Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần dầu hạt của cây tía tô trắng thu hái tại xã mường vi, huyện bát xát, tỉnh lào cai

Các nghiên cứu dịch tễ học cũng như thực tiễn đã chỉ ra lợi ích của dầu hạt Tía tô đối với sức khỏe con người như làm giảm nồng độ cholesterol, triglyceride, lipoprotein tỉ trọng thấp LD

LƯƠNG THỊ KIM CHI

MƯỜNG VI, HUYỆN BÁT XÁT,

HÀ N ỘI – 2015

LƯƠNG THỊ KIM CHI

MƯỜNG VI, HUYỆN BÁT XÁT,

hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến ThS Phạm

Hà Thanh Tùng – Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy PGS.TS Trần Văn Ơn,

ThS Nghiêm Đức Trọng – Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, đã

giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu và phân tích mẫu

Khóa luận không thể được hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ quý báu

của PGS.TS Panee Sirisaard – Khoa Dược, Đại học Chiang Mai, Thái Lan và ông Thanach Sathapanachai – Công ty Jingabell Biotech Co LTD, Thái Lan

trong hoạt động hợp tác nghiên cứu thành phần dầu hạt Tía tô trắng

Tôi gửi lời tri ân đặc biệt tới anh Vàng Văn Sưởng cùng bà con dân tộc Giáy xã Mường Vi, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong

quá trình thu mẫu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới sinh viên Đoàn Thị Phương – Đại học Dược

Hà Nội đã luôn sẵn sàng hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên và các bạn nghiên cứu khoa học – Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội,

đã luôn giúp đỡ, và tạo điều kiện thuận lợi để cho tôi có thể hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm trên bộ môn

Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới ông bà, bố mẹ và các bạn đã luôn ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và trong thời gian nghiên cứu đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015

SINH VIÊN

Lương Thị Kim Chi

M ỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Cây Tía tô 2

1.1.1 Vị trí phân loại Tía tô 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của loài Perilla frutescens L Britton 2

1.1.3 Đặc điểm sinh thái 4

1.1.4 Bộ phận dùng 4

1.2 Phương pháp Mã vạch DNA (DNA Barcoding) và trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 của cây Tía tô 5

1.2.1 Phương pháp mã vạch DNA (DNA Barcoding) 5

1.2.2 Trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 của cây Tía tô 6

1.3 Thành phần dầu hạt Tía tô 7

1.3.1 Các acid béo 7

1.3.2 Vitamin E 9

1.3.3 Các hợp chất phenolic 10

1.4 Tác dụng sinh học của hạt Tía tô 10

1.4.1 Tác dụng trên hệ hô hấp 11

1.4.2 Tác dụng trên hệ tim mạch 11

1.4.3 Tác dụng chống viêm 11

1.4.4 Tác dụng trên não bộ 12

1.4.5 Các tác dụng khác 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 13

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 13

2.1.2 Dung môi, hóa chất 13

2.1.3 Máy móc, thiết bị 14

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 14

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu 15

2.2.3 Nghiên cứu trình tự di truyền 15

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học 19

3.2 Đặc điểm vi phẫu 21

3.2.1 Vi phẫu thân 21

3.2.2 Vi phẫu lá 23

3.3 Trình tự di truyền đoạn DNA ribosome nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 24

3.3.1 Tách chiết DNA 24

3.3.2 Xác định trình tự rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 25

3.3.3 So sánh trình tự gen với các trình tự gen của Perilla frutescens đã công bố trên Genbank 25

3.4 Hàm lượng các thành phần trong dầu hạt Tía tô P1 27

3.4.1 Các acid béo 27

3.4.2 Hàm lượng Omega 3,6,9 29

3.4.3 Thành phần Vitamin E 29

3.5 Bàn luận 30

3.5.1 Về thực vật 30

3.5.2 Về trình tự đoạn rDNA vùng ITS1-5.8S-ITS2 31

3.5.3 Về thành phần dầu hạt Tía tô P1 32

KẾT LUẬN 39

KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH M ỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt : Tên đầy đủ (Giải thích)

P : Perilla

AA : Arachidonic acid

ALA : α-linolenic acid

AOAC : Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các

nhà Hóa phân tích) BLAST Basic local aligning search tool

BOLD : Barcode of Life Database (Cơ sở dữ liệu về Mã vạch cuộc

sống)

bp : base pairs (cặp base)

DHA : Docosahexanoic acid

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxynucleotide triphosphates

EPA : Eicosapentaenoic acid

FAPAS : Food Analysis Performance Assessment Scheme (Hệ thống

đánh giá, phân tích thực phẩm)

GC : Gas chromatography (Sắc ký khí)

GLC : Gas Liquid Chromatography (Sắc ký khí lỏng)

HDL : High-density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng cao)

HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao) IL-1β : Interleukin-1β

ITS : Internal transcribed spacer (Vùng phiên mã nội)

LDL : Low-density lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp)

LGC : Laboratory of the Government Chemist (Phòng thí nghiệm

của các nhà khoa học chính phủ) PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại gen) rDNA : Ribosomal DNA (DNA ribosom)

TLC/FID : Thin Layer Chromatography with Flame Ionization

Detection (Sắc ký lớp mỏng với detector ion hóa ngọn lửa) TNF α : Tumor necrosis factor α (Yếu tố hoại tử khối u alpha) w/w : Weight/weight (Khối lượng/Khối lượng)

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả định lượng các thành phần trong dầu hạt Tía tô P1 28

