Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của n hydroxy 7 (3’ spiro1,3dioxolan 2’ oxoindolin 1’ yl)heptanamid và một số dẫn chất

Trong số các loại chất ức chế HDAC đã được tổng hợp và công bố cho đến nay, các dẫn xuất của acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệt một dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid

NGUYỄN THỊ VÂN TRANG

NGUYỄN THỊ VÂN TRANG

hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám

ơn chân thành đến GS Nguyễn Hải Nam, TS Phan Thị Phương Dung, ThS Trần Thị Lan Hương và DS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại

học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi

trong thời gian thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè

đã luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Vân Trang

1.1.1 Khái niệm histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase

1.1.3 Vai trò sinh học của HDAC và cơ chế chống ung thư của các chất ức chế

1.2.3 Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC 8 1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID

1.4 CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

DCM : Dicloromethan

HAT : Histon acetyltranferase

HDAC : Histon deacetylase

ω-alkoxy trong nghiên cứu của Hanessian S và cộng sự 10

2 Bảng 1.2: Tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic

3 Bảng 3.1: Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid

4 Bảng 3.2: Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn

5 Bảng 3.3: Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất IVa-d 31

6 Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ MS của các dẫn chất

9 Bảng 3.7: Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất

10 Bảng 3.8: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn

chất IVa-d bằng phương pháp định lượng IC50 40

11 Bảng 3.9: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của

12 Bảng 3.10: Kết quả thử hoạt tính của các acid hydroxamic

có khung isatin-3-oxim, isatin-3-methoxim và 3-spiro[1,3]

5 Hình 1.5: Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 8

6 Hình 1.6: Cấu trúc apicidin và azumamid E 8

7 Hình 1.7: Tương tác giữa HDAC4 và một hợp chất có cầu nối

mạch vòng trong nghiên cứu của Micco S.D và cộng sự 9

8 Hình 1.8: Mô hình ZBG theo nghiên cứu của Vanommeslaeghe

9 Hình 1.9: Cấu trúc các chất trong nghiên cứu của Feng T và

10 Hình 1.10: Cấu trúc cơ bản của các hợp chất tương tự SAHA có

nhóm thế tại C7 trong nghiên cứu của Taddei M và cộng sự 13

11 Hình 1.11: Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H và

12 Hình 1.12: Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được nghiên

13 Hình 3.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất

14 Hình 3.2: Biểu đồ so sánh tác dụng của các dẫn chất IVa-d trên

1 Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung 21

2 Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp dẫn chất IIa 21

3 Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp dẫn chất IIIa 22

4 Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVa 23

5 Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVb 25

6 Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVc 26

7 Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVd 28

8 Sơ đồ 3.8: Cơ chế phản ứng tạo thành IIa-d 35

9 Sơ đồ 3.9: Cơ chế phản ứng tạo thành IIIa-d 35

10 Sơ đồ 3.10: Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT) là các enzym quan trọng tham gia vào quá trình điều hoà biểu hiện gen Nhiều nghiên cứu cho thấy sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [15,20] Do đó, các HDAC là mục tiêu phân tử hấp dẫn cho nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư hiện nay [12,21,39] Trong số các loại chất ức chế HDAC đã được tổng hợp và công bố cho đến nay, các dẫn xuất của acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệt một dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza®),

đã được FDA phê duyệt năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL)

Theo hướng tiếp cận này, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt Trong bài báo khoa học của GS Nguyễn Hải Nam và cộng sự [31], các acid hydroxamic tương tự SAHA được tổng hợp sử dụng khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol làm nhóm khoá hoạt động, đã cho tác dụng ức chế HDAC tốt hơn nhiều lần SAHA Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy sử dụng dị vòng làm nhóm khoá hoạt động có khả năng cho hoạt tính tốt Dựa vào kết quả trên, nhóm nghiên cứu của GS Nguyễn Hải Nam [1,30] tiếp tục tổng hợp các chất có nhóm khoá hoạt động là dị vòng isatin-3-oxim và isatin-3-methoxim với cầu nối heptanamid (thay thế cầu nối octandiamid

trong SAHA), kết quả thu được cũng rất khả quan Trên cơ sở các nghiên cứu trên,

chúng tôi tiến hành tổng hợp các chất hướng ức chế HDAC với cầu nối heptanamid được tiếp tục sử dụng nhưng nhóm khoá hoạt động được thay đổi bằng khung 3-

spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin Đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

Nhiễm sắc thể được cấu thành từ các đơn vị cấu trúc cơ bản là các protein, gọi là mononucleosom Mỗi mononucleosom là một octamer của các histon (gồm 2 cặp của mỗi protein H2A, H2B, H3 và H4) [24]

Các đầu tận của protein histon thường bị biến đổi bởi các quá trình methyl hoá (Me), phosphoryl hoá (P) hoặc acetyl hoá (Ac) sau dịch mã Quá trình acetyl hoá histon được điều khiển bởi các enzym histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [5]

1.1.1 Khái niệm histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC):

Histon acetyltransferase (HAT): là enzym acetyl hoá nhóm ε-NH2 trong gốc lysin (đầu N tận) của histon, làm trung hoà điện tích dương trên lysin, do đó giảm khả năng tương tác của histon với ADN (tích điện âm), tạo ra cấu trúc mở của chromatin Vì vậy, sự acetyl hoá histon tạo điều kiện cho quá trình phiên mã, dịch

mã xảy ra (hình 1.1b) [5,19]

Histon deacetylase (HDAC): là enzym có tác dụng đối lập với HAT HDAC loại bỏ nhóm acetyl từ acetyllysin (Ac-Lys) ở đầu N tận của histon, làm đóng xoắn chromatin, do đó ức chế quá trình phiên mã (hình 1.1a) [5,19]

Hình 1.1: Cấu trúc chromatin điều khiển quá trình phiên mã, dịch mã

a Sự methyl hoá và deacetyl hoá tạo ra cấu trúc “đóng” của chromatin, gây ức chế quá trình phiên mã, dịch mã với sự tham gia của enzym HDAC

b Sự acetyl hoá và demethyl hoá tạo ra cấu trúc “mở” của chromatin, tạo điều kiện cho quá trình phiên mã, dịch mã với sự tham gia của enzym HAT

1.1.2 Phân loại các HDAC

Cho đến nay, 18 HDAC đã được tìm thấy ở người Các HDAC có thể được chia thành 2 loại: loại phụ thuộc Zn2+ và loại phụ thuộc NAD+ (nicotinamid adenin dinucleotid) [32]

HDAC cũng có thể được chia thành 4 nhóm [32]:

Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8

Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10

Nhóm III: Sirtuin (SIRT) 1-7

Nhóm IV: HDAC11

Trong đó nhóm III là các HDAC phụ thuộc NAD+, nhóm I, II, IV là các HDAC phụ thuộc Zn2+ Nhóm I, II, IV còn được gọi là nhóm các HDAC “kinh điển” [32]

1.1.3 Vai trò sinh học của HDAC và cơ chế chống ung thư của các chất ức chế HDAC

1.1.3.1 Điều khiển quá trình phiên mã

HDAC được coi là chất ức chế quá trình phiên mã Sự acetyl hoá histon bởi các enzym HAT làm trung hoà điện tích dương trên lysin, do đó giảm khả năng tương tác với ADN (tích điện âm) Vì vậy, sự acetyl hoá histon tạo điều kiện cho các yếu tố kích thích quá trình phiên mã gắn vào ADN, thúc đẩy quá trình phiên

mã Ngược lại, sự khử nhóm acetyllysin của các HDAC ngăn cản quá trình phiên

mã [20] Sự mất cân bằng hoạt động của HAT và HDAC có thể dẫn đến những sai lệch trong quá trình phiên mã, từ đó dẫn đến bất thường biểu hiện gen [20]

1.1.3.2 Điều khiển sự chết tế bào theo chương trình

Sự chết tế bào theo chương trình được điều khiển bởi nhiều phức hợp protein Quá trình này phụ thuộc vào nhiều yếu tố nội tại và yếu tố ngoại lai, trong

đó có các HDAC (hình 1.2) [22]

Các nghiên cứu đã cho thấy HDAC1 ức chế các yếu tố tăng trưởng TGF-β1 (transforming growth factor-β1), do đó ức chế HDAC1 dẫn đến sự chết tế bào theo chương trình Ngược lại, sự biểu hiện quá mức HDAC1 lại kích thích sự nhân lên

của tế bào HDAC2 đóng vai trò như yếu tố điều hoà âm tính với TGF-β1 Loại bỏ HDAC1 và HDAC2 làm kích thích sự chết tế bào theo chương trình, khởi đầu với quá trình hyperacetyl hoá p53 Sự phân huỷ HDAC3 và HDAC4 phụ thuộc caspase,

sự phân huỷ HDAC4 tạo ra các mảnh protein, các mảnh này kích thích sự giải phóng cytochrom c và gây ra sự chết tế bào theo chương trình [22]

Hình 1.2: Vai trò điều khiển sự chết tế bào theo chương trình

Các chất ức chế HDAC nhắm vào đích là các yếu tố ức chế sự chết tế bào Các butyrat và TSA hoạt hoá caspase-3 và kích thích sự tăng lên của các protein Bad - protein khởi đầu sự chết của tế bào ung thư Một protein khởi đầu sự chết tế bào khác, Bak, cũng được nhân lên bởi butyrat TSA và butyrat còn làm giảm các yếu tố ức chế sự chết tế bào như Bcl-2 [35]

1.1.3.3 Điều khiển chu trình tế bào

Nghiên cứu trên gen tế bào nấm men cho thấy các HDAC đóng vai trò là yếu

tố điều hoà gen có liên quan đến chu trình tế bào [5] Ngoài cơ chế điều hoà gen, các HDAC còn điều khiển chu trình tế bào theo nhiều cơ chế khác như tương tác với các yếu tố điều hoà chu trình tế bào, dẫn đến sự ngừng chu trình tế bào ở một số điểm (hình 1.3) [19] Ví dụ, sự giảm HDAC1 gây ngừng chu trình tế bào ở điểm giới hạn G1/S hoặc điểm kiểm soát G2/M [36] Trapoxin ức chế HDAC do đó gây ngừng chu trình tế bào ở G1/S và G2/M [34]

Hình 1.3: Vai trò điều khiển chu trình tế bào của các chất ức chế HDAC

Điểm giới hạn G1/S và điểm kiểm soát G2/M là các điểm kiểm soát trong chu trình tế bào, nhằm đảm bảo sự chính xác của quá trình phân bào Nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất ức chế HDAC đối với điểm kiểm soát G2/M trong chu trình

tế bào bình thường và trên một số dòng tế bào ung thư cho thấy các chất ức chế HDAC kích thích sự kiểm tra tại G2 [19] Cơ chế phân tử của quá trình này chưa được biết rõ, nhưng có quan điểm cho rằng ở một số dòng tế bào, các chất ức chế HDAC tác động đến một (hoặc một vài) gen nhất định Các gen này tác động kích thích trực tiếp hoặc gián tiếp lên sự kiểm soát tại G2/M [19]

