Tổng hợp một số dẫn chất lai hóa azaartemisinin aminoquinolin qua cầu nối amin với định hướng điều trị sốt rét

LÊ VĂN HOAN TỔNG HỢP MỘT SỐ HỢP CHẤT LAI HÓA ARTEMISININ-AMINOQUINOLIN QUA CẦU NỐI AMIN VỚI ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ SỐT RÉT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.. STT Tên sơ đ

LÊ VĂN HOAN

TỔNG HỢP MỘT SỐ HỢP CHẤT LAI HÓA ARTEMISININ-AMINOQUINOLIN QUA CẦU NỐI AMIN VỚI ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ SỐT RÉT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Hà Nội – 2015

LÊ VĂN HOAN

TỔNG HỢP MỘT SỐ HỢP CHẤT LAI HÓA ARTEMISININ-AMINOQUINOLIN QUA CẦU NỐI AMIN VỚI ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ SỐT RÉT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Đào Thị Kim Oanh

2 TS Nguyễn Quốc Vượng

Nơi thực hiện:

Viện Hóa sinh biển Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hà Nội - 2015

được gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến những người trong suốt thời

gian qua đã luôn ở bên cạnh giúp đỡ tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận

tốt nghiệp

Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời

cám ơn chân thành đến TS Đào Thị Kim Oanh, ThS Trần Thị Lan Hương

- Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội và TS Nguyễn Quốc

Vượng, TS Lê Nguyễn Thành, Ths Nguyễn Hữu Giáp - Trung tâm nghiên

cứu phát triển thuốc - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam, thầy cô đã không chỉ tạo những điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn

thành khóa luận mà đã luôn có những hướng dẫn chính xác và kịp thời những

lúc tôi gặp khó khăn, luôn ở bên động viên tôi, tạo cho tôi động lực và niềm tin

lớn

Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị và các

bạn làm việc và học tập tại Trung tâm phát triển thuốc - Viện hóa sinh biển -

Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, những người đã chia sẻ vui

buồn, đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã

quan tâm, động viên tạo động lực cho tôi đi đến ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 15, tháng 04, năm 2015

Sinh viên

Lê Văn Hoan

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Thực trạng về bệnh sốt rét trên thế giới 2

1.2 Một số nhóm thuốc điều trị sốt rét điển hình 3

1.2.1 Quinin 3

1.2.2 Artemisinin và các dẫn chất 3

1.2.3 Nhóm 4-aminoquinolin 4

1.3 Liệu pháp điều trị phối hợp artemisinin với các thuốc sốt rét khác (ACTs) 5

1.4 Nghiên cứu trước đây về dẫn chất 11-aza-artemisinin 7

1.4.1 Chuyển đổi artemisinin thành 11-aza-artemisinin và thử tác dụng sinh học của Ziffer và cộng sự 7

1.4.2 Tổng hợp các dẫn xuất 11-aza-artemisinin sử dụng phản ứng Ugi và đánh giá tác dụng chống sốt rét 9

1.5 Nghiên cứu hiện nay về thuốc điều trị sốt rét dùng “phương pháp lai hóa” 11

1.6 Một vài nghiên cứu về phép lai hóa, kết hợp artemisinin hoặc dẫn chất artemisinin với các dẫn chất 4-aminoquinolin 11

1.6.1 Lai hóa giữa dihyroartemisinin (DHA) và aminoquinolin 11

1.6.2 Tổng hợp phân tử lai trioxaquin 12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Tổng hợp hóa học 18

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 19

2.3.3 Xác định cấu trúc 19

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Thực nghiệm, kết quả 20

3.1.1 Tổng hợp hóa học 21

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 28

3.1.3 Xác định cấu trúc 29

3.2 Bàn luận 35

3.2.1 Tổng hợp hóa học 35

3.2.2 Khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C( C nuclear magnetic resonance)

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H (1H nuclear magnetic resonance)

ACTs Liệu pháp kết hợp điều trị với artemisinin (Artemisinin-based

combination therapies) ADN Acid deoxy ribonucleic

CTCT Công thức cấu tạo

DCM Dicloromethan

DHA Dihyro artemisinin

DIBAL diisobutylaluminium hydrid

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) các chất Va-Vc 29

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) các chất

STT Tên sơ đồ, hình Trang

Sơ đồ 1.1 Chuyển artemisinin thành 11-aza-artemisinin 7

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp các dẫn chất 11-aza-artermisin sử dụng phản

ứng Ugi

9

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp phân tử lai DHA- aminoquinolin 12

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp trioxaquin từ trioxan và dẫn chất

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh sốt rét hiện nay vẫn còn là một vấn đề sức khoẻ lớn trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, một nửa dân số thế giới có nguy cơ mắc sốt rét, hơn 200 triệu ca mỗi năm cướp đi khoảng 627000 mạng sống [32,33] Hiện tượng kháng thuốc thì xuất hiện ngày càng nhiều và ngày một nghiêm trọng, đặc biệt đã xuất hiện kháng artemisinin, một thuốc quan trọng chưa có thuốc thay thế

Để khắc phục những khó khăn trên thế giới đã đưa ra nhiều giải pháp bao gồm cả việc đưa ra một liệu pháp điều trị mới, liệu pháp kết hợp ACTs, và đã đạt được một số hiệu quả tương đối lớn nhưng vẫn tồn tại rất nhiều hạn chế về mặt kinh tế cũng như độ an toàn trong điều trị Nhu cầu đặt ra cần phải tìm ra một loại thuốc mới có thể khắc phục tối đa những nhược điểm trên

Sự phát triển nghiên cứu thuốc đã cho ra đời phương pháp lai hóa, một phương pháp phát triển thuốc mới dựa trên sự kết hợp 2 phân tử thuốc vào trong

1 phân tử duy nhất mà vẫn đảm bảo phát huy tác dụng của cả 2 thuốc[12] Nhiều nhà nghiên cứu đã dùng phương pháp này để mong muốn tìm được các loại thuốc chống sốt rét mới và đã đạt được nhiều kết quả khả quan Trong đó một

số công trình nghiên cứu đã tổng hợp các hợp chất lai hóa giữa artemisinin và một số dẫn chất aminoquinolin và chúng có tác dụng chống sốt rét rất tốt, đặc biệt còn có tác dụng trên các chủng đã kháng [15,23]

Với mong muốn đóng góp một phần làm phong phú thêm các nghiên cứu về tổng hợp các hợp chất lai hóa giữa artemisinin và các dẫn chất aminoquinolin, và định hướng cho việc tìm kiếm các loại thuốc chống sốt rét mới, đề tài: “Tổng hợp một số hợp chất lai hóa artemisinnin-aminoquinolin qua cầu nối amin với định hướng điều trị sốt rét” đã được thực hiện với mục tiêu: Tổng hợp và khẳng định cấu trúc một số dẫn chất hợp chất lai hóa artemisinnin-aminoquinolin qua cầu nối amin với định hướng điều trị sốt rét

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Thực trạng về bệnh sốt rét trên thế giới

Trong hơn một thập kỷ qua, thế giới đã đạt được nhiều tiến bộ lớn trong cuộc chiến chống bệnh sốt rét Từ năm 2000, nhờ sự tăng cường đầu tư tài chính

và đẩy mạnh các biện pháp phòng chống sốt rét đã làm giảm đáng kể gánh nặng sốt rét ở nhiều nơi, cứu sống khoảng 3,3 triệu người (69%) Tỷ lệ tử vong sốt rét đã giảm 42% trên toàn cầu và 49% ở khu vực Châu Phi [32,33]

Tuy vậy bệnh sốt rét hiện nay vẫn còn là một vấn đề sức khoẻ lớn trên thế giới, một nửa dân số thế giới (khoảng 3,4 tỷ người) có nguy cơ mắc sốt rét, nhất là người dân các nước nghèo Hàng năm, có hơn 200 triệu ca mắc sốt rét

và cướp đi khoảng 627000 sự sống, đặc biệt chủ yếu là trẻ em dưới 5 tuổi vùng cận sa mạc Sahara châu Phi Trong năm 2012, có khoảng 207 triệu ca mắc (dao động từ 135 triệu đến 287 triệu) và 627.000 ca tử vong do sốt rét (dao động từ

473000 đến 789000) [32,33]

Tại Việt Nam, theo số liệu báo cáo hàng năm của Chương trình phòng chống sốt rét Quốc gia, nhiều tỉnh vẫn có mức độ lưu hành sốt rét cao, đặc biệt chủ là khu vực Miền Trung - Tây Nguyên với hầu hết các tỉnh có các xã, huyện

có đường biên giới với Lào hoặc Campuchia, đều có tỷ lệ bệnh nhân mắc sốt rét cao hơn so với các địa phương khác trong toàn quốc [32,33]

Các nhóm thuốc điều trị sốt rét đang sử dụng:

- Quinin

- Artemisinin và các dẫn chất

- Các 4-aminoquinolin

- Nhóm aryl-amino-alcol: mefloquin, halofantrin, lumefantrin

- Nhóm antifolic, antifolinic: các sulfamid, sulfon, pyrimethamin, proguanil, clorproguanil