Bảng 3.2 Hàm lượng Omega-3,6,9 trong dầu hạt Tía tô P1 29

Bảng 3.3 Thành phần vitamin E trong dầu hạt Tía tô P1 30

Bảng 3.4: Bảng so sánh tỷ lệ thành phần các acid béo bão hòa và không bão hòa của cây Tía tô P1 với một số mẫu dầu thực vật trên thế giới 33

Bảng 3.5 Bảng so sánh hàm lượng một số chỉ tiêu quan trọng trong các mẫu

dầu thực vật khác nhau 37

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của vùng rDNA - ITS và các mồi thường sử dụng 6

Hình 1.2: Cấu tạo của triacylglycerol 8

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của các acid béo no, đơn không no, đa không no chính trong dầu hạt Tía tô 8

Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng mẫu P1 19

Hình 3.2: Phân tích hoa mẫu P1 20

Hình 3.3: Chi tiết vi phẫu thân mẫu P1 22

Hình 3.4: Chi tiết vi phẫu lá mẫu P1 23

Hình 3.5: Điện di sản phẩm DNA toàn phần và sản phẩm PCR 24

Hình 3.6: Sắc ký đồ trình tự DNA theo chiều 5’-3’ mẫu P1 với cặp mồi ITS1-ITS4 25

Hình 3.7: Kết quả gióng hàng trình tự rADN của mẫu P1 với ngân hàng gen sử dụng công cụ Blast 26

Hình 3.8: Quả (“Hạt”) của Tía tô: (a) Trung Quốc, (b)Thái Lan, (c) P1 và (d) mẫu “Tô tử” ở chợ Lãn Ông 31

Hình 3.9: Dầu hạt Tía tô Okinawa Perilla oil (Aman Prana, Đức) với nhãn giá trị dinh dưỡng 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tía tô (Perilla frutescens L Britton), họ Bạc hà (Lamiaceae), là cây cỏ

mọc quanh năm, đã được sử dụng lâu đời trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Trong loài P frutescens L Britton, có hai thứ chính thường gặp được phân

biệt dựa vào đặc điểm hình thái và cách sử dụng là P frutescens var.crispa

(Thunb.) W Deane là một loại rau gia vị và là vị thuốc trong y học cổ truyền

Trung Hoa và P frutescens var frutescens là một cây cho hạt để ép lấy dầu [25, 26, 29]

Các nghiên cứu dịch tễ học cũng như thực tiễn đã chỉ ra lợi ích của dầu

hạt Tía tô đối với sức khỏe con người như làm giảm nồng độ cholesterol, triglyceride, lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) [28, 32], giảm cục máu đông giúp

giảm nguy cơ tai biến, nhồi máu cơ tim [21, 28]; giảm triệu chứng dị ứng quá

mẫn, giảm hen suyễn; giảm đau chống viêm; kích thích chức năng miễn dịch [21]; tham gia vào quá trình hình thành và phát triển trí não ở trẻ [8]

Ở Việt Nam, hiện nay việc khai thác Tía tô để lấy lá làm rau gia vị là

rất phổ biến tuy nhiên việc lấy hạt theo hướng khai thác dầu còn hạn chế Trong quá trình khảo sát thực địa, hạt của một loại Tía tô trắng được phát hiện

sử dụng phổ biến bởi đồng bào dân tộc Giáy ở xã Mường Vi, huyện Bát Xát,

tỉnh Lào Cai để làm lương thực Các đặc điểm mô tả sơ bộ của mẫu cây này cho thấy sự tương đồng cao với các đặc điểm của loài P frutescens var frutescens Nhận thấy tiềm năng khai thác cây Tía tô trắng này theo hướng lấy

dầu hạt, chúng tôi đã thực hiện đề tài này với 3 mục tiêu chính là:

• Mô tả đặc điểm thực vật của cây Tía tô trắng

• Xác định trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS2 của cây Tía tô trắng

ITS1-5.8S-• Xác định thành phần dầu hạt của cây Tía tô trắng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Cây Tía tô

1.1.1 Vị trí phân loại Tía tô

Tía tô (Perilla frutescens L Britton) thu ộc chi Tía tô (Perilla L.), họ

Bạc hà (Lamiaceae), bộ Hoa môi (Lamiales), phân lớp Hoa môi (Lamiidae),

lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) [2, 5]

1 1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của loài Perilla frutescens L Britton

Cây cỏ mọc thẳng đứng, cao 50-150 cm Thân vuông, màu xanh hay tím nhạt, có lông đa bào thưa hoặc dày đặc Lá hình trứng rộng hay gần tròn,

cỡ 5-15 x 3-10 cm, chóp lá nhọn, gốc tù, tròn hay hình nêm, mép xẻ răng cưa

to và sâu, 2 mặt màu xanh hay tím nhạt, có lông đa bào dày; gân bên 7-8 đôi;

cuống lá dài 2-5 cm Cụm hoa dạng chùm ở đỉnh cành, dài 5-20 cm, mỗi đốt 2 hoa mọc đối Lá bắc hình trứng, dài hơn hoa, có lông đa bào dài Hoa lưỡng tính, mọc thẳng hoặc vòng, có cuống dài 1-3 mm Đài hình chuông, cỡ 3-4 x 2-2,5 mm, có lông đa bào và điểm tuyến ở phía ngoài, có vòng lông ở họng, 2 môi: môi trên 3 thùy ngắn; môi dưới 2 thùy nhọn và dài hơn môi trên, đài quả đồng trưởng cỡ 7-10 x 3,5-4,5 mm Tràng hoa màu tím nhạt, dài 5-6 mm, có lông ở phía ngoài, có vòng lông ở họng, 2 môi: môi trên 2 thùy xẻ nông; môi dưới 3 thùy với thùy giữa lớn, không có khuyết ở đỉnh Nhị 4, thụt trong ống tràng, 2 nhị dưới dài hơn 2 nhị trên; bao phấn 2 ô song song Bầu nhẵn; vòi

nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh Đĩa mật có thùy trước cao hơn các thùy khác Quả

hạch nhỏ, gần hình cầu, đường kính 1-1,5 mm, có gân mạng lưới, màu nâu đậm hoặc vàng nâu [5, 12]

