Xây dựng phương pháp điều chế cao khô và phân lập puerarin từ sắn dây

Vì vậy nếu có thể nghiên cứu chiết xuất thành công isoflavonoid và puerarin từ rễ củ sắn dây song song với việc chế tinh bột có thể giúp chủ động về nguồn nguyên liệu isoflavonoid cũng n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ PHƯƠNG DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ CAO KHÔ VÀ PHÂN LẬP PUERARIN

TỪ SẮN DÂY LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ PHƯƠNG DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ CAO KHÔ VÀ PHÂN LẬP PUERARIN

TỪ SẮN DÂYLUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hân, là người đã tận tình hướng dẫn và

giúp đỡ tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi về mọi mặt trong quá trình nghiên cứu hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi tới Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các thầy

cô giáo trường Đại học Dược à ội lòng biết ơn về sự quan tâm, giúp đỡ trong thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua

à ội, tháng 07 năm 2014

ọc viên

Phạm Thị Phương Dung

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HI U, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤ ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về cây sắn dây 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây sắn dây 2

1.1.2 Thành phần hóa học của rễ củ sắn dây 2

1.1.3 Tác dụng dược lý 4

1.1.4 Công dụng 6

1.1.5 Các nghiên cứu chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây 6

1.2 Puerarin 12

1.2.1 Công thức hóa học 12

1.2.2 Tính chất lý hóa 12

1.2.3 Kỹ thuật phân tích 13

1.2.4 Tác dụng sinh học của puerarin 15

1.2.5 Các nghiên cứu tinh chế puerarin hiện nay 19

1.3 Cao thuốc 20

1.3.1 Khái niệm 20

1.3.2 Phân loại 20

1.3.3 Kỹ thuật điều chế 21

1.3.4 Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc 22

Chương 2 NGUYÊN VẬT LI U, TRANG THIẾT BỊ VÀ Ơ G Á NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Dụng cụ 23

2.1.3 Phương tiện và máy móc 23

2.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.2.1 Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu khô 24

2.2.2 Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi 24

2.2.3 Điều chế cao khô 25

2.2.4 Phân lập puerarin và daidzin 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin 25

2.3.2 Phương pháp định tính các isoflavonoid bằng sắc ký lớp mỏng 29

2.3.3 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô 30

2.3.4 Phương pháp chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi 30

2.3.5 Phương pháp tinh chế dịch chiết sắn dây tươi 31

2.3.6 Phương pháp điều chế cao khô 32

2.3.7 Phương pháp phân lập puerarin và daidzin 35

2.3.8 Phương pháp xác định cấu trúc puerarin và daidzin 35

2.3.9 Phương pháp xác định khối lượng cắn trong dịch chiết 35

2.3.10 Phương pháp xác định mất khối lượng do làm khô 36

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Định lượng isoflavonoid toàn phần trong nguyên liệu 37

3.1.1 Đường chuẩn isoflavonoid 37

3.1.2 Định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu 38

3.2 Định lượng puerarin trong nguyên liệu 39

3.3 Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô 40

3.3.1 Khảo sát các dung môi chiết 40

3.3.2 Tinh chế dịch chiết sắn dây khô 44

3.4 Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi 45

3.4.1 Chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi 45

3.4.2 Tinh chế dịch chiết sắn dây tươi 46

3.5 Điều chế cao khô từ dịch chiết sắn dây tươi 47

3.6 Phân lập puerarin và daidzin 49

3.6.1 Phân lập daidzin 49

3.6.2 Phân lập puerarin 53

3.6.2.1 Tiến hành 53

Chương 4 BÀ L ẬN 57

4.1 Về nguyên liệu chiết xuất isoflavonoid 57

4.2 Về phương pháp bào chế cao khô 57

4.3 Về phương pháp phân lập puerarin và daidzin 58

KẾT LUẬ VÀ ĐỀ XUẤT 60

KẾT LUẬN 60

ĐỀ XUẤT 61

TÀI LI T A K ẢO

Ụ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AMPK : 5'-adenosine monophosphat-activated protein kinase ATP : Adenosine triphosphat

CV : Coefficient of variation

( ệ số phân tán) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DĐV : Dược điển Việt am

ESI – MS : ElectroSpray Ionization - Mass spectrometry

(Khối phổ - Ion hóa bằng phương pháp phun mù điện tử) GOT : Glutamic oxaloacetic transaminase

HDL : High-density lipoprotein

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

( ắc ký lỏng hiệu năng cao) HSCCC : High Speed Counter Current Chromatography

( ắc ký ngược dòng tốc độ cao)

IL : Interleukin

IR : Infrared

( ồng ngoại) LDL : Low-density lipoprotein

LPS : Lipopolysaccharid

mTOR : mammalian Target of Rapamycin

(Đích tác dụng trên động vật có vú của Rapamycin) MAPK : Mitogen-activated-protein-kinase

NMR : Nuclear magnetic resonanc

(Độ lệch chuẩn) TLC : Thin Layer Chromatography

( ắc ký bản mỏng) TNF : Tumor necrosis factors

(Yếu tố hoại tử khối u)

UV : Ultraviolet

(Tử ngoại)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1 Công thức cấu tạo của một số isoflavonoid thường gặp trong sắn dây 3

Bảng 1.2 o sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng 9

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng 23

Bảng 3.1 Mật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bước sóng 250 nm 37

Bảng 3.2 Kết quả định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu 39

Bảng 3.3 Diện tích pic sắc ký của dãy dung dịch chuẩn 39

Bảng 3.4 àm lượng puerarin trong nguyên liệu thu mua ở Phú Thọ 40

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau 41

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát chiết isoflavonoid từ sắn dây khô bằng dung môi nước 43

Bảng 3.7 Kết quả tinh chế dịch chiết sắn dây khô 44

Bảng 3.8 Kết quả chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi 45

Bảng 3.9 Hiệu suất và hàm lượng cao đặc sau tinh chế (thu được từ 500 ml dịch chiết, tương ứng khoảng 150 g dược liệu) 46

Bảng 3.10 Dịch tinh chế đem vào phun sấy 47

Bảng 3.11 Một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô phun sấy 48

Bảng 3.12 Kết quả đo phổ hồng ngoại của daidzin 51

Bảng 3.13 Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của daidzin 52

Bảng 3.14 Kết quả đo phổ NMR của daidzin 52

Bảng 3.15 Kết quả đo phổ hồng ngoại của puerarin 54

Bảng 3.16 Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của puerarin 54

Bảng 3.17 Kết quả đo phổ NMR của puerarin 55

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ình 1.1 Sắn dây 2

ình 2.1 ơ đồ chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi 31

ình 2.2 Quy trình điều chế cao khô 34

Hình 3.1 Phổ UV-VIS của dung dịch chất đối chiếu 37

ình 3.2 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ puerarin và mật độ quang 38

