Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 184 213

Tuy nhiên, ngày nay với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp hoặc bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên chloramphenicol, tổng hợp nhân tạo các chất có hoạt tính kháng sinh

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

đỡ tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận này

Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy, cô giáo, cán bộ công nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập nghiên cứu tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã giú đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian thực hiện khóa luận có hạn và trình độ của bản thân còn hạn chế nên khóa luận này còn nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô và các bạn để khóa luận này được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội ngày 9 tháng 5 năm 2015

Sinh viên Nguyễn Thị Duyên

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh 2

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.3 Phân loại kháng sinh 3

1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh 4

1.1.5 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 5

1.2 Đại cương về xạ khuẩn 6

1.2.1 Phân loại và phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 6

1.2.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 6

1.2.3 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 7

1.3 Một số phương pháp phân lập VSV sinh kháng sinh: 8

1.3.1 Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch: 8

1.3.2 Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn VSV kiểm định : 8

1.3.3 Phương pháp làm giàu đất: 8

1.3.4 Phương pháp thêm kháng sinh vào trong môi trường phân lập: 9

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 9

1.4.1 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên: 9

1.4.2 Đột biến cải tạo giống 9

1.4.3 Bảo quản giống xạ khuẩn 9

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 10

1.5.1 Bản chất của quá trình lên men 10

1.5.2 Nhân giống VSV 10

1.5.3 Các phương pháp lên men: 11

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 12

1.6.1 Các phương pháp chiết xuất 12

1.6.2 Các phương pháp tách kháng sinh 13

1.6.3 Tinh chế kháng sinh 13

1.7 Bước đầu xác định cấu trúc kháng sinh 13

1.7.1 Phổ tử ngoại- khả kiến 13

1.7.2 Phổ hồng ngoại 13

1.7.3 Khối phổ MS 14

1.8 Một số nghiên cứu gần đây 14

1.8.1 Sản xuất kháng sinh từ Streptomyces sannanensis SU118 14

1.8.2 Phân lập, thử nghiệm, tách các thành phần kháng sinh từ Streptomyces sp SCA7 15 Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.2 Máy móc thiết bị 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.2.1 Bước đầu xác định hình thái của Streptomyces 184.213 19

2.2.2 Chọn lọc, cải tạo giống 19

2.2.3 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh 19

2.2.4 Sơ bộ xác định một số t nh chất và cấu trúc của kháng sinh 20

2.3 Tiến hành thực nghiệm 20

2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20

2.3.2 Sơ bộ xác định hình thái xạ khuẩn theo ISP 20

2.3.3 Đánh giá hoạt t nh kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 20

2.3.4 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 21

2.3.5 Sàng lọc ngẫu nhiên 22

2.3.6 Đột biến 22

2.3.7 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23

2.3.8 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của dịch 24

2.3.8.1 Xác định độ bền nhiệt 24

2.3.8.2 Xác định độ bền pH 24

2.3.9 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ 24

2.3.10 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc k lớp m ng 24

2.3.11 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 25

2.3.12 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc k cột 25

2.3.13 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 26

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 27

3.1 Sơ bộ xác định đặc điểm hình thái của Streptomyces 184.213 27

3.2 Kết quả xác định MT nuôi cấy th ch hợp: 27

3.3 Kết quả thử HTKS sau SLNN 28

3.4 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 28

3.5 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 29

3.6 Chọn MT lên men chìm 30

3.7 Kết quả chọn chủng lên men 30

3.8 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền 31

3.9 Kết quả chọn dung môi chiết suất kháng sinh 32

3.10 Kết quả sắc ký lớp m ng chọn hệ dung môi 33

3.11 Kết quả sắc ký cột lần 1 34

3.12 Kết quả SKLM chọn hệ DM lần 2 35

3.13 Kết quả sắc k cột lần 2 36

3.14 Kết quả sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 37

3.14.1 Phổ UV 37

3.14.2 Phổ hồng ngoại 37

3.14.3 Phổ khối 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

2 Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ISP International Streptomyces Project

ADN Acid 2‟- deoxyribonucleic

CW Cell wall (Thành tế bào)

L-DAP L-diaminopimelat acid

MS Mass spectrometry (Phổ khối)

MT Môi trường

MTdt Môi trường dịch thể

P mirabilis Proteus mirabilis

B.subtilis Bacillus subtilis

RAPD Random amplified polymorphic DNA

(ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Nội dung

Bảng 2.1 Các chủng VSV kiểm định

Bảng 2.2 Các môi trường d ng trong nuôi cấy xạ khuẩn

Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Bảng 2.4 Các dung môi đã sử dụng