Trên thế giới, Tía tô phân bố ở Ấn Độ, Butan, Myanmar, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Indonesia [5, 12]

Theo Thực vật chí Trung Quốc, loài Perilla frutescens L Britton gồm 3

thứ được phân loại theo khóa sau:

1a Lá có răng cưa sâu, hẹp, màu tím … var crispa

1b Lá có răng cưa thô, đôi khi có màu xanh, ít nhất là

ở mặt trên

2a Đài quả tới 1,1cm, đế và thân có lông dài,

mềm, dày; lá hình trứng rộng tới cầu, 7-13x4,5-10cm,

mặt trên có lông nhiều, mặt dưới có lông mịn; quả hạch

màu nâu xám, kích thước đường kính khoảng 1,5mm

Theo Thực vật chí Việt Nam, ở Việt Nam, đã xác định có 3 thứ:

• Thứ chuẩn: Perilla frutescens L Britton (tương ứng với thứ Perilla frutescens var frutescens trong Thực vật chí Trung Quốc)

Thứ chuẩn có đặc điểm như mô tả ở trên

Thứ này phân bố chủ yếu ở độ cao 1.300-1.600 m trên dãy Hoàng Liên Sơn [4]; và một số tỉnh thành như Lào Cai (Sa Pa), Lạng Sơn (Bắc Sơn), Hòa Bình (Mai Châu, Pà Cò) [5]

• Perilla frutescens var acuta (Thunb.) Kudo - Tía tô nhọn (tương ứng

với thứ Perilla frutescens var purpurascens trong thực vật chí Trung Quốc)

Tên đồng nghĩa: Perilla ocymoides L var purpurascens Hayata, Ocimum acutum Thunb, Perilla cavaleriei Levl

Khác với thứ chuẩn đã mô tả trên bởi cây có lông tơ và lông đa bào thưa hơn, lá có kích thước nhỏ hơn (4-7 x 2,5-5 cm), mép xẻ răng cưa nông

và đài quả có kích thước nhỏ hơn (cỡ 4-5 mm)

Thứ này thường phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Đồng Văn, thị

xã Hà Giang), Lạng Sơn (Bắc Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội, Ninh Bình (Chợ Ghềnh) Trên thế giới, loài này còn được tìm thấy ở Trung Quốc,

Khác với thứ chuẩn đã mô tả ở trên bởi thân gần như nhẵn hay chỉ có lông rải rác ở phần non; lá màu tím, xẻ răng cưa sâu, rúm và thường biến thái hơn; đài quả cũng có kích thước nhỏ hơn

Thứ này được phân bố rộng rãi hầu khắp các tỉnh, thành phố ở nước ta Trên thế giới, chúng còn được trồng ở Trung Quốc, Nhật Bản [5]

1 1.3 Đặc điểm sinh thái

Cây trồng bằng hạt và được gieo trồng vào tháng 5 [26] Mùa hoa vào tháng 7-9, mùa quả vào tháng 10-12 Cây ưa sáng và ẩm, thích hợp với đất

thịt và đất phù sa [5]

1.1.4 B ộ phận dùng

Hạt cây Tía tô chứa dầu béo, dùng để rang ăn Ngọn và lá non dùng làm rau gia vị và làm thuốc Cây có tinh dầu Toàn cây được dùng làm thuốc [5, 25]

1.2 Phương pháp Mã vạch DNA (DNA Barcoding) và trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2 của cây Tía tô

1.2.1 Phương pháp mã vạch DNA (DNA Barcoding)

Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada đã đề xuất "Mã vạch DNA" (DNA Barcoding) như là một cách để xác định loài Phương pháp mã vạch sử dụng một đoạn trình tự gen rất ngắn lấy

từ một vị trí chuẩn của hệ gen Cách dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách phân biệt các mã vạch màu đen đặc trưng cho từng sản phẩm Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mẫu trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, nhưng phương pháp mã vạch DNA có thể phân biệt được [36]

Phương pháp DNA barcoding gồm 4 phần cơ bản:

• Mẫu: Các viện bảo tàng, phòng tiêu bản, vườn thú, hồ, mô đông lạnh, ngân hàng giống, các mẫu thu hái được,…

• Phân tích trong phòng thí nghiệm: Các phòng thí nghiệm sinh học phân

tử làm theo các quy trình chuẩn để tạo ra trình tự mã vạch DNA Các dữ liệu này sau đó được đặt trong một cơ sở dữ liệu để phân tích tiếp

• Cơ sở dữ liệu: Một trong những phần quan trọng nhất của sáng kiến Mã

vạch là việc xây dựng một thư viện tham khảo chung để xác định các loài chưa biết dựa trên các loài đã biết Hiện nay, trên thế giới, có hai cơ sở dữ liệu

mã vạch chính là: Ngân hàng gen (Genbank) và Barcode of Life Database (BOLD)

• Phân tích dữ liệu: Mẫu vật được xác định bằng cách tìm các báo cáo tham khảo trùng hợp nhất trong cơ sở dữ liệu Từ đó so sánh, đối chiếu đoạn DNA được mã hóa của mẫu chưa biết với đoạn trình tự đã biết trong cơ sở dữ

liệu [37]

Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau: (1) chuẩn hóa – tính đặc hiệu cao, chứa những thông tin quan trọng của loài; (2)

tối giản– có độ dài thích hợp để thuận tiện cho việc tách chiết và giải trình tự DNA; (3) có khả năng mở rộng – có khả năng phân biệt nhiều loài [3, 19, 20]

1.2.2 Trình t ự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng ITS1-5.8S-ITS2

c ủa cây Tía tô

Khoảng hơn một thập kỷ trở lại đây, trình tự di truyền đoạn DNA ribosom nhân vùng phiên mã nội (rDNA – ITS) là đoạn gen phổ biến trên DNA được sử dụng trong các nghiên cứu tiến hóa về phân loại các nhóm thực

vật Cấu trúc của rDNA - ITS gồm 3 tiểu phần: tiểu đơn vị 5.8S – trình tự có tính bảo tồn cao trong tiến hóa và 2 vùng phiên mã nội ITS1 và ITS2 Độ dài trình tự tiểu phần 5.8S gần như không khác nhau (163-164 bp), trong khi đó

độ dài vùng phiên mã nội ITS có sự khác nhau: ITS1 (187bp đến 298 bp) và ITS2 (187 bp đến 252 bp) Toàn bộ vùng ITS ở thực vật có hoa có độ dài dưới

700 bp [14, 15]

Hình 1.1: C ấu trúc của vùng rDNA - ITS và các mồi thường sử dụng

Có 4 lý do để ITS ngày càng trở nên phổ biến: (i) Tính sẵn có của một

số bộ mồi PCR phổ biến (hoặc tương tự) áp dụng với một lượng lớn của các nhóm loài (ii) cấu trúc đa sao chép tạo điều kiện khuếch đại PCR thậm chí từ

mẫu tiêu bản (iii) Các kích thước vừa phải của ITS (dưới 700 bp) thường cho

phép khuếch đại và giải trình tự mà không cần nội mồi, ngoại lệ với nhiều nhóm thực vật hạt trần (iv) Do mức độ của sự biến đổi, ITS thường cung cấp

đủ các marker phân tử thích hợp cho các nghiên cứu tiến hóa ở cấp độ loài, như nguồn gốc của các loài đa bội, lai tạo, biến đổi gen, và cuối cùng, suy

luận phát sinh loài [15, 22]

Với cây Tía tô, trên thế giới có rất nhiều công bố về trình tự đoạn DNA ribosom nhân vùng phiên mã nội (rDNA – ITS1-5.8S-ITS2) Các đoạn trình

tự này đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới Genbank [38] Đây là cơ

sở của việc nghiên cứu xác định đoạn trình tự của mẫu nghiên cứu ở Việt Nam và so sánh với các trình tự đã so sánh trên thế giới

1.3 Thành ph ần dầu hạt Tía tô

Dầu thu được từ hạt thường có màu vàng nhẹ, trong suốt và có mùi thơm, tan nhẹ trong ethanol [8, 9] Thành phần dầu chiếm khoảng 35-45%

khối lượng hạt Dầu trong hạt Tía tô có thành phần chủ yếu là triacylglycerol được cấu tạo bởi glycerol và các acid béo Acid béo trong dầu hạt Tía tô chủ

yếu là acid béo không no, và một phần acid béo no[8] Ngoài ra, dầu hạt Tía

tô còn chứa các polyphenol, flavone khác nhau (rosemarinic acid, luteolin, chrysoeriol, quercetin, catcehin, apegenin và shishonin) [8], và các hợp chất khác như là acid caffeic, monoterpen alkaloids, ascorbic acid, beta-caroten, citral, dillapiol, elemicin, limonene, myristicin, protocatechuic acid, perillaldehyd, xanthin oxidase, các vitamin và muối khoáng [9]

1.3.1 Các acid béo

Các acid béo trong dầu gồm acid béo no, đơn không no hoặc đa không

no, trong đó, acid béo không no thường có tỷ lệ lớn hơn 90% [11] Các acid béo không no có hàm lượng cao nhất và được nhắc tới nhiều nhất trong dầu

hạt Tía tô là các acid béo omega như omega-3, omega-6, omega-9 Acid béo

omega-3 chủ yếu trong dầu là acid α-linolenic [ALA, 18:3, n-3], omega-6 chủ

yếu là acid linoleic [18:2, n-6], omega-9 chủ yếu là acid oleic [18:1] [8]

Năm 2006, Siriamornpun S và cộng sự đã nghiên cứu về thành phần các chất trong dầu hạt Tía tô thu hái được tại Maehongsorn, Chiang Mai và

một mẫu thu mua trên thị trường (Thái Lan) Dầu được chiết từ hạt Tía tô

bằng dung môi hữu cơ Thành phần của dầu được định tính bằng Iatroscan (TLC/FID) Hàm lượng các acid béo được phân tích bằng phương pháp GLC chuẩn Hàm lượng lipid trong hạt khoảng 34-36%, trong đó triacylglycerol là thành phần chủ yếu (97%), và một phần nhỏ là phytosterol (3%) Acid béo chiếm hàm lượng lớn nhất là acid α-linolenic (acid béo omega-3) (55-60%) Hai acid béo chiếm tỉ lệ đáng kể khác là acid linoleic (acid béo omega-6) (18-22%) và acid oleic (acid béo omega-9) (11-13%) [30]