ình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ puerarin và diện tích pic sắc ký 40

ình 3.4 Biểu đồ so sánh lượng isoflavonoid chiết được bởi các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau 42

ình 3.5 Bột cao khô phun sấy 48

ình 3.6 ình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254 nm của dịch chiết 49

ình 3.7 Quy trình phân lập daidzin và puerarin 50

Hình 3.8 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của daidzin 51

ình 3.9 Công thức cấu tạo của daidzin 52

Hình 3.10 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của puerarin 53

ình 3.11 Công thức cấu tạo của puerarin 55

Tại Việt Nam, sắn dây được trồng khá phổ biến nhưng chủ yếu nhằm chế tinh bột Vai trò của sắn dây trong chiết xuất isoflavonoid chưa được quan tâm đầy

đủ Hiện nay, isoflavonoid nguyên liệu và puerarin vẫn phải nhập chủ yếu từ Trung Quốc với giá thành cao Vì vậy nếu có thể nghiên cứu chiết xuất thành công isoflavonoid và puerarin từ rễ củ sắn dây song song với việc chế tinh bột có thể giúp chủ động về nguồn nguyên liệu isoflavonoid cũng như puerarin trong sản xuất và tận dụng được phế phẩm của quá trình sản xuất tinh bột sắn

Nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ rễ sắn dây phù hợp với điều kiện thực tiễn ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Xây dựng phương pháp điều chế cao khô và phân lập puerarin từ sắn dây”

với hai mục tiêu chính sau:

1 Xây dựng quy trình điều chế cao khô phun sấy từ rễ củ sắn dây

2 Phân lập được puerarin từ rễ củ sắn dây

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về cây sắn dây

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây sắn dây

Sắn dây có tên khoa học là Pueraria thomsonii

Benth., họ Đậu – Fabaceae Một số tài liệu Trung Quốc

ghi loài Pueraria lobata (Willd.) Ohwi hoặc P

pseudohirsuta Tang et Wang [3] Dược điển Trung Quốc

ghi nhận cả hai loài Pueraria lobata và Pueraria

thomsonii [32]

Sắn dây là một loại dây leo, dài có thể đến 10m, lá

kép gồm ba lá chét Cuống lá chét giữa dài, cuống lá chét

hai bên ngắn Lá chét có thể phân thành 2-3 thùy Về mùa

hạ trổ hoa màu xanh tím, mọc thành chùm ở kẽ lá Quả loại đậu có nhiều lông Củ dài to nặng có thể tới 20kg, nhiều xơ

Muốn trồng người ta đào các hố sâu 50cm, đổ rác và mùn rồi lấp đất xốp lại Đến tháng 1-2 giâm cành vào các hố đó hiều nơi ở nước ta thường kết hợp làm giàn lấy bóng mát Cũng có những vùng chuyên trồng để chế tinh bột ví dụ làng Cao Xá thuộc huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh mỗi năm sản xuất khoảng 20 tấn tinh bột [3]

Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3-4 năm sau Ở Trung Quốc, người ta thường thu hoạch sắn dây vào mùa thu và mùa đông [32] Để chế vị Cát Căn thì rửa sạch, bóc bỏ lớp vỏ dày bên ngoài, cắt thành khúc dài 10-15 cm Nếu củ to thì bổ dọc để có những thanh dày khoảng 1cm, sau đó xông diêm sinh rồi phơi hoặc sấy khô Loại trắng ít xơ là loại tốt Muốn chế tinh bột sắn dây thì bóc vỏ, đem giã nhỏ hoặc mài trên tấm sắt tây có đục thủng lỗ, hoặc xay bằng máy, cho thêm nước rồi nhào lọc qua rây thưa, loại bã, sau đó lọc lại 1 lần nữa qua rây dày hơn, để lắng gạn lấy tinh bột rồi đem phơi hoặc sấy khô [3]

1.1.2 Thành phần hóa học của rễ củ sắn dây

Rễ củ các loài ueraria đều chứa tinh bột, tỷ lệ khoảng 12-15% theo tươi [3] đến 40% theo khô [4] Ngoài ra còn có saponin [4], [20] và các flavonoid thuộc

ình 1.1 ắn dây

nhóm isoflavonoid Từ loài Pueraria lobata người ta đã phân lập được các

isoflavonoid sau puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3), formonetin (4) ăm 1987 các nhà nghiên cứu Nhật đã phát hiện thêm 13 chất mới, trong đó có genistein và các glycosid của daidzein, genistein [20] Các nghiên cứu sau này đều chỉ ra rằng puerarin, daidzin, daidzein, genistein và genistin là các isoflavonoid chiếm tỷ lệ lớn trong rễ củ các loài sắn dây, và cho các tác dụng sinh học đáng chú ý [46], [11], [37]

Pueraria [44] Trong đó Pueraria lobata là loài có hàm lượng flavones cao nhất và

có nhiều flavones được phân lập nhất (36 chất) [44]

àm lượng isoflavone trong rễ củ sắn dây phụ thuộc nhiều vào loài, vùng trồng trọt [44] và thời gian thu hái [11] àm lượng flavone trung bình ở loài

Pueraria lobata là 7,42% trong khi hàm lượng flavone trung bình ở loài Pueraria thomsonii chỉ có 0,93% [44] àm lượng flavone ở loài Pueraria lobata trồng tại

Shanxi lên tới 10,4% trong khi hàm lượng này khi trồng tại Jiangxi chỉ đạt 3,3% [44] Tuổi và thời gian thu hái cũng là yếu tố ảnh hưởng đáng kể tới hàm lượng

isoflavone của loài Pueraria lobata trồng tại Huoshan Rễ củ 3 năm tuổi thu hái vào

khoảng tháng Giêng sẽ cho nồng độ isoflavone cao nhất, đạt 7,26% Tuổi cao hơn

hoặc thời gian thu hái trước tháng Giêng đều làm giảm nồng độ isoflavone của sắn dây [11]

sắn dây không liên quan tới catecholamin mà là do tác dụng giãn cơ trực tiếp [8]

1.1.3.2 Tác dụng hạ huyết áp của cao sắn dây

Tiêm tĩnh mạch với liều 5-30 mg trên chó, mèo có tác dụng hạ huyết áp Cao sắn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác dụng kích

thích tim của isoprenalin, ngoài ra còn làm giảm nhịp tim và gây hạ huyết áp [8]

1.1.3.3 Tác dụng chống loạn nhịp tim

So sánh tác dụng chống loạn nhịp tim của puerarin, daidzein và dạng chiết cồn từ sắn dây trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng cho thấy tác dụng của daidzein tương đối mạnh, cho hiệu quả rõ rệt Dạng chiết cồn có tác dụng giống với daidzein; điều này chứng tỏ daidzein là thành phần chủ yếu có tác dụng chống loạn nhịp tim Puerarin với liều tương đương có tác dụng kháng rõ rệt với loạn nhịp tim

do aconitin và bari clorid gây nên, giảm nhẹ mức độ loạn nhịp do thiếu máu cơ tim,

tác dụng đối kháng với rung thất không bằng daidzein [8]