Các tế bào thường đi qua sự kiểm tra tại G2 trong chu trình tế bào mà không

bị tiêu diệt Trong khi đó, ở các tế bào ung thư, sự sai hỏng ADN làm bất hoạt các phức hợp chuyển từ G2 sang M, do đó chu trình tế bào bị ngừng ở G2 [9] Các tế bào ung thư có thể tiếp tục nhân đôi ADN, cuối cùng sẽ chết theo chương trình [19]

Ngoài ra, các chất ức chế HDAC còn tác động lên tế bào ung thư theo một số

cơ chế khác như tác động lên sự hình thành mạch nuôi dưỡng tế bào ung thư, tác động lên sự biệt hoá tế bào, sự di căn và đề kháng với hoá trị liệu của tế bào ung thư, tác động lên các chaperon (là các yếu tố giúp protein gập xoắn để hình thành cấu trúc bậc cao) [22]

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC có thể được chia thành 4 nhóm dựa trên cấu trúc hoá học: acid hydroxamic, acid carboxylic, benzamid, peptid vòng (hình 1.4) [20] Một

số tác giả chia các chất ức chế HDAC thành 6 nhóm: acid hydroxamic, acid carboxylic, các benzamid, peptid vòng, epoxid (VD trapoxin A), phân tử lai (hybrid) [13,44]

Trichostatin A (TSA) là chất đầu tiên thuộc nhóm acid hydroxamic được tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC Sau đó, SAHA (vorinostat) với cấu trúc tương

tự TSA là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA phê duyệt cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) [10] Tuy nhiên, TSA và vorinostat đều là các chất ức chế HDAC chưa chọn lọc [20]

Các peptid vòng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất, bao gồm depsipeptid, apicidin, các peptid chứa nhóm hydroxamic Depsipeptid được FDA phê duyệt cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) vào tháng 11 năm 2009 Depsipeptid là tiền thuốc, được chuyển hoá trong tế bào thành dạng chứa nhóm sulfhydryl hoạt động,

có khả năng tương tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC nhóm I, đặc biệt HDAC1 và HDAC2 [13]

Các acid carboxylic, bao gồm các acid butyric, phenylbutyric, acid valproic,

là các chất ức chế HDAC tương đối yếu (có tác dụng ở nồng độ mM) [20]

MS-275 là dẫn xuất benzamid tổng hợp, có tác dụng ức chế HDAC1, HDAC2 và HDAC3 ở nồng độ µM MGCD0103 là benzamid thể hiện tác dụng ức chế chọn lọc lên các enzym HDAC nhóm I và IV, không tác dụng lên các enzym HDAC nhóm II [40]

H OH O

O

N H OH

O

N N H

N H O

NH2SAHA

NH O

HN

NH O

S S

O

O O

OH O

O- Na+O

Natri phenylbutyrat Acid valproic

Depsipeptid (FK228, romidepsin)

Hình 1.4: Một số chất ức chế HDAC

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Cấu trúc các chất ức chế HDAC thường gồm 3 phần chính (hình 1.5) [26]:

- Nhóm khóa hoạt động (cap group) hay nhóm nhận diện bề mặt (SRG): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường tham gia vào quá trình nhận diện với bề

mặt amino acid [26]

- Vùng cầu nối (linker): thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no, có vai trò tạo liên kết

Van der Waals với kênh enzym [26]

- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): có thể là acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton Nhóm kết thúc gắn với kẽm tham gia tạo tương tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC [26]

Hình 1.5: Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Như vậy, các phần trong cấu trúc của các chất ức chế HDAC đều tham gia

vào quá trình hình thành liên kết với enzym và phát huy tác dụng

1.2.3 Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC

1.2.3.1 Ảnh hưởng của nhóm khoá hoạt động

Ảnh hưởng của cấu trúc không gian

Các hợp chất cyclopeptid thiên nhiên mag vòng lớn (ví dụ azumamid E, depsipeptid và apicidin) cho tác dụng ức chế chọn lọc HDAC nhóm I

O

N O

Hình 1.6: Cấu trúc apicidin và azumamid E

Tác dụng chọn lọc của các cyclopeptid thiên nhiên đã được Micco S.D và cộng sự nghiên cứu và giải thích như sau: các hợp chất trên mang vòng lớn (cyclopeptid, với vai trò là nhóm khoá hoạt động) (hình 1.6) [26], do đó yêu cầu một khoảng không gian trong enzym để tạo tương tác Các HDAC nhóm I đáp ứng điều kiện này do có chứa một túi ở bề mặt với đường kính 11 Å, vì vậy phù hợp để các hợp chất vòng lớn có thể vào đây và tạo các tương tác Van der Waals, tương tác

hydro Các tương tác này làm cho liên kết giữa các chất ức chế HDAC và enzym khá bền vững [26]

Ở các HDAC nhóm II, tại bề mặt enzym có các phân tử cồng kềnh, do đó khó tạo liên kết với các hợp chất vòng lớn khác [26]