Hình 1.2: Cấu tạo của triacylglycerol

Trong đó RCO-, R’CO-, R”CO- là các gốc acyl của các acid béo

Hình 1.3: Công th ức cấu tạo của các acid béo no, đơn không no, đa không

no chính trong dầu hạt Tía tô

Các phương pháp chiết tách dầu từ hạt Tía tô là phương pháp ép [31,

35] và phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ [11, 30] Tuy nhiên, phương pháp chiết bằng dung môi thường được làm trong phòng thí nghiệm với quy

mô nhỏ Khi sản xuất tạo ra sản phẩm trên thị trường, phương pháp ép thường được sử dụng, để tránh sự có mặt của các dung môi độc hại trong dầu [31]

Phương pháp phân tích thành phần các acid béo trong dầu mỡ động

thực vật được áp dụng phổ biến nhất hiện nay là phương pháp Sắc ký khí dịch chiết thủy phân chất béo dựa trên các quy trình chuẩn như AOAC [6], LGC, FAPAS [10, 18, 30]

Ngoài ra, có một số phương pháp khác được thực hiện trong một số nghiên cứu về hàm lượng omega-3 trong thực phẩm Năm 2011, Ian Acworth

và cộng sự đã nghiên cứu ra quy trình định lượng các acid béo omega-3, omega-6 trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC pha đảo và phát hiện

bằng detector aerosol tích điện [7]

1.3.2 Vitamin E

Vitamin E được biết tới là một chất chống oxy hóa tốt có cấu tạo gồm 4

dạng cấu hình (α, β, δ, γ) của 2 nhóm Tocopherol và Tocotrienol Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy, α-Tocotrienol có tác dụng chống lại các tác nhân oxy hóa tự do gấp 3 lần so với α-Tocopherol trong thử nghiệm in vitro

Các Tocotrienol cũng được báo cáo là ức chế quá trình tổng hợp cholesterol, làm giảm nồng độ cholesterol huyết tương trong các thí nghiệm trên động vật,

và ngăn chặn sự di căn của tế bào ung thư, trong đó, tác dụng của cấu hình γ,

δ, được chứng minh là có hiệu lực tốt hơn cấu hình α [17]

Cũng giống như các dầu thực vật khác, vitamin E trong dầu hạt Tía tô thường tồn tại ở dạng đồng phân chính là γ-tocopherol Trong nghiên cứu của Ozan Nazim Ciftci và cộng sự (2012), tổng hàm lượng của vitamin E là 734 mg/kg, hàm lượng của đồng phân γ-tocopherol là 691 mg/kg (chiếm 94,1%

tổng hàm lượng vitamin E) Phân tích hàm lượng vitamin E được thực hiện

bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector huỳnh quang [10]

1.3.3 Các h ợp chất phenolic

Hạt Tía tô không chỉ là nguồn cung cấp giàu omega-3 mà nó còn chứa các hợp chất phenolic có tác dụng chống oxi hóa như acid rosmarinic, luteolin, chrysoeriol, quercetin, catcehin và apigenin Trong đó luteolin là hợp

chất phenolic có tác dụng chống oxy hóa và kháng khuẩn mạnh hơn các hợp

chất phenolic còn lại [33]

1.4 Tác d ụng sinh học của hạt Tía tô

Các acid béo không no như omega-3 (ví dụ như acid α-linolenic), omega-6 (ví dụ như acid linoleic) là các acid béo thiết yếu, bởi vì chúng không được tự tổng hợp trong cơ người mà phải bổ sung từ bên ngoài để đáp ứng nhu cầu của cơ thể Acid béo omega-9 (ví dụ acid oleic) là acid béo thiết

yếu có điều kiện, tức là nó có thể được cơ thể tổng hợp từ các acid béo khác [8]

Vai trò và tầm quan trọng của các acid béo omega là khác nhau Vấn đề

cần quan tâm khi lựa chọn các loại dầu là hàm lượng omega-3, omega-6 và sự cân bằng giữa omega-3: omega-6, trong đó thành phần omega-3 là quan trọng

nhất Bởi vì, khi omega-6 trong chế độ ăn được đưa vào cơ thể, chúng sẽ đi vào bên trong màng tế bào, và chuyển hóa thành các hợp chất gây đông máu

bất thường và làm gia tăng phản ứng viêm Trong khi các acid béo omega-3

lại có tác dụng gần như ngược lại Các acid béo omega-3 có tác dụng cải thiện

sức khỏe tim mạch, hỗ trợ điều trị một số loại ung thư, tăng cường hệ thống

miễn dịch, cũng như là giảm phản ứng gây viêm, dị ứng [8, 27] Các nghiên

cứu của Simopoulos A.P (2002) cũng chỉ ra rằng trong chế độ ăn hiện tại, tỷ

lệ omega-6: omega-3 thường là 15:1-16:1 Sự mất cân bằng đã làm gia tăng

phát sinh các bệnh bao gồm các bệnh tim mạch, ung thư, viêm và tự miễn Khi gia tăng tỷ lệ omega-3 (tức là giảm tỷ lệ omega-6:omega-3) thì tạo ra các tác dụng ngược lại Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng trong chế độ ăn, tỷ lệ omega-6: omega-3 cần được cân bằng trong khoảng 4:1 đến 1:1 [27]

1.4.1 Tác d ụng trên hệ hô hấp

Năm 2000, Okamoto và cộng sự đã nghiên cứu về sự ảnh hưởng của

dầu hạt Tía tô (giàu omega-3) trên bệnh nhân hen phế quản về chức năng hô

hấp của phổi và sự tạo thành leukotrien B4 (LTB4) và LTC4 bởi bạch cầu

Kết quả cho thấy dầu hạt Tía tô có tác dụng điều trị bệnh hen vì làm giảm

hoạt động của LTB4 và LTC4 sinh ra bởi bạch cầu và cải thiện chức năng hô

hấp [21]