1.1.3.4 Tác dụng đối với tuần hoàn não

Thử nghiệm trên chó gây mê, flavon toàn phần của sắn dây bằng đường tiêm động mạch cảnh với liều 0,1-5,0 mg/kg làm lưu lượng máu qua não tăng 87,7-134%, nếu cho thuốc bằng đường tiêm tĩnh mạch flavon toàn phần với liều 10-30 mg/kg chỉ làm lưu lượng máu qua não tăng 20% Trên bệnh nhân cao huyết áp,

flavon toàn phần tiêm bắp với liều 200 mg giúp cái thiện tuần hoàn não cho 53%

bệnh nhân, làm giảm trợ lực mạch máu não [8]

1.1.3.5 Tác dụng đối với hệ thần kinh

Dịch chiết sắn dây với liều 2 g/kg cho thẳng vào dạ dày trên thỏ gây sốt bằng vaccin thương hàn có tác dụng hạ nhiệt, bột sắn dây có tác dụng tương tự ước sắn dây với liều 6 g/kg cho thẳng vào dạ dày trên chuột nhắt trắng, có tác dụng cải thiện

hiện tượng trí nhớ bị tổn thương do scopolamin gây nên [8]

1.1.3.6 Tác dụng đối với cơ trơn

Trong các dịch chiết bằng aceton, methanol và nước từ sắn dây thì dạng PA3, PA4 có tác dụng ức chế co bóp hồi tràng cô lập chuột lang kiểu papaverin, dạng PM1, PM3 lại có tác dụng gây co thắt Daidzein có tác dụng giải co thắt đối với ruột non đã cô lập của chuột nhắt trắng, tác dụng này bằng khoảng 1/3 tác dụng

của papaverin [8]

1.1.3.7 Tác dung hạ đường huyết và lipid huyết

ước sắc sắn dây với liều 6-8 g/kg cho thẳng vào dạ dày thỏ bình thường có tác dụng hạ đường huyết nhưng không thể đối kháng với hiện tượng đường huyết tăng cao do adrenalin gây nên Puerain với liều 500 mg/kg hoặc dùng liều thấp phối hợp với aspirin 100 mg/kg dùng liên tục trong 9 ngày qua đường dạ dày, có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh của chuột nhắt trắng đã được gây tăng cholesterol bằng alloxan Aspirin dùng đơn độc không có tác dụng hạ đường huyết

hay lipid huyết [8]

1.1.3.8 Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết cồn từ sắn dây với liều 10 g/kg trên động vật thí nghiệm có tác dụng ức chế nhất định sự phát triển của tế bào sarcom 180, u báng Ehrlich và tế bào ung thư phổi Lewis Daidzein với nồng độ 14µg/ml có tác dụng ức chế sự tăng

trưởng của tế bào ung thư máu HL-60 (promyelocytic leukemia) [8]

1.1.3.9 Tác dụng chống oxy hóa

Thí nghiệm trên chuột gây tiểu đường bằng cách tiêm phúc mạc streptozotocin Thí nghiệm sử dụng cao sắn dây chứa khoảng 10,42% puerarin và một vài chất liên quan, với liều 500 mg/kg, dùng đường uống trong 3 tuần, kết quả

cho thấy nồng độ malondialdehyd trong huyết tương-được sử dụng như một dấu hiệu của chất béo bị oxy hóa, đã giảm xuống mức tương tự như ở chuột khỏe mạnh,

và giống như trong nhóm được điều trị tích cực hàng ngày bằng tocopherol acetat

với liều 50 mg/kg [8],[9]

1.1.3.10 Các tác dụng khác:

Dung dịch puerarin 0,2-1,6% với liều 0,2 ml tiêm dưới da chuột lang theo dõi phản ứng giác mạc và da cho thấy tác dụng gây mê cục bộ Thí nghiệm trên chuột hamster, cao sắn dây có tác dụng chống nghiện rượu, trên chuột cống trắng, daidzein có tác dụng hạ thấp lượng rượu trong máu và rút ngắn thời gian ngủ do rượu gây nên Đối với gan của chuột nhắt trắng gây nhiễm độc bằng CCl4, isoflavonoid chiết từ cát căn với liều 250 mg/kg có tác dụng ức chế 30,7% hoạt độ men GOT [8]

Nghiên cứu của Đỗ Thị oa Viên đã chứng minh rằng cao chiết isoflavonoid

từ củ sắn dây Pueraria thomsonii Benth có hoạt tính nội tiết kiểu estrogen trên

51,5% chuột nhắt trắng cái với liều uống 150 mg/con/ngày Điều này cho thấy hoạt tính estrogen của hỗn hợp isoflavonoid chiết xuất từ củ sắn dây là khá rõ rệt [7]

1.1.4 Công dụng

Theo y học cổ truyền, cát căn là một vị thuốc chữa sốt nhức đầu, khát nước, kiết lỵ, ban sởi Cát căn đã được ghi vào dược điển Việt Nam Tinh bột sắn dây pha với nước thêm đường uống để giải khát [3] Ngoài ra trong y học cổ truyền còn dùng hoa của dây sắn dây với tên “Cát hoa” để làm thuốc giã rượu [3]

Theo Dược điển Trung Quốc, sắn dây có tác dụng hạ sốt, kích thích tiết dịch

cơ thể, cầm ỉa chảy Do vậy, sắn dây được sử dụng để điều trị sốt, đau đầu, khát nước, tiểu đường, ban sởi, kiết lỵ hoặc ỉa chảy cấp, cứng gáy và đau trong tăng huyết áp [32]

1.1.5 Các nghiên cứu chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây

1.1.5.1 Chiết kiểu truyền thống

Mặc dù với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại đã có rất nhiều phương pháp chiết hiệu quả được đưa vào ứng dụng nhưng chiết xuất theo kiểu

truyền thống vẫn được nghĩ đến đầu tiên khi nghiên cứu về các dược liệu mới Chỉ có hiểu rõ đặc điểm chiết các dược liệu này theo phương pháp hồi lưu đơn giản mới có thể áp dụng các biện pháp cải tiến để nâng cao hiệu suất cũng như chất lượng sản phẩm chiết Cũng vì thế, trong rất nhiều nghiên cứu chiết sắn dây

đã được thực hiện trên thế giới, phương pháp chiết hồi lưu vẫn được các nhà khoa học quan tâm thực hiện Mục tiêu của các nghiên cứu này hầu hết là để tìm ra được loại dung môi, nhiệt độ, thời gian… tối ưu cho việc chiết isoflavonoid từ sắn dây

