Nghiên cứu tổng hợp kháng sinh từ streptomycin 184.225

Chi này còn có nhiều VSV ngoài khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn tổng hợp các chất khác: chất điều trị ung thư actinomycin D, chất kích thích tăng trưởng được sử dụng nhiều trong ch

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP

KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES

184.225

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP

KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES

184.225

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

ThS Nguyễn Liên Hương Nơi thực hiện:

Bộ môn Vi sinh - Sinh học

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo ThS Nguyễn

Liên Hương - người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình để giúp tôi hoàn

thành khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường

Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên,

hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu khoa học

Do điều kiện nghiên cứu, thời gian có hạn và trình độ của bản thân còn hạn hẹp nên không thể tránh khỏi những sai sót trong bài luận Vì vậy, tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Ngô Thanh Huyền

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.2 Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 3

1.3 Cải tạo giống và bảo quản giống vi sinh vật 5

1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 7

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh 8

1.6 Sơ lược một số phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh 10

1.7 Một số nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces 11

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.1 Giống xạ khuẩn 13

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 13

2.1.3 Các loại môi trường nuôi cấy 13

2.1.4 Dụng cụ, hóa chất 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.2 Chọn lọc và cải tạo giống 17

2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh 17

2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 17

2.3 Phương pháp thực nghiệm 18

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống 18

2.3.2 Phương pháp xác định hình thái xạ khuẩn 18

2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 19

2.3.4 Phương pháp chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 20

2.3.5 Phương pháp cải tạo và chọn giống 20

2.3.6 Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23

2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh trong dịch lọc dịch lên men 24

2.3.8 Các phương pháp chiết tách kháng sinh 24

2.3.8.2 Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 24

2.3.9 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 26

2.3.10 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 26

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 27

3.1 Xác định hình thái xạ khuẩn Streptomyces 184.225 27

3.2 Kết quả chọn MT nuôi cấy thích hợp và xác định tác dụng của kháng sinh 27

3.3 Kết quả cải tạo giống 28

3.3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 28

3.3.2 Kết quả đột biến 29

3.4 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 32

3.5 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 33

3.6 Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh 34

3.7 Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 36

3.8 Kết quả chạy sắc kí cột 37

3.9 Sơ bộ xác định cấu trúc hóa học và một số đặc điểm của KS thu được 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

AND Acid 2'- deoxyribonucleic

B.subtilis Bacillus subtilis

P.mirabilis Proteus mirabilis

s Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh

DANH MỤC BẢNG, DANH MỤC PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 2

Bảng 2.1 Các vi sinh vật kiểm định 13

Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) 14

Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 15

Bảng 2.4 Các dung môi sử dụng và một số đặc tính của nó 15

Bảng 3.1 Các đặc điểm của Streptomyces 184.225 27

Bảng 3.2 Kết quả thử HTKS với 10 VSV kiểm định 27

Bảng 3.3 Kết quả thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 29

Bảng 3.4 Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 29

Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 30

Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học 31

Bảng 3.7 Kết quả thử HTKS chọn môi trường lên men 32

Bảng 3.8 Kết quả lên men các biến chủng tốt nhất trên MT2dt 32

Bảng 3.9 Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh 33

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 34

Bảng 3.11 Kết quả chiết kháng sinh bằng DMHC ở các pH khác nhau 35

Bảng 3.12 Kết quả tách kháng sinh trong dịch chiết bằng SKLM 36

Bảng 3.13 Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 1 37

Bảng 3.14 Kết quả SKLM với các phân đoạn 2-18 (hiện hình bằng B.subtilis) 38

Bảng 3.15 Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2 39

Bảng 3.16 Kết quả SKLM các PĐ 2-15 của lần chạy cột lần 2 tách KS1, KS2 40

Bảng 3.17 Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 3 41

Bảng 3.18 Kết quả SKLM các PĐ 2-12 của lần chạy cột lần 3 tách KS2, KS3 41

Phụ lục 1 Bảng 3.3 Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 49

Phụ lục 2 Bảng 3.4 Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 50

Phụ lục 3 Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 52

Phụ lục 4 Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học 54

Phụ lục 5 Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh 56

Phụ lục 6 Ống nghiệm chứa Streptomyces 184.225 sau 6 ngày nuôi cấy 56

Phụ lục 7 Kết quả thử HTKS Streptomyces 184.225 bằng PP giếng thạch 57

Phụ lục 8 Kết quả thử HTKS Streptomyces 184.225 bằng PP khoanh giấy lọc 57

Phụ lục 9 SKLM các phân đoạn tách các chất kháng sinh 58

Phụ lục 10 Hình dạng chuỗi bào tử (a) và bề mặt bào tử (b) của Streptomyces 184.225 58