1.4.2 Tác dụng trên hệ tim mạch

Năm 1999, Ezaki và cộng sự đã làm thử nghiệm lâm sàng về ảnh hưởng của việc sử dụng dầu hạt Tía tô giàu omega-3 trên 20 người cao tuổi ở

Nhật Bản trong vòng 3 tháng để đánh giá yếu tố nguy cơ trên bệnh mạch vành

và nồng độ acid béo trong huyết tương Kết quả cho thấy nồng độ acid linolenic (ALA, acid béo omega-3) trong huyết tương tăng từ 0.8% đến 1.6%,

α-nồng độ acid eicosapentaenoic (EPA) và acid docosahexanoic (DHA) tăng tương ứng là 2.5-3.6% và 5.3-6.4% [21] Sự gia tăng các chất ALA, EPA và DHA trong huyết tương có thể ngăn ngừa các bệnh mạch vành và giảm cục máu đông [21, 23]

1.4.3 Tác d ụng chống viêm

Dầu hạt Tía tô giàu acid α-linolenic (ALA), làm giảm hoạt động của

AA trên màng tế bào, ức chế sự chuyển hóa của AA, giảm sản sinh cytokines IL-1β và TNFα bởi các đơn bào được kích thích in vitro, tương tự như trong các bệnh viêm [8, 27]

1.4.4 Tác d ụng trên não bộ

Liều cao omega-3 trong dầu Tía tô được sử dụng cho nhóm thí nghiệm

có tác dụng ngăn chặn hoàn toàn nhiễm độc thần kinh gây ra bởi dopamine

Bởi vì Parkinson’s là một bệnh gây ra bởi sự gián đoạn của hệ dopamin, nên tác dụng bảo vệ này có thể đưa ra một cam kết cho các nghiên cứu trong tương lai trong việc ngăn chặn căn bệnh Parkinson này [8, 21]

1.4.5 Các tác dụng khác

Năm 2001, Hiroyo Yamamoto và Tomohiko Ogawa đã làm nghiên cứu

về tác dụng kháng khuẩn của các hợp chất polyphenol trong dầu hạt Tía tô trên các vi khuẩn gây bệnh ở răng miệng Kết quả cho thấy, dịch chiết ethyl acetat của hạt Tía tô có tác dụng kháng khuẩn mạnh với các vi khuẩn streptococci ở miệng và các chủng vi khuẩn P gingivalis Trong các hợp chất

polyphenol, luteolin thể hiện tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất so với các hợp

chất polyphenol còn lại [33]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên li ệu và thiết bị

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm thực vật: phần trên mặt đất của cây Tía tô trắng P1 được thu hái tại thôn Cửa Cải, xã Mường Vi, huyện Bát Xát, tỉnh Lào Cai, ngày 19/10/2014, đã được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại Phòng Tiêu bản, Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (Mã số tiêu bản: HNIP/18129/15)

Nghiên cứu trình tự di truyền đoạn DNA ribosom vùng ITS2: lá của Tía tô trắng P1

ITS1-5.8S-Nghiên cứu thành phần dầu hạt: dầu ép từ hạt Tía tô trắng P1

2.1.2 Dung môi, hóa chất

2.1.2.1 Nghiên c ứu đặc điểm vi phẫu

Dung dịch Javen, dung dịch acid acetic, xanh methylen, đỏ carmin (Son phèn), nước cất làm tiêu bản, glycerin

2.1.2.2 Nghiên c ứu trình tự rDNA – ITS1-5.8S-ITS2

• Nitơ lỏng

• Bộ kit chiết tách DNA thực vật GeneJET – số lô 00209197 (Thermo Scientific)

• Bộ kit tinh sạch DNA GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific)

• Bộ kit giải trình tự DNA BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems)

• Dung dịch đệm TAE 1x: pha từ dung dịch gốc TAE 10x có thành phần như sau: 48.4 g Tris base (Sigma); 11.4 mL glacial acetic acid (17.4M) (Sigma); 3.7g EDTA disodium salt (Sigma), pha trong nước khử ion vừa đủ 1L

• Gel agarose 1%: 0,5g agarose pha trong 50mL đệm TAE 1x, đung trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn tạo dung dịch trong suốt (khoảng 2 phút)

Để nguội đến khoảng 60˚C, thêm 2 µL ethidium bromide (EB): 10 mg/mL (Sigma) rồi đổ ra khay đã có lược để tạo giếng Để thạch nguội ở nhiệt độ phòng

• Thang DNA 100 bp chuẩn (Ladder 100bp) (Thermo Scientific)

• Cặp mồi: ITS1-ITS4 (Intergrated DNA Technologies) :

Mồi xuôi: ITS1 (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)

Mồi ngược: ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)

2.1.3 Máy móc, thiết bị

2.1.3.1 Nghiên c ứu đặc điểm thực vật và vi phẫu

• Kính lúp soi nổi Leica EZ4, kính hiển vi Leica CME

• Máy ảnh kỹ thuật số Canon, thước kẻ, đĩa petri, kim mũi mác, dao,…

2.1.3.2 Nghiên c ứu đặc điểm di truyền

• Thiết bị bảo quản mẫu: tủ lạnh sâu -22˚C (Biomedical Freezer – Sanyo)

• Dụng cụ tách chiết DNA từ mẫu: chày, cối, kéo, máy votex IKA, máy

ly tâm để bàn tốc độ cao Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu, ống eppendorf (2,0

mL, 1,5 mL), bể ổn định nhiệt Memmert WNB10, micropipette (1000, 100,

20, 10)

• Dụng cụ điện di: Máy điện di Consort EV222, máy soi chụp ảnh DNA UVP Gel-docIt, lò vi sóng Saiko

• Dụng cụ PCR: Máy PCR Eppendorf Mastercycler Pro S

2.2 N ội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

Mô tả đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp

mô tả phân tích [1] Phân tích hoa và quan sát trên kính lúp soi nổi Leica Z24

Tên khoa học được xác định dựa trên khóa phân loại và mô tả trong các tài liệu trong nước (Thực vật chí Việt Nam, tập 2) và tài liệu nước ngoài (Thực vật chí Trung Quốc)

2.2.2 Nghiên c ứu đặc điểm vi phẫu

Tiến hành làm vi phẫu thân và lá của mẫu nghiên cứu theo phương pháp nhuộm kép [1] Soi vi phẫu trên kính kính hiển vi Leica CME

2.2.3 Nghiên cứu trình tự di truyền

2.2.3.1 Tách chi ết DNA toàn phần

Quy trình tách chiết DNA sử dụng bộ kit chiết tách DNA thực vật GeneJET (Thermo Scientific) gồm các bước sau:

#1 Lấy 1 lá bánh tẻ còn tươi của mẫu P1, loại bỏ phần gân, cắt và nghiền

mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày

#2 Chuyển mẫu đã nghiền vào ống eppendorf 1,5mL có chứa 350 µL Lysis Buffer A Votex mẫu 1 phút để trộn đều hỗn hợp đảm bảo tất cả các bột lá được tiếp xúc đều Lysis Buffer A

#3 Thêm 50 µL Lysis Buffer B và 20 µL RNase A Lắc nhẹ

#4 Ủ ở 65˚C trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc ống trong lúc ủ

#5 Thêm 130 µL Precipitation Solution và lắc đảo ống 2-3 lần Ủ trong đá 5 phút

#6 Ly tâm với tốc độ 13.200 vòng/phút trong 8 phút

Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf 1,5 mL mới Thêm 400 µL Plant DNA Binding Solution và 400 µL ethanol 96% và trộn đều

#7 Chuyển hỗn hợp trên vào một ống spin column được cung cấp sẵn Ly tâm với tốc độ vòng 8000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch

#8 Thêm 500 µL Wash Buffer I đã được thêm ethanol 96% vào ống spin column Ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch nổi Column chuyển sang, đặt trong ống eppendorf mới

#9 Thêm 500 µL Wash Buffer II đã được thêm ethanol 96% Ly tâm với tốc

độ 13.200 vòng/phút trong 6 phút Loại bỏ ống eppendorf chứa dịch nổi Colunm chứa DNA được chuyển sang đặt trong eppendorf mới

#10 Thêm 100 µL Elution Buffer để hòa tan DNA, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 1 phút Loại column, thu ống eppendorf có chứa DNA đã được hòa tan

#11 Kiểm tra quá trình chiết DNA trên bản gel agarose 1%

#12 Bảo quản DNA ở nhiệt độ -20˚C để thực hiện các bước tiếp theo

2.2.3.2 Khuếch đại DNA (PCR)

Phản ứng PCR được thực hiện với hỗn hợp phản ứng được trình bày trong bảng dưới đây

Bảng 2.1 Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR

Thành phần Thể tích (µL)/ 1

phản ứng

Thể tích (µL)/ mẫu thí nghiệm

Dung dịch đệm cho Taq DNA

Tiến hành PCR với các cặp mồi ITS1- ITS4

Dung dịch đệm sử dụng là Dream Taq Buffer (chứa 20 mm MgCl2)

2 2.3.3 Điện di DNA trên bản gel agarose 1%

#1 Đặt bản gel agarose 1% đã được thêm EB vào trong máy điện di có dung

dịch đệm TAE 1x

#2 Pha mẫu theo tỷ lệ: 2 µL chỉ thị Dye trộn đều với 2 µL sản phẩm PCR Làm tương tự với Ladder

#3 Chạy điện di với hiệu điện thế 90V trong vòng 30 phút

#4 Quan sát bản gel dưới ánh sang đèn tử ngoại bước sóng 302 nm

#4 Chuyển hỗn hợp sang DNA binding column tube và ly tâm trong 1 phút

với tốc độ 13000 vòng/phút Loại bỏ dịch nổi, và đặt các cột DNA binding column với ống thu 2,0 mL

#5 Thêm 500 µL Buffer 2 vào cột lọc DNA Ly tâm 1 phút với tốc độ 13000 vòng/phút Loại bỏ nước rửa và đặt các cột DNA binding column với ống thu 2,0 mL (Tiến hành bước này 2 lần)

#6 Làm khô bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ ethanol Chuyển cột lọc DNA sang ống 1,5 mL mới

#7 Thêm 30 µL Buffer 3 vào giữa cột lọc DNA, đợi ít nhất khoảng 1 phút ở nhiệt độ phòng để hòa tan

#8 Thu lấy DNA đã hòa tan bằng cách ly tâm 1 phút ở tốc độ 13000 vòng/phút

#9 Bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ -20˚C

2.2.3.6 So sánh trình tự DNA

So sánh trình tự gen của mẫu P1 với các trình tự gen của Perilla frutescens var frutescens đã công bố trên Genbank bằng công cụ Blast

2.2.4 Nghiên c ứu thành phần dầu

Hạt mẫu Tía tô P1 đã thu được đem phơi khô và loại bỏ tạp Sau đó ,

tiến hành ép dầu bằng máy ép vít Dầu ép xong được tinh chế sơ bộ và bảo

quản trong chai nhựa, nắp kín, trong tối Quá trình được thực hiện tại công ty Jingabell Biotech LTD, Thái Lan Mẫu dầu được gửi phân tích tại Central Laboratory (Thailand) Co., LTD (Thái Lan) Số hiệu phiếu phân tích: TR(CM) 58/06020, TR(CM) 58/01310

Thành phần các acid béo trong dầu được phân tích theo phương pháp TE-CH-208 dựa trên AOAC (2012) 996.06 Thành phần vitamin E được phân tích theo phương pháp được mô tả trong Journal of Food Composition and Analysis 18 (2005).