Ngay từ năm 1998, Li Wehong và cộng sự đã xác định được giữa hai dung môi nước và cồn, dung môi cồn cho hiệu suất chiết cao hơn và dễ tinh chế sản phẩm hơn Cũng từ đó, nhóm nguyên cứu đã tìm ra được điều kiện chiết xuất tối

ưu cho sắn dây là chiết bằng ethanol 60% trong 6 giờ ở 60C [25]

Đến năm 2007, an Jian và cộng sự vẫn tiếp tục nghiên cứu chiết isoflavonoid từ sắn dây bằng phương pháp truyền thống nhưng sử dụng dung môi chiết là nước Mặc dù không phải là một dung môi được đánh giá cao trong nhiều nghiên cứu song nếu tiến hành theo phương pháp của Han Jian vẫn có thể chiết được lượng lớn puerarin từ sắn dây Chiết nước ở điều kiện tối ưu là chiết 2 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước, thời gian chiết lần lượt là 1,5 giờ và 1 giờ [14]

Để nâng cao hiệu suất chiết người ta đã tiến hành thay đổi dung môi chiết,

sử dụng hệ dung môi thay vì các dung môi đơn thông thường Đáng kể đến là chuỗi nghiên cứu của Hua-Neng Xu và cộng sự Đầu tiên, nhóm nghiên cứu đã tìm ra hệ dung môi hai pha n-butanol/nước tỷ lệ 1:1 (v/v) không những dùng được cho quá trình chiết rắn – lỏng và tinh chế lỏng-lỏng mà còn giúp chiết được daidzein và isoflavonoid toàn phần với hiệu suất cao hơn nhiều so với dung môi chiết một pha thông thường [15] Với hệ dung môi hai pha như trên, daidzein dễ dàng được tách và tinh chế từ pha n-butanol [15] uerarin được tinh chế từ phần pha nước bằng cách điều chỉnh pH và lắc với n-butanol Quá trình tinh chế tương đối đơn giản nhưng lại cho ra sản phẩm tinh chế sạch khi phân tích sắc ký [16] Với những kết quả thu được, các tác giả đã tiến hành tiếp những đánh giá toàn diện hơn về các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình chiết isoflavonoid từ sắn

dây bằng hệ dung môi hai pha n-butanol/nước Cuối cùng, rút ra những kết luận như sau thành phần của hệ dung môi hai pha và nhiệt độ chiết là những yếu tố chính ảnh hưởng tới tốc độ và hiệu suất chiết isoflavonoid toàn phần; hệ dung môi n-butanol/nước với tỷ lệ 1:1 là có hiệu quả hơn cả; hiệu suất chiết và hệ số phân bố tăng lên ở tất cả các hệ dung môi đã khảo sát khi tăng nhiệt độ; những kết quả tính toán được từ mô hình là hoàn toàn phù hợp với dữ liệu thực nghiệm [17]

Tại Việt am, năm 2009 Dược sĩ Lê Thùy Linh đã nghiên cứu chiết isoflavonoid từ sắn dây bằng dung môi phân cực theo phương pháp chiết hồi lưu Khảo sát ba dung môi chiết là ethanol 90o, methanol và ethyl acetat Dựa vào tỷ

lệ phần trăm hàm lượng cắn thu được và kết quả định tính isoflavonoid trong dịch chiết tác giả chọn ethanol 90o là dung môi sử dụng để chiết isoflavonoid từ sắn dây [5]

1.1.5.2 Chiết dưới áp suất cao

So với phương pháp chiết hồi lưu, chiết dưới áp suất cao cho hiệu suất chiết cao hơn hẳn Khi sử dụng cùng dung môi chiết là ethanol 95%, chiết dưới

áp suất cao giúp chiết được lượng puerarin cao gấp 1,8 – 2,4 lần, lượng daidzin cao gấp 1,4 – 1,8 lần và lượng daidzein cao gấp 2,6 – 3,7 lần so với phương pháp hồi lưu [31]

gười ta cũng nhận thấy rằng, hiệu suất chiết isoflavonoid phụ thuộc vào nhiệt độ chiết khi chiết dưới áp suất cao Hiệu suất chiết tăng khi tăng nhiệt độ [31]

1.1.5.3 Chiết bằng siêu âm

Khi so sánh phương pháp chiết bằng siêu âm với phương pháp chiết truyền thống, Yang Hu và cộng sự nhận thấy rằng sử dụng siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết xuống 20 lần so với phương pháp chiết hồi lưu iệu suất chiết của phương pháp chiết bằng siêu âm đạt 19% sau 20 phút, trong khi hiệu suất chiết của phương pháp chiết hồi lưu chỉ đạt được 14,3% và 16,5% sau 1 và 2 giờ Chiết bằng siêu âm đạt được hiệu suất này sau 5 phút Mặt khác, siêu âm không làm phân hủy tới các thành phần hoạt chất có trong dịch chiết [45]

Cũng trong nghiên cứu này, Yang Hu và cộng sự đã chứng minh rằng, hiệu suất chiết khi sử dụng siêu âm bị ảnh hưởng bởi dung môi chiết [45], tỷ lệ dung môi và năng lượng siêu âm [31] Trong các dung môi chiết nước, methanol, ethanol và ethyl acetat người ta nhận thấy dung môi chiết tối ưu là ethanol nước tỷ lệ 7:3 Mặc dù nước là dung môi chiết cho hiệu suất cao nhưng lại hòa tan nhiều tinh bột trong dịch chiết gây khó khăn cho quá trình lọc, dịch chiết thu được không trong và cao dẻo dính khó thu hồi [45]

Không chỉ có hiệu quả hơn phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, Hwa và cộng sự còn chứng minh được rằng, chiết bằng siêu âm còn cho hiệu suất chiết cao hơn phương pháp chiết dưới áp suất cao [31] Dưới đây là bảng so sánh

Mei-ba phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, áp suất cao và siêu âm:

Bảng 1.2 o sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng

Yếu tố Truyền thống Dưới áp suất cao Siêu âm

Thời gian chiết Tốn thời gian Ngắn (≤ 1 giờ) Trung bình (1-2h) Hiệu suất chiết Thấp Trung bình hoặc cao Cao

để duy trì áp suất cao Trung bình Nhiệt độ Cao hoặc

nhiệt độ phòng

Nhiệt độ cao

áp suất cao Nhiệt độ phòng

ăm 2007, Xu uaneng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chiết

isoflavonoid từ rễ Pueraria lobata bằng siêu âm (20k z, điện năng đầu vào thay

đổi từ 0-650W) Tác giả nhận thấy điện năng đầu vào và thời gian chiết là các yếu tố chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết khi sử dụng dung môi chiết là nước, n-butanol, ethanol 96% và ethanol 50% Dung môi chiết là ethanol 50% và nước cho hiệu suất chiết cao ethanol 95% và n-butanol Tốc độ chiết và hiệu suất chiết tăng lên rõ rệt khi phối hợp thêm siêu âm với tất cả các dung môi chiết kể trên ăng lượng điện đầu vào càng lớn trong khoảng 0-650W thì hiệu suất chiết đạt

