi trong việc tách đồng phân đối quang của Atenolol Một số nghiên cứu được công bố dùng kỹ thuật điện di mao quản vùng và sử dụng chất chọn lọc đối quang là dẫn xuất hydroxylpropyl, carboxyl, sulfat CD (bảng 1.2) Các nghiên cứu này sử dụng đa dạng các chất chọn lọc đối quang Tuy nhiên độ phân giải giữa hai pic của đồng phân đối

quang atenolol chưa tốt Trong nghiên cứu của Wuhong et al 2010 [20], tác giả

đã tách được hai đồng phân đối quang của atenolol hoàn toàn khỏi nhau và thời gian di chuyển của hai đồng phân không quá dài Tuy nhiên tác giả chưa xác định được thứ tự di chuyển của hai đồng phân

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu tách đồng phân đối quang atenolol bằng CE

mao quản

nhiệt độ, thế

Dung dich điện ly nền t (phút)

1993 [24] 50 cm x 75 µm I.D 10 kV 28 mM Me-β-CD, đệm 20 mM Tris - acid

phosphoric, pH 2,4

(-) atenolol: 17,15 (+) atenolol: 17,37

Các nghiên cứu ở trong nước

Ở Việt Nam, phân tích đồng phân đối quang atenolol đã được thực hiện bằng kỹ thuật HPLC [5] và CE [6]

Một số thông số của phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol bằng HPLC [5]:

- Cột Chirex 3022 ((S)-indoline-2-carboxylic acid và naphtyl)ethylamine) kích thước 4,0 x 250 mm; 5 µm

(R)-1-(α Pha động: n(R)-1-(α hexan/ 1,2 dicloromethan/ methanol / acid trifluoroacetic tỷ lệ 57,5/35/7,5/0,2 (v/v/v/v), Tốc độ dòng: 1 ml/ phút

- Detector UV, bước sóng phát hiện 229 nm

- Nồng độ chất phân tích: 0,05 mg/ml (racemic), Thể tích tiêm mẫu: 20 µL

Nghiên cứu này dùng cột sắc ký hoạt quang đắt tiền, chương trình sắc ký pha thuận, pha động có chứa các dung môi hữu cơ ít phân cực, độc hại

Nghiên cứu [6] tách đồng phân đối quang atenolol bằng CE sử dụng tác nhân chọn lọc đối quang là carboxymethyl-β-cyclodextrin và các điều kiện điện di sau:

- Cột mao quản silica nung chảy: 60 cm (50 cm) x 75 µm (I.D)

- Nồng độ chất phân tích: 0,1 mg/ml hay 100 ppm atenolol racemic

Hai đồng phân đối quang đã tách hoàn toàn khỏi nhau và đã xác định được thứ tự

di chuyển của hai đồng phân Tuy nhiên thời gian di chuyển của hai đồng phân còn dài (thời gian di chuyển của đồng phân (R)- và (S)-atenolol lần lượt là 29,5

và 30,4 phút), chưa phù hợp với thực tế kiểm nghiệm thuốc

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, hoá chất, trang thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chế phẩm viên nén có chứa atenolol 50 mg (dạng racemic):

- Viên nén Atenolol STADA 50 mg, SĐK: VD-12619-10, số lô: 051113,

hạn dùng: 04/11/18, nhà sản xuất: công ty TNHH liên doanh STADA-VN

- Mẫu placebo: chứa các thành phần tá dược của viên do công ty STADA cung cấp gồm: tinh bột ngô, tinh bột tiền hồ hóa, lactose monohydrat,

povidon K25, natri laurylsulfat, colloidal silica khan, magnesi stearat

Sigma Natri hydroxyd Merck KGaA, Đức

- Tris (hydroxymethyl amino methan (Tris) Merck KGaA, Đức

- Acid phosphoric 85 % Merck KGaA, Đức

- Acid hydrochloric Merck KGaA, Đức

- Methanol Merck KGaA, Đức

- Cân phân tích Mettler Toledo AL2004, d = 0,1 mg và XS105DU, d = 0,01

mg, Thụy Sỹ

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 30, Elma, Đức

- Máy cất nước hai lần Hamilton WSC/4D, Anh

- Hệ thống lọc nước siêu sạch Labostar-1, Siemens, Đức

- Màng lọc cellulose acetat với kích thước lỗ lọc 0,2 µm, Sartorius, Đức

- Bộ lọ nhựa đựng mẫu và nắp đậy

- Các dụng cụ chính xác: các pipet chính xác với thể tích khác nhau, bình

định mức với thể tích khác nhau

- Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, giấy lọc, phễu thủy tinh…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng phân đối quang atenolol

bằng điện di mao quản

- Lựa chọn cột mao quản

- Lựa chọn dung dịch điện ly nền

- Lựa chọn hiệu điện thế

- Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang

- Xác định thứ tự di chuyển của hai đồng phân đối quang

- Xác định hàm lượng đồng phân (R)- và (S)-atenolol trong chuẩn atenolol racemic

2.2.3 Ứng dụng

Định lượng các đồng phân đối quang atenolol trong chế phẩm viên nén có chứa atenolol trên thị trường

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện điện di

Dựa trên các tài liệu tham khảo, chúng tôi đưa ra một số điều kiện điện di ban đầu và khảo sát thêm một số điều kiện điện di: cột mao quản, dung dịch điện

ly nền, nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang, điện thế

Lựa chọn cột mao quản

Chúng tôi tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm (kl/tt) với điều kiện điện di trên, sử dụng các cột mao quản khác nhau

Lựa chọn dung dịch điện ly nền

Tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm (kl/tt) sử dụng dung dịch điện ly nền lần lượt là dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-CD 8 mM và dung dịch đệm Tris 50 mM, pH 4,0, chứa CM-β-

CD 8 mM Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn dung dịch điện

ly nền thích hợp

Lựa chọn điện thế

Thay đổi điện thế áp vào hai đầu mao quản từ 15 đến 30 kV (∆E= 5 kV) và tiến hành phân tích mẫu, lựa chọn điện thế phù hợp

Lựa chọn nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang

Tiến hành điện di dung dịch chuẩn (R,S)-atenolol 100 ppm với điều kiện điện

di đã lựa chọn ở trên và thay đổi nồng độ tác nhân chọn lọc đối quang

CM-β-CD từ 6 mM đến 10 mM Dựa vào tín hiệu trên điện di đồ thu được, lựa chọn nồng độ CM-β-CD thích hợp