Phụ lục 11 Phổ tử ngoại vết KS2 của Streptomyces 184.225 59

Phụ lục 12 Phổ hồng ngoại vết KS2 của Streptomyces 184.225 60

Phụ lục 13 Phổ khối lượng vết KS2 của Streptomyces 184.225 60

ĐẶT VẤN ĐỀ

Năm 1928 khi Alexander Fleming ngẫu nhiên phát hiện ra sự ức chế phát triển

S.aureus của Penicillin notatum, đến năm 1941, ông đã chiết ra được Penicillin từ chủng Penicilium chrysogenium có hoạt tính cao hơn nhiều lần và đã cứu được hàng

ngàn thương binh trong chiến tranh thế giới lần 1 Từ đó, các công trình nghiên cứu kháng sinh liên tục được tiến hành, ứng dụng rộng rãi trong y học lâm sàng, và ngành công nghệ lên men sản xuất kháng sinh đã ra đời

Mặc dù đã có rất nhiều thành công trong việc phát hiện ra kháng sinh và những tiến bộ trong kỹ thuật sản xuất kháng sinh, nhưng hiện nay các bệnh nhiễm khuẩn vẫn đang là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới, khoảng hơn 17 triệu người chết mỗi năm Tự sử dụng thuốc và lạm dụng kháng sinh

là một yếu tố quan trọng gây hiện tượng kháng kháng sinh, giảm tuổi thọ của thuốc

Do đó thấy được sự cấp thiết phải liên tục cho nghiên cứu và phát triển các loại thuốc kháng sinh mới

Khí hậu Việt Nam có điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của hệ VSV, đáng chú ý là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong số đó

55% là do chi Streptomyces sản xuất Chi này còn có nhiều VSV ngoài khả năng

sinh tổng hợp kháng sinh còn tổng hợp các chất khác: chất điều trị ung thư (actinomycin D), chất kích thích tăng trưởng được sử dụng nhiều trong chăn nuôi…

Chính vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ

Streptomyces 184.225” với các mục tiêu sau:

- Sơ bộ xác định hình thái của Streptomyces 184.225 theo ISP

- Cải tạo giống theo hướng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Xác định, lựa chọn môi trường lên men thích hợp, chiết xuất, tinh chế KS

- Sơ bộ xác định một vài đặc tính vật lí, hóa học của kháng sinh tổng hợp được

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh

Theo quan niệm truyền thống: "Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất

tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác"

Theo quan niệm hiện nay: Kháng sinh đại diện cho tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh (cũng như cả với tế bào ung thư) ở nồng độ thấp, mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp chỉ được sinh tổng hợp mạnh mẽ ở giai đoạn phát triển sau (pha logarit muộn, pha dừng, hoặc pha suy tàn) của sinh trưởng VSV [9]

1.1.2 Phân loại kháng sinh

Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa học, cơ chế tác dụng,…trong

đó phân loại theo cấu trúc hóa học được áp dụng phổ biển nhất vì nó giúp người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện thông qua cấu trúc hóa học của nó Các chất được phân loại theo cấu trúc hóa học chia làm 10 nhóm theo bảng 1.1 [8], [5]

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Khái quát theo đích tác dụng của kháng sinh:

- Tổng hợp thành tế bào: β –lactam, vancomycin…

- Màng tế bào chất: Polyen, amphotericin,…

- Tổng hợp ADN: Actinomycin, anzamycin

- Tổng hợp protein: Aminoglycosid (ribosome), macrolid (liên kết t-ADN)…

- Trao đổi chất hô hấp: Antimycin,…

- Trao đổi chất folat: Sulfamid,…

Sơ đồ cơ chế tác dụng kháng sinh được trình bày ở phụ lục 5 [9]

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn

- Sự hình thành chất kháng sinh của xạ khuẩn: kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha lũy thừa, đầu pha cân bằng của quá trình sinh trưởng

- Ảnh hưởng của thành phần lên men: nguồn carbon, nguồn nitơ, phosphat vô

cơ và các yếu tố vi lượng

- Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy: độ thông khí, nhiệt độ, pH, tuổi giống [9]

1.2 Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)

Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rộng rãi trong tự nhiên Trước kia chúng được xếp vào Tản thực vật, nhưng ngày nay, chúng được xếp vào vi khuẩn (Schizomyces)

Đa số là vi khuẩn Gr (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty), tỷ lệ G+C > 55% Chúng có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzym, vitamin,… Vì thế, chúng được nghiên cứu nhiều Tuy nhiên một số ít xạ khuẩn có thể gây hại cho người hoặc động vật

[4], [9],[11]

1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Streptomyces

Streptomyces là một chi của vi khuẩn Gram (+)

- Khuẩn lạc của xạ khuẩn Streptomyces: khá đặc biệt, thường có dạng khô ráp,

dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, dùng que cấy không di chuyển được khuẩn lạc xạ khuẩn vì KTCC bám sâu vào trong thạch

- Khuẩn ty xạ khuẩn: Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng từ 0,3-1,0 µm đến 2-3µm Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn, màu sắc khuẩn ty rất phong phú: đỏ, cam, đen, lục cam, nâu, KTCC có thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố như: sắc tố tan trong nước, sắc tố tan trong DMHC, đặc biệt có loài tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen

- KTCC phát triển một thời gian dài ra trong không khí thành KTKS Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh KTKS sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử mọc đơn hay mọc vòng (thẳng, uốn cong, xoắn lò xo, )

- Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của chi xạ khuẩn Streptomyces Bề

mặt bào tử có thể nhẵn, sần sùi da cóc, có gai, có tóc,…với các hình dạng phong phú: hình cầu, hình ellipsoic, hình trụ…[9],[11]

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn

- Thành tế bào: có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm, có chức năng duy

trì hình dạng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào Chi Streptomyces thuộc nhóm CWI có chứa L-DAP (L- diaminopimelic acid) và glycin

- Màng tế bào chất: dày khoảng 7,5-10nm Chúng có cấu trúc và chức năng giống vi khuẩn nói chung

- Mesosom nằm ở phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay hình ống Mesosom làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào chất và qua đó làm tăng cường hoạt tính enzym, tăng vận chuyển điện tử…

- Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt phosphat, các hạt polysaccarid [9],[11],[16]

1.2.3 Đặc điểm sinh lý

Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Để phát triển, chúng phân

giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, chúng có thể khử nitrat thành nitrit

Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ tối thích thường là 25-300C,

pH tối thích thường từ 6,8-7,5 Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành 4

nhóm: sắc tố hòa tan, sắc tố của KTCC, sắc tố của KTKS, sắc tố melanoid [9]

1.2.4 Xác định hình thái xạ khuẩn

Xác định hình thái chuỗi bào tử dựa vào cách phân loại theo ISP

Tại hội nghị vi sinh vật thế giới lần thứ X (1970), khóa phân loại do Shirling

& Gottlieb đề xuất đã được sử dụng để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomytaceae Khóa phân loại dựa trên các đặc điểm:

- Đặc điểm hình thái học của xạ khuẩn: Màu sắc KTCC, màu sắc KTKS, hình dạng chuỗi bào tử, đặc điểm bề mặt, kích thước và hình dạng bào tử

- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả năng

sử dụng nguồn hydratcarbon [9], [20], [2]

1.3 Cải tạo giống và bảo quản giống vi sinh vật

1.3.1 Cải tạo giống vi sinh vật

 Mục đích:

Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có hoạt tính rất thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm:

- Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Cải tạo các đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn: rút ngắn thời gian lên men, tạo ít bọt hơn

- Chỉ sinh tổng hợp 1 sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi hơn

- Sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo ra các liên kết, nhóm chức mới [8],[9]

 Các phương pháp cải tạo giống:

 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên:

Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh gấp 20-30% những cá thể khác Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính kháng sinh cao nhất trong ống giống nghiên cứu tiếp Việc chọn lọc này chỉ để tiến hành nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất [13]

 Đột biến nhân tạo

Các tác nhân gây đột biến mạnh như tia UV, tia X hay tác nhân hóa học như HNO2, ethylenimin, dimethylsulfat, nitrosoguanidin, cho tác dụng với liều lượng

và thời gian thích hợp sẽ giết chết các VSV Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi tính trạng dẫn đến hoặc là mất khả năng tạo ra kháng sinh (đột biến âm tính) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương tính)

Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào vi sinh vật

có kích thước nhỏ (0,5-3,0µm) thì có có thể xuyên thấu tới vùng nhân Vì vậy, ánh sáng UV được dùng phổ biến trong cải tạo giống Liều lượng chiếu được đặc trưng bởi 3 yếu tố: thời gian chiếu, khoảng cách chiếu, độ pha loãng bào tử Liều lượng chiếu càng cao thì số lượng đột biến càng lớn và cuối cùng đạt đến giới hạn nhất định Thông thường đột biến dương sẽ xuất hiện ở liều lượng chiếu có độ sống sót

từ 0,1-1,0%, còn đột biến âm sẽ xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hơn

Để tạo ra biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng gen, kĩ thuật tách dòng gen, tạo và dung hợp tế bào trần

1.3.2 Bảo quản giống vi sinh vật

 Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao và ổn định các đặc tính di truyền, không bị nhiễm các vi sinh vật lạ

 Các phương pháp bảo quản:

- Bảo quản lạnh: bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường ở 20C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền Tuy nhiên, cách này khiến chủng có nguy cơ bị thay đổi đặc tính di truyền

- Làm khô: trộn tế bào VSV với giá mang (đất, cát, gelatin) và làm khô ở nhiệt

độ phòng

- Đông khô: phân tán tế bào VSV trong môi trường chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh bằng thăng hoa Cách này tuy phức tạp nhưng đảm bảo được các đặc tính di truyền

- Đông lạnh: huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp (từ -780C đến -200

C) Cách này đơn giản và hiệu quả, nhưng cần có phương tiện để duy trì nhiệt độ thấp

Trong phòng thí nghiệm thường nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 20C và định kì 3-6 tháng cấy chuyền [8],[2],[10],[15]

1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.4.1 Khái niệm lên men

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của

VSV nhờ xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng

Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp, được tạo thành lúc gần kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân bằng [8],[13],[19]

1.4.2 Các phương pháp lên men

Có 2 phương pháp lên men:

 Lên men bề mặt:

Là quá trình VSV được nuôi cấy trên bề mặt rắn, bán rắn, lỏng VSV hấp thu các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường Vì vậy yêu cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng, lớn và không quá sâu (5-10cm)

- Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết bị ban đầu thấp

- Nhược điểm: hiệu suất sử dụng thường thấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự động hóa, tốn nhân công

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh

 Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:

- Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ

- Phương pháp tạo phức kết tủa

- Phương pháp trao đổi ion

- Phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, )

 Chiết xuất:

- Là phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai pha lỏng (1 pha là nước, 1 pha là dung môi hữu cơ không đồng tan với nước)

- Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào nhau

- Kháng sinh ngoại bào tồn tại trong dung dịch nên ta có thể sử dụng chiết lỏng - lỏng theo phép chiết đơn, lặp hay ngược dòng Kháng sinh nội bào tồn tại trong tế bào nên tiến hành chiết rắn lỏng

 Tinh chế:

- Phương pháp sắc ký: là một quy trình trong đó các chất tan được tách riêng

ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học của các chất này trong hệ thống hai hay nhiều pha

- Nguyên lý tách: mẫu phân tích được hòa tan trong pha động, sau đó được đưa lên pha tĩnh 1 cách liên tục và không hòa lẫn với nó Các chất tan của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ khác nhau tùy thuộc sự tương tác giữa pha tĩnh, pha động, chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, các thành phần sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đồ

- Một số phương pháp sắc ký thường dùng:

 Sắc ký lớp mỏng: là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ) Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf

trong đó: dv: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết

ddm: Khoảng cách dung môi chạy

Rf phụ thuộc: cách tiến hành, tính chất hoạt động của chất hấp thụ, tính chất của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm

 Sắc ký cột: là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách thêm liên tục một lượng mới của pha động [1],[2],[3],[8],[17]

1.6 Sơ lược một số phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh

1.6.2 Phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS)

- Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại

- Vùng UV-VIS bao gồm tia cực tím và ánh sáng khả kiến Do cấu trúc phân

tử quyết định mức năng lượng của điện tử và chuyển dịch điện tử xảy ra với sóng

ánh sáng vùng này, do vậy phương pháp này được áp dụng để định danh các chất [3], [7]

1.6.3 Phổ khối lượng (MS)

- Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó nhờ kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

- Dựa trên phổ thu được ta xác định được khối lượng phân tử và góp phần nhận dạng cấu trúc hóa học của hợp chất [2],[15], [18]

1.7 Một số nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces

1.7.1 Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn Streptomyces gilvigriseus:

Chủng Streptomyces MUSC 26T được phân lập từ mẫu đất rừng ngập mặn

tại Tanjung Lumpur, Malaysia Hình thái xạ khuẩn được quan sát trên bề mặt môi trường ISP7 thấy được là Gram dương, khuẩn ty khí sinh màu vàng Vách tế bào được xác định là có chứa acid LL-diaminopimelic, ngoài ra còn xác định có lipid, các loại đường (galactose, glucose, mannose…) Các đặc điểm khác cho thấy chủng

này có một loạt các đặc điểm giống với các loài thuộc chi Streptomyces: Streptomyces qinglanensis 172205T (96,5%), Streptomyces sodiiphilus YIM 80305T (96,6%), Streptomyces rimosus ATCC 10970T (96,4%) Tiến hành giải

trình tự gen kết luận rằng chủng này đại diện cho một loài mới, đặt tên là

Streptomyces gilvigriseus [25]

1.7.2 Phương pháp tiếp cận mới để tăng hiệu suất tổng hợp kháng sinh trên chủng Streptomyces albus:

Nghiên cứu trên chủng Streptomyces albus sinh kháng sinh Salinomycin mà

trước đây chủng này được nuôi cấy để sản xuất trên quy mô công nghiệp Người ta

đã chứng minh được hiệu quả của việc dùng các đột biến kháng thuốc để cải thiện hiệu suất sản xuất Salinomycin với tỷ lệ cao (7-12%) Sau đó, tiếp tục chứng minh

thành công việc cải thiện hiệu suất Salinomycin bằng việc dùng đột biến ba tác nhân Các Streptomycin đã được chứng minh là có một điểm đột biến trong gen rpsL (mã hóa protein ribosome S12) Tương tự như vậy, các đột biến Rifampin có đột biến ở gen rpoB (mã hóa cho tiểu đơn vị RNA polymerase β) Tăng năng suất của Salinomycin trong giống đột biến Streptomycin (có chứa các đột biến K88R trong protein S12) có thể là kết quả của một cơ chế tổng hợp protein bất thường Ribosome đột biến K88R được đặc trưng bởi sự tăng 70S (ổn định trong nồng độ thấp Mg2+) Kết luận rằng khả năng tổng hợp protein bất thường này trong giống đột

biến Streptomyces là kết quả của việc gia tăng sự ổn định của phức hợp 70S, tác

động trực tiếp đến việc tăng cường sản xuất Salinomycin [26]

1.7.3 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 - Streptomyces microflavus

Tiến hành nghiên cứu trên chủng Streptomyces 15.29: theo phân loại ISP nhận thấy Streptomyces 15.29 có các đặc trưng giống với Streptomyces sinensis

(92,86%) Tiến hành giải trình tự gen 16S rARN ứng dụng PCR fingerprinting sử

dụng mồi MST1 cho thấy hệ gen của Streptomyces 15.29 hoàn toàn trùng khớp với gen của Streptomyces microflavus Do đó, kết luận tên khoa học của Streptomyces 15.29 là Streptomyces microflavus Qua cải tạo giống, hiệu suất sinh tổng hợp KS của Streptomyces 15.29 được nâng cao rõ rệt, chọn được biến chủng Streptomyces 15.29.21.23 (từ đột biến UV) để lên men chìm Tiến hành lên men chìm trên máy

lắc và trong bình lên men 5 lít và 500 lít, nhận thấy lên men trong máy lắc cho kết quả tốt hơn Khảo sát các dung môi và pH thích hợp để chiết kháng sinh từ dịch lên men, nhận thấy dung môi Ethylacetat ở pH = 5 cho kết quả tốt nhất Tiến hành tách

KS bằng SKLM và sắc ký cột cho thấy bột kháng sinh thô có ít nhất 4 thành phần Tiến hành tinh chế các thành phần chính thu được hiệu suất là 66% [20]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Giống xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 đã được

phân lập và tuyển chọn, do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp và lưu giữ

2.1.2 Vi sinh vật kiểm định

VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp (bảng 2.1):

Bảng 2.1 Các vi sinh vật kiểm định

Loại vi khuẩn Tên VSV kiểm định Tên viết tắt

Vi khuẩn Gram dương (+)

Bacillus subtilis ATCC 10241 B subtilis Bacillus pumilus ATCC 10241 B pumilus

Staphyllococus aureus ATCC 1128 S aureus

Vi khuẩn Gram âm (-)

Escherichia coli ATCC 25922 E coli

Pseudomonas aeruginosa VM 201 P aeruginosa

2.1.3 Các loại môi trường nuôi cấy

 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

Thành phần các môi trường sử dụng nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 2.2:

Bảng 2.2 Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml)

Với môi trường lên men dịch thể (MTdt) sử dụng để lên men chìm thì các thành phần tương tự như môi trường nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không có thạch

 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (bảng 2.3):

Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần NaCl (g) Pepton (g) Cao thịt (g) Thạch (g) Nước

Bảng 2.4 Các dung môi sử dụng và một số đặc tính của nó

- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48

- Nồi hấp vô trùng Hyrayama model HL 3030

- Tủ sấy Sanyo Clean Bench, tủ lạnh, tủ lạnh sâu

- Tủ ấm Memmert, Binder 30oC – 37oC

- Cân kỹ thuật, cân phân tích

- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 LF

- Máy cất quay BuchiR220, bơm chân không Waterbath B490

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt Máy quét phổ UV

- Máy đo phổ IR, MS (Khoa Hóa - Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên)

- Thước kẹp Palmer, bình chiết, bình nón, ồng đong, đèn cồn, pipet, ống nghiệm, đĩa Petri…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xác định hình thái xạ khuẩn Streptomyces 184.225

- Nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 trên MT ISP2 và ISP3

- Quan sát và đánh giá hình thái của Streptomyces 184.225 bằng kính hiển vi điện tử

2.2.2 Chọn lọc và cải tạo giống

- Xác định MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 184.225

- Chọn 2 chủng vi khuẩn (1 vi khuẩn G (+) và 1 vi khuẩn G (-)) để làm VSV kiểm định cho các nghiên cứu về sau

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc

- Đột biến bằng tác nhân hóa học để tiếp tục nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc

2.2.3 Lên men, chiết tách kháng sinh

- Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất

- Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được từ những lần cải tạo giống, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất

- Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của dịch lọc kháng sinh

- Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất

- Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ

2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

- Đo phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS)

- Biện giải kết quả thu được

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống

* Mục đích: Bảo quản các chủng giống thuần khiết đã phân lập, các dạng chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên, các biến chủng sau đột biến nhân tạo cho các nghiên cứu tiếp theo

* Tiến hành: Chuẩn bị môi trường phân lập, đun sôi, khuấy trộn, phân đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5-6ml, nút bông Tiệt trùng ở 120o

C/120 phút, 1 atm rồi đặt nghiêng cho đông Khi môi trường nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zigzac các

bào tử Streptomyces 184.225 đã thuần khiết lên bề mặt thạch nghiêng Nuôi cấy ở

28oC trong 6 ngày cho xạ khuẩn phát triển, cất giữ trong tủ lạnh (2-4oC) Định kỳ cấy truyền sau 3-6 tháng

2.3.2 Phương pháp xác định hình thái xạ khuẩn

Chuẩn bị ống giống gốc được nuôi cấy trong ống thạch nghiêng đủ 6 ngày tuổi

Xác định đặc điểm hình thái và sắc tố hòa tan:

MT xác định: ISP2, ISP3 đã được hấp tiệt trùng, đổ vào đĩa Petri, mỗi MT làm

4 đĩa Cấy zigzac bào tử của Streptomyces 184.225 lên bề mặt thạch Ủ ở 28oC, tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy 7, 14 và 21 ngày

- Màu của khuẩn ty khí sinh: Quan sát trực tiếp trên bề mặt khuẩn lạc có thể có: màu đỏ (R), màu vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh da trời (B), tím (V), xám (Gy), trắng (W), trường hợp có các màu xen kẽ thì ghi các màu liền nhau

- Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát mặt sau của khuẩn lạc (mặt dưới đĩa Petri), thường có các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1), nếu không thấy ký hiệu là (0)

- Chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có độ phóng đại cao

+ Dạng chuỗi bào tử: Thẳng (R), uốn cong (Rf), móc câu (RA), lò xo (S) Nếu chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ các đặc điểm (ví dụ: SRA: chuỗi lò

2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

* Nguyên tắc: Mẫu thử (chứa chất kháng sinh) được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

* Tiến hành:

+ Tạo hỗn dịch VSV kiểm định: vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy vào môi trường canh thang, nuôi cấy tạo hỗn dịch vi khuẩn ổn định có nồng độ 107-108 tế bào/ml, ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 18-24h Đưa hỗn dịch này vào môi trường thạch thường ở 45 – 50oC sau khi đã hấp tiệt trùng với tỷ lệ V giống/V thạch thường = 2,5/100 Lắc đều để vi khuẩn kiểm định phân tán đều vào môi trường, đổ vào đĩa Petri với thể tích 20ml/đĩa

+ Các phương pháp thử:

- Phương pháp khối thạch: Đưa các mẫu thử là các khối thạch ( = 6mm) chứa

vi sinh vật sinh kháng sinh cần thử lên bề mặt môi trường vi sinh vật kiểm định

- Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch trên môi trường VSV kiểm định ( = 6mm), sau đó nhỏ 0,05ml mẫu thử dạng dung dịch vào mỗi giếng thạch

- Phương pháp khoanh giấy lọc: Các khoanh giấy lọc (= 6mm) đã sấy khô

tẩm dung dịch thử (3 lần), sấy khô ở 45oC, sau đó đặt các khoanh giấy này lên bề mặt môi trường VSV kiểm định

Các đĩa Petri có mẫu thử được đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24h Sau thời gian ủ trên tiến hành đánh giá kết quả dựa vào đường kính vòng vô khuẩn đo bằng thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02 mm và được đánh giá theo công thức:

D(mm): Đường kính trung bình vòng vô khuẩn

Di (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: Số thí nghiệm làm song song (n = 3)

2.3.4 Phương pháp chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

* Mục đích: tìm môi trường nuôi cấy và bảo quản chủng xạ khuẩn ổn định, giữ được hoạt tính kháng sinh tốt nhất

* Tiến hành: chủng được cấy lên 5 môi trường (MT1, MT2, MT5, MT6, MT7) trong đĩa Petri, ủ ở 280

C trong 6 ngày, sau đó thử HTKS bằng phương pháp khối thạch Tiến hành thử song song trên 3 mẫu, chọn môi trường có HTKS mạnh nhất

để tiến hành nuôi cấy và nghiên cứu tiếp

2.3.5 Phương pháp cải tạo và chọn giống

2.3.5.1 Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên

* Mục đích: Chọn lọc ngẫu nhiên những cá thể cho hoạt tính kháng sinh cao nhất so với các cá thể khác từ các giống thuần khiết

* Tiến hành:

- Cân pha MT2 (môi trường phân lập), hấp tiệt trùng, đổ môi trường ra đĩa Petri vô trùng (20ml/đĩa)

- Chuẩn bị hỗn hợp dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử xạ khuẩn

Streptomyces 184.225 từ ống giống rồi hòa vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô

trùng, lắc cho bào tử phân tán đều thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1

(định ước) Tiếp tục pha loãng hỗn dịch này bằng nước vô trùng đến nồng độ 10-6

- Cấy bào tử: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-5-10-6, nhỏ lên bề mặt của MT2 trong đĩa Petri, nuôi xạ khuẩn trong tủ

ấm ở 28oC trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển

- Sàng lọc: Sau 6 ngày nuôi, chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển đa dạng mọc riêng rẽ, cấy zigzac lên bề mặt MT2 trong đĩa Petri (chọn 32 - 33 khuẩn lạc) sau đó nuôi ở 28o

C trong 6 ngày

- Thử HTKS của các biến chủng bằng phương pháp khối thạch, đánh giá kết quả Căn cứ kết quả vòng vô khuẩn, lựa chọn và giữ lại 3 chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

2.3.5.2 Đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng UV

* Mục đích: Cải tạo những chủng có hoạt tính cao sau sàng lọc ngẫu nhiên nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

* Tiến hành:

- Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử biến chủng tốt nhất của sàng lọc ngẫu nhiên cho vào 10ml nước vô trùng lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước) Lấy 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được pha vào đĩa Petri vô trùng và được đem đột biến dưới tác dụng ánh sáng UV với  = 254 nm, khoảng cách chiếu 60cm, thời gian chiếu 5 phút Hỗn dịch bào tử sau khi được chiếu UV được đưa vào chỗ tối 2h, sau đó dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-4

- 10-5

- Cấy bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng ở nồng độ 10-6

và 0,1ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở nồng độ 10-4, 10-5 cho vào đĩa Petri chứa MT2, dùng que trang dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch Mỗi nồng độ pha loãng tiến hành trên 3 đĩa Petri song song, sau đó nuôi cấy

ở 28oC cho khuẩn lạc phát triển Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc sống sót

Tỷ lệ phần trăm xạ khuẩn sống sót được tính theo công thức

N0: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng

-k: Nồng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử đã sử dụng

Sàng lọc các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như ở phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên, làm song song với mẫu chứng Tính % biến đổi hoạt tính của biến chủng thứ i sau đột biến theo công thức:

% biến đổi hoạt tính =

0

D

D i

x 100%

D i: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau ĐB

D0: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng

Dựa vào kết quả thu được lựa chọn 3–5 biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp

2.3.5.3 Đột biến cải tạo giống bằng tác nhân hóa học HNO2

 Mục đích: Cải tạo những chủng có hoạt tính cao sau đột biến UV nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

 Nguyên tắc : HCl + NaNO2 = NaCl + HNO2

 Tiến hành :

- Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử biến chủng tốt nhất của đột biến UV2 cho vào 10ml nước vô trùng lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha

loãng 10-1 (định ước) Lấy 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được pha vào ống nghiệm

- Đột biến bằng HNO2 : 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10 -1, cho 0,07g NaNO2 vào ống hòa tan (nồng độ HNO2 : 0,1M) Sau đó, nhỏ HCl 0,1N vào ống nghiệm đó đến khi pH = 4,5 để 2-3 phút, rồi nâng đến pH = 7-8 bằng NaOH 0,1N dùng pipet vô trùng pha loãng đến 10-5 bằng nước cất vô trùng

- Cấy các bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng ở nồng độ 10-6 và 0,1ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở nồng độ 10-4, 10-5 cho vào đĩa Petri chứa MT2, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào

tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song Sau đó nuôi cấy ở 28oC cho khuẩn lạc phát triển Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc sống sót

Sau đó tính tỷ lệ phần trăm sống sót và thử KTKS tương tự như đột biến UV

2.3.6 Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh

* Mục đích: Chọn ra được chủng tốt nhất để định hướng cho phát triển sản xuất công nghiệp

* Tiến hành:

- Tạo giống cấp 1: chủng giống Streptomyces 184.225 sau khi nuôi cấy trên

MT2 thạch nghiêng đủ 6 ngày được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2 dịch thể bằng 10ml nước vô trùng, đem lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 280C, tốc

độ quay 140 vòng/phút trong 48h

- Lên men: sau 48h nhân giống, giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2 dịch thể với tỷ lệ Vgiống: V môi trường = 1:10 Các bình lên men được lắc 280C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h Sau 120h, lấy ra lọc hoặc ly tâm dịch lên men rồi thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch

- Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính dịch lên men

2.3.8 Các phương pháp chiết tách kháng sinh

2.3.8.1 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ

* Mục đích: Xác định pH và dung môi thích hợp để tách hoạt chất kháng sinh

ra khỏi hỗn dịch dịch lọc lên men

* Tiến hành:

- Dùng phương pháp chiết 1 lần

- Dịch lọc lên men sau khi đã được loai bỏ sinh khối được điều chỉnh về các mức pH=3, pH=5, pH=7, pH=9, pH=11 bằng dung dịch NaOH 0,1N hoặc HCl 0,1N Cho dung môi hữu cơ và dịch lên men vào bình gạn với tỷ lệ Vdung môi: Vdịch lọc = 1:5 Lắc đều, để 1h cho phân lớp Tách riêng lớp dung môi và dịch lọc Sau đó thử HTKS của lớp dung môi hữu cơ và lớp nước bằng phương pháp khoanh giấy lọc Căn cứ kết quả thu được chọn lấy dung môi hữu cơ và pH tối ưu để chiết

2.3.8.2 Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký

 Sắc ký lớp mỏng

 Mục đích: bước đầu sơ bộ biết được mẫu thử có bao nhiêu thành phần, mẫu thử có độ tinh khiết như thế nào

 Tiến hành:

- Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút

- Pha các hệ dung môi theo đúng tỉ lệ, đổ vào bình sắc ký, cho bão hòa dung môi trong 30 phút sao cho lớp dung môi không quá 1cm

- Chấm dịch chiết lên bản mỏng đã hoạt hóa, vết chấm cách mép dưới 1,5cm, cách 2 mép bên 1cm từ 3-5 lần Để khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, đặt bản mỏng vào bình sắc ký khi dung môi chạy đến ¾ bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy

- Sấy bản mỏng, soi đèn UV hoặc hiện hình bằng VSV

- Phương pháp hiện hình VSV: đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng, đổ thạch

có cấy VSV kiểm định lên, ủ ở 370

C trong 18-24h Xác định vết kháng sinh bằng vòng vô khuẩn

trong đó: dv: khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết

ddm: khoảng cách dung môi chạy

 Sắc ký cột

 Mục đích: tinh chế và tách riêng các thành phần trong bột kháng sinh

 Tiến hành:

- Cột:  =1 cm, dài 50 cm, rửa sạch, sấy khô

- Chất nhồi: Silicagell 60 Merck cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm được hoạt hóa ở

1100C trong 30 phút Hòa thành hỗn dịch với hệ DMHC chạy đưa lên cột

- Mẫu thử: bột kháng sinh thu được sau cất quay dịch chiết DMHC hòa tan với

1 lượng nhỏ dung môi rồi trộn với 1 lượng nhỏ Silicagel đã hoạt hóa Sấy khô, rồi

cho lên cột, để ổn định trong 30 phút

- Chạy cột: cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,3-0,5ml/phút Lấy các phân đoạn đã chạy qua cột vào ống nghiệm sạch, mỗi ống 3-5ml Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc

Các phân đoạn có HTKS được tiến hành SKLM với hệ dung môi tách tốt nhất Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại đem cất quay tinh chế tiếp

2.3.9 Phương pháp thu tinh thể kháng sinh tinh khiết

Các phân đoạn chính tinh khiết sau chạy cột được gộp vào cất quay chân không đến khô, cạo thu bột kháng sinh tinh khiết vào ống nghiệm sạch Kết tinh kháng sinh nhiều lần bằng hỗn hợp DMHC thích hợp Lọc, sấy, cân lượng kháng sinh tinh khiết thu được

2.3.10 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được

Bột kháng sinh tinh khiết đem đi đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ IR, phổ tử ngoại, phổ khối lượng để sơ bộ dự đoán cấu trúc kháng sinh thu được