được càng cao Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hiệu suất chiết isoflavonoid toàn phần cao hơn khi sử dụng siêu âm [41]

1.1.5.4 Chiết bằng vi sóng

ăm 2001, Zhenku Guo và cộng sự đã tiến hành chiết isoflavonoid từ sắn dây bằng vi sóng Kết quả gây bất ngờ khi thời gian chiết của phương pháp chỉ kéo dài 1 phút, ngắn hơn rất nhiều so với các phương pháp chiết truyền thống Nhóm nghiên cứu cũng nhận thấy rằng dung môi chiết, thời gian chiết, nhiệt độ

và áp suất chiết là những yếu tố ảnh hưởng đáng kể tới hiệu suất chiết của phương pháp Trong số các dung môi thử nghiệm, ethanol 70% cho là dung môi hiệu suất chiết isoflavonoid cao nhất, song để chiết puerarin thì nước lại là dung môi tốt hơn [47]

Vi sóng không chỉ giúp rút ngắn thời gian chiết mà còn làm cho quá trình cô cao trở nên nhanh chóng hơn rất nhiều Yang Hu và cộng sự đã chứng minh được rằng, sử dụng vi sóng có thể rút ngắn thời gian sấy khô dịch chiết xuống 10 lần

so với phương pháp cất thu hồi dung môi thông thường [45] ơn nữa, sóng viba không gây ra những tác động nào làm ảnh hưởng tới cấu trúc và thành phần các chất trong dịch chiết sắn dây thu được [45]

1.1.5.5 Chiết bằng dung môi siêu tới hạn

Trong những năm gần đây chiết xuất bằng dung môi tới hạn đã được áp dụng rộng rãi trong thực phẩm và y học CO2 siêu tới hạn là dung môi chủ yếu được sử dụng trong phương pháp này u điểm của CO2 siêu tới hạn là không độc, không gây cháy nổ, giá thành rẻ và dễ loại khỏi sản phẩm cuối

Nghiên cứu chiết puerarin từ rễ củ sắn dây Pueraria lobata, Lingzhao Wang

và cộng sự nhận thấy bốn yếu tố chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết puerarin từ

rễ củ Pueraria lobata là áp suất, nhiệt độ, thời gian chiết và thể tích đồng dung

môi Ở áp suất 20 Mpa hiệu suất chiết đạt được là 5,8 ± 0,3 mg/g, áp suất cao hơn

và thấp hơn đều làm giảm hiệu suất chiết puerarin Tương tự như vậy, chiết ở nhiệt độ 50C sẽ cho hiệu suất chiết cao nhất, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn đều làm giảm hiệu suất Thời gian chiết càng lớn, khả năng chiết kiệt puerarin càng cao, đặc biệt là trong khoảng thời gian dưới 100 phút Hiệu suất chiết puerarin

tăng lên không rõ rệt khi kéo dài thời gian hơn 100 phút Điều này có thể giải thích do độ tan của puerarin trong dung môi tới hạn và tốc độ chuyển khối đều là các yếu tốt phụ thuộc vào thời gian Do vậy, thời gian chiết xuất càng lớn sẽ giúp hòa tan được nhiều dược chất vào dung môi chiết hơn, và do đó tăng hiệu suất chiết lên Đồng dung môi được sử dụng là ethanol tuyệt đối gười ta thấy rằng hiệu suất chiết puerarin sẽ đạt giá trị tối đa khi thêm một lượng xác định ethanol (120 g) [26]

Từ những kết quả kể trên, các tác giả đã thực hiện tối ưu hóa và tìm được

điều kiện chiết puerarin tối ưu từ rễ củ Pueraria lobata bằng dung môi siêu tới

hạn ở 20,04 Mpa, 50,24C và thể tích đồng dung môi sử dụng là 181,24 ml ethanol trong tổng khoảng thời gian chiết là 90 phút [27]

1.1.5.6 Chiết bằng dung môi ion

Dung môi ion lỏng là dạng muối nóng chảy do trong thành của nó có cả cation và anion ở dạng không phân ly Phần cation thường là các cation hữu cơ [38]

Dung môi ion lỏng có nhiệt độ nóng chảy khá thấp, thường là dưới 100°C và thường ở dạng lỏng ở nhiệt độ phòng [38]

Trong chiết xuất hiện đại, dung môi ion lỏng được sử dụng thay thế cho các dung môi hữu cơ thông thường nhờ tính chọn lọc cao hơn các dung môi phân cực như nước, methanol; chiết được các phân tử hữu cơ phức tạp như cyclodextrins, glycolipid, kháng sinh, artermisinin và alkaloid …; dễ dàng rửa sạch hoặc loại đi khỏi sản phẩm chiết cuối [38]

Tuy nhiên, dung môi ion lỏng có nhược điểm là trong quá trình chiết xuất, một lượng lớn dung môi ion lỏng kỵ nước có thể bị lẫn nước tạo thành hệ hai pha dung môi ion/nước làm thay đổi độ nhớt, tỷ trọng, giảm dung lượng chiết và tính chọn lọc của dung môi trong quá trình chiết [18], [ 38] Để hạn chế nhược điểm này, Jie-Ping Pan và cộng sự đã tạo ra các hệ dung môi hai pha thân nước để

chiết puerarin từ rễ Pueraria lobatae từ các dung môi ion

1-carboxymethyl-3-methylimidazolium tertrafluoroborat ([COOHMIM]BF4), methylimidaziolium tertrafluoroborat ([C2OHMIM] BF4), 1-butyl-3-

1-hydroxyethyl-3-methylimidazolium hydroxid ([BMIM]OH) và 1-butyl-3-1-hydroxyethyl-3-methylimidazolium bromua ([BMIM]Br) với các muối vô cơ K2CO3, Na2CO3, K2HPO4, (NH4)2SO4,

Na2SO4, NaCl, NaH2PO4 Trong các hệ hai pha dung môi ion khảo sát, hệ

K2HPO4 0,30-0,42 g/mL, [BMIM]Br 0,30-0,36 g/ml và 1,0 ml dung dịch gốc puerarin, cho hiệu suất chiết puerarin cao nhất đạt trên hơn 99% với một lần chiết duy nhất [18]

Lợi dụng ưu điểm của phương pháp chiết bằng siêu âm và phương pháp chiết bằng dung môi ion, Jie-Ping Pan và cộng sự tiếp tục nghiên cứu chiết

puerarin từ rễ củ sấy khô Pueraria lobata với các dung môi ion [BMIM]Br,

[BMIM]BF4, [C2OHMIM]Cl, [C2OHMIM]BF4, [COOHMIM]BF4 kèm siêu âm

Sử dụng phương pháp phân tích mặt đáp để đánh giá các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất chiết puerarin và tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất Kết quả chiết xuất tối ưu thu được với 0,43g dược liệu trong 10ml dung môi ion [BMIM]Br 1,06 mol/L, siêu âm trong 27,43 phút ở 480W [19]

1.2.2.1 Lý tính: Puerarin là một isoflavonoid tự nhiên, được tìm thấy trong rễ

sắn dây Pueraria lobata và Pueraria thomsonii Về độ tan, puerarin:

 Ít tan trong nước, aceton, độ tan trong nước tăng lên khi tăng nhiệt độ

 Tan được trong hỗn hợp methanol – acid acetic, độ tan phụ thuộc vào nhiệt độ và tỷ lệ của acid acetic trong hỗn hợp Tăng nhiệt độ làm tăng độ tan, ngược lại tăng thể tích acid acetic trong hỗn hợp làm giảm độ tan của

puerarin trong hỗn hợp dung môi [12]

1.2.2.2 Hóa tính: Do cấu trúc phân tử của puerarin có một nhóm carbonyl

(>C=O) và 6 nhóm hydroxyl (−O ) trong đó có 2 nhóm hydroxyl phenol

nên puerarin có thể

 Tạo liên kết hydro với các hợp chất có nhóm carbonyl và hydroxyl khác

 Thể hiện tính acid của 2 nhóm −O phenol

Vì vậy, puerarin có thể tan trong các dung dịch kiềm và acid mạnh [18]

1.2.3 Kỹ thuật phân tích

ăm 2007, để xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong rễ củ sắn dây nhanh chóng, chính xác Chen Sibao và cộng sự đã tiến hành đánh giá và so sánh độ chính xác của phương pháp đo V với phương pháp LC Quét phổ dung dịch chuẩn của 7 loại isoflavonoid thường gặp và chiếm hàm lượng lớn trong rễ sắn dây, các tác giả nhận thấy rằng chỉ trừ genistin có cực đại hấp thụ ở 260nm còn 6 isoflavonoid còn lại đều có cực đại hấp thụ tại 250nm Nồng độ isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết rễ củ sắn dây tươi được định lượng theo phương pháp đo V bằng cách so sánh với mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn puerarin có nồng độ

từ 4,77 – 12,72µg/ml Kết quả cho thấy, hệ số tương quan khi định lượng

isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang với khi định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao là 0,975 Điều này chứng tỏ, kết quả định lượng isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang ở 250nm là tương quan với kết quả khi định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [11]

Cùng thời gian này, Xu Huaneng và cộng sự cũng sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm để định lượng hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết rễ

củ sắn dây nhờ tác dụng của siêu âm àm lượng isoflavonoid trong mẫu thử được ngoại suy từ đường chuẩn của dung dịch puerarin [41]

ăm 2008, trong nghiên cứu so sánh khả năng chiết isoflavonoid từ sắn dây bằng cách sử dụng siêu âm và bằng cách dùng vi sóng Yang Hu và cộng sự cũng sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm để định lượng isoflavonoid trong các dịch chiết thu được Dịch chiết isoflavonoid toàn phần được pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi đo quang ở 250nm Nồng độ isoflavonoid trong mẫu thử được tính toán từ đường chuẩn puerarin [45]

hư vậy, để định lượng isoflavonoid toàn phần từ dịch chiết hoặc trong nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm, so sánh với đường chuẩn của dung dịch puerarin Kết quả định lượng bằng phương pháp này có độ chính xác cao, phương pháp tiến hành nhanh chóng, đơn giản

Để định lượng riêng từng hoạt chất hoặc đánh giá kết quả của quá trình tinh chế, phương pháp V không còn có thể sử dụng được, lúc này LC là phương pháp thích hợp hơn cả

ăm 2001 Chen Bin và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xây dựng hương pháp LC đơn giản, nhanh chóng và có độ nhạy cao dùng để định lượng puerarin

và daidzin trong Pueraria lobata Isoflavonoid toàn phần chiết được từ P.lobata

bằng ethanol 70%, vi sóng trong 2 phút Phân lập bằng cột Symmetry 18 Thời gian lưu của puerarin và daidzin là 4,38 phút và 8,15 phút Đường chuẩn trong khoảng 0,115 ~ 1,38µg/ml có R=0,9991 đối với puerarin và trong khoảng 0,12 ~ 1,44 µg/ml

có R=0,9998 đối với daidzin Phần trăm tìm lại trung bình khoảng 103,31% với hệ

số phân tán CV=1,37% puerarin và 98,73% với CV=2,43% daidzin [10]

Để tách và định lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân và lá của

Pueraria thomsonii, Zhou Hong-Ying và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký

pha đảo RP-HPLC với cột Diamosil TM C18 (4,6 mm x 150 mm, 5µm) và gradient rửa giải, pha động là methanol – 1% dung dịch acid acetic băng Tốc độ dòng 1ml/phút Bước sóng phát hiện ở 250nm, nhiệt độ cột 25C Các tác giả nhận thấy rằng cả ba hợp chất đều có đường chuẩn với hệ số tương quan tốt (r > 0,9995) và phần trăm tìm lại trong khoảng 99,0% - 101,6% Hàm lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân cao hơn trong lá Nghiên cứu đã chứng minh được rằng phương pháp sắc ký pha đảo xây dựng được có độ nhạy cao và có thể sử dụng để sử dụng để

định lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân và lá của Pueraria thomsonii

[48]

ăm 2008, an Chen và cộng sự đã xây dựng được phương pháp LC khá

đơn giản và chính xác để xác định hàm lượng puerarin trong rễ Pueraria lobata Sử

dụng cột sắc ký C18, pha động là methanol/nước (25:75), detector UV ở bước sóng 250nm Kết quả cho thấy mối quan hệ tương quan chặt chẽ giữa nồng độ puerarin

và mật độ quang trong khoảng 20 ~ 140µg/ml (r=0,9999) Phần trăm tìm lại là 97,40%, RSD = 3,0% [29]

1.2.4 Tác dụng sinh học của puerarin

1.2.4.1 Tác dụng trên tim mạch

Gần đây có rất nhiều báo cáo đã xác minh tác dụng giãn mạch của puerarin trên chuột Tác dụng giãn mạch của puerarin trên động mạch chủ ngực của chuột do hoạt hóa điện áp dẫn lớn và kênh kali canxi kích hoạt đóng vai trò quan trọng trong điều hòa nhịp tim Hoạt động của kênh kali canxi kích hoạt gây ra hiện tượng ưu phân cực trên màng tế bào

Tác dụng thư giãn nội mạc nguyên vẹn của vòng động mạch chủ ở chuột đã bị làm hẹp trước đó bởi phenylephrine (10-9 – 10-6) hoặc KCl (10 – 100 mM) của

puerarin (50, 150 và 450µM) không phụ thuộc vào nồng độ Tuy nhiên, tác dụng thư giãn này không quan sát thấy ở vòng động mạch chủ của chuột đã bị loại bỏ lớp nội mạc, điều này chỉ ra rằng tác dụng giãn mạch của puerarin phụ thuộc vào hoạt động của lớp nội mạc Ngoài ra, tác dụng chống co mạch của puerarin đối với phenylephrine hoàn toàn bị vô hiệu hóa bởi dung dịch Ca2+ tự do Điều này có nghĩa

là tác dụng chống co mạch của puerarin liên quan đến việc kích hoạt dòng Ca2+ từ ngoại bào đi vào nội mô [43]

Puerarin bảo vệ tim mạch qua kênh natri và calci dạng L ở chuột lang và tế bào

cơ tâm thất ở chuột Tác dụng bảo vệ tim mạch của puerarin chống lại các tổn thương do thiếu máu cục bộ và tái tưới máu ở tế bào cơ tâm thất ,.;m/thông qua việc hoạt hóa các kênh kali nhạy cảm ATP ở ti thể và ức chế việc mở kênh vận chuyển trên màng ti thể Ở tim chuột cô lập đã được sử dụng puerarin (0,24 mmol/L) trước khi gây thiếu máu cục bộ, việc sản xuất formazan được tăng cường

và giảm giải phóng lactat dehydrogenase Tuy nhiên tác dụng này bị mất khi điều trị paxilline 1µmol/L (tác nhân block kênh kali canxi hoạt hóa) [43]

Puerarin có thể làm phục hồi sự biểu hiện mRNA của yếu tố tăng trưởng biến đổi tim 1 và AD3 đồng thời giảm sự biểu hiện mRNA ở SMAD7 tim trên chuột tăng huyết áp tự phát Các SMAD là các protein nội bào vận chuyển tín hiệu

từ yếu tố tăng trưởng biến đổi  trong tế bào, SMAD3 là loại SMAD kiểu receptor còn AD7 là AD đối kháng Các thay đổi biểu hiện gen này sẽ giúp cải thiện phì đại và xơ hóa cơ tim, đó có thể là cơ chế bảo vệ cơ tim của puerarin [43]

1.2.4.2 Giảm đau, hạ sốt

Tiêm màng bụng cho chuột dung dịch puerarin (25-200µM) làm giảm nhiệt độ

cơ thể và nồng độ IL-1, TNF- IL-6, prostaglandin E2 và NO, và chặn sự hoạt hóa NF-B và sự phosphoryl hóa MAPKs gây ra bởi LPS 100 µg/kg) ở chuột, chứng tỏ rằng tác dụng hạ sốt của puerarin liên quan tới việc điều chỉnh hoạt động tổng hợp

và giải phóng các chất gây sốt nội sinh thông qua ức chế hoạt động của NF-B và con đường MAPK [43]

1.2.4.3 Chống viêm

Đặc tính chống viêm của puerarin đã được xác minh trên mô hình tai chuột phù

và một vài mô hình tế bào viêm Puerarin tác dụng không phụ thuộc liều ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa và giáng hóa của inhibitor-B và chuyển vị của hạt nhân NF-B p65 subunit, làm ngăn cản quá trình biểu hiện protein và mRNA của protein phản ứng C với LPS kích thích tế bào máu đơn nhân ngoại biên uerarin ngăn chặn

sự biểu hiện của protein phản ứng C, iNOS, và cyclooxygenase-2, ức chế đường tín hiệu NF-B ở tế bào RAW264,7 có LPS hoạt động và ngăn chặn rõ rệt sự biến đổi hình thái của lipopolysaccharid ở tế bào RAW264,7 Ngoài ra, sự biểu hiện mRNA

ở NF-B p65 trong tế bào và nồng độ đại thực bào protein viêm 2 và TNF- trong

tế bào nổi đã bị ức chế bởi việc sử dụng puerarin trước đó [43]

1.2.4.4 Chống oxy hóa

Puerarin thu dọn cả các anion superoxid tạo ra bởi ánh sánh riboflavin và gốc hydroxyl sinh ra từ phản ứng Fenton, làm giảm phản ứng oxi hóa tán huyết hồng cầu và nồng độ malondialdehyd tạo ra từ H2O2 trong tế bào hồng cầu, sửa chữa những biến đổi trên LDL gây ra bởi tia cực tím và đồng II sulfat, cho thấy tác dụng chống peroxy hóa và tiềm năng sử dụng để phòng ngừa vữa xơ động mạch của puerarin uerarin ngăn cản quá trình oxi hóa LDL gây ra bởi ion Cu2+ trên invitro, tăng sản xuất prostacyclin huyết tương và DL, ức chế kết tụ và bám dính tiểu cầu, ngăn chặn quá trình hình thành cục nghẽn Ngoài ra puerarin còn có tác dụng làm giảm sản xuất LDL và cholesterol toàn phần, do đó làm tăng sản xuất HDL trên mô hình thỏ tăng lipid

1.2.4.5 Tác dụng kiểu estrogen

Puerarin vẫn thường được biết đến như là một phytoestrogen bởi tác dụng kiểu estrogen của nó trên nhiều mô hình động vật Tiêm ngắn hạn puerarin (0,7 mg/kg) làm tăng số lượng các tuyến tử cung ở chuột chưa trưởng thành và tiêm kéo dài puerarin (7 mg/kg) làm tăng rõ rệt tỷ lệ phần trăm các tế bào sừng hóa ở chuột cái trưởng thành, điều này chứng tỏ puerarin có tác dụng kiểu estrogen Sử dụng puerarin đường uống trong 3 tháng làm tăng cả áp lực bàng quang và niệu đạo, giảm béo phì và tăng cường trọng lượng tử cung ở chuột Các tác dụng này của puerarin

đều tương đương hoặc yếu hơn 17-estradiol (E2) Những kết quả này chứng tỏ rằng puerarin có thể giúp cải thiện tình trạng bế niệu, mang lại những lợi ích đáng

kể trong điều trị các rối loạn do mãn kinh uerarin làm tăng rõ rệt cân nặng, IGF-1

và biểu hiện C3 và nồng độ chất chống oxy hóa trong huyết thanh, đồng thời làm giảm nồng độ melondialdehyd và tổn thương D A ở tế bào lympho trên chuột, chứng tỏ rằng puerarin có tác dụng trên tử cung và có thể là một tác nhân trị liệu có hiệu quả trong việc chống tăng sản nội mạc tử cung và hội chứng tiền kinh nguyệt