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái Streptomyces 184.213

Bảng 3.2 Kết quả thử HTKS chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

Bảng 3.3 Kết quả thử HTKS sau sàng lọc ngẫu nhiên

Bảng 3.4 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 1

Bảng 3.5 Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần 2

Bảng 3.6 Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT2dt

Bảng 3.7 Kết quả thử độ bền nhiệt

Bảng 3.8 Kết quả thử độ bền pH

Bảng 3.9 Kết quả chọn DM và pH chiết

Bảng 3.10 Kết quả SKLM chọn hệ DM chạy sắc k cột lần 1

Bảng 3.11 Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy săc k cột lần 1

Bảng 3.12 Kết quả sắc k lớp m ng các phân đoạn sau chạy cột lần 1

Bảng 3.13 Kết quả sắc k lớp m ng các phân đoạn sau chạy cột lần 2

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Tên hình Nội dung

Hình 1.1 Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh

Hình 1.2 Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn

Hình 1.3 Khuẩn lạc xạ khuẩn

Phụ lục 1 Hình ảnh hiển vi chuỗi bào tử

Phụ lục 2 Hình ảnh hiển vi bề mặt bào tử

Phụ lục 3 Kết quả thử HTKS bằng phương pháp khối thạch

Phụ lục 4 Kết quả thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển về vi sinh vật học, sự phát minh ra kháng sinh đầu tiên là penicillin năm 1940 trở thành bước ngoặt lịch sử mở ra kỷ nguyên mới trong lĩnh vực y học Từ đây ngành công nghệ sản xuất kháng sinh được khai sinh và ứng dụng mạnh mẽ vào điều trị bệnh cho con người Mặc dù thành công vang dội trong việc tìm ra kháng sinh và sự cải tiến trong quá trình sản xuất như vậy nhưng các bệnh lý nhiễm trùng vẫn là nguyên nhân thứ hai dẫn đến tử vong trên toàn thế giới

và nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra xấp xỉ 17 triệu ca tử vong hằng năm chủ yếu trên trẻ em và người già Việc tự ý sử dụng và lạm dụng kháng sinh là một yếu tố quan trọng tạo ra t nh kháng kháng sinh Do đó việc nghiên cứu và phát triển các kháng sinh mới có hiệu quả cao, ít bị kháng và độc tính thấp đang trở thành nhu cầu tất yếu đối với nền y học thế giới, trong đó có Việt Nam- một quốc gia đang phát triển

có tỉ lệ nhiễm tr ng cũng như tỉ lệ kháng kháng sinh rất cao

Hiện nay khoảng 80% các loại kháng sinh được sinh tổng hợp từ

Streptomyces Nước ta có môi trường khí hậu đa dạng là điều kiện cho nhiều loại vi

sinh vật phát triển, trong đó có rất nhiều xạ khuẩn, đặc biệt là xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces Với thực trạng nước ta hiện nay nhu cầu sử dụng kháng sinh rất lớn

trong khi đó ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh còn chưa phát triển, hầu hết kháng sinh trên thị trường là nhập khẩu( dạng thành phẩm hoặc bán thành phẩm) Đây là một hướng nghiên cứu tìm ra kháng sinh mới từ đó đưa vào sản xuất, điều

trị Do đó tôi đã chọn đề tài “ Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces

184.213” làm khóa luận với các mục tiêu sau:

 Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

 Xác định các điều kiện tối th ch để lên men, chiết tách kháng sinh

 Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1 Lược sử nghiên cứu kháng sinh

Năm 1928, Alexander Flemming( 1881-1955), một nhà khoa học người

Scotland, lần đầu tiên thấy trong môi trường tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm Penicillium notatumthì khuẩn lạc gần nấm sẽ không phát triển được Nhưng phải hơn 10 năm

sau, năm 1940 một nhóm nhà khoa học mới tách chiết thành công được chế phẩm penicillin Năm 1941, nhóm đã chọn được loại nấm Penicilin ưu việt nhất là chủng

Penicilium chrysogenium, chế ra loại penicillin có hoạt t nh cao hơn cả triệu lần

penicillin do Flemming tìm thấy lần đầu năm 1928 Đây được coi là một trong

những thành tựu vĩ đại nhất thế kỉ XX

Từ đây thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu Hàng loạt kháng sinh mới có giá trị trong y học được ra đời như :Streptomycin( Selman Waksman và Albert Schatz năm1934), Cephalosporins( năm 1945)…