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học

Cây cỏ, mọc thẳng đứng, cao 1-1,5 m, phân nhánh nhiều, toàn cây có mùi thơm Thân và cành vuông, màu xanh, có rãnh dọc theo cạnh thân, phủ nhiều lông đa bào màu trắng Lá đơn, mọc đối chéo chữ thập, cuống lá dài 40-

50 mm, đường kính 1,5-2 mm, màu xanh, có lông trắng, ngắn Phiến lá mỏng, hình trứng rộng, kích thước 45-55 mm x 105 mm, đỉnh lá nhọn kéo dài, gốc lá

nhọn Mặt trên, mặt dưới đều màu xanh, có lông ngắn, thưa, mép răng cưa Gân lá lông chim màu trắng ngà, có lông tập trung, gân bên 5-6 đôi (Hình 3.1)

Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng mẫu P1

1 C ả cây, 2 Thân và cành, 3 Cành mang cụm hoa, 4 Lá

Cụm hoa dạng chùm, mọc ở ngọn cành hoặc kẽ lá, dài 5-13cm, tại mỗi

kẽ lá mọc một cụm hoa, đỉnh ngọn mọc một cụm hoa, dài nhất Cuống hoa dài 1-3 mm, màu xanh tím có nhiều lông Hoa mọc dày, xếp 4 hàng thẳng, tạo hình chữ thập Hoa không đều, lưỡng tính, mẫu 5 Lá bắc hình trứng rộng, đỉnh lá nhọn, kéo dài, kích thước 4 mm x 7 mm, màu xanh, có lông ngắn ở hai bên mép gần gốc, mép nguyên, tồn tại đến khi hoa thành quả (Hình 3.2)

Đài hình chuông, màu xanh, có nhiều lông thẳng màu trắng, kích thước: 2-3 mm x 8-10 mm, 2 môi: môi trên 3 thùy ngắn, môi dưới 2 thùy

nhọn, xẻ sâu và dài hơn môi trên, đài tồn tại đến khi quả khô, đã rụng (Hình 3.2)

Hình 3.2: Phân tích hoa mẫu P1

1, 2 C ụm hoa; 3 Hoa đơn lẻ; 4 Lá bắc; 5 Tràng và nhị; 6 Chỉ nhị;

7 Nh ụy và noãn; 8 Quả bế tư; 9 Quả chín (“Hạt”)

Tràng hợp thành ống ở phía dưới, màu trắng, dài 3-4mm Có lông ở vòm họng, 2 môi 2/3: môi trên chia 2 thùy cạn; môi dưới có thùy giữa lớn hơn hai thùy bên Nhị 4, đính 1/3 ở phía trên ống tràng xen kẽ với cánh hoa, không nhô ra hẳn ngoài, 2 nhị dưới dài hơn hai nhị trên Chỉ nhị dạng sợi, bao

phấn màu nâu, 2 ô song song, nứt dọc, hướng trong đính đáy (Hình 3.2)

Bộ nhuỵ gồm 2 lá noãn tạo thành bầu 2 ô, sau đó có vách giả chia thành

4 ô, mỗi ô 1 noãn, đính đáy Bầu noãn đường kính 1-1,5mm, hình vuông, góc tròn Ở một số bầu noãn, có khi chỉ có 2-3 noãn phát triển thành hạt, các noãn khác không phát triển Vòi nhụy dạng sợi dài 2-3mm, màu nâu, 2 đầu nhụy thò ra ngoài (Hình 3.2)

Quả bế tư, hình trứng hoặc gần cầu, có gốc quả hơi nhọn, gồm 4 quả

hạch nhỏ (thường gọi là “hạt”), mỗi hạch chứa một hạt Khi chưa chín, màu

trắng ngà, đường kính mỗi quả khoảng 0,5-0,75 mm, cả tứ bế quả khoảng 2,0 mm Lúc chín quả có màu nâu đậm, đường kính 1-1,5 mm, có vân dạng lưới, dễ dàng rơi ra khỏi đài từng quả riêng rẽ Vỏ quả mỏng, dòn, dễ vỡ

1,5-Khối lượng 1000 quả là 1.316g (Hình 3.2)

Đối chiếu với các đặc điểm mô tả của Thực vật chí Việt Nam và Thực

vật chí Trung Quốc, mẫu P1 được định tên là Perilla frutescens var frutescens, họ Lamiaceae (Bạc hà)

3 2 Đặc điểm vi phẫu

3.2.1 Vi phẫu thân

Thân có tiết diện vuông, lồi lên ở 4 góc đều nhau Biểu bì (1) gồm 1

lớp tế bào hình chữ nhật, xếp xít nhau Trên lớp biểu bì có lông che chở (2) đa bào, thon dần về ngọn và lông tiết (3) đầu tròn, đa bào Dưới biểu bì là mô dày góc (4) liên tục, tập trung nhiều ở 4 góc, gồm những tế bào đa giác, kích thước không đều nhau, 4-6 lớp ở góc, 1-2 lớp ở cạnh Mô mềm vỏ (5) là

những tế bào hình dạng đa dạng, không đều nhau, xếp cạnh nhau giữa có