1.2.4.6 Ức chế các rối loạn do rượu

Khả năng sống của tế bào, sự tích lũy lipid bên trong tế bào ở các tế bào gan

ủ ethanol đã được khôi phục về bình thường sau khi điều trị bằng puerarin Ngoài ra, puerarin còn kích thích quá trình phosphoryl hóa AMPK, và block các protein ribosome S6 và protein 4E-binding là những protein mục tiêu ở động vật

có vú của rapamycin (mammalia targets of rapamycin - mTOR), phục hồi cơ chế

tự tiêu hủy ở các tế bào sản xuất ethanol Những kết quả này chỉ ra rằng cơ chế bảo vệ của puerarin có liên quan đến con đường AMPK/mTOR Trong tế bào

mô đệm tủy xương gây ngộ độc bằng rượu, puerarin ức chế tăng sinh số lượng

tế bào mỡ, ức chế sản xuất triglycerid và tăng cường hoạt động của phosphatase kiềm, osteocalcin và biểu hiện mRNA của osteocalcin Điều đó cho thấy puerarin có tác dụng phòng ngừa các rối loạn liên quan tới nghiện rượu [43]

1.2.4.7 Chống tiểu đường và ức chế các biến chứng tiểu đường

uerarin đã được sử dụng để điều trị đái tháo đường ở Trung Quốc từ những năm 1990 Tiêm tĩnh mạch puerarin giúp làm hạ đường huyết, tăng mR A và tăng biểu hiện protein vận chuyển glucose trong cơ, kích thích tuyến thượng thận tăng tiết -endorphin, làm giảm đường huyết ở chuột bị gây tiểu đường bởi streptozotocin Ở chuột đực Sparague-Dawley được cho ăn với chế độ ăn giàu chất béo, các dấu hiệu như tăng trọng lượng cơ thể và giảm glucose dung nạp/tăng đề kháng insulin đã giảm, sự tăng nồng độ resistin và leptin huyết tương cũng được ngăn chặn khi điều trị bằng puerarin (100 và 20 mg/kg) [43]

uerarin giúp tăng cường đáng kể sự hấp thu glucose vào các tế bào nhạy cảm insulin, giảm lượng đường trong máu, triglycerid, insulin, cholesterol toàn phần và trọng lượng cơ thể ở chuột Zucker béo phì và chuột mắc tiểu đường type 2 theo di truyền Sự chuyển hóa glucose và insulin được cải thiện đáng kể ở nhóm chuột được thêm puerarin sắn dây vào chế độ ăn hằng ngày [43]

1.2.5 Các nghiên cứu tinh chế puerarin hiện nay

ăm 2004, Xiangling He và cộng sự sử dụng sắc ký hấp phụ trên epichlorohydrin gắn ligand -cyclodextrin ha động là dung dịch acid acetic 10% Dung lượng phân tích khoảng 1,2 mg dịch chiết uerarin thu được có độ tinh khiết khoảng 98% [40]

Có thể thấy, phương pháp sắc ký tách hoạt chất với độ tinh khiết cao (>90%) từ một lượng rất nhỏ dịch chiết (<100mg) hương pháp này thích hợp

để tinh chế ra chất chuẩn cho định lượng nhưng với lượng mẫu nhỏ khó triển khai trên quy mô lớn

Mặc dù phương pháp tinh chế bằng sắc ký cho ra các sản phẩm có độ tinh khiết cao song chỉ thực hiện với cỡ mẫu nhỏ, chi phí tốn kém chủ yếu dùng nghiên cứu thành phần của dược chất hơn là tinh chế sản xuất trên quy mô công nghiệp Và do vậy, bên cạnh phương pháp sắc ký người ta luôn phải nghiên cứu tìm ra các phương pháp tinh chế hoạt chất khác rẻ tiền, dễ triển khai trên quy mô lớn với mức độ tinh khiết chấp nhận được

hương pháp đơn giản nhất có thể kể đến đó là phương pháp của

Hua-Neng Xu và cộng sự Chiết rễ củ sắn dây Pueraria lobata bằng hỗn hợp dung

môi n-butanol/nước (1:1) ở 25C trong 6 giờ Dịch chiết thu được để lắng cho tách pha thu lấy phần nước để tinh chế puerarin (daidzein phân bố chủ yếu ở pha n-butanol) Phần dịch này được lắc với n-butanol trong 1 giờ, sau đó điều chỉnh

pH của pha nước bằng acid HCl về 4,0, lúc này puerarin sẽ chuyển sang pha butanol Thu lấy pha n-butanol, tiếp tục lắc với đồng thể tích nước trong 1 giờ,

n-pH của pha nước được điều chỉnh về giá trị 8,0 Lúc này puerarin lại chuyển sang pha nước Thu lấy phần chiết nước Phân tích HPLC cho thấy sau 2 lần chuyển pha puerarin thu được tương đối tinh khiết [16]

Tại Việt Nam, tinh chế puerarin từ dịch chiết sắn dây chưa được quan tâm nghiên cứu mặc dù đây là thành phần chiếm hàm lượng lớn và cho tác dụng sinh học chủ đạo của sắn dây Hiện tại chỉ có duy nhất nghiên cứu của Dược sĩ Lê Thùy Linh đã tiến hành tinh chế được daidzein bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi CCl3 : Methanol (98:2) [5]

Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng

trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc

Cao đặc: Là khối đặc quánh àm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao

không quá 20%

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô

không được có độ ẩm lớn hơn 5% [2]

1.3.3 Kỹ thuật điều chế

Quy trình điều chế cao khô gồm những giai đoạn sau:

1.3.3.1 Chuẩn bị dung môi, dược liệu

Dược liệu thường được sấy khô, chia nhỏ đến kích thước thích hợp Một số dược liệu đặc biệt cần diệt enzym hoặc loại chất béo Dung môi điều chế cao thường là nước, ethanol, ete ethylic Để làm tăng độ tan của hoạt chất có thể acid hóa hoặc kiềm hóa dùn môi bằng acid hydrochloric, acid acetic, amoniac, natri

hydroxyd

1.3.3.2 Chiết xuất hoạt chất

Tùy theo bản chất dược liệu và dung môi, tiêu chuẩn chất lượng thành phẩm cũng như điều kiện trang thiết bị và quy mô sản xuất, có thể sử dụng các phương pháp: Ngâm, ngấm kiệt, chiết xuất ngược dòng hay các phương pháp thích hợp

khác

1.3.3.3 Loại bớt tạp chất

Cần phải loại tạp chất vì chúng thường dễ phân hủy ảnh hưởng đến chất lượng cao thuốc Trường hợp điều chế cao đặc, cao khô, nếu hàm lượng hoạt chất chưa đủ quy định cũng có thