Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của n hydroxy 4 (3 methoxyimino 2 oxo 1 indolinyl) methylcinnamamid và một số dẫn chất

Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, thử tác dụng sinh học của các acid hydroxamic mới với sự thay đổi nhóm nhận diện bề mặt dự

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám ơn

chân thành đến GS.TS Nguyễn Hải Nam và TS Phan Thị Phương Dung - Bộ môn

Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn

và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến DS Đỗ Thị Mai Dung và các anh chị kỹ

thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược

- Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè

đã luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Hà Quang Văn

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2

1.1.1 Khái niệm về histon deacetylase 2

1.1.2 Phân loại các HDAC 3

1.1.3 Cấu trúc của HDAC 4

1.1.4 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC 5

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 6

1.2.1 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 6

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 7

1.2.3 Phân loại 8

1.2.3.1 Dẫn chất benzamid 9

1.2.3.2 Các peptid vòng 9

1.2.3.3 Các acid béo mạch ngắn 10

1.2.3.4 Các dẫn chất ceton 10

1.2.3.5 Các hydroxamat và dẫn chất 11

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 15

2.1.1 Hóa chất 15

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Tổng hợp hóa học 16

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.3.1 Tổng hợp hóa học 16

2.3.2 Thử tác dụng sinh học 17

2.3.3 Đánh giá mức độ giống thuốc cuả chất tổng hợp được 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 HÓA HỌC 20

3.1.1 Tổng hợp hóa học 20

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 30

3.1.3 Xác định cấu trúc 30

3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 35

3.2.1 Thử hoạt tính sinh học 35

3.2.2 Đánh giá mức độ giống thuốc 35

3.3 BÀN LUẬN 36

3.3.1 Tổng hợp hóa học 36

3.3.2 Tác dụng sinh học 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AcOH

ALL

: :

Acid acetic Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính AML : Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính

APL

CLL

CTCL

: : :

Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính Bệnh lympho mãn tính (Chronic lymphocytic leukemia)

Tế bào lymphoT dưới da (Cutaneous T cell lymphoma)

Histon deacetylase Các chất ức chế HDAC

Phổ khối lượng Ung thư phổi tế bào không nhỏ (Non-smali lung cell) NST : Nhiễm sắc thể

SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic

T0nc : Nhiệt độ nóng chảy

TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng

TSA : Trichostatin A

3 Bảng 3.1: Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của các chất 2a-d 23

5 Bảng 3.3: Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của các chất 4a-d 29

6 Bảng 3.4: Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy của các chất 4a-d 30

7 Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ IR của các chất 4a-d 31

8 Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ MS của các chất 4a-d 32

9 Bảng 3.7: Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của các chất 4a-d 32

10 Bảng 3.8: Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của các chất 4a-d 34

11 Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 4a-d theo

13 Bảng 3.11: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

4 Hình 1.4: Quá trình điều hòa sự sống sót và phát triển của tế bào

9 Hình 1.9: Các chất ức chế HDAC có cấu trúc hydroxamat 11

12 Hình 1.12: Dẫn chất N‑hydroxycinnamamid của nhóm nghiên

13 Hình 1.13: Dẫn chất cinnamic mang nhóm urea/thiourea 14

14 Hình 3.1: Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế HDAC của các

15 Hình 3.2: Biều đồ so sánh tác dụng kháng tế bào ung thư của

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Các nghiên cứu về HDAC đã chỉ ra rằng, HDAC có liên quan đến nhiều loại bệnh ung thư do chúng có thể gây ra những sai khác trong quá trình phiên mã tạo điều kiện cho sự hình thành khối u Vì vậy, một số nhà khoa học đã và đang tập trung nghiên cứu các chất ức chế HDAC và thu được rất nhiều kết quả khả quan

Belinostat là một chất ức chế HDAC rất tiềm năng Kết quả thử nghiệm trên lâm sàng với 129 bệnh nhân cho thấy, có 25,8% bệnh nhân không còn triệu chứng hoặc các triệu chứng thuyên giảm sau khi điều trị [15,34,37] Đến năm 2014, cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) đã cho phép sử dụng belinostat (Beleodap®) trong điều trị ung thư

Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, thử tác dụng sinh học của các acid hydroxamic mới với sự thay đổi nhóm nhận diện bề mặt dựa trên cấu trúc của chất dẫn đường belinostat

Khóa luận: “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

Cấu trúc của nhiễm sắc thể là một phức hợp gồm: ADN, các histon và protein không phải histon Histon là các protein cơ bản giàu acid amin như: lysin, arginin Đơn vị cấu trúc cơ bản của NST là nucleosom Một nucleosom điển hình bao gồm một octamer hình đĩa của 4 cặp histon (2 cặp của H2A với H2B và 2 cặp của H3 với H4) được quấn quanh bởi 146 cặp nucleotid [1,38] (hình 1.1):

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo nucleosom

Quá trình dịch mã và tổng hợp protein xảy ra khi nhiễm sắc thể được tháo xoắn

và ngược lại Quá trình này liên quan đến hoạt động của 2 emzym histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT)

1.1.1 Khái niệm về histon deacetylase

Histon deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl

từ -N acetyl lysine amino acid của histon, dẫn đến nhiễm sắc thể bị đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã HDAC có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase (HAT)

- enzym xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến -amino của lysin ở đầu N của histon [40]

Hình 1.2: HAT và HDAC điều hòa quá trình phiên mã

1.1.2 Phân loại các HDAC

Có 18 HDAC ở người được chia thành 4 nhóm dựa trên sự tương đồng cấu trúc của chúng lần lượt với Rpd3, Hdal và Sir2 trong nấm men [17]

Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8

Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10

Nhóm III: Các protein điều hòa chuỗi thông tin bao gồm:

- Chất đồng đẳng của Sir2 trong nấm men Saccharomyces cerevisiae

- Sirtuin trong động vật có vú (SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5,

cơ chế hoạt động của chúng phụ thuộc vào NAD+ như 1 cofactor thiết yếu [32].Thuật

ngữ các chất ức chế HDAC thường được sử dụng cho những hợp chất nhằm mục tiêu vào các HDAC kinh điển và những hợp chất này đang được đánh giá dựa trên các thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau

1.1.3 Cấu trúc của HDAC

Việc xác định cấu trúc của HDAC rất cần thiết để xác định cơ chế tác dụng của HDAC, đồng thời dựa vào cấu trúc HDAC để thiết kế công thức các chất ức chế HDAC Hiện nay, bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X người ta đã xác định được cấu trúc 3D của hầu hết các HDAC và trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl của chúng

Các HDAC đều có trung tâm hoạt động gồm hai phần chính:

- Ion Zn2+: là coenzym của HDAC, nằm ở đáy kênh enzym Trong phân tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 5 liên kết phối trí: 4 liên kết với nguyên tử oxy và nito của các acid amin, một liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl trong phân tử acetyl-lysin ở phần đầu N của histon, từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl [6]

- Kênh enzym: có dạng túi hình ống với kích thước hẹp, tạo liên kết Van Der Walls với cơ chất Túi được cấu tạo từ các acid amin thân lipid Đáy túi có một vài phân

tử làm nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deacetyl hóa và tham gia tạo liên kết hydro khi không có mặt nhóm –OH của tyrosin Cấu trúc túi khá linh động, có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl hóa [6]

Hình 1.3: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC

1.1.4 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC

Đuôi histon thường mang điện tích dương do các nhóm amin trên các axit amin: lysin và arginin Các điện tích dương giúp đuôi histon tương tác và liên kết với các nhóm phosphate tích điện âm trên ADN Acetyl hóa trong tế bào trung hòa điện tích dương dẫn đến nhiễm sắc thể được tháo xoắn, cho phép quá trình sao chép di truyền xảy ra Quá trình này chịu sự điều khiển của HAT Ngược lại, HDAC xúc tác loại bỏ nhóm acetyl từ histon và protein không phải histon, làm tăng sự tích điện dương trên

đầu N của histon và đóng xoắn NST, kết quả là ức chế quá trình phiên mã do ngăn

cản các nhân tố sao mã tiến đến đích của chúng trên ADN Như vậy sự acetyl hóa và deacetyl hóa NST đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen Việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có thể dẫn đến những bất thường biểu hiện gen và do đó dẫn đến ung thư [13,23,25,27,30]

HDAC đã được xác định bị rối loạn điều hòa trong ung thư Sự huy động bất thường của các HDAC vào chuỗi điều hòa của gen đích có thể xảy ra thông qua tương tác biến đổi của chúng với việc tăng cường vai trò của các protein gắn kết ADN gây ung thư Ví dụ như receptor α-RAR gắn kết gen PML (promyelocytic leukemia gen) hoặc PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger) trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL) Trong điều kiện sinh lý, α-RAR là nhân tố sao mã hoạt hóa acid retinoic giúp giải phóng phức hợp đồng ức chế chứa HDAC và làm gia tăng các chất đồng hoạt hóa sao mã (bao gồm cả HAT) Điều này dẫn đến sự acetyl hóa histon và ức chế gen đẩy mạnh sự biệt hóa tế bào Trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL), protein gắn kết α-RAR/PML hoặc α-RAR/PLZF giữ HDAC và phối hợp với phức hợp đồng

ức chế Do đó tăng methyl transferase histon và ADN dẫn đến ngăn cản sự phiên mã [13,14,22]

Vì vậy, tế bào ung thư không trải qua giai đoạn biệt hóa và phát triển quá mức

Sự gia tăng bất thường của HDAC còn được quan sát khi gen đột biến gây ung thư Bcl6 được biểu thị quá mức trong bệnh u lympho tế bào B [5] Tương tự, protein gắn kết AML1-ETO tìm thấy trong bệnh bạch cầu tủy bào cấp (AML) có chức năng như chất ức chế sao mã chủ yếu thông qua ETO, nên có vai trò như vị trí gắn kết cho phức

hợp đồng ức chế N-Cor/Sin3/HDAC1 Việc chuyển đổi AML1 từ chất hoạt hóa phiên

mã thành chất ức chế được điều khiển bởi protein gắn kết CBFb-SMMHC thông qua

sự gia tăng phức hợp đồng ức chế mSin3A/HDAC

Cuối cùng, biểu thị quá mức nhân tố sao mã SCL/Tal1 trong bệnh u lympho tế bào T cấp có nguyên nhân là do gia tăng bất thường HDAC1 nằm trong phức hợp đồng ức chế, dẫn đến ngăn cản gen đích điều hòa E47/HEB [11]

Biểu thị quá mức HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6 còn gặp trong một

số bệnh ung thư tạng đặc như ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ dày, trực tràng, ung thư vú và ung thư não [18,33] cũng như trong các bệnh lý ác tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T ngoại vi, bệnh u lympho

tế bào B và bệnh u lympho da tế bào T [29] Hơn nữa, việc tìm ra các cơ chất của HDAC là các protein như p53, E2F, Rb, Bcl6, Gli1 liên quan đến xu hướng gây ung thư và tiến triển bệnh ung thư đã khẳng định vai trò của HDAC trong ung thư [9,29] Tóm lại, các biến đổi sau phiên mã của HDAC có thể làm thay đổi tương tác của chúng với phức hợp đồng ức chế mà các phức hợp này liên quan đến quá trình phiên

mã của các gen gây ung thư

Như vậy ức phiên mã được điều hòa bởi sự ra tăng HDAC và có thế kiểm soát ung thư bằng cách ức chế hoạt động của HDAC Các chất ức chế HDAC đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu nhằm tìm ra chất có tác dụng ức chế chọn lọc từng loại HDAC để ứng dụng trong điều trị ung thư

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng trong chu trình

tế bào làm mất sự điều hòa trong tế bào ác tính Trong đó, yếu tố quan trọng nhất quyết định hoạt tính của các chất ức chế HDAC là khả năng thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào [2]

Hình 1.4: Quá trình điều hòa sự sống sót và phát triển của tế bào bởi các chất ức

chế HDAC [22]

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC được chia thành nhiều nhóm khác nhau nhưng nhìn chung về cấu tạo gồm 3 phần chính:

- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt: thường là

các aryl hay một số vòng khác, nằm trên bề mặt enzym

- Vùng cầu nối sơ nước: thường là mạch hydrocacbon thân dầu liên kết Van der

Waals với kênh enzym

- Nhóm kết thúc gắn với ion Zn2+: gồm acid hydroxamic, thiol, nhóm aminoanilin của benzamid… quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của các chất ức chế HDAC

o-Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC cho thấy nhóm kết thúc, cầu nối và một phần của nhóm khóa hoạt động nằm trong túi enzym làm lấp đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động tương tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym Nhóm nhận diện bề mặt có thể liên kết với phần cầu nối thông qua một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp phần cải thiện dược động học cho các chất ức chế HDAC Việc nghiên cứu thiết kế cấu trúc các chất mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này

Hình 1.5: Cấu trúc của chất ức chế HDAC

1.2.3 Phân loại

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng

Ghi chú: NSCLC: carcinom tế bào phổi không nhỏ; AML: ung thư bạch cầu tủy bào cấp; MDS:

hội chứng loạn sản tủy; CTCL: u lympho da tế bào T; ALL: ung thư bạch cầu cấp; CLL: ung thư bạch cầu mãn

Nhóm Hợp chất Pha Loại ung thư

Các benzamid SNDX-275

CI-994 MGCD-0103

I, II

I, II

II

Tạng đặc, u lympho, AML Tạng đặc, NSCLC, tế bào thận,tụy Tạng đặc, ung thư bạch cầu, MDS

Peptid vòng Depsipeptid (FK228) I, II Tạng đặc, CLL, AML, u đa tủy xương,

NHL tế bào T ngoại vi, RAI kháng thyroid, ung thư đại tràng tiến triển

Acid carboxylic Butyrat

AN-9 (tiền thuốc) Acid valproic Phenyl butyrat

Tạng đặc, AML/MDS

Acid

hydroxamic

SAHA Belinostat NVP-LAQ824 LBH-589 ITF-2357 SB-939 CRA 024781 JNJ-16241199

Theo cấu trúc hóa học, các chất ức chế HDAC được chia thành 5 nhóm chính gồm: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamind và các dẫn chất ceton Mỗi nhóm có những hạn chế riêng: các hydroxamic bị chuyển hoác nhanh và

ức chế không chọn lọc các HDAC, các benzamid và acid béo có hiệu lực hạn chế, dẫn chất ceton bị khử hóa trong huyết tương, trong khi đó các peptid vòng có cấu trúc quá phức tạp

Về nguồn gốc, các chất ức chế HDAC có thể có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp Nhưng đa phần, chúng được tổng hợp bằng hóa học

Cho đến nay, FDA đã cấp phép lưu hành trên thị trường ba chất ức chế HDAC

để điều trị u lympho tế bào T dưới da là SAHA (vorinostat, Zolinza®), depsipeptid (Romidepsin®) và Belinostat (Beleodaq®) Điều này cho thấy tiềm năng của các chất

ức chế HDAC trong điều trị ung thư, đồng thời là nguồn động lực thúc đẩy các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu tìm ra các chất ức chế HDAC mới.

1.2.3.1 Dẫn chất benzamid

Nhóm này bao gồm một số chất: MS-275, MGCD-103 Chúng có hoạt tính kém hơn các acid hydroxamic và các peptid vòng, ức chế HDAC ở nồng độ micromol [21]

Hình 1.6: Các chất ức chế HDAC là các benzamid 1.2.3.2 Các peptid vòng

Đây là nhóm các chất ức chế HDAC có cấu trúc phức tạp nhất, có tác dụng ức chế HDAC mạnh tương tự như các acid hydroxamic gồm: depsipeptid (FK-288), apicidin, trapoxin A… và các CHAP

Hình 1.7: Các chất ức chế HDAC có cấu trúc vòng peptid 1.2.3.3 Các acid béo mạch ngắn

Nhóm này gồm một số chất như: acid valproic, natributyrat, phenylbutyrat Tác dụng ức chế HDAC của chúng gần đây mới được quan tâm đến Nhược điểm lớn nhất của nhóm này là đáp ứng hạn chế trên lâm sàng do thời gian bán thải ngắn và nồng

1.2.3.5 Các hydroxamat và dẫn chất

Depsipeptid và SAHA là hai chất đầu tiên trong nhóm các hydroxamat đã được FDA cho phép sử dụng trên lâm sàng để điều trị ung thư và là cơ sở so sánh để đánh giá tác dụng ức chế HDAC cho các chất mới được nghiên cứu

Các chất ức chế HDAC là dẫn chất của acid hydroxamic có thể chia thành một

số nhóm nhỏ như sau: acid hydroxamic mạch thẳng, dẫn chất cinamic, dẫn chất phenyl Đặc trưng của nhóm này là acid hydroxamic dễ tạo phức với ion Zn2+ của HDAC nên ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II và bị chuyển hóa nhanh [12,28]

Hình 1.9: Các chất ức chế HDAC có cấu trúc hydroxamat

Năm 1990, Yoshida và cộng sự đã phát hiện ra dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên có tác dụng ức chế HDAC là trihchostatin A (TSA) Kể từ đó tới nay, dựa trên những hiều biết về mối liên quan giữa HDAC và ung thư, đồng thời việc xác định được cấu trúc 3D của các HDAC đã tạo điều kiện cho các nhà khoa học nghiên cứu và tổng hợp được nhiều chất ức chế HDAC mới Một số chất đang được thử nghiệm trên lâm sàng cho kết rất tốt,có thể ứng dụng trong điều trị ung thư

Năm 2003, nhóm các N-hydroxy-2-propenamid được Kim D và cộng sự [24]

thiết kế và tổng hợp dựa trên cơ sở nghiên cứu cấu trúc của TSA và oxamflatin Các chất này có tác dụng ức chế HDAC yếu hơn TSA song tương tự oxamflatin

Năm 2007, các dẫn chất ω-alkoxy của SAHA do nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm nghiên cứu Sigma-Tau (Pomezia, Ý) thiết kế và tổng hợp [19] Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC2 cho thấy tất cả các dẫn xuất đều cho giá trị IC50 ở mức rất thấp (0,05 - 0,5 µM)

Năm 2009, dựa trên cấu trúc của SAHA, nhóm nghiên cứu của công ty Topo Target (Anh) [4], đã thiết kế và tổng hợp các amind ngược Nhiều chất trong đó có tác dụng ức tương đương hoặc mạnh hơn chất ban đầu

Năm 2013, nhóm nghiên cứu của bộ môn hóa dược trường đại học dược Hà Nội [31], đã thiết kế và tổng hợp được các dẫn chất acid hydroxmic mang hợp phần khung benzothiazol, trong đó có nhiều dẫn chất cho kết quả rất khả quan

Hình 1.10: Các acid benzothiazol - hydroxamic

Bên cạnh các chất ức chế HDAC mang cấu trúc hydroxamat được nghiên cứu dựa trên các chất “kinh điển” như TSA, SAHA thì nhóm các dẫn chất cinnamic cũng được các nhà khoa học rất quan tâm Trong đó phải kể đến belinostat (PXD 101), một chất ức chế HDAC đã được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị da tế bào lympho T [16]

Hình 1.11: Cấu trúc của belinostat (PXD 101)

Nghiên cứu dựa trên cấu trúc khung của belinostat (PXD 101), nhóm nghiên cứu hóa dược trường đại học Shandong (Trung Quốc) hợp tác cùng với phòng nghiên cứu phát triển thuốc của đại học Y Nam Carolina (Mỹ) [39], đã thiết kề và tổng hợp được dãy N-hydroxycinnamamid chứa nhóm nhận diện bề mặt là nhân indol Kết quả

nghiên cứu in vitro cho thấy có nhiều chất có tác dụng ức chế HDAC rất tốt

Bảng 1.2: Tác dụng ức chế HDAC của một số dẫn chất

N‑hydroxycinnamamid mang nhân indol

Tiếp tục nghiên cứu, nhóm nghiên cứu thay thế các gốc R khác nhau của dẫn chất N‑ hydroxycinnamamid mang nhân indol để tìm dẫn chất có tác dụng tốt hơn, kết quả đã phát hiện một dẫn chất có tác dụng ức chế HDAC rất mạnh, được đánh giá

mạnh nhất tại thời điểm đó khi thử nghiệm trong in vitro [36]

Hình 1.12: Dẫn chất N‑hydroxycinnamamid của nhóm nghiên cứu Shangdong

Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu của khoa dược, trường đại học Nam Trung (Trung Quốc) [10], cũng thiết kế và tổng hợp dãy các dẫn chất cinnamic mang nhóm urea/thiourea Kết quả thử hoạt tính cho thấy có 1 số chất trong nhóm có hoạt lực mạnh hơn belinostat

Hình 1.13: Dẫn chất cinnamic mang nhóm urea/thiourea

Qua việc tìm hiểu về các chất ức chế HDAC đã được biết đến và tình hình nghiên cứu về các chất ức chế HDAC có thể rút ra một số nhận xét sau:

- Cấu trúc của các chất ức chế HDAC rất đa dạng, chứng tỏ cấu trúc trung tâm hoạt động dạng túi của HDAC rất linh động

- Các peptid vòng có tác dụng ức chế mạnh các HDAC ở nồng độ nanomol nhưng cấu trúc của chúng lại quá phức tạp gây khó khăn cho sản xuất và bán tổng hợp chúng

- Các benzamid có cấu trúc đơn giản hơn nhiều nhưng hoạt tính của chúng lại không cao

- Các acid béo mạch ngắn và ceton ái điện tử có ưu điểm là cấu trúc đơn giản nhưng hoạt tính yếu và đáp ứng chậm trên lâm sàng

- Các acid hydroxamic là nhóm chất ức chế HDAC có hoạt tính mạnh, đồng thời cấu trúc khá đơn giản Vì vậy đây là một hướng nghiên cứu quan trọng cần được quan tâm đặc biệt

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

Các hóa chất dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm Bao gồm:

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 mL có nút mài, bình nón, pipet, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy cất quay chân không Buchi R-200

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu

- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm, bể điều nhiệt

- Bản mỏng silicagel Merck 70 – 230 mesh

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Melting point Apparatus Smp3)

- MáyPerkin Elmer

- Máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất tổng hợp được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt

độ nóng chảy

2.3.2 Thử tác dụng sinh học

2.3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá bằng 2 phương pháp:

- Đánh giá theo phương pháp Western blot:

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng (SW620) Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng Chi tiết cách tiến hành được dựa trên phương pháp đã được công bố trước đây[35]

- Định lượng nồng độ enzyme HDAC2 bị ức chế:

Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Phân tích dựa trên phương pháp huỳnh

quang trên đĩa 96 lỗ, sử dụng bộ kit định lượng enzym HDAC2 (Flour de Lys®-Green

- ENZO LIFE SCIENCES) Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của

bộ KIT thử nghiệm

Tóm tắt các bước như sau: Enzym HDAC2 được ủ với cơ chất tripeptid có gắn flourescence ở nồng độ 30 ng/µL và hòa tan trong 50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), 138 mM NaCl, 10% glycerol, pH 8,0 Phản ứng deacetyl hóa được tiến hành trong dung dịch đệm chứa 50 mM TRIS/Cl,

pH 8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1mM MgCl2 Enzym HDAC2 và cơ chất hòa tan trong dimethyl sulfoxid (DMSO) được trộn lẫn trong giếng và ủ ấm Phần huỳnh quang sẽ được tách ra sau deacetyl hóa Cường độ huỳnh quang được đo bằng thiết

bị đọc đĩa huỳnh quang (flourometric plate reader) Dữ liệu được phân tích và tính toán để xác định nồng độ mẫu thử tối thiểu có thể ức chế được 50% hoạt động của enzym HDAC2, từ đó tính được giá trị IC50 Dữ liệu được phân tích và tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism Trong phép thử này, sự sai lệch mật độ huỳnh quang

giữa các lần đo không quá 10%

2.3.2.2 Thử độc tính tế bào

* Nguyên tắc thử

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện

tại Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB và giá trị IC50 được tính trên phương pháp probit

Dòng tế bào thử nghiệm: SW 620 (ung thư đại tràng), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), AsPc-1 (ung thư tuyến tụy)

Thiết bị, huyết thanh và các thuốc thử được sử dụng cho việc nuôi cấy tế bào được cung cấp từ công ty GIBCO (Grand Island, New York, USA)

Các tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp SRB theo các bước sau:

Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS và chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 9.103 µL Các đĩa sau đó được ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2 Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 µL môi trường RPMI bổ sung

10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2

µL mẫu thử vào các giếng có nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu thử được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1% Đem cố định với TCA (tricloroacetic acid)

Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 µL thuốc nhuộm SRB (sulforhodamineB) với nồng độ SRB là 5 mg/mL trong dung dịch đệm Tri(hydroxymethyl)aminomethane Các đĩa được ủ thêm 30 phút ở 37oC trong điều kiện 5% CO2 Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100 µL dung dịch DMSO, để 5 phút để hòa tan Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm

* Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp probits Trong phương pháp thử này,

IC 50 ≤ 20 µg/mL được coi là có hoạt tính

2.3.3 Đánh giá mức độ giống thuốc cuả chất tổng hợp được

Tính giá trị logP của các chất tổng hợp được bằng phần mềm EPIsuite cung cấp bởi US Environment Protection Agency’s Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC) Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP

Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinski [26]:

- Khối lượng phân tử của chất không lớn hơn 500g/mol

- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10

- Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5

- Giá trị của logP của chất không lớn hơn 5

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ chung như sau (sơ đồ 3.1):

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung

Tác nhân và điều kiện: i) O-methylhydroxylamine hydroclorid, triethylamin, ethanol, đun hồi lưu

70 o C, 12h; ii) methyl 3-(4-(bromomethyl)phenyl)acrylate, K 2 CO 3 , DMF, tiến hành ở 30 o C/24h; iii)Methanol, NH 2 OH.HCl, NaOH, -5 o C, 30 phút

3.1.1.1 Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất (2a-d)

a Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2a):

Quy trình tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin (2a) được thực hiện theo

sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất 2a

 Tiến hành:

- Cân 0,29 g (2 mmol) isatin, hòa tan trong 5ml ethanol khan trong bình cầu

- Thêm lần lượt 0,20 g (2,4 mmol) methylhydroxylamin HCl và 2,4 ml triethylamin 1M vào bình cầu trên (bình cầu đặt trong nước lạnh)

- Khuấy hỗn hợp phản ứng ở 70oC trong 12h

 Xử lý:

- Chuyển từ từ hỗn hợp phản ứng vào 20ml nước lạnh để tạo tủa

- Lọc, rửa tủa bằng nước cất, sấy ở 60oC

Bảng 3.1: Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của các chất 2a-d

- Cân 0,26 g (1,5 mmol) chất 2a hòa tan với 1ml DMF (dimethylformamid)

trong bình cầu, thêm 0,27 g K2CO3, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 30-45 phút

- Hòa tan 0,38 g (1,5 mmol) methyl 3-(4-(bromomethyl)phenyl)acrylat trong 1ml DMF, sau đó nhỏ từ từ vào bình phản ứng

- Phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ phòng trong 24h

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1)

 Xử lý:

- Làm lạnh bình phản ứng, thêm 5ml nước cất

- Trung hòa bằng dung dịch acid HCl 5% đến pH trung tính để tạo tủa

- Lọc và rủa tủa bằng nước cất

- Sấy tủa ở 60oC, thu được chất 3a

Quy trình tổng hợp methyl

3-(4-((5-floro-3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat (3b) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:

Quy trình tổng hợp methyl

3-(4-((5-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat (3c) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:

Quy trình tổng hợp methyl

3-(4-((7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindol-1-yl)methyl)phenyl)prop-2-enoat (3d) được tiến hành theo sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.9: Quy trình tổng hợp chất 3d

 Tiến hành: tương tự quy trình tổng hợp của chất 3a với chất ban đầu là

7-cloro- 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin 0,58g (1,5 mmol)

 Kết quả:

- Cảm quan: bột màu vàng đậm

- Hiệu suất: 78,15%

- Cân 0,35 g (1 mmol) chất 3a rồi hòa tan trong 3 ml MeOH Sau đó, nhỏ từng

giọt vào bình phản ứng Khuấy hỗn hợp phản ứng trong 2h, ở nhiệt độ -5oC

- Tiến hành phản ứng cho đến khi hết ester 3a

- Theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách thử với dung dịch FeCl3 5% và chạy TLC, cụ thể làm như sau:

+ Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5% Nếu xuất hiện màu đỏ vang

chứng tỏ đã có acid hydroxamic được tạo ra

+ Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH : AcOH (90:10:1) Kết thúc

phản ứng khi kết quả cho thấy đã phản ứng hết lượng ester 3a ban đầu

 Xử lý:

- Cất quay loại bớt dung môi

- Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dd HCl 10% đến pH khoảng 6, tạo tủa, lọc rửa tủa bằng nước cất

- Sấy khô ở 60oC, thu sản phẩm

- Kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi MeOH : H2O , thu sản phẩm

Bảng 3.3: Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của các chất 4a-d

4a H 351,0 C19H17O4N3 Đỏ gạch 56,00

4b 5-F 369,0 C19H16O4N3F Đỏ cam 50,52

4c 5-Cl 385,5 C19H16O4N3Cl Đỏ đậm 49,90

4d 7-Cl 385,5 C19H16O4N3Cl Đỏ đậm 55,12