Ở Việt Nam, người đầu tiên nghiên cứu kháng sinh là GS Đặng Văn Ngữ

Ông đã lấy dịch nuôi cấy nấm Penicillium và để rửa vết thương cho thương binh

trong chiến dịch Đông Xuân 1951-1952

Tiếp theo năm 1968, một đơn vị nghiên cứu kháng sinh ở trường Đại học Dược khoa Hà Nội đã được thành lập do GS Trương Công Quyền phụ trách Tại đây đã phân lập được hàng nghìn chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau

Từ năm 1974, tại Viện Khoa học Việt Nam ( nay là Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) đã có một nhóm nghiên cứu về kháng sinh Nhiều chủng VSV cho kháng sinh có hoạt tính mạnh được ứng dụng trong bảo vệ động vật, thực vật Một

số chế phẩm kháng sinh : Tetravit, biovit, bacitracin đã được sản xuất và đưa vào sử dụng trong chăn nuôi.[8]

1.1.2 Định nghĩa kháng sinh

Kháng sinh, theo quan niệm hẹp là: bất kì sản phẩm từ VSV nào mà ngay cả

ở nồng độ thấp (µm/ml) cũng có thể kìm hãm hoặc tiêu diệt các VSV khác( nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) một cách chọn lọc Thuật ngữ antibiotic bắt nguồn từ

chữ Hy Lạp, “anti” là kháng lại, “biotic” là sự sống Tuy nhiên thuật ngữ này không phản ánh đúng t nh chất của kháng sinh Đã có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh

Tuy nhiên, ngày nay với sự phát triển của khoa học, người ta có thể tổng hợp hoặc bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên( chloramphenicol), tổng hợp nhân tạo các chất có hoạt tính kháng sinh ( sulfamid, quinolon)- nên định nghĩa về kháng sinh trong y học hiện đại đã được mở rộng

Tóm lại, hiện nay kháng sinh được định nghĩa như sau :Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn khác có hoạt tính sinh học cao,

có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọ lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa ) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [4,10]

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách khác nhau để phân loại kháng sinh :

 Phân loại theo nguồn gốc : Kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, kháng sinh có

nguồn gốc bán tổng hợp, tổng hợp

 Phân loại theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh: kháng sinh diệt

khuẩn , kháng sinh kìm khuẩn

 Phân loại theo cơ chế tác dụng: Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ức chế

tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nucleic, ức chế chuyển hóa, thay đổi tính

thấm của màng tế bào

 Phân loại theo cấu trúc hóa học : Đây là cách phân loại khoa học nhất vì nó

được sử dụng phổ biến Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia

ra các nhóm:[9,10]

 Nhóm có cấu trúc β-lactam:

- Penicilin: benzylpenicilin, oxacilin,

 Nhóm có cấu trúc aminoglycosid (aminosid): streptomycin, gentamycin…

 Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromycin, spiramycin…

 Nhóm lincosamid: lincomycin, clindamycin

 Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol

 Nhóm có cấu trúc 4 vòng: tetracycline, doxycyclin…

 Nhóm peptid:

- Glucopeptid: vancomycin

- Polypeptide: polymycin, bacitracin

 Nhóm ansamycin : rifamycin, rifampicin

 Nhóm antracyclin:, daunorubicin

 Nhóm actinomycin: dactinomycin D

 Nhóm kháng sinh polyen :nystatin, amphotericin B

 Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin, ofloxacin…

 Nhóm co- trimoxazol: co- trimoxazol

1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh

 Lĩnh vực y học kháng sinh được d ng điều trị và dự phòng các bệnh nhiễm

tr ng Ngoài ra kháng sinh còn được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác :

 Trong trồng trọt:để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng Kháng sinh còn được dùng kích thích hạt nảy mầm

Vd :Ningnamycin d ng để trừ các bệnh đạo ôn, khô vằn, bạc lá, lép hạt, thối mạ, hoa cúc, mốc xám; đốm lá trên bắp cải, cải xanh, héo rủ lở cổ rễ trên cà chua, thối quả trên xoài, vải, nhãn, nho; vàng lá trên hoa cúc

 Trong chăn nuôi: điều trị các bệnh nhiễm tr ng động vật

Vd: Doxyvet ( doxycyclin) đặc trị viêm phổi, viêm ruột, thương hàn, tụ huyết

tr ng ở lợn, bò

 Trong công nghiệp thực phẩm : bảo quản thực phẩm nhờ tác dụng diệt VSV trong thực phẩm [5]

1.1.5 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh

Lọc, ly tâm

Cô, tinh chế

Kiển nghiệm

Đóng gói

Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh

Giống xạ khuẩn truyền ủ trong phòng thí nghiệm nghiệmnghiệm nghiệm

Bình nhân giống quy mô thí nghiệm

Nhân giống trong thiết bị nhân giống

Lên men tổng hợp kháng sinh

1.2 Đại cương về xạ khuẩn

1.2.1 Phân loại và phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn ( Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật ( Eubacteria), là các vi

khuẩn Gr+, có tỉ lệ G+C trong ADN trên 55% Đại đa số xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu kh , hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh Trong số khoảng 1000 chi và

5000 loài sinh vật nguyên thủy đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ

khuẩn Trong đó có khoảng 478 loài được công bố thuộc chi Streptomyces, hơn 500

loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào loại xạ khuẩn hiếm

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, bùn, nước, và trong các hợp chất hữu cơ có sẵn, thậm ch trong cả những cơ chất mà vi khuẩn và nấm không phát triển được Nhưng chủ yếu phân bố nhiều ở trong đất Phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ ẩm, thành phần của đất, mức độ canh tác, Đất giàu hữu cơ, khoáng, và lớp bề mặt có nhiều m n thường có nhiều xạ khuẩn hơn.Theo Waksman trong 1gam đất có khoảng 29.000-2.400.000 CFU xạ khuẩn, chiếm 9-45% tổng số VSV [22]

Trong số hơn 16000 kháng sinh đã được biết trên thế giới thì khoảng 55-60%

do xạ khuẩn tạo ra Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase, cellulose, protease ) Ngoài ra xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong tự nhiên như: tham gia vào các quá trình phân hủy, chuyển hóa các chất trong đất

[13,17]

1.2.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

 Xạ khuẩn có hệ khuẩn ty phát triển thành sợi, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh

Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty kh sinh Đường kính của khuẩn ty thay đổi từ 0,3-1,0 µm đến 2-3 µm Khuẩn ty của xạ khuẩn phân nhánh, không có vách ngăn và không bị đứt đoạn Màu sắc của khuẩn ty rất phong phú: trắng, vàng, da cam, xám, nâu, đen đ [6,14,19]

- Khuẩn ty cơ chất : mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra MT một số

loại săc tố, có loại tan trong nước, có loại phụ thuộc pH, có loại chỉ tan trong

DM hữu cơ Chức năng chủ yếu của khuẩn ty cơ chất là dinh dưỡng [19]

- Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí Chức năng chủ yếu là sinh sản ( Hình 1.2)

Hình 1.2 : Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn

 Khuẩn lạc: là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt mà thường xù xì có dạng thô ráp, dạng phấn hoặc vôi không trong suốt, có các nếp t a ra theo hình phóng xạ.[6]( Hình 1.3)

Hình 1.3 : Khuẩn lạc xạ khuẩn

1.2.3 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces

 Đặc điểm sinh dưỡng: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có t nh oxi hóa cao

Chúng phát triển bằng cách phân giải các hydrocarbon làm nguồn cung cấp vật

chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh

bột, khử nitrat thành nitrit Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu kh , nhiệt

độ tối th ch của chúng là 25-30 ºC và pH tối th ch là 6,8-7,5 [6]

 Đặc điểm sinh sản: Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty kh sinh sẽ xuất hiên các chuỗi bào tử với rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng uốn cong, móc câu, xoắn lò xo; phân cắt thành các bào tử trần,là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn Bào tử trần có hình dạng hình cầu, bầu dục, hình trụ…bề mặt bào tử có thể nhẵn, sần s i hoặc có gai, có tóc [6]

1.3 Một số phương pháp phân lập VSV sinh kháng sinh: [10]

1.3.1 Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch:

Cân 1g cơ chất rồi hòa vào 10 ml nước vô tr ng, sau đó d ng nước pha loãng đến nồng độ mong muốn, sử dụng pipet nh 0,1 ml lên bề mặt MT thạch, d ng que chang dàn đều trên mặt thạch của hộp Petri Sau thời gian nuôi trong tủ ấm có nhiệt

độ và thời gian th ch hợp cho các nhóm VSV sẽ hình thành khuẩn lạc và d ng que cấy cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng

1.3.2 Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn VSV kiểm định :

Trên hộp Petri có môi trường dinh dưỡng và chứa sẵn VSV kiểm định, đem gieo cấy trực tiếp các „hạt‟ đất lên bề mặt thạch, để tủ ấm 24-48 giờ, mang ra quan sát Nếu xung quanh các hạt đất có vòng vô khuẩn, ta biết được trong VSV trong hạt đất có sinh ra kháng sinh chống lại VSV kiểm định Từ hạt đất đó ta tiến hành phân lập VSV sinh kháng sinh để nghiên cứu tiếp