- Ảnh hưởng của mạch thẳng và vòng thơm

Năm 2013, nghiên cứu được công bố bởi Micco S.D và cộng sự cho thấy trong kênh enzym của HDAC có hai nhóm phenylalanin, hai nhóm này tham gia vào quá trình acetyl hoá lysin của histon Nhóm tác giả sau đó đã nghiên cứu docking nhiều hợp chất có cầu nối mạch thẳng và cầu nối vòng thơm để xác định cấu trúc cầu nối phù hợp tạo tương tác với hai nhóm phenylalanin trong HDAC Kết quả cho thấy các chất ức chế HDAC có cầu nối vòng thơm cho ái lực mạnh với đích, do vòng thơm đã tạo liên kết π-π với hai gốc phenylalanin (hình 1.7) [26]

O O

Hình 1.7: Tương tác giữa HDAC4 và một hợp chất có cầu nối mạch vòng trong

nghiên cứu của Micco S.D và cộng sự

Ghi chú: Protein được biểu diễn bởi các dải Mạch của các acid amin His158, His159 and Tyr170

(màu xanh nhạt) và 1 (trắng) được biểu diễn bởi các đường ống Màu của các nguyên tử: H màu

trắng, N xanh lam đậm, O đỏ, F xanh lục

- Ảnh hưởng của chiều dài cầu nối và nhóm thế

Một số nghiên cứu đã cho thấy chiều dài cầu nối đóng vai trò quan trọng trong tác dụng ức chế chọn lọc của các chất ức chế HDAC [11,18] Chiều dài cầu nối phù hợp sẽ đưa được nhóm kết thúc đến gắn với Zn2+ và giúp nhóm khoá hoạt động ở vị trí phù hợp để tạo liên kết với các acid amin bề mặt Đối với đa số HDAC nhóm I, chiều dài cầu nối phù hợp để tạo tác dụng chọn lọc là 6 carbon Riêng với chất ức chế chọn lọc HDAC6, cầu nối thường dài hơn 6 carbon [26]

Tuy nhiên, chiều dài cầu nối thích hợp để tạo tác dụng ức chế chọn lọc còn phụ thuộc vào các nhóm thế Năm 2007, Hanessian S và cộng sự đã nghiên cứu khả

năng ức chế HDAC2 và hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên các dòng tế bào

ung thư ở người (NB4, H460 và HCT-116) của các dẫn xuất ω-alkoxy có cấu trúc tương tự SAHA với mạch 7 carbon (n=4), 8 carbon (n=5), 9 carbon (n=6) Kết quả nghiên cứu cho thấy (bảng 1.1) [16]:

Bảng 1.1: Cấu trúc và hoạt tính của các dẫn xuất SAHA ω-alkoxy

trong nghiên cứu của Hanessian S và cộng sự

N

NHOHO

O

ORH

Ức chế HDAC2

IC 50 1* (µM) Độc tính tế bào IC 50 2* (µM) 0,5-0,1 ≥0,05 NB4 H460 HCT-116

deacetyl hoá của HDAC2; 2 Nồng độ gây ra sự giảm 50% số lượng tế bào

- Các dẫn xuất mạch nhánh 7 carbon: 2b, 2e-f có tác dụng ức chế HDAC2

trung bình nhưng hoạt tính kháng tế bào ung thư kém

- Các dẫn xuất mạch nhánh 8 carbon: cho tác dụng tốt nhất khi so sánh giữa các chất có cùng nhóm thế R, chỉ khác về độ dài mạch carbon

Trong các dẫn xuất mạch nhánh 8 carbon, các dẫn xuất benzyloxy 3d, 3j ức

chế HDAC2 tương tự SAHA, nhưng hoạt tính kháng tế bào ung thư rất mạnh

- Các dẫn xuất mạch nhánh 9 carbon: 4a-b, 4d bị mất tác dụng ức chế HDAC2 ở nồng độ dưới 0,1 µM, trừ dẫn chất mạch nhánh 9 carbon ω-O-allyl 4c

cho tác dụng ức chế HDAC2 và hoạt tính kháng tế bào ung thư tương tự SAHA

1.2.3.3 Ảnh hưởng của nhóm kết thúc gắn với kẽm (ZBG)

- Cấu trúc của ZBG

Năm 2005, Vanommeslaeghe K và cộng sự đã nghiên cứu cấu trúc của vùng chứa ion Zn2+ trong HDAC, thấy rằng vùng này chứa 1 gốc Tyr và 2 nhóm His-Asp Từ đó, tác giả đã đưa ra cấu trúc của nhóm kết thúc gắn với kẽm trong phân tử chất ức chế HDAC gồm 5 phần (hình 1.8) [43]:

O

B C L

H N

O O

Asp166 His131

Hình 1.8: Mô hình ZBG theo nghiên cứu của Vanommeslaeghe K và cộng sự

+ Phần A: mang đôi electron không liên kết, có khả năng tạo liên kết hydro với H trong nhóm OH của tyrosin, đồng thời tạo liên kết chelat với ion Zn2+ Tuy nhiên A cũng có thể chứa hydro (để nhận điện tử từ oxy trong nhóm phenol của tyrosin tạo liên kết hydro)

+ Phần B: nối ZBG với vùng cầu nối, do đó B phải tạo ít nhất 3 liên kết + Phần C: chứa hydro linh động, tạo liên kết hydro với His132

+ Phần D: là nhóm cho proton cho His131, tạo liên kết tĩnh điện với His131

và liên kết chelat mạnh với Zn2+

+ Phần L: vùng cầu nối

Từ cấu trúc này có thể lý giải tác dụng ức chế HDAC mạnh của các dẫn chất hydroxamic [43].

- Ảnh hưởng của ZBG tới tính chọn lọc của chất ức chế HDAC

Cấu trúc ZBG có tác động tới tính chọn lọc của chất ức chế Một số nghiên cứu cho thấy các chất ức chế HDAC có ZBG là nhóm 2-amino benzamid có tác dụng ức chế chọn lọc HDAC nhóm I, đặc biệt HDAC1 và HDAC2 [25,33] Nhóm amino của benzamid liên kết với Zn2+ trong trung tâm hoạt động của enzym Tuy nhiên, khác với các ZBG khác (acid hydroxamic, acid carboxylic, ), để nhóm amino benzamid có thể liên kết với Zn2+ cần có một khoảng không gian trong kênh enzym để chứa vòng phenyl Các HDAC nhóm I đáp ứng được điều kiện này do ở đáy của kênh enzym 11 Å có một túi rỗng kích thước 14 Å [26]

Ngoài ra, trong kênh 11 Å của các HDAC nhóm I có chứa nhóm CO của glycyl và tyrosyl: Glyl 49 và Tyr 303 của HDAC1, Gly 154 và Tyr 308 của HDAC2, Gly 143 và Tyr 298 của HDAC3, Gly 151 và Tyr 306 của HDAC8 Đây là các nhóm có thể tạo liên kết hydro Mặt khác, kênh của các enzym HDAC nhóm II không chứa chất cho và nhận để tạo liên kết hydro Do đó, các chất ức chế chọn lọc HDAC nhóm I thường chứa liên kết amid giữa cầu nối và ZBG (-NH của amid có thể tạo liên kết hydro với nhóm CO của glycin) [26]

1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC

ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI

1.3.1 Thay đổi nhóm khoá hoạt động

Nhiều nghiên cứu cho thấy nhóm khoá hoạt động có vai trò quan trọng đối với tác dụng chọn lọc của chất ức chế HDAC [26,42] Do đó, việc thay đổi nhóm khoá hoạt động có thể cải thiện tác dụng chọn lọc của các chất ức chế HDAC [38]

Năm 2013, Feng T và cộng sự đã nghiên cứu các chất ức chế HDAC dẫn

xuất N-hydroxyfurylacrylamid có mạch nhánh ở nhóm khoá hoạt động (hình 1.9) [12] Các hợp chất này được đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên

các dòng tế bào PC-3, HCT116, A549, HepG2 và khả năng ức chế chọn lọc các

enzym HDAC1, HDAC4, HDAC6 Kết quả nghiên cứu cho thấy 5a, 5b, 5c, 5d cho

tác dụng chọn lọc tốt nhất với HDAC6 Bên cạnh đó, khả năng ức chế HDAC1 (của

hợp chất 5a, 5b, 5c) cũng không hoàn toàn biến mất Qua nghiên cứu docking hợp chất 5b, các tác giả giải thích 5b có sự ức chế chọn lọc HDAC6 là do mạch nhánh

cồng kềnh ở nhóm khoá hoạt động có kích thước đủ lớn vừa khít với rãnh trên bề mặt HDAC6, nhưng không khít với rãnh trên bề mặt HDAC1 và HDAC4 [12]

O N

N H

OH R

Hình 1.9: Cấu trúc các chất trong nghiên cứu của Feng T và cộng sự

1.3.2 Thay đổi cầu nối

- Thay đổi nhóm thế

Các nghiên cứu gắn thêm nhóm thế vào mạch carbon trong cầu nối của SAHA đã tạo ra các hợp chất có tính chọn lọc tốt trên HDAC [8,6] Năm 2013,

Taddei M và cộng sự đã tổng hợp các hợp chất 6 có nhóm thế amido lactam ở vị trí

C7 của SAHA (hình 1.10) [39] Các hợp chất tổng hợp được cho hoạt tính ức chế mạnh với HDAC và độc tính mạnh trên các dòng tế bào ung thư Thử nghiệm cho thấy vòng amid trên cầu nối (gần vị trí nhóm khoá hoạt động) đóng vai trò quan trọng trong sự gắn kết chất ức chế với enzym [39]

N

H OH O

O HN

NH O

O n

6

Hình 1.10: Cấu trúc cơ bản của các hợp chất tương tự SAHA có nhóm thế tại C7

trong nghiên cứu của Taddei M và cộng sự

- Thay đổi mạch thẳng/ vòng

Nghiên cứu cấu trúc HDAC cho thấy trung tâm hoạt động của HDAC1 có kích thước bé hơn trung tâm hoạt động của HDAC6 [4] Vì vậy, Lee J.H và cộng

sự đã nghiên cứu hoạt tính của các hợp chất thay đổi cầu nối mạch thẳng (SAHA) thành cầu nối có cấu trúc cồng kềnh hơn về không gian nhằm tổng hợp các chất ức

chế chọn lọc HDAC6 Kết quả cho thấy hợp chất

N-hydroxy-4-(2-[(2-hydroxyethyl)(phenyl)amino]-2-oxoethyl)benzamid (HPOB) 7 cho hoạt tính ức chế

chọn lọc HDAC6 in vitro và in vivo (hình 1.11) [21]

N

N H OH O

O HO

7 (HPOB)

Hình 1.11: Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H và cộng sự

1.4 CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG NƯỚC

N

S

N H

NHOH R

O

O

8a, R = -H 8b, R = -CH3

S

N N

N

O O

[ ] 4 R

9a, R = -H 9b, R = 2-Cl

NHOH OH

NHOH OCH3

Cùng với xu hướng chung của thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, khảo sát tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mới hướng ức chế histon deacetylase dựa trên cấu trúc của SAHA (hình 1.12) [1,2,27,28,29,30,31,41]

Kết quả cho thấy nhiều chất tổng hợp được có tác dụng rất tốt khi thử khả

năng ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro trên một số dòng tế bào ung thư

(bảng 1.2) Các nghiên cứu cũng cho thấy việc sử dụng dị vòng làm nhóm khoá hoạt động và heptanamid làm cầu nối (thay thế phenyl và dioctanamid trong cấu trúc SAHA) đem lại kết quả rất khả quan

Bảng 1.2: Tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic

được thiết kế, tổng hợp trong nước

Hợp

chất R

Tác dụng

ức chế HDAC1

Độc tính tế bào IC 502 (µM)/ dòng tế bào SW620 MCF-7 PC3 AsPC-1 NCI-

bằng phương pháp Western blot

Các kết quả trên đây đã tạo nền tảng cho khoá luận phát triển hướng nghiên cứu bằng việc giữ nguyên cấu trúc cầu nối heptanamid nhưng phát triển nhóm khoá hoạt động (thay thế khung 3-oxim-isatin và 3-methoxim-isatin bằng khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin) Kết quả cụ thể sẽ được trình bày trong các chương tiếp theo của khóa luận

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

Các hóa chất và dung môi khác: N,N-dimethylformamid (DMF),

dicloromethan (DCM), methanol, aceton, ethyl acetat, toluen, natri hydroxyd, natri sulfat khan, kali carbonat, acid hydrocloric, nước muối bão hoà, nước cất

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, sinh hàn hồi lưu, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy cất quay chân không Buchi R-210

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu

- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng

- Máy Melting point Apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy

- Máy Impact 400 để xác định phổ IR

- Máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap để ghi phổ MS

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tổng hợp hóa học

- Tổng hợp 4 dẫn chất:

N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid (IVa)

N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-5’-fluoro-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid (IVb) N-hydroxy-7-(5’-cloro-3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid (IVc) N-hydroxy-7-(7’-cloro-3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid (IVd)

- Kiểm tra độ tinh khiết

- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

- Thử tác dụng ức chế HDAC

- Thử độc tính trên các dòng tế bào ung thư SW620, PC-3 và AsPC-1

- Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tổng hợp hóa học

2.3.1.1 Tổng hợp

- Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất theo thiết kế

- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy

- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, chế độ +ESI-MS, dung môi methanol

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMR được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,

dung môi DMSO-d 6 Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

2.3.2 Thử tác dụng sinh học

2.3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất được đánh giá bằng 2 phương pháp:

- Đánh giá theo phương pháp Western blot:

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng (SW620) Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng Chi tiết cách tiến hành được dựa trên phương pháp đã được công bố trước đây [45]

- Định lượng nồng độ HDAC2 bị ức chế bằng phương pháp huỳnh quang Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Enzym HDAC2 được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) và sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience) Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit thử nghiệm

Tóm tắt các bước như sau: Enzym HDAC2 được ủ với KBH-A42 ở nhiều nồng độ khác nhau ở 37oC trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang HDAC developer (tạo chất phát huỳnh quang trong hỗn hợp phản ứng) được thêm vào sau khi ủ Mức độ phát huỳnh quang được ghi bằng máy VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) với bước sóng kích thích 360 nm và bước sóng phát xạ 460 nm Kết quả được ghi lại và giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)

2.3.2.2 Thử độc tính tế bào

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực

hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB) [7,17]

Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng), PC-3 (tế bào ung thư tiền liệt tuyến) và AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tuỵ)

Các tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB)

* Nguyên tắc thử

Dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượng protein, từ đó suy ra số lượng tế bào [7]

* Các bước tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị tế bào (đĩa A)

- Sử dụng các tế bào đang ở pha logarit hoặc được trypsin hoá (với các dòng

tế bào bám dính)

- Phân tán dòng tế bào trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò), 1% glutamin, 1% pen/ strep (100 U/ml penicillin và 100 µg/ml streptomycin) hoặc các môi trường phù hợp khác, điều chỉnh đến nồng độ 300-500.103 tế bào/ml

- Thu lấy mỗi giếng 100 000 tế bào và phân tán vào 10 ml môi trường gồm 20% FBS, 1% glutamin và 1% pen/ strep

- Từ 100 000 tế bào trong 10 ml môi trường, dùng pipet hút 100 µl hỗn dịch

tế bào và môi trường vào mỗi giếng để có 1000 tế bào ở mỗi giếng

- Hàng đầu tiên được sử dụng làm mẫu trắng, hàng tiếp theo là các mẫu đối chứng (không có mẫu thử)

Bước 2: Chuẩn bị mẫu (đĩa B)

- Thêm 125 µl môi trường RPMI 1640 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng

- Thêm 125 µl mẫu thử (hoà tan trong DMSO) vào hàng đầu tiên, trộn đều, sau đó lấy 125 µl hỗn hợp ở hàng đầu tiên thêm vào các giếng ở hàng thứ hai, lặp lại quá trình này cho đến hàng cuối cùng để có được các nồng độ pha loãng

- Hút 100 µl ở hàng thứ 10 của đĩa B thêm vào hàng cuối cùng của đĩa A (để dung dịch nồng độ nhỏ hơn ít ảnh hưởng đến nồng độ dung dịch được hút ở các lần tiếp theo), lần lượt như vậy cho đến hàng thứ 3 của đĩa A

- Thêm 100 µl môi trường RPMI 1640 (không chứa mẫu thử) vào hàng mẫu đối chứng để được 200 µl hỗn dịch với 10% FBS trong mỗi giếng

- Thêm 200 µl môi trường vào hàng mẫu trắng

- Ủ trong 48 h

Bước 3: Tiến hành thử:

- Chuẩn bị dung dịch gốc 50% TCA, làm lạnh ở 4oC rồi thêm 50 µl dung dịch đã làm lạnh vào mỗi giếng chứa 200 µl hỗn dịch tế bào và môi trường để tạo nồng độ 10% TCA ở mỗi giếng

- Đặt đĩa 96 giếng ở 4oC trong 1 h để cố định tế bào

- Chuẩn bị dung dịch 0,4% SRB (kl/tt) trong 1% acid acetic và thêm 70 µl dung dịch này vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Rửa đĩa với 1% acid acetic 5 lần để rửa trôi lượng SRB chưa gắn

- Chuẩn bị dung dịch gốc 10 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan (base Trizma) và thêm 200 µl dung dịch này vào mỗi giếng để hoà tan các SRB đã gắn Đặt đĩa 96 giếng vào máy lắc trong ít nhất 10 phút

- Đọc độ hấp thụ ở 492 nm với các đĩa vi thể (microplate), loại trừ độ hấp thụ của nền (đĩa microplate) ở bước sóng 620 nm

* Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với mẫu đối chứng Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ sai khác không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp Probits

2.3.2.3 Sơ bộ đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được

Tính giá trị logP của các dẫn chất bằng phần mềm EPIsuite Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính logP

Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinsky [23]:

- Khối lượng phân tử của chất không lớn hơn 500 g/mol

- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10

- Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5

- Giá trị logP của chất không lớn hơn 5

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

N O O O

OC2H5O R

NH O OH

a, R = -H

b, R = 5-F

c, R = 5-Cl

d, R = 7-Cl

Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung

7-bromoheptanoat, kali carbonat, DMF, 100 o C, 4 h; iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, methanol

- nước, -5 o C, 1,5h

3.1.1.1 Tổng hợp dẫn chất yl)heptanamid (IVa)

O

O + HO OH

N H O O O

110oC, 4 h Toluen, TsOH

+ Khuấy và đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 4 h ở 110oC

- Xử lý phản ứng

+ Thêm 10 ml nước cất vào bình cầu

+ Chiết thu sản phẩm bằng dung môi toluen (3 lần, mỗi lần 10 ml) sau đó gộp các dịch chiết

+ Rửa dịch chiết bằng dung dịch muối bão hoà và natri sulfat khan

+ Cất loại dung môi bằng máy cất quay ở 70oC, thu được 0,30 g sản phẩm

OC2H5O

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp dẫn chất IIIa

- Tiến hành phản ứng

+ Cân 0,29 g (1,5 mmol) dẫn chất IIa hoà tan vào 4 ml DMF trong bình cầu

đáy tròn dung tích 50 ml, thêm 0,30 g (2,2 mmol) kali carbonat

+ Khuấy hỗn hợp phản ứng trong 1 h ở 50oC tới khi chất trong bình phản ứng đổi màu sẫm hoàn toàn

+ Cân 0,36 g (1,5 mmol) ethyl 7-bromoheptanoat hoà trong 1,5 ml DMF rồi nhỏ từ từ vào bình phản ứng

+ Khuấy hỗn hợp phản ứng trong 4 h ở 100oC

- Xử lý phản ứng:

+ Làm lạnh bình phản ứng và trung tính hoá bằng acid HCl 5% đã làm lạnh

+ Chiết thu sản phẩm bằng dung môi DCM (chiết 3 lần, mỗi lần 10 ml DCM), gộp các dịch chiết

+ Làm khan dịch chiết bằng dung dịch muối bão hòa và natri sulfat khan + Cất loại dung môi bằng máy cất quay ở 40°C, thu được 0,40 g sản phẩm

(IVa) được tổng hợp bằng phản ứng tạo acid hydroxamic giữa hợp chất IIIa với

hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ 3.4 như sau:

Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVa

+ Nhỏ giọt từ từ dung dịch dẫn chất IIIa vào bình chứa hydroxylamin kết

hợp khuấy từ với tốc độ phù hợp ở -5°C Theo dõi phản ứng đến khoảng 1,5h thấy

ester IIIa phản ứng hết

Theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách cho phản ứng với dung dịch FeCl3 5% và chạy TLC, cụ thể làm như sau:

- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5% Nếu xuất hiện màu đỏ vang chứng

tỏ đã có acid hydroxamic được tạo ra

- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng trong ống nghiệm, thêm ethyl acetat để chiết lấy sản phẩm tạo ra Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM/ MeOH = 25/ 1 Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy đã phản

ứng hết lượng ester IIIa ban đầu

- Xử lý phản ứng

+ Acid hóa hỗn hợp phản ứng đến pH 5 bằng dung dịch HCl 5% đã làm lạnh + Chiết thu sản phẩm bằng DCM (chiết 3 lần mỗi lần 10 ml DCM), gộp các dịch chiết, làm khan dịch chiết bằng dung dịch muối bão hoà và natri sulfat khan

+ Cất quay chân không ở 40oC thu được chất rắn

+ Kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi methanol - nước: hoà tan sản phẩm trong lượng tối thiểu methanol, thêm từ từ nước đến khi xuất hiện tủa li ti, để lạnh trong 24 h

+ Lọc tủa, sấy, thu được 0,09 g sản phẩm là dẫn chất IVa

N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-5’-fluoro-2’-Dẫn chất IVb được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.5

Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVb

7-bromoheptanoat, kali carbonat, DMF, 100 o C, 4 h; iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, methanol

- nước, -5 o C, 1,5h

a Tổng hợp dẫn chất IIb

Để tổng hợp dẫn chất IVb cần tổng hợp dẫn chất dioxolan-2,3’-indolin]-2’-on (IIb) Quá trình tổng hợp dẫn chất IIb từ 0,33 g (2,0 mmol) chất 5-fluoroisatin (Ib) được thực hiện tương tự như tổng hợp dẫn chất IIa

5’-fluorospiro[1,3-Kết quả thu được như sau:

Kết quả thu được như sau:

+ Cảm quan: bột màu vàng nâu

O F

ii

N O O O

OC2H5O F

iii

IVb

N O O O

NH O OH F

c Tổng hợp dẫn chất IVb

Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-5’-fluoro-2’-oxo

indolin-1’-yl)heptanamid (IVb) từ 0,18 g (0,5 mmol) dẫn chất IIIb được tiến hành tương tự như tổng hợp dẫn chất IVa

Kết quả thu được dẫn chất IIIb như sau:

+ Cảm quan: bột kết tinh màu vàng nâu

N-hydroxy-7-(5’-cloro-3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-Hợp chất IVc được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.6:

O Cl

ii

N O O O

OC2H5O Cl

iii

IVc

N O O O

NH O OH Cl

Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVc

7-bromoheptanoat, kali carbonat, DMF, 100 o C, 4 h; iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, methanol

- nước, -5 o C, 1,5h

a Tổng hợp dẫn chất IIc

Hợp chất 5’-clorospiro[1,3-dioxolan-2,3’-indolin]-2’-on (IIc) được tổng hợp

từ 0,36 g (2,0 mmol) dẫn chất 5-cloroisatin (Ic) theo quy trình tương tự như tổng hợp dẫn chất IIa

Kết quả thu được như sau:

+ Cảm quan: bột màu vàng nâu

Kết quả thu được như sau:

+ Cảm quan: bột màu vàng nâu

Kết quả thu được như sau:

+ Cảm quan: bột kết tinh màu vàng nâu

N-hydroxy-7-(7’-cloro-3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-Dẫn chất IVd được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.7:

H

O

O Cl

i

N H O O O

Cl

ii

N O O O

OC2H 5 O Cl

iii

IVd

N O O O

NH O

OH Cl

Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVd

7-bromoheptanoat, kali carbonat, DMF, 100 o C, 4 h; iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, methanol

NH O OH

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các dẫn chất IVa-d và các sản phẩm trung gian IIa-d, IIIa-d thu được sau

khi xử lý phản ứng được đem kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy Chỉ số Rf và nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất

IVa-d cụ thể được trình bày trong bảng 3.2

* Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-230 mesh, với 3 hệ dung môi khác nhau là DCM/ MeOH (90/ 1), DCM/ MeOH

(25/ 1), DCM, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Kết quả cho thấy các chất đều có vết gọn, rõ, không có vết phụ

* Đo nhiệt độ nóng chảy

Các dẫn chất đều ở dạng rắn, có thể tiến hành đo được nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Kết quả trình bày trong bảng 3.2 cho

thấy các dẫn chất IVa-d sau khi kết tinh lại đều có nhiệt độ nóng chảy xác định

(khoảng dao động nhiệt độ hẹp 1-2oC)

Bảng 3.2: Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy (t o nc ) của các dẫn chất IVa-d

Chất R kết tinh lại Dung môi (%) H Hệ dung môi chạy TLC R f T o nc ( o C) IVa -H MeOH - H2O 55,0 DCM : MeOH = 25 : 1 0,44 243,0-243,5

IVb 5-F MeOH - H2O 51,8 DCM : MeOH = 25 : 1 0,43 241,7-242,9

IVc 5-Cl MeOH - H2O 54,2 DCM : MeOH = 25 : 1 0,46 250,6-251,3

IVd 7-Cl MeOH - H2O 51,0 DCM : MeOH = 25 : 1 0,51 251,0-251,9

Như vậy từ kết quả chạy sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy của 4

dẫn chất IVa-d có thể khẳng định các dẫn chất tổng hợp được là tinh khiết và có thể

sử dụng để đo phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR

3.1.3 Xác định cấu trúc

Dãy chất IVa-d được đem ghi phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR) và

phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon (13C-NMR) để khẳng định cấu trúc

Kết quả ghi phổ của các chất cụ thể được trình bày trong phần phân tích phổ

và phụ lục

3.1.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các dẫn chất IVa-d được trình bày trong

bảng 3.3

R

IVa-d

N O O O

NH O OH

Bảng 3.3: Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất IVa-d

Ghi chú: ν là dao động hóa trị

Nhận xét: Phổ IR của các dẫn chất IVa-d không có nhiều tín hiệu để khẳng

định chắc chắn cấu trúc của các chất Tuy nhiên, thông qua các dải hấp thụ đặc trưng có thể nhận dạng sơ bộ sự hiện diện của một số nhóm chức như O-H và N-H

trong chức acid hydroxamic, C-H mạch nhánh, C=O và C=C

3.1.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS)

Kết quả phân tích phổ khối lượng của các dẫn chất IVa-d được trình bày

NH O OH

R

IVa-d

N O O O

NH O OH