- Các kháng sinh chống sốt rét: nhóm cyclin, macrolid, floroquinolon, lincosamid

đe dọa to lớn cho việc kiểm soát bệnh sốt rét [8]

1.2 Một số nhóm thuốc điều trị sốt rét điển hình

Artemisinin dihydroartemisinin

- Cơ chế:

Artemisinin là một lacton sesquiterpen trioxan có cầu nối endoperoxid là đặc điểm quan trọng cho tác dụng chống sốt rét Mặc dù cơ chế chính xác vẫn chưa rõ và còn rất nhiều tranh cãi, song nhiều tác giả cho rằng artemisinin và các dẫn xuất tập trung chọn lọc vào các tế bào nhiễm ký sinh trùng sốt rét và phản ứng với hemozoin trong chúng Phản ứng này tạo ra nhiều gốc tự do hữu

cơ độc, có thể phá hủy màng của ký sinh trùng sốt rét Các dẫn xuất có tác dụng mạnh hơn artemisinin [20,21]

- Tác dụng:

Thuốc diệt thể phân liệt trong máu của mọi ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt tốt với sốt rét thể não do chủng Plasmodium falciparum gây ra, kể cả loài kháng cloroquin Thuốc không diệt giao bào và không có tác dụng lên giai đoạn ngoại hồng cầu Thời gian tác dụng ngắn nên không làm thuốc dự phòng và không

Các ký sinh trùng tiêu hóa hemoglobin của tế bào vật chủ, giải phóng ra một chất là sắt, feriprotoporphyrin IX (FP IX), acid amin, heme Đồng thời polyme hóa heme thành các sắc tố hemozoin làm thức ăn cho ký sinh trùng sốt rét Thuốc có tác dụng diệt sốt rét do có các cơ chế sau:

+ Ức chế quá trình polyme hóa, làm thiếu hemozoin và tích lũy heme gây độc cho ký sinh trùng

+ Tạo phức hợp cloroquin – FP IX gây tiêu hủy màng tế bào và diệt ký sinh trung

+ Do là base yếu, nên khi xâm nhập vào nội bào tạo hệ đệm làm mất khả năng tiêu hóa hemoglobin của ký sinh trùng [2]

- Tác dụng

Diệt thể vô tính ở giai đoạn tiền hồng cầu và trong hồng cầu, thể giao tử (trừ Plasmodium falciparum kháng cloroquin) Tác dụng cắt cơn sốt rét nhanh hơn quinin Thường dùng dự phòng và điều trị cắt cơn sốt rét do Plasmodium

vivax và Plasmodium malariae [2]

1.3 Liệu pháp điều trị phối hợp artemisinin với các thuốc sốt rét khác (ACTs)

Việc sử dụng không hợp lý, lạm dụng các thuốc chống sốt rét là nguyên nhân chính gây ra những hậu quả nghiêm trọng như thất bại điều trị, phản ứng

có hại và tương tác thuốc, tác động xấu đến hiệu quả quá trình điều trị bệnh sốt rét hiện nay [9,19,25,27] Hiện tượng kháng thuốc cũng như thất bại khi điều trị rét bằng các thuốc sốt rét hiện tại xảy ra ngày càng nhiều ở nhiều nước châu Phi đã buộc thế giới phải tìm ra một liệu pháp điều trị mới thay thế liệu pháp

cũ Từ năm 2001, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã đề nghị các nước đang có bệnh sốt rét phải thay đổi phác đồ cũ và áp dụng liệu pháp điều trị sốt rét mới, liệu pháp phối hợp ACTs

Các phối hợp thuốc artemether - lumefantrin, artesunat + amodiaquin, artesunat + sulphadoxin / pyrimethamin, và artesunat + mefloquin là một số ACTs đã được khuyến cáo sử dụng ở châu Phi dựa trên hiệu quả và dữ liệu về

độ an toàn [3,31] Mục đích phối hợp để tăng cường tác dụng lên kí sinh trùng sốt rét nhờ tác dụng hiệp đồng và để giảm sự kháng thuốc Liệu pháp phối hợp ACTs hiện nay vẫn đang được áp dụng trên quy mô lớn ở các nước châu Phi

và đạt được nhiều hiệu quả cũng như độ an toàn Các báo cáo cho thấy khả năng xuất hiện phản ứng bất lợi là hầu như không có hoặc rất nhỏ [5]

Các liệu pháp phối hợp ACTs hiện nay được tổ chức Y tế Thế Giới đưa vào hướng dẫn điều trị sốt rét [31]:

- Artemether phối hợp lumefantrin

Hiện đang có sẵn dạng một công thức cố định liều trong 1 viên chứa 20

mg artemether và 120 mg lumefantrin [31]

- Artesunat phối hợp amodiaquin

Hiện đang có sẵn dạng một công thức cố định liều trong 1 viên chứa 25 / 67,5 mg, 50/135 mg hoặc 100/270 mg artesunat và amodiaquin Vỉ thuốc riêng biệt có chứa 50 mg artesunat và 153 mg amodiaquin, tương ứng, cũng có sẵn [31]

- Artesunat phối hợp mefloquin

Hiện đang có sẵn dạng vỉ thuốc với viên nén ghi riêng biệt có chứa 50 mg của artesunat và 250 mg mefloquin, tương ứng Một công thức cố định liều artesunat và mefloquin đang được nghiên cứu

- Artesunat phối hợp sulfadoxin-pyrimethamin

Hiện đang có sẵn dạng viên nén riêng biệt có chứa 50 mg artesunat và viên nén có chứa 500 mg sulfadoxin và 25 mg pyrimethamin [4,31]

- Dihydroartemisinin phối hợp piperaquin

Hiện đang có sẵn dạng liều cố định với viên chứa 40 mg dihydroartemisinin và 320 mg piperaquin

- Artesunat phối hợp với tetracyclin hoặc doxycyclin hoặc clindamycin Không có vỉ đóng gói của bất kỳ dạng kết hợp này Đây là dành cho những trường hợp rất hiếm hoi khi thất bại điều trị với ACTs đề nghị và trong một số nhóm đặc biệt, ví dụ: phụ nữ mang thai không điều trị ACTs [31]

Nhược điểm của các liệu pháp phối hợp này là gây ra những khó khăn trong bào chế, làm tăng giá thành sản phẩm, tăng chi phí điều trị, người dùng thuốc gặp khó khăn trong tuân thủ điều trị và tăng nguy cơ tương tác thuốc

1.4 Nghiên cứu trước đây về dẫn chất 11-aza-artemisinin

1.4.1 Chuyển đổi artemisinin thành 11-aza-artemisinin và thử tác dụng sinh

học của Ziffer và cộng sự

Cho đến năm 1995, cấu trúc khung artemisinin vẫn không được biến đổi nhiều Hầu hết các dẫn xuất artemisinin vẫn chỉ được tổng hợp dưới dạng ester, ether, cacbonat và urethan của dihydroartemisinin Ziffer và cộng sự [29,30] là những người đầu tiên đưa ra nghiên cứu một chuỗi phản ứng mới, mà bắt đầu với việc mở vòng lacton và tạo gốc amid, từ đó hệ thống vòng tetracyclic được chuyển thành một vòng lactam (sơ đồ 1.3), đây cũng là lúc các hợp chất 11-aza-artemisinin được biết đến

Sơ đồ 1.1: Chuyển artemisinin thành 11-aza-artemisinin

Các aza-artemisinin 5 và 6 của Ziffer đã được kiểm tra khả năng chống

lại một chủng Plasmodium falciparum kháng cloroquin (FCR3) [29] Theo dự

kiến, các hợp chất deoxy 6 không cho thấy bất kỳ tác dụng nào Các kết quả

thử in vitro cho thấy rằng ba trong số các hợp chất mang thử có tác dụng chống

sốt rét mạnh hơn so với artemisinin (1) (bảng 1.1) Xét nghiệm tác dụng sinh học cho thấy hợp chất 6i (bảng 1.1) có tác dụng chống sốt rét mạnh hơn gấp 26

lần trong in vitro và gấp hơn 4 lần trong in vivo (thử trên P berghei ở chuột) so

với tác dụng của artemisinin (bằng xấp xỉ tác dụng của β-arteether) Hợp chất

5i này thu được bằng cách ozon phân khử nhóm N-allyl của hợp chất 5b

[14,29,30]

Bảng 1.1: Tác dụng chống sốt rét in vitro của các hợp chất 11-aza-artemisinin

5 và desoxo aza-artemisinin 6 so với artemisinin 1

Tác dụng chống

sốt rét in vitro

với chủng P

falciparum kháng cloroquin FCR3

Tác dụng chống

sốt rét in vitro

với chủng P falciparum kháng cloroquin FCR3

1.4.2 Tổng hợp các dẫn xuất 11-aza-artemisinin sử dụng phản ứng Ugi và

Plasmodium falciparum kháng cloroquin mạnh Mỗi chất 10- 24 trong sơ đồ sẽ

được thử ở ba nồng độ 100, 10 và 1 ng/mL (bảng 1.2) Kết quả ở nồng độ 100

ng/mL cả 15 chất 10- 24 đều cho tác dụng ức chế 100 % Ở nồng độ 10 ng/mL

có 10 chất 11, 12, 15 – 19, 21, 23, 24 cho ức chế 50 % và ở nồng độ 1ng/mL vẫn có 3 chất 12, 15 và 21 cho tác dụng ức chế rất mạnh (78-100 %) lên chủng FcB1 Đặc biệt có 3 hợp chất 12, 15 và 21 có tác dụng mạnh hơn các thuốc điều

trị hiện nay [28]

Bảng 1.2: Hiệu suất và tác dụng chống sốt rét của các dẫn chất

11-aza-artemisinin

Như vậy, một chuỗi các dẫn chất mới của 11-aza-artemisinin được tổng

hợp bằng phản ứng Ugi, đều cho thấy tác dụng chống sốt rét, và 3 chất 12, 15,

và 21 cho tác dụng ức chế rất mạnh Đây thực sự là một tiềm năng rất tốt cho

việc nghiên cứu ra các thuốc chống sốt rét mới

Hợp chất R

Hiệu suất (%)

100 ng/

mL

10 ng/

mL

1 ng/

1.5 Nghiên cứu hiện nay về thuốc điều trị sốt rét dùng “phương pháp lai hóa”

Sốt rét là một căn bệnh ảnh hưởng đến gần 40% dân số toàn cầu, và hóa trị liệu vẫn là trụ cột của chiến lược kiểm soát của nó Tình hình sốt rét toàn cầu đang ngày càng bị trầm trọng thêm bởi sự xuất hiện của kháng thuốc với hầu hết các thuốc chống sốt rét có sẵn, nhu cầu cần thiết phải tìm kiếm ra các loại thuốc mới Một cách tiếp cận hợp lý gần đây của các nhà nghiên cứu thuốc sốt rét được gọi là “covalent bitherapy” liên quan đến việc liên kết hai phân tử thuốc với các cơ chế tác dụng riêng lẻ thành một phân tử duy nhất, do đó đóng gói tác dụng kép của 2 phân tử thuốc vào một phân tử lai duy nhất [12] Các phân tử lai, theo như mô tả của Meunier, gồm hai phân tử riêng biệt tham gia đồng hóa trị thành một phân tử lai, mà nó sẽ hoạt động như hai pharmacophore riêng biệt [17] Nghiên cứu hiện nay trong lĩnh vực này đã xác nhận các phân

tử lai này như các thuốc chống sốt rét thế hệ tiếp theo Nếu tác dụng sinh học

của các tiền chất lai có thể được chứng minh in vivo với sinh khả dụng tốt, nó

sẽ mang lại các lợi thế khác nhau bao gồm cả việc dễ tuân thủ liều lượng, độc tính giảm thiểu, khả năng phối hợp thuốc tốt hơn, và đánh giá tiền lâm sàng rẻ hơn, trong khi đạt được mục tiêu giảm kháng thuốc, có tiềm năng sử dụng trên lâm sàng [12]

1.6 Một vài nghiên cứu về phép lai hóa, kết hợp artemisinin hoặc dẫn chất artemisinin với các dẫn chất 4-aminoquinolin

1.6.1 Lai hóa giữa dihyroartemisinin (DHA) và aminoquinolin

Marli CL và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu lai hóa, DHA được bắt cặp với mỗi aminoquinolin thông qua cầu nối ether (sơ đồ 1.3), với mục đích kéo dài thời gian bán thải của DHA [15] Bằng cách thay cầu nối ester bằng cầu nối ether/amin thì sẽ giúp hợp chất ổn định hơn, không bị thủy phân bởi men estease

trong cơ thể Hơn nữa hợp chất lai này sẽ giúp mang lại tác dụng kép của cả hai chất trong một

Vậy bằng cách này, hợp chất lai sẽ giúp tăng tác dụng chống sốt rét và kéo dài thời gian bán thải, giúp tránh được tương tác thuốc – thuốc, cải thiện tuân thủ điều trị

Sơ đồ 1.3: Tổng hợp phân tử lai DHA- aminoquinolin

1.6.2 Tổng hợp phân tử lai trioxaquin

Meunier và cộng sự nghiên cứu về tổng hợp phân tử lai trioxaquin bằng cách kết hợp trioxan (một dẫn chất tương tự artemisinin có cầu nói peroxid) và 4-aminoquinolin [23]

Trong giai đoạn hồng cầu, ký sinh trùng sốt rét biến đổi hemoglobin tạo thành heme, như một chất thải của chúng, giai đoạn này chính là đích tác dụng chung của 2 chất 4-aminoquinolin và các dẫn xuất endoperoxid (artemisinin) [6,11]

Meunier và cộng sự tổng hợp một phân tử mới có tên là các trioxaquin, bằng cách gắn liên kết cộng hóa trị của một trioxan riêng biệt với một phân tử 4-aminoquinolin (hình 1.1) Phần trioxan sẽ là một tác nhân alkyl hóa tiềm năng sau khi được kích hoạt khử bởi heme [22,23,24], còn các 4-aminoquinolin có khả năng dễ dàng thâm nhập vào bên trong các hồng cầu bị nhiễm kí sinh trùng sốt rét và sau đó tương tác với heme [10] Những phân tử trioxaquin này sẽ thâm nhập vào các tế bào hồng cầu bị nhiễm sau đó tương tác với các phân tử heme tự do giải phóng ra trong quá trình tiêu hóa hemoglobin bởi thể phân liệt sốt rét Phân tử lai này được dự kiến sẽ kết hợp được tác dụng, thuộc tính của

cả hai nửa trioxan và 4-aminoquinolin

Hình 1.1: Cấu trúc chung của các trioxaquin

Trioxaquin đầu tiên, DU1102 (42) (sơ đồ 1.4), được tổng hợp bởi Meunier

và đồng nghiệp, cho thấy tác dụng tốt trong in vitro đối với Plasmodium

falciparum kháng cloroquin cũng như pyrimethamin Họ tổng hợp bốn dẫn xuất

trioxaquin 39, 40, 41, 42 (sơ đồ 1.4) và thử nghiệm khả năng chống lại ba chủng

khác nhau của P falciparum: Nigeria chủng nhạy cảm với cloroquin, FcB1 kháng cloroquin và FcM29 kháng cloroquin cao Trong số bốn hợp chất tổng

hợp các dicitrat-trioxaquin 42 và chất tương tự nó 40 đã có tác dụng tích cực

trên P falciparum hơn so với cloroquin [10,26]

Sơ đồ 1.4: Tổng hợp trioxaquin từ trioxan và dẫn chất 4-aminoquinolin

Tóm lại, sự phát triển của các phân tử lai với tác dụng kép này là một mốc quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu thuốc Đây là một phương pháp có thể tìm ra các loại thuốc với giá cả phải chăng và có khả năng chống lại sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc Trioxaquin là ví dụ tốt nhất của một phân tử như vậy Các trioxaquin với khả năng akyl hoá heme và ức chế hemozoin có thể giúp tránh sự phát triển của các chủng kháng thuốc Hơn nữa, các trioxaquin cũng cho thấy tác dụng tốt đối với thể giao bào sốt rét do đó sẽ hạn chế việc truyền các ký sinh trùng sốt rét Vì vậy, các trioxaquin có thể được coi là một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho một thuốc mới có khả năng chống bệnh sốt rét

thông qua tác dụng làm giảm triệu chứng và cả hạn chế quá trình lây truyền [10,7]

Trên cơ sở các công trình nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu tổng hợp các chất lai hóa giữa 11-aza-artemisinin và dẫn chất 4-aminoquinolin với định hướng điều trị sốt rét

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Hóa chất

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm là loại dành cho tổng hợp Các hóa chất này đạt các tiêu chuẩn cơ sở, tiêu chuẩn dược điển, được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm.

- Hóa chất chính

- DIBAl (diisobutylaluminium hydrid)

- Máy cất quay chân không Buchi R-114

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu

- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm

- Bản mỏng silica gel 60F254 (Merck)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital)

- Máy Perkin Elmer để xác định phổ IR

- Máy khối phổ LC/MS Agilent 1120

- Máy cộng hưởng từ Bruker Avance 500 MHz

1.2 Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp hóa học

Tổng hợp 3 hợp chất lai hóa giữa artemisinin và 4-aminoquinolin qua

cầu nối amin Va, Vb, Vc:

1.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học

Các chất Va-Vc được tổng hợp theo sơ đồ:

Sơ đồ 2.1: Tổng hợp các chất Va-Vc

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết

- Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng

- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy Sắc kí lớp mỏng TLC thực hiện trên bản mỏng silica gel 60F254 (Merck)

và quan sát dưới đèn UV bước sóng 254 nm / hiện màu với thuốc thử Ce-Mo Nhiệt độ nóng chảy máy được trên máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital)

2.3.3 Xác định cấu trúc

Các chất tổng hợp được xác định cấu trúc bằng các loại phổ sau: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR) đo bằng máy Perkin Elmer

- Phổ khối (MS) được đo máy khối phổ LC/MS Agilent 1120

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) được đo bằng máy cộng hưởng hạt nhân Bruker Avance 500 MHz với TMS làm chất nội chuẩn, độ dịch chuyển hóa học được báo cáo theo số liệu ppm

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN3.1 Thực nghiệm, kết quả

Quá trình tổng hợp 3 chất trong đề tài được tiến hành theo sơ đồ sau:

- Hợp chất 11-aza-artemisinin aldehyd IV được tổng hợp từ hợp chất artemisinin I

Tiếp theo, hợp chất lai hóa được tạo ra nhờ liên kết hóa trị giữa artemisinin

và 4-aminoquinolin qua cầu nối amin

Hòa tan 2,00 g artemisinin I (7,09 mmol) vào 40 mL THF và 12 mL

methanol trong bình cầu phản ứng, làm lạnh phản ứng xuống -15 oC, thêm vào

đó 10 mL dung dịch amoniac 25% trong nước Phản ứng được khuấy ở nhiệt

độ -15 oC trong 12 giờ Loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ thường

để thu được chất rắn màu vàng nhạt Hòa tan chất rắn trên trong 40 mL

dicloromethan và thêm vào 1,48 g acid p-toluensulfonic (7,8 mmol) và tiếp tục

khuấy trong vòng 3 giờ

- Xử lý

Sau khi phản ứng kết thúc, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung

môi EA-n-hexan (1:1), cho thêm nước và chiết bằng ethylacetat Dịch chiết

được làm khan với natri sulphat, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm

Tinh chế bằng cách kết tinh với ethylacetat/n-hexan để thu được sản phẩm II

- Kết quả:

Thu được 1,55 g chất rắn màu trắng, to

nc = 143-145oC, H = 78,0 %

Hòa tan 1,50 g 11-aza-artemisinin (II) (5,3 mmol) vào 50 mL THF trong

bình cầu phản ứng, thêm vào đó 1,5 mL metyl acrylat (16 mmol) và 640 mg NaOH (16 mmol) Phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Kiểm

tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi EA - n-hexan (1:2), cho đến khi phản

Hòa tan 500 mg hợp chất (III) (1,35 mmol) vào 10 mL THF trong bình

cầu phản ứng, làm lạnh phản ứng xuống -78 oC bằng hỗn hợp aceton-đá khô, thêm từ từ 2,5 mL dung dịch DIBAL 1,1M trong THF Phản ứng tiếp tục được

khuấy ở nhiệt độ đó trong 1 giờ

- Xử lý

Sau khi phản ứng kết thúc, cho thêm dung dịch NH4Cl và chiết bằng ethylacetat Dịch chiết được làm khan với natri sulphat, lọc và cất loại dung

môi dưới áp suất giảm Tinh chế bằng sắc ký cột sử dụng hệ dung môi EA-

n-Hexan (1:1) để thu được sản phẩm (IV)

- Kết quả

Thu được 241 mg một chất keo màu vàng nhạt, H = 53,0 %

dần lên nhiệt độ phòng trong 5 giờ rồi chấm TLC kiểm tra phản ứng kết thúc

- Xử lý

Sau khi phản ứng kết thúc lọc bỏ MgSO4, cô khô, chiết bằng hỗn hợp EA

và nước Dịch chiết được làm khan với natri sulphat, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm Tinh chế bằng sắc ký cột sử dụng hệ hệ dung môi EA-MeOH (10:1), chấm và soi UV Thu sản phẩm, rồi mang cô hút chân không thu được

chất Va

- Kết quả

Thu được 37,7 mg một chất rắn màu trắng hơi vàng, H = 48,4 %

0oC rồi thêm khoảng 12 mg NaBH4, khuấy cho phản ứng trong 1h rồi Sau đó

nâng lên nhiệt độ phòng trong 5 giờ rồi chấm TLC kiểm tra phản ứng kết thúc

- Xử lý

Sau khi phản ứng kết thúc lọc bỏ MgSO4, cô khô, chiết bằng hỗn hợp EA

và nước Dịch chiết được làm khan với natri sulphat, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm Tinh chế bằng sắc ký cột sử dụng hệ hệ dung môi EA-MeOH (10:1), chấm và soi UV Thu sản phẩm, rồi mang cô hút chân không thu được

chất Vb

- Kết quả

Thu được 40 mg một chất rắn màu trắng, H = 50,0 %

0oC rồi thêm khoảng 12 mg NaBH4, khuấy cho phản ứng trong 1 giờ Sau đó

nâng lên nhiệt độ phòng 5 giờ rồi chấm TLC kiểm tra phản ứng kết thúc

- Xử lý

Sau khi phản ứng kết thúc lọc bỏ MgSO4, cô khô, chiết bằng hỗn hợp EA

và nước Dịch chiết được làm khan với natri sulphat, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm Tinh chế bằng sắc ký cột sử dụng hệ hệ dung môi EA-MeOH (10:1), chấm và soi UV Thu sản phẩm, rồi mang cô hút chân không thu được

chất Vc

- Kết quả

Thu được 39,5 mg một chất rắn màu trắng, H = 47,1 %

Các chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các chất Va-Vc được tổng kết

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Độ tinh khiết của các chất Va-Vc được kiểm tra bằng sắc kí TLC và đo

- Đo nhiệt độ nóng chảy

Cả 3 chất Va-Vc đều có dạng tinh thể rắn Điểm nóng chảy của các dẫn

chất được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital) Nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất dao dộng trong khoảng nhỏ Giá trị Rf và tonc của các chất Va-Vc được tổng hợp trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Giá trị R f và tonc của các chất Va-Vc

Vb

EA - MeOH (10:1) 0,32

280-282 DCM – EtOH (5:1) 0,49

Vc

EA - MeOH (10:1) 0,31

290-291 DCM – EtOH (5:1) 0,51

Như vậy có thế khẳng định các hợp chất Va-Vc tương đối tinh khiết, có

thể mang đi tiến hành đo các phổ IR, MS, NMR

3.1.3 Xác định cấu trúc

Để khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được, tiến hành ghi phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR) của các sản phẩm cuối Kết quả phổ của các chất được trình bày cụ thể ở bảng 3.3 – 3.7

3.1.3.1 Phổ hồng ngoại (IR)

Kết quả đo phổ IR được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) các chất Va-Vc

1443,36

2932,86 2862,18

1536,92 1576,89 1448,41

2830,19 2866,43

Ghi chú: ν: dao động hóa trị

Nhận xét: Phổ IR của các chất Va-Vc cho thấy các tín hiệu để có thể nhận

dạng sơ bộ sự hiện diện một số nhóm chức: C=O amid (khoảng hấp thụ 1665 -

1760 cm-1), N-H (khoảng hấp thụ 3250 - 3450 cm-1), C=C (khoảng hấp thụ

1400 – 1600 cm-1) với các giá trị của dải hấp thu, cường độ pic, hình dạng pic phù hợp với dự đoán

3.1.3.2 Phổ khối lượng (MS)

Kết quả đo phổ khối MS được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) các chất Va-Vc

Chú thích: m: khối lượng , z: điện tích

Nhận xét: Kết quả phân tích phổ ở bảng 3.4 và phổ đồ cho thấy: các phổ đều có pic phân tử có số khối đúng bằng số khối dự kiến với cường độ mạnh, các pic ion phân tử [M+H]+ ở m/z có tỉ lệ 3:1 (100 : 32) cho phép xác định cả

3 hợp chất Va-Vc đều có 1 nguyên tử Cl trong phân tử

3.1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H ( 1 H-NMR)

Kết quả đo phổ 1H-NMR được tổng hợp trong bảng 3.5 và 3.6

Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H (1H-NMR) các

chất II, III, IV, Va-Vc

II

6,20 (1H, br s), 5,36 (1H, s), 3,15 (1H, m), 2,30–2,47 (1H, m), 1,90–2,05 (2H, m), 1,38 (3H, s), 1,68–1,87 (3H, m), 1,12 (3H, d,

m), 1,34 (3H, s), 1,09 (3H, d, J =

7,2 Hz), 0,98 (3H, d, J = 6,0 Hz),

0,81-1,01 (2H, m)

Ghi chú: δ: Độ chuyển dịch hóa học (ppm); s: singlet, vạch đơn; d: doublet,

vạch đôi; t: triplet, vạch ba; m: multiplet, đa vạch

Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H (1H-NMR) các

s), 3,45-3,52 (1H, m), 3,15-3,31 (3H, m), 3,11 (1H, m), 2,60 (2H, m), 2,40-2,50 (2H, m), 2,21 (1H, m), 1,45-1,85 (9H, m), 1,10-1,31

(3H, m), 0,95 (3H, d, J = 7,0 Hz), 1,15 (3H, s), 0,82 (3H, d, J = 6,5

Hz), 0,65-0,90 (2H, m)

Vb

8,34 (1H, d, J= 5,5Hz), 8,10 (1H,

d, J= 9,0Hz), 7,77 (1H, d, J= 2,0Hz), 7,38 (1H, dd, J= 2,0Hz, J= 9,0Hz ), 6,51 (1H, d, J= 5,5Hz),

5,33 (1H, s), 3,58-3,64 (1H, m), 3,40-3,46 (1H, m), 3,36-3,38 (2H, m), 3,19 (1H, m), 2,62 (2H, m), 2,54-2,59 (2H, m), 2,34 (1H, m), 1,91-1,99 (2H, m), 1,59-1,88 (9H,