1.3.3 Phương pháp làm giàu đất:

Đất trước khi đem phân lập VSV sinh kháng sinh được đưa vào chậu thủy tinh, giữ độ ẩm xác định- thỉnh thoảng ta lại cho them một ít VSV kiểm định vào, trộn đều Nuôi ở tủ ấm sau một thời gian đem ra phân lập theo phương pháp nêu ở mục 1.3.1 Phương pháp này dễ dàng thu được VSV đối kháng với VSV kiểm định mặc d ban đầu VSV đối kháng có trong đất rất ít

1.3.4 Phương pháp thêm kháng sinh vào trong môi trường phân lập:

Xạ khuẩn phát triển chậm hơn vi khuẩn và nấm mốc vì vậy để dễ dàng phân lập xạ khuẩn, người ta cho thêm kháng sinh chống nấm và kháng khuẩn với nồng độ 5-25 mcg/ml vào môi trường phân lập các kháng sinh thường dùng là: tetracyclin, neomycin, nystatin…

1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập từ cơ chất thiên nhiên thường có

hoạt tính không cao Ví dụ: các chủng Penicillium phân lập từ đất chỉ đạt từ

30-50đv/ml dịch nuôi cấy Vì vậy để thu được các chủng có hoạt t nh cao đưa vào sản xuất đòi h i phải tuyển chọn , cải tạo giống bằng các phương pháp khác nhau

[9,16]

1.4.1 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên:

Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có dạng chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 20-30% những chủng khác Cần phải chọn lấy dạng chủng có hoạt tính cao nhất trong ống giống

để nghiên cứu tiếp [10,17]

1.4.2 Đột biến cải tạo giống[10,14,17]

Có 3 nhóm tác nhân gây đột biến:

 Tác nhân hóa học:ethylenimin, acid nitrơ,dimethylsulphat, nitrosoguanidin,

 Tác nhân vật l : ánh sáng UV, tiaX, tia hay tia Tác nhân vật l hay được

d ng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV).Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách đột biến, thời gian và cường độ bức xạ

 Tác nhân sinh học gây đột biến gen như phage Mu, transposon

Các tác nhân vật l và hóa học với liều lượng và thời gian th ch hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các t nh trạng dẫn đến hoặc làm mất, làm giảm khả năng tạo kháng sinh(đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh mẽ(đột biến dương)

1.4.3 Bảo quản giống xạ khuẩn

 Mục đ ch của bảo quản giữ giống VSV : giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ [12,16]

 Ngày nay có nhiều phương pháp bảo quản giống, lựa chọn những phương pháp bảo quản giống tùy thuộc khả năng từng phòng thí nghiệm: [6,11]

 Phương pháp bảo quản lạnh: các chủng VSV được cấy trên MT thích hợp(dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hoặc bình nón và để trong điều kiện thích hợp cho VSV phát triển Sau đó bảo quảntrong tủ lạnh có nhiệt độ 2ºC, định kỳ cấy truyền sang sau 3-6 tháng

 Phương pháp làm khô: trộn tế bào VSV với các chất mang ( đất khô, cát, hạt)

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh

1.5.1 Bản chất của quá trình lên men

Lên men thực chất là quá trình oxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác của các enzym do VSV tổng hợp với mục đ ch cung cấp năng lượng và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men [10,16]

1.5.2 Nhân giống VSV[11]

Mục đích: Tăng số lượng tế bào VSV Giống vi sinh vật dùng trong quá trình

lên men phải là các tế bào sinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất cao nhất.Trong quy trình lên men, tùy từng chủng giống VSV khác nhau mà nhân giống theo cơ chất và môi trường nhân khác nhau Thường

có hai dạng giống: tế bào sinh dưỡng và bào tử

 Trường hợp giống là tế bào sinh dưỡng: Người ta thường chọn Mt nhân giống là MT đảm bảo cho VSV tồn tại thích hợp nhất, để với thời gian ngắn

nhất cho sinh khối VSV lớn nhất Trong trường hợp này thường chọn MT dịch thể

 Trường hợp giống là bào tử: Thông thường chọn MT đặc (nuôi cấy bán rắn: cám gạo, bột bắp, m n cưa )Nuôi cấy xạ khuẩn thường cần thời gian khá dài

để tạo bào tử Bào tử được thu hồi cho vào bình khô, có gắn miệng bình bằng paraffin, bảo quản nơi thoáng mát và sử dụng hằng năm

1.5.3 Các phương pháp lên men: [6,10]

Lên men bề mặt: Là thực hiện nuôi cấy VSV trên bề mặt cơ chất rắn, bán

rắn, hoặc l ng VSV hấp thụ các chất từ môi trường và sử dụng oxy không kh để

hô hấp trên bề mặt môi trường dinh dưỡng

 Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi h i

thiết bị phức tạp

 Nhược điểm: tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng không gian thấp, khó cơ

giới hóa tự động hóa

 Ứng dụng: ngày này chỉ sử dụng trong chọn giống và giữ giống

Lên men chìm: VSV phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường

l ng Chủng VSV cấy vào MT được phân tán khắp mọi điểm và chung quanh mặt tế bào được tiếp xúc với dịch dinh dưỡng Phương pháp này d ng cho cả VSV hiếu

kh và kị kh Đối với VSV kị kh trong quá trình lên men không cần sục kh , còn VSV hiếu kh thì phải vừa khuấy trộn vừa sục kh liên tục

 Ưu điểm: hiệu suất cao, môi trường dinh dưỡng được sử dụng triệt để, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới hóa, tự động hóa

 Nhược điểm: phải có thiết bị chuyên dụng, chi ph đầu tư lớn, đòi h i phải làm trong điều kiện vô tr ng tuyệt đối, không xử lý cục bộ được

 Ứng dụng: được sử dụng phổ biến trong công nghệ vi sinh để sản xuất kháng sinh, enzym, men bánh mì, protein đơn bào…

 Phân loại: Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính

 Lên men mẻ

 Lên men có bổ sung

 Lên men liên tục

 Lên men bán liên tục

1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men [8,12]

Sau quá trình lên men, dịch lên men thu được thường có hàm lượng kháng sinh không cao, chứa nhiều tạp chất Do đó cần tách riêng kháng sinh kh i tạp chất

và tinh chế sản phẩm để đạt được các tiêu chuẩn cần thiết Kỹ thuật chiết tách và tinh chế kháng sinh thích hợp là cho sản phẩm đạt chất lượng cao, bảo quản lâu

hơn, đồng thời làm tăng tỉ lệ thu hồi và hạ giá sản phẩm

1.6.1 Các phương pháp chiết xuất

T y theo đặc tính của loài VSV mà kháng sinh được tiết vào môi trường nuôi cấy hoặc giữ lại trong tế bào Để lựa chọn được phương pháp chiết xuất kháng sinh phù hợp phải dựa vào bản chất hóa học của kháng sinh Một số phương pháp chiết xuất:

 Chiết bằng DM hữu cơ: chuyển kháng sinh cần tách ( đang hòa tan trong dịch lọc) sang pha DM hữu cơ Khi đó DM phải th a mãn yêu cầu: rẻ tiền,

dễ kiếm, không độc, khó cháy, có tính chọn lọc cao và dễ cất thu hồi DM

 Phương pháp kết tủa :dựa trên bản chất hóa học của kháng sinh là chất hữu

cơ hay vô cơ có thể kết tủa với tác nhân phức hóa Chất kết tủa thu được bằng cách lọc hay ly tâm

 Hấp phụ bằng nhựa trao đổi ion: dựa trên bản chất hóa khọc của kháng sinh

là acid, kiềm hay hợp chất vô định hình được hấp phụ trên nhựa trao đổi ion mang điện t ch dương hay âm, sau đó sử dụng dung dịch để phản hấp phụ kháng sinh kh i nhựa

Trước khi chiết xuất kháng sinh ra kh i môi trường nuôi cấy cần phải loại sinh khối tế bào ra kh i dịch nuôi cấy bằng phương pháp lọc hay ly tâm:

 Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp lọc( giấy lọc hoặc bông) do chênh lệch áp suất Lưu pH của dịch nuôi cấy có ảnh hưởng tới việc kháng sinh đi vào môi trường nhiều hay tích tụ ở sinh khối

 Ly tâm: là phương pháp tách các chất có khối lượng riêng khác nhau, thường

là tách pha rắn kh i pha l ng nhờ lực ly tâm

1.6.2 Các phương pháp tách kháng sinh

Trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh, phương pháp sắc k được sử

dụng để tách sản phẩm Các phương pháp sắc k thường được dùng:

 Sắc ký lớp m ng: tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp

phụ(là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt rắn hấp phụ

 Sắc ký l ng trên cột: tách các chất xác định dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha Pha tĩnh được giữ trên cột, pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách

thêm liên tục lượng mới của pha động

Nguyên tắc: Quá trình hấp thụ các bức xạ tử ngoại gây ra biến đổi năng

lượng điện tử của phân tử Các điện tử ở trạng thái cơ bản E0 chuyển sang trạng thái kích thích E1, E2 Cấu trúc hóa học của phân tử chất nghiên cứu với quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ Phân tử nào có càng nhiều liên kết đôi thì sự hấp thụ càng chuyển về bước sóng dài hơn Các điện tử tham gia vào hiệu ứng này có thể là các điện tử trong liên kết đơn, liên kết bội, hệ thống thơm… hay cặp điện tử tự do không tham gia liên kết của O, N, S

1.7.2 Phổ hồng ngoại[1,18]

Nguyên tắc: năng lượng bức xạ hồng ngoại không đủ lớn đề thay đổi trạng thái năng lượng của điện tử mà chỉ đủ để thay đổi trạng thái dao động của phân tử Trong phân tử khi có nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ trên phổ IR Mỗi bước sóng hấp thụ cực

đại trên phổ IR sẽ đặc trưng cho một nhóm chức nên phổ IR được sử dụng để nhận

biết một nhóm chức đặc biệt trong phân tử

1.7.3 Khối phổ MS

Phổ khối là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối lượng của carbon 12C) hoặc bằng Dalton (1 dalton Da bằng khối lượng

của nguyên tử hydro)

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ

bộ phân tích khối trước khi đến detector Tất cả quá trình này diễn ra trong hệ thiết

bị chân không, áp suất trong hệ dao động từ 10-3 Pa đến 10-6 Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng 1 số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại

thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối [18]

Phổ khối cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các

chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất [1,2]

1.8 Một số nghiên cứu gần đây

1.8.1 Sản xuất kháng sinh từ Streptomyces sannanensis SU118[20]

Một chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ở hồ Loktak , Manipur, Ấn Độ đã

được xác định là Streptomyces sannanensis SU118 Chủng SU118 có thể phát triển

ở nhiệt độ lên đến 40ºC và pH9 với nồng độ Nacl 3% Chủng SU118 có thể sử dụng glucose, arabinose, malnitol,xylose, meso-inositol, raffinose, rhamnose, salicin,sucrose,galactose,fructose là nguồn carbon mà không sinh ra acid Chuỗi gen 16S rRNA của chủng SU118 được so sánh với các chuỗi nucleotide của các chủng

Streptomyces khác từ dữ liệu của ngân hàng gen NCBI Chủng SU118 có chuỗi gen 16S rRNA tương ứng nhất với chủng S.sannanensis HBUM174756(99%) Do đó

dựa trên các đặc đểm hình thái, sinh lý, hóa sinh và sự phân tích chuỗi gen 16S

rRNA chủng SU118 mới phân lập được xác định là S sannanensis Chủng Streptomycessannanensis SU118 sinh kháng sinh tốt nhất khi ủ ở 28ºC trong 7 ngày

sau nuôi cấy và kháng sinh được sinh ra được chiết bằng DM ethylacetat và tách

bằng SKLM.Đo và thử hoạt tính sinh học của một hợp chất có tiềm năng cho hoạt tính sau khi phân tách các thành phần từ dịch chiết DM cho kết quả là: Rf = 0,56;

ƛ max =275,0 nm và có MIC= 0,5µg/ml trên Staphylococcus aureus MTCC 96 và Staphylococcus aureus (phân lập trên lâm sàng), trong khi đó nồng độ ức chế cao nhất là 0,3 µg/ml trên Mycobacterium smegmatis MTCC 6 và Bacillus circulans

MTCC 8074 Do đó ta thấy xạ khuẩn được phân lập từ tự nhiên có tiềm năng lớn trong việc sinh tổng hợp kháng sinh, góp phần thúc đấy tìm ra kháng sinh mới

1.8.2 Phân lập, thử nghiệm, tách các thành phần kháng sinh từ Streptomyces

sp SCA7 [21]

37 chủng xạ khuẩn đã được phân lập từ mẫu đất phân lập từ 1 cánh đồng ở Vengodu, Thiruvannamalai, Tamil Nadu, Ấn độ Các chủng này được đáng giá hoạt tính kháng sinh trên 5 vi khuẩn Gr(+) và 7 vi khuẩn Gr(-) và 2 loại nấm gây bệnh Bước đầu thử nghiệm hoạt tính cho thấy, 43% các chủng xạ khuẩn có hoạt tính yếu, 16% có hoạt tính trung bình, 5% có hoạt tính tốt, và 35% không có hoạt tính Hoạt tính kháng sinh mạnh nhất thu được khi nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch thường dinh dưỡng thay đổi Dịch chiết thô được tách từng thành phần bằng sắc ký cột và được đem thử hoạt t nh kháng sinh Phân đoạn 10 có hoạt tính kháng sinh tốt

chống lại Staphylococcus epidermidis (31,25µg/ml) và Malassezia pachydermatis

(500µg/ml) và phân đoạn 10 được xác định có hợp chất 2,4-bis(1,1-dimethylethyl) phenol Dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh l , môi trường, phân tử (chuỗi 16S

rDNA) chủng này được xác định là Streptomyces sp SCA7 Nó có thể được sử

dụng để phát triền các chất mới cho dược phẩm và mục đ ch nông nghiệp

Chương II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.213 do bộ môn Vi sinh-Sinh

học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

 Giống VSV kiểm định: các chủng VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh-Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp: (bảng 2.1)

Bảng 2.1: Giới thiệu các VSV kiểm định

9341 S lutea

Salmonnella typhi

DT220 S typhi

 Các môi trường:

 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn:

Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn được giới thiệu ở bảng 2.2

Bảng 2: Các môi trường d ng trong nuôi cấy xạ khuẩn

MT Thành

 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định: ( bảng 2.3)

Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Thành

Phần

MT

NaCl (g)

Cao thịt (g)

Pepton (g)

Thạch (g)

Nước (ml) pH

Canh thang 0,5 0,3 0,5 0

100(vđ) 7,0-7,4 Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6-1,8

 Các môi trường ISP2, ISP3 phân loại theo ISP

Dung dịch muối vi lượng của ISP: MnCl2.4H2O: 0,1g; FeSO4.7H20: 0,1g; ZnSO4.7H2O: 0,1g; nước cất vđ 100ml; pH=7,0 † 7,2

Dung dịch A: Pepton: 20,0g; acid citric: 0,384g; FeSO4.7H2O: 0,556g; NH4OH 25%: 0,264g; Na2S2O3: 10ml; K2HPO4: 1g; nước cất vđ 1000ml

Dung dịch Pridham và Gottlieb(ddB): CuSO4.5H2O: 0,64g; FeSO4.7H2O: 0,11g; MnCl2.4H2O: 0,79g; ZnSO4.7H2O: 0,15g; nước cất vđ 1000ml

- ISP2: Cao nấm men: 4,0g; dịch chiết malt 10,0g; glucose: 4,0g; thạch: 20,0g;

nước cất vđ 1000ml; pH=7,3

- ISP3: Yến mạch: 20,0g; dung dịch muối vi lượng: 1,0ml; thạch: 18,0g; nước

cất vđ 1000ml; pH=7,2

: các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MTdt lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định

đều được tiệt tr ng ở 118-120oC trong 30 phút

 Một số hóa chất được sử dụng: tinh bột, saccarose, glucose, bột đậu tương ,

cao thịt, NaNO3, CaCO3, KNO3, KCl, (NH4)2SO4, thạch, aceton, methanol, butylacetat, ethylacetat,…

2.1.2 Máy móc thiết bị

 Đèn UV ( = 254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V,

 Nồi hấp vô tr ng Hirayama Model HL3030,

 Cân kỹ thuật Sartorius TE 210,

 Cân phân t ch Sartorius BP 121S,

 Tủ ấm Memmert, Binder,

 Tủ lạnh Deawoo, Sanyo,

 Tủ cấy vô tr ng Aura VF 48,

 Tủ sấy SL shellab,

 Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf,

 Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt,

 Máy đo UV-VIS HiTaChi U-1900,

 Máy đo phổ MS-Xevo TQMS,

 Máy đo phổ IR Impact 410-NicoLet-USA (Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam),

 K nh hiện vi điển tử…

 Thước kẹp Palmer độ ch nh xác 0,02mm,

 Đĩa Petri, buret, pipet,

 Patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, cốc có m , que cấy, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác, que đục thạch, que chang, giấy lọc, giấy thử pH,

bông…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Bước đầu xác định hình thái của Streptomyces 184.213

Sơ bộ xác định đặc điểm hình thái của Streptomyces 184.213

2.2.2 Chọn lọc, cải tạo giống

 Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 184.213

 Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn các dạng chủng có HTKS cao nhất,

 Đột biến bằng ánh sáng UV để nâng cao hoạt t nh của Streptomyces 184.213

2.2.3 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh

 Từ 3 MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất, chọn một MT lên men chìm tốt nhất

 Từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn chủng (biến chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất