Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ một loài giảo cổ lam thu hái tại yên bái

Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá, thân Giảo cổ lam nghiên cứu ..... Song song với đó là các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học đã và đang được tiến hành để g

- -

PHẠM HẢI HOA

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ

HỢP CHẤT TỪ MỘT LOÀI GIẢO CỔ LAM THU HÁI TẠI YÊN BÁI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM HẢI HOA

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ

HỢP CHẤT TỪ MỘT LOÀI GIẢO CỔ LAM THU HÁI TẠI YÊN BÁI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Lời cảm ơn

Trong quá trình thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè và gia đình

Nhân dịp này, tôi xin gửi lời biết ơn chân thành nhất tới ThS Thân Thị

Kiều My, người thầy đã hết lòng chỉ bảo, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt

thời gian làm khóa luận

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược liệu đã hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, các phòng ban và các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, anh em, bạn bè trong suốt thời gian qua đã luôn ở bên động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc của tôi

Do thời gian và điều kiện có hạn, khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong được sự góp ý của thầy cô và các bạn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

PHẠM HẢI HOA

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma 2

1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Gynostemma 2

1.2.2 Phân bố chi Gynostemma 3

1.2.3 Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam 3

1.3 Thành phần hóa học 6

1.3.1 Nghiên cứu về saponin 6

1.3.2 Nghiên cứu về flavonoid 10

1.3.3 Một số thành phần hóa học khác 10

1.4 Tác dụng dược lý 10

1.5 Độc tính 12

1.6 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học chi Gynostemma tại Việt Nam 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Thuốc thử, dung môi, hóa chất 17

2.1.3 Dụng cụ 17

2.1.4 Phương tiện và máy móc 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá, thân Giảo cổ lam nghiên cứu 19

3.2 Chiết xuất phân đoạn các nhóm chất 21

3.2.1 Định lượng cắn các phân đoạn 23

3.2.2 Định tính cắn các phân đoạn 23

3.3 Phân lập các chất trong phân đoạn ethylacetat 26

3.3.1 Phân lập lần 1 26

3.3.2 Phân lập lần 2 29

3.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được 32

3.3.4 Nhận dạng các chất phân lập được 34

3.4 Bàn luận 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá và thân Giảo cổ

Bảng 3.4 Giá trị Rf và màu sắc của các vết quan sát được trên sắc

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.3 Sắc kí đồ cắn phân đoạn P2 khi quan sát dưới UV254 và

-33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giảo cổ lam là tên thường gọi của một số loài trong chi Gynostemma, họ bầu

bí - Cucurbitaceae Đây là một dược liệu quý có nhóm hoạt chất chính là saponin và flavonoid [44] với nhiều tác dụng nổi bật như làm hạ lipid máu [44], làm hạ đường huyết [40], chống oxy hóa, bảo vệ gan [20], ức chế một số dòng tế bào ung thư [33], [39], [51], Hiện nay, các sản phẩm từ Giảo cổ lam đang trở nên ngày càng phổ biến và được nhiều người sử dụng

Để có cơ sở cho việc sử dụng dược liệu Giảo cổ lam, năm 1997, Giảo cổ lam lần đầu được nghiên cứu tại Việt Nam bởi nhóm nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ Từ đó đến nay đã có thêm nhiều loài Giảo cổ lam được phát hiện Song song với đó là các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học đã và đang được tiến hành để góp phần tiêu chuẩn hóa, kiểm nghiệm dược liệu cũng như chứng minh các tác dụng sinh học của dược liệu trên lâm sàng

Năm 2014, GS.TS Phạm Thanh Kỳ đã thu mẫu Giảo cổ lam tại Yên Bái để tiếp tục nghiên cứu Qua khảo sát sơ bộ, chúng tôi dự đoán đây là một thứ mới của

Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài :

“Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ một loài Giảo cổ lam thu hái tại Yên

Bái” với 3 mục tiêu:

1 Xác định các nhóm chất hữu cơ chính có trong mẫu nghiên cứu

2 Chiết xuất, xác định hàm lượng cắn các phân đoạn chiết từ lá và thân cây Giảo cổ lam nghiên cứu

3 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam [5], Thực vật dược và phân loại thực vật [18], Thực vật chí Trung Quốc [24], Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma, một chi

nằm trong họ bầu bí (Cucurbitaceae), và có vị trí phân loại:

1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Gynostemma

Chi Gynostemma được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa trên hình thái của loài G.simplicifolium [25] Từ đó đến nay, đã có thêm nhiều loài được

mô tả Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam [5] và Thực vật chí Trung Quốc [24], các loài thuộc chi Gynostemma có đặc điểm chung như sau:

Cây thảo lâu năm, khác gốc, ít khi cùng gốc, thân leo mảnh, nhẵn hoặc có lông mịn

Lá kép, ít khi là lá đơn, lá có cuống, phiến lá chân vịt có 3-9 lá chét Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn

Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực

Hoa đực: nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con; cuống hoa có đốt Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô

Hoa cái: Đài và tràng giống hoa đực Nhụy 1 hoặc 2, bầu hình cầu nhỏ,

2-5 ngăn, thường 3 ngăn, ít khi 2,4,2-5, đầu nhụy chia 2-3 đầu nhọn

Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở Quả có 2-3 hạt hình trứng, hơi dẹt 2 bên hoặt có 3 góc Hạt sần sùi [5], [24]

1.2.2 Phân bố chi Gynostemma

Chi Gynostemma chủ yếu được phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông

Nam Á, từ dãy Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và đảo New Guinea Các loài thuộc chi Gynostemma hầu hết sống ở miền tây nam Trung Quốc (Phía nam tỉnh Thiểm Tây và nam lưu vực sông Trường Giang) [21], [24]

Hiện nay, trên thế giới đã nhận dạng 21 loài thuộc chi Gynostemma [25]

Ở Trung Quốc đã ghi nhận được 14 loài (với 9 loài đặc hữu) [24] Tại Việt Nam đã

công bố 4 loài thuộc chi Gynostemma là G pentaphyllum (Thumb.) Makino, G

laxum (Wall.) Cogn [4], [5], G longipes C.Y.WU [12], [17], G.pedeta Blume [6]

1.2.3 Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài trong chi Gynostemma tại Việt

Nam

1.2.3.1 Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino

Tên gọi khác: Cổ yếm, giảo cổ lam, thất diệp đởm [5]

Đặc điểm thực vật:

Cây thảo mọc leo yếu, không lông hoặc lông thưa thớt ở mấu

Lá kép có cuống chung dài 3-4cm; phiến do 5-7 lá chét với mép có răng dài 3-9cm, rộng 1,5- 3cm Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [5], [6], [24]

Cụm hoa đực dạng chùm kép Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4mm, ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5, bao phấn đính thành đĩa

Cụm hoa cái dạng chùy ngắn hơn hoa đực Hoa có đài và tràng giống hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, ngắn [24]

Quả khô, tròn, đường kính 5-9mm, khi chín màu đen Hạt 2-3, treo, hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4mm, màu nâu [5], [24]

Hoa tháng 3 - 10 Quả tháng 4 - 12

Thu hái dây lá vào mùa thu, phơi khô [4], [5], [6]

Phân bố: Cây mọc ở rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng tới độ

cao 2000m [5], [24]

Phân bố ở Ấn Độ, Xrilanca, Mianma, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Việt Nam và bán đảo Malaixia [6] Tại Việt Nam, cây mọc nhiều nơi như Lào

Cai, Lạng Sơn, Hòa Bình, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Đồng Nai [4], [5], [6]

1.2.3.2 Gynostemma laxum (Wall.) Cogn

Tên gọi khác: Cổ yếm lá bóng, thư tràng thưa

Đặc điểm thực vật:

Dây leo mảnh, lông dài 10-20 cm, có lông mịn

Vòi đơn Lá có 3 lá chét, lá giữa dài 10-12cm, mỏng, mép có răng cưa nhọn, gân phụ 5-7 cặp, có lông mịn 2 mặt, mép lá hình sóng rãnh

Hoa khác gốc, cụm hoa hình chùy, chùy hoa ngắn hay dài đến 30 cm Cánh hoa rời nhau, cao 3mm, nhị 5, dính nhau ở chỉ nhị và bao phấn

Quả tròn, to 6-8mm, hình trái xoan, hơi dẹp, dài và rộng cỡ 4mm

Ra hoa vào tháng 5

Phân bố: Cây mọc ở các rừng thưa, savan cỏ, trên đất sét hoặc trong các

rừng cây bụi trên núi đá vôi [4], [5]

Phân bố ở Trung Quốc, Việt Nam, Mianma, Ấn Độ, Thái Lan [6], [24] Tại Việt Nam, cây mọc leo ở rừng thưa các tỉnh Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Bình và Quảng Trị [4], [5]

1.2.3.3 Gynostemma longipes C.Y.WU

Đặc điểm thực vật:

Cây dây leo Thân cành mảnh, có 5 góc hình ngũ giác

Lá kép chân vịt Mép lá răng cưa to Ngọn lá nhọn dài Mặt trên có lông cứng rải rác, mặt dưới nhẵn, gân bên 9 cặp hình lông chim, có lông tơ thưa Lá bên nhỏ dần Tua cuốn mảnh, rẽ đôi muộn

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh Hoa đực rất nhỏ, màu trắng Đài 5, rời, hình tam giác Tràng 5, rời, hình tam giác Nhị 5, chỉ nhị đính thành 1 cột ở trung tâm, hình sao, bao phấn 2 ô Cụm hoa cái kép 3 lần chùm Hoa cái có cuống dài 1,8 - 2,0mm Đài và tràng giống hoa đực Bộ nhụy cấu tạo bởi

3 lá noãn hàn liền, 2 - 3 vòi nhụy mập, rời, núm nhụy chia 2 - 3, bầu giữa, 3 ô, mỗi

ô có 1 hạt

Quả mọng, khi chín màu xanh, đường kính 6 7mm, cuống quả dài 8 15mm

-Hạt hình tim, rộng 3 - 4mm, màu xám nhạt, viền hạt có răng cưa

Mùa hoa tháng 8 - 10, mùa quả vào tháng 11 - 12 [17], [24], [27]

Phân bố: Độ cao khoảng 1400 - 3200m so với mặt nước biển [24] Tại

Việt Nam, cây phân bố tại Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [27]

1.2.3.4 Gynostemma pedeta Blume

Đặc điểm thực vật:

Cây thảo, mảnh, nhẵn Thân không tròn có góc cạnh, bề mặt nhăn

Lá hình chân vịt kép, cuống dài 3 4cm, có 5 7 lá chét Lá chét dài 35 60mm, rộng 15 - 25mm hình oval, đầu trên và gốc lá tù hoặc nhọn, có răng cưa, có

-7 cặp gân lá Tua cuốn đôi hoặc chẻ đôi, mảnh

Cụm hoa đực ở nách lá, hình chùy mảnh, dài 11 – 16cm Hoa nhỏ, nụ hình cầu, khi nở hình sao cuống dài 2mm Đài dạng ống, phiến đài hình tam giác, dài 0,7mm Tràng 5, hình oval dài 2mm Nhị 1 bó, chỉ nhị hàn liền; bao phấn 5, có 1

ô Hoa cái dạng chùy ngắn hơn hoa đực, đài và tràng như hoa đực Nhụy bầu dưới, hình cầu thóp ở đỉnh, 2 - 3 ngăn, 2 - 3 noãn treo trên, 2 - 3 vòi nhụy ngắn

Quả gần như nang, không mở, hình cầu 5 - 6 mm, màu lục đen khi chín Hạt treo, hình tim dẹt 2 bên dài 4mm

Phân bố: Tại Việt Nam, cây mọc ở Ba Vì, Lạng Sơn, Sa Pa, Hà Nội,

Ninh Bình, Hòa Bình [2], [6]

Theo Võ Văn Chi [5], trong Giảo cổ lam có saponin, flavonoid và các loại đường

1.3.1 Nghiên cứu về saponin

Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện phần aglycon của saponin trong Giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran [33], [44]

Hình 1.1: Cấu trúc khung Dammaran

Dammaran là một nhóm saponin thuộc loại saponin 4 vòng (saponin triterpenoid tetracyclic) Khung cấu trúc có 4 vòng và một mạch nhánh 8 carbon 4 vòng gồm 3 vòng 6 cạnh, 1 vòng 5 cạnh Do có nhóm OH đính vào C-20 nên khi tác dụng bởi acid, mạch nhánh dễ bị đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran Phần đường nối vào OH ở carbon C-3 hoặc C-20 để tạo thành glycosid [3], [10]

1.3.1.1 Saponin trong Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino

Các nghiên cứu về phân lập saponin từ chi Gynostemma chủ yếu tập trung vào loài G pentaphyllum Saponin trong G pentaphyllum còn được gọi là

gynosaponin hay gypenosid, hàm lượng gypenosid toàn phần chiếm khoảng 2,4% khối lượng dược liệu khô và đã có hơn 100 loại gypenosid được phân lập [44]

Số lượng các gypenosid đã phân lập gấp khoảng 5 - 6 lần các ginsenosid

(thành phần có hoạt tính chính của Nhân sâm Panax ginseng) Hơn nữa đã phân lập

được 8 gypenosid có cấu trúc giống như loại protopanaxadiol trong ginsenosid là Rb1 (gypenosid III) [32], Rc [39], Rb3 (gypenosid IV), Rd (gypenosid III), F2 [38],

Rg3 [44], malonyl - Rb1, malonyl - Rd [32], và 1 loại protopanaxatriol là ginsenosid

Rf Những ginsenosid này chiếm 25% lượng gynosaponin toàn phần trong cây và cũng là ví dụ đầu tiên về ginsenosid được tìm thấy ngoài họ Araliaceae [36]

Cấu trúc saponin trong G.pentaphyllum (thumb.) Makino được trình bày qua

O

i

Bảng 1.1 Saponin thường gặp trong G.pentaphyllum (Thumb.) Makino

R1

Đường glu., rham., xyl., có thể 1 hoặc 2, 3 đường kết hợp với nhau

- OH

Gypenosid I, Rb1 Gynos TN1, gynos TN2

R3

-CH3-CH2OH -CHO

Gypenosid I, Rb1 Gylongiposid I

R4

-OH -H

=O

Rb1Gylongiposid I Gypentonosid A

R5

-OH -đường đôi; thường là glu kết hợp với rha hoặc xyl

Rg3, Rf

Rb1, gymnemasid II

R6

-CH3 -CH2OH -CH2O-glu hoặc –CH2O-xyl

Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vị trí C-17 cũng được phát hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R- tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và (20S, 24S)- 20, 24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [36]

OH

Hình 1.4 Cấu trúc epoxy dammaran từ G.pentaphyllum (Thumb.) Makino

Các saponin trong G.pentaphylllum (Thumb.) Makino đa số ở dạng vô định

hình [36], chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [36], gynogenin II [39] và gynosaponin TN1 [43]

G pentaphyllum có số lượng các loại saponin dammaran nhiều nhất trong

các loài thực vật đã được nghiên cứu [44]

1.3.1.2 Saponin trong một số loài khác thuộc chi Gynostemma

- Gynostemma longipes C.Y.WU

Đã phân lập được các saponin mới là glycosid A, glycosid B, gylongiposide 1, ginsenosid Rb1, gypenosid XLIX [45] và vinagynosteside A [17]

từ G longipes

- Gynostemma pubescens (Gagnep.) C.Y.Wu

Đã phân lập được saponin 1-8 Trong đó, hợp chất 1-4 có 8 nhóm carboxyl ở cả 2 vị trí C-21 và C-29, 5 có chứa 1 nhóm carboxylic ở C-21 và 1 nhóm chức aldehyd ở C-29, 6 và 7 chứa nhóm carboxylic ở C-21 và 1 nhóm hydroxymethylen ở C-29 [49]

- Gynostemma cardiospermum Cogniaux ex Oliver

Từ dịch chiết ethanol của phần trên mặt đất loài G.cardiospermum, Feng

Yin và cộng sự đã đã phân lập được 6 saponin cấu trúc dammaran [50]

1.3.2 Nghiên cứu về flavonoid

Flavonoid là một thành phần chính có mặt trong các loài thuộc chi

Gynostemma nhưng ít được nghiên cứu hơn saponin

quercetin-di-(rhammo)-hexosid, quercetin-hexosid, kaempferol- hexosid và kaempferol-3-O-rutinosid [30]

lưu với dung môi ethanol 70% ở nhiệt độ 90 °C [41]

1.3.3 Một số thành phần hóa học khác

nhỏ (khoảng 0,0001%) bao gồm ergostanol, sitosterol, stigmasterol [31], [44]

có mặt trong G.pentaphyllum bằng phương pháp HPLC, trong đó nhiều nhất là

trans- Lutein, kế đến là cis- Lutein [35]

hình với thành phần chính là glucose (23,2%), tiếp theo là galactose (18,9%), arabinose (10,5%), rhamnose (7,7%), acid galacturonic (4,7%), xylose (3,9%),

mannose (3,1%) và acid glucuronic(1,2%), [48]

định được trong G.pentaphyllum có 15 chlorophyll và dẫn chất [28]

Các tác dụng của Gynostemma được cho là có được bởi saponin và

flavonoid, đặc biệt là saponin, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc [44] Trong các loài thuộc chi

Gynostemma được nghiên cứu, G.pentaphyllum là loài được nghiên cứu và công bố

nhiều nhất với các tác dụng dược lý đáng chú ý như sau:

1.4.1 Tác dụng hạ lipid máu

Tác dụng của gypenosid trên sự chuyển hóa lipid đã được nghiên cứu rộng rãi trên cả người và động vật Các kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng dịch chiết thô và các gypenosid ở các liều khác nhau đều có khả năng làm giảm mức triglycerid và cholesterol trên động vật thí nghiệm và người Những thành phần mang lại hoạt tính này được báo cáo là gynosaponin E, G, K, progypenosid A2, I, J,

M, N và O [44]

1.4.2 Tác dụng trên hệ tim mạch

G.pentaphyllum có khả năng ảnh hưởng tới hoạt động của hệ tim mạch, cụ

thể là dụng làm giảm áp lực máu, làm giảm nhịp tim, làm tăng độ bền mạch ngoại

vi, động mạch não và động mạch vành [42] Có nhiều nghiên cứu đã minh chứng cho điều này như cải thiện chứng loạn nhịp tim ở lợn [23], làm giảm phạm vi nhồi máu cơ tim và co thắt mạch vành ở thỏ, bảo vệ cơ tim ở chuột, tăng cường lưu thông trên mạch vành của chó đã gây tê [44],

1.4.3 Tác dụng hạ đường huyết

Khả năng làm giảm đường huyết được chứng minh qua các nghiên cứu sau:

khi điều trị cho chuột đã được kích thích tăng đường huyết bởi streptozocin [44]

dammaran từ Gynostemma) có tác dụng kích thích insulinrelase từ tụy chuột cống

cô lập Khi cho chuột uống, phanoside đã cải thiện sự dung nạp glucose và tăng insulin huyết tương, từ đó làm hạ đường huyết [44]

phì bằng cách cải thiện sự nhạy cảm của các recepter insulin [40]

1.4.4 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

Nhiều thử nghiệm trên động vật cho thấy các gypenosid có tác dụng rõ rệt trên hệ thần kinh trung ương

Gypenosid toàn phần (tiêm tĩnh mạch liều 50mg/kg trên thỏ) có tác dụng bảo vệ não thỏ khỏi bị thiếu máu khi co thắt 2 động mạch cảnh [44]

Cao Gynostemma (450mg/kg) có tác dụng ức chế các hoạt động tự phát

của chuột khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột bằng cách sử dụng tấm kim loại nóng [44]

Với não chuột cống bị tổn thương do thiếu máu, gypenosid liều

100mg/kg hạn chế rõ rệt sự phá hủy AND và ARN [52]

1.4.5 Ảnh hưởng tới chức năng miễn dịch

Các gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300mg/kg trong 7 ngày gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong huyết thanh và giảm lượng kháng thể tiêu huyết Lượng IgG huyết thanh tăng và tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim [44]

1.4.6 Tác dụng tới các tế bào ung thư

Một số hợp chất tinh khiết phân lập được từ G pentaphyllum có tác dụng

gây độc tính với các dòng tế bào ung thư invitro: SGC-7901 (dạ dày), BEL-7402 (gan) [51], A549 (phổi) [33], [46], HT-29 (ruột kết) [39], [48], MCF-7 (ung thư vú), SK-OV-3 (ung thư buồng trứng) [33],

Các gypenosid cũng ngăn chặn tác nhân gây đột biến cyclosphosphamid

ở chuột nhắt và đẩy mạnh quá trình hồi phục ADN [37]

1.4.7 Một số tác dụng bảo vệ khác

Gynostemma có một số tác dụng khác đã được nghiên cứu như: chống oxy

hóa, chống sốt, an thần, giảm đau, chống loét dạ dày [44],

Đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng Gynostemma pentaphyllum

(Thumb.) Makino là khá an toàn và không có tác dụng phụ, không độc tính [20], [22], [53]

Tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về chi Gynostemma về sinh

học, thành phần hóa học và tác dụng Trong đó, nhiều nhất là các nghiên cứu về thành phần hóa học

1.6.1 Định tính

Bằng các phản ứng hóa học đã xác định trong G.pentaphyllum và G.longipes

đều có saponin, flavonoid, sterol, polysaccharid [2], [7], [9], [12]

Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X, đã xác định được trong Giảo cổ lam

có Al, Si, Ca, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag Trong đó nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag (0,0001%) [7]

Đặc biệt, đối với nhóm hợp chất chính saponin, đã xây dựng được phương pháp cho phép định tính saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp dấu vân tay trong HPLC [15], định tính được saponin toàn phần của một số loài Giảo cổ lam phương pháp sắc kí lớp mỏng [11]

1.6.2 Định lƣợng

Bảng 1.2 Kết quả định lƣợng saponin và flavonoid toàn phần trong lá và thân

G.pentaphyllum ở Cao Bằng và Hòa Bình [13]

Bảng 1.3 Kết quả định lƣợng các phân đoạn trong lá và thân Giảo cổ lam ở

Sapa [2], Hòa Bình [13], [17]

lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang và ứng dụng phương pháp này xác định được hàm lượng saponin toàn phần của 10 mẫu

thuộc loài G.pentaphyllum thu hái tại các vùng trồng khác nhau ở Việt Nam [16]

1.6.3 Chiết xuất, tinh chế

- Chiết xuất: Theo nghiên cứu về phương pháp chiết xuất dược liệu Giảo cổ

lam bằng các dung môi hữu cơ, chiết xuất bằng EtOH 70% cho khối lượng cao toàn phần lớn nhất, bước loại tạp bằng dung môi không phân cực trước khi chiết xuất gần như không ảnh hưởng đến hiệu quả và khả năng chiết xuất của dung môi [13],

[14]

- Tinh chế saponin từ dịch chiết:

Saponin là nhóm chất được quan tâm nhiều nhất trong Giảo cổ lam, đã có một số phương pháp nghiên cứu về việc loại tạp, tinh chế saponin như sau:

Phương pháp 1: Loại tạp bằng EtOH tuyệt đối, saponin từ dịch lọc được tinh chế bằng phương pháp kết tủa trong aceton Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có thể triển khai trên quy mô công nghiệp [14]

Phương pháp 2: Tinh chế saponin từ dịch chiết bằng phương pháp chiết rắn sử dụng nhựa hấp phụ D101, rửa giải bằng EtOH 80% Đây là phương pháp có quy trình đơn giản, dễ thực hiện, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, không độc hại, loại được nhiều tạp mà không làm hao hụt saponin [16]

lỏng-Phương pháp 3: Tinh chế saponin bằng phương pháp chiết lỏng - rắn sử dụng

giải trong khoảng nồng độ MeOH từ 50-80% để thu saponin Phương pháp loại được hết chlorophyll và phần lớn flavonoid [15]

GS.TS Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã phân lập được 7 saponin mới có cấu

trúc dammaran từ G.pentaphyllum là: gypenosid VN1 (C59H100O26), gypenosid VN2 (C53H88O22), gypenosid VN3 (C53H88O22), gypenosid VN4 (C53H88O23), gypenosid VN5 (C47H80O18), gypenosid VN6 (C47H78O18), gypenosid VN7 (C47H78O18) [33]

Từ loài G.longipes, năm 2010, Phan Thị Thảo đã phân lập được 1 saponin

mới vinagynostesid A [17]

- Acid hữu cơ

Acid benzoic và 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid (acid vanillic) [2]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

được GS.TS Phạm Thanh Kỳ thu hái vào năm 2014 tại Yên Bái Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ 50-60°C trong tủ sấy Shellab có quạt thông gió Dược liệu sau khi sấy khô được bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát

Hình 2.1 Ảnh của GS Phạm Thanh Kỳ về Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái

Vì chưa thu được mẫu mang hoa đực, nên chúng tôi chưa thể xác định chính xác tên khoa học của loài Giảo cổ lam nghiên cứu Tuy nhiên dựa vào các đặc điểm

thực vật quan sát được và dựa vào khóa phân loại theo Thực vật chí Trung Quốc

[24], chúng tôi dự đoán mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu thuộc loài Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino, Cucurbitaceae Chúng tôi nhận thấy mẫu nghiên

cứu có một số đặc điểm như: có vị ngọt; phiến lá chỉ có 3 hoặc 5 lá chét, không xuất hiện lá có 7 lá chét; nhiều quả mang 1 hạt Những đặc điểm này khác biệt với các mẫu Giảo cổ lam đã được miêu tả trước đây, do đó chúng tôi dự đoán đây có thể là

một thứ mới của loài Gynostemma pentapylllum (Thumb.) Makino

2.1.2 Thuốc thử, dung môi, hóa chất

Dung môi, hóa chất sử dụng trong thực nghiệm đạt tiêu chuẩn phân tích:

- Thuốc thử: Dung dịch vanillin 1% trong acid sulfuric 10%

2.1.3 Dụng cụ

Nghiên cứu sử dụng các bộ dụng cụ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.4 Phương tiện và máy móc

- Nồi đun cách thủy, bình chiết và bộ dụng cụ chiết hồi lưu

- Máy cất thu hồi dung môi BÜCHI ROTAVAPOR R-200

- Máy xác định độ ẩm Sartorius

- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254nm và 366 nm

- Cân phân tích và cân kĩ thuật Sartorius

- Tủ sấy BINDER

- Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 của Merck

- Silica gel cho sắc kí chạy cột, cỡ hạt 63 - 200µm và 15 - 40 µm

- Hạt sephadex LH-20 cho sắc kí cột rây phân tử

- Cột sắc kí thủy tinh các loại

- Đinh tính các nhóm chất hữu cơ chính có trong mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu

- Chiết xuất, xác định hàm lượng cắn các phân đoạn chiết từ lá và thân cây

Giảo cổ lam nghiên cứu

- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được

- Định tính sơ bộ các nhóm chất chính theo phương pháp ghi trong tài liệu

Phương pháp nghiên cứu dược liệu [8] và Bài giảng Dược liệu tập 1 [3]

- Chiết xuất các chất bằng phương pháp hồi lưu theo tài liệu [41], [8]

- Xác định hàm lượng cắn các phân đoạn bằng phương pháp cân theo tài liệu

“Bài giảng Dược liệu, tập 1” [3]

(Standard deviation)

(kích thước hạt: 63-200µm và 15-40µm) và sắc kí cột rây phân tử sử dụng chất hấp

phụ sephadex- LH20 theo tài liệu Phương pháp nghiên cứu dược liệu [8]

- Kết tinh các chất bằng kỹ thuật kết tinh theo tài liệu Phương pháp nghiên

cứu dược liệu [8]

và phổ 13C- NMR

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá, thân Giảo cổ lam nghiên cứu

Các phản ứng định tính được được trình bày trong phụ lục 1 Kết quả định

tính như sau:

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá và thân Giảo cổ lam thu

hái tại Yên Bái

Chú thích: (–) Phản ứng âm tính (++) Phản ứng dương tính rõ

(+) Phản ứng dương tính (+++) Phản ứng dương tính rất rõ

Nhận xét: Trong thân và lá Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái có flavonoid,

saponin, sterol, đường khử, acid amin và polysaccharid Trong đó flavonoid và saponin là 2 nhóm chính

Cân chính xác khoảng 100g dược liệu đã xác định độ ẩm

Thấm ẩm dược liệu bằng EtOH 70%, sau đó cho vào bình cầu, đặt lên bếp, lắp sinh hàn, chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 70% Sau khi sôi 1 giờ, lấy dịch chiết, thêm dung môi EtOH 70% chiết tiếp Chiết liên tục 3 lần, gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn Hòa cắn vào nước nóng thu được dịch chiết nước, đem dịch chiết nước lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc và n-BuOH, thu được 4 phân đoạn dịch chiết Đem cất thu hồi dung môi được cắn ký hiệu là H, E, B, N Cắn các phân đoạn được đem sấy ở 60°C tới khối lượng không đổi

Quy trình chiết xuất được tóm tắt bằng sơ đồ hình 3.1

Hình 3.1 Quy trình chiết các phân đoạn trong lá, thân của cây Giảo cổ

lam thu hái tại Yên Bái

Dược liệu

Cắn

Dc nước

EtOH thu hồi

3.2.1 Định lƣợng cắn các phân đoạn

Cân chính xác khoảng 100g bột dược liệu đã xác định độ ẩm Chiết xuất theo

sơ đồ hình 3.1 Cắn các phân đoạn thu được đem sấy ở 60°C tới khối lượng không đồi Cân cắn và tính hàm lượng các chất trong các phân đoạn theo công thức:

𝑀.(1−𝑥) x 100 Trong đó:

F: Hàm lượng chất (%) a: Khối lượng cắn (g) M: Lượng dược liệu đem cân (g) x: Độ ẩm của dược liệu (%) Kết quả định lượng được ghi ở bảng 3.2:

Bảng 3.2 Hàm lƣợng cắn các phân đoạn chiết lá và thân cây Giảo cổ

lam nghiên cứu

STT

Khối lượng (g)

Hàm

ẩm (%)

Cắn H ( n-hexan)

Cắn E (EtOAc)

Cắn B (n-BuOH)

Cắn N (nước)

Bảng 3.3 Kết quả định tính cắn các phân đoạn

Cắn H ( n-hexan)

Cắn E (EtOAc)

Cắn B (n-BuOH)

Cắn N (nước)

Hệ II: CHCl3 – MeOH – HCOOH (3 : 0,4 : 0,2)

Hệ IV: EtOAc – CHCl3 – HCOOH (4 : 1 : 0,5)

Hệ V: EtOAc – MeOH – HCOOH (12 : 1 : 1)

Hệ VI: EtOAc – n-hexan ( 7 : 2 )

- Hiện màu: Quan sát dưới ánh sáng thường, dưới UV254 và UV366, sau đó

phun dung dịch vanillin 1% trong acid sulfuric 10% rồi sấy ở 110°C trong

10 phút

- Kết quả: Hệ dung môi II cho sắc kí đồ có các vết tách rõ ràng và nhiều vết

nhất Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường, UV254, UV366, phun TT

vanillin/H2SO4 Kết quả sắc kí ở hệ dung môi II được thể hiện ở sắc kí đồ hình 3.2 và bảng 3.4

AST UV254 UV366 TT

Hình 3.2 Sắc kí đồ cắn phân đoạn EtOAc khai triển với hệ dung môi

Bảng 3.4 Giá trị Rf và màu sắc của các vết quan sát đƣợc trên sắc kí đồ

cắn phân đoạn EtOAc

Xanh ++

Vàng +++

Đỏ ++

Xanh ++

++

Tím +

Đỏ +++

Xanh +++

+++

Đen +++

Nâu ++

Vàng +++

++

Tím ++

Chú thích:(-) Không quan sát thấy vết (+) Quan sát thấy vết mờ

(++) Quan sát thấy vết rõ (+++) Quan sát thấy vết rất rõ

Sử dụng cắn E để tiến hành phân lập

3.3.1 Phân lập lần 1: Phân lập cắn E trên cột sắc ký theo cơ chế hấp phụ, sử

dụng chất hấp phụ là silica gel cỡ hạt 63-200µm

 Dụng cụ và hóa chất:

- Cột sử dụng là ống hình trụ, bằng thủy tinh, chiều dài 75cm, đường kính

4,8cm, đầu dưới có một khóa thủy tinh dùng để điều chỉnh tốc độ dòng chảy

- Chất hấp phụ silica gel có cỡ hạt: 63 - 200µm

- Dụng cụ hứng: ống nghiệm loại 20ml Các ống nghiệm đều được đánh số từ

1 trở đi và xếp sẵn trong các giá theo thứ tự

 Tiến hành:

Lấy 4g cắn E hòa tan lại vào lượng tối thiểu EtOAc, trộn với silica gel sau đó

cho bay hơi hết dung môi ở áp suất giảm thu được hỗn hợp bột khô và trơn chảy tốt

Tiến hành sắc kí:

Đưa hỗn hợp cắn E trong silica gel lên cột đã chuẩn bị Cột sắc kí được tiến

hỗn hợp thay đổi như sau: 1%, 2%, 3%, 5%, 7% Tốc độ rửa giải khoảng 5ml/phút

Dung dịch rửa được hứng từng 20ml vào ống nghiệm và kiểm tra bằng sắc kí

phần tương tự được gộp thành 1 phân đoạn Kết quả thu được 4 phân đoạn:

- Từ ống 1 đến 135 cho nhiều vết không rõ, gộp lại vào các cốc có mỏ, thu được phân đoạn P1

- Từ ống 136 đến 160 cho 1 vết đậm và 4 vết mờ ở UV254, vết đậm này khi phun thuốc thử hiện màu, quan sát dưới ánh sáng thường thấy màu vàng

cam Gộp các ống nghiệm, cất thu hồi dung môi tới cắn, thu được phân đoạn P2

- Từ ống 161 đến172 cho 1 vết đậm rõ ở ánh sáng thường sau khi đã hiện màu bằng TT vanillin/H2SO4, gộp các ống nghiệm, cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm tới cắn, thu được phân đoạn P3

Hình 3.4 Sắc kí đồ cắn phân đoạn P3 sau khi hiện màu bằng TT

- Từ ống 173 đến 194 cho nhiều vết không rõ, gộp lại được phân đoạn P4 Như vậy sau khi phân lập lần 1, từ cắn ethylacetat ban đầu thu được 4 phân đoạn, trong đó có 2 phân đoạn đáng chú ý là P2 và P3 Tiến hành phân lập lần 2 với P2 và P3

Dung môi: MeOH

Dụng cụ hứng: Ống nghiệm loại 5ml Các ống nghiệm được đánh số từ 1 trở

đi và xếp sẵn trong giá theo thứ tự

Tiến hành sắc kí:

Đưa dung dịch P2 trong MeOH lên cột

Cột sắc kí được tiến hành rửa giải bằng dung môi MeOH

Dung dịch rửa được hứng từng 5ml vào ống nghiệm và kiểm tra bằng sắc kí

 Kết quả : Từ ống 20 đến ống 23 chỉ cho 1 vết trên sắc ký đồ Gộp các ống

lại, cho bay hơi dung môi tới cắn thu được chất bột màu vàng, kí hiệu là V1

 Phân đoạn P3: Phân lập cắn P3 bằng sắc ký sử dụng chất hấp phụ silica gel

 Dụng cụ, hóa chất:

Cột sử dụng là ống hình trụ, bằng thủy tinh, chiều dài 40cm, đường kính 1,8cm, đầu dưới có 1 khóa thủy tinh dùng để điều chỉnh tốc độ chảy

Chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 15 - 40µm

Dung môi: hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (95 : 5)

Dụng cụ hứng: ống nghiệm loại 5ml Các ống nghiệm được đánh số từ 1 trở

đi và xếp sẵn trong giá theo thứ tự

 Tiến hành:

Cắn P3 được hòa tan vào lượng tối thiểu CH2Cl2

Chuẩn bị chất nhồi cột, chuẩn bị cột tương tự như phân lập lần 1

Tiến hành sắc ký:

Đưa dung dịch P3 trong CH2Cl2 lên cột

Cột sắc kí được tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (95: 5) Dung dịch rửa được hứng từng 5ml vào ống nghiệm và kiểm tra bằng sắc kí

 Kết quả : Từ ống 28 đến ống 53 chỉ cho 1 vết trên sắc ký đồ Gộp các ống

lại, cho bay hơi dung môi tới cắn, kết tinh lại trong MeOH ta thu được tinh thể màu trắng kí hiệu là V2

Hình 3.5: Sơ đồ phân lập V1, V2

Cắn E

Sắc ký cột silica gel 63-200µm

Sắc ký cột rây phân tử sephadexLH20

Sắc ký cột silica gel 15-40µm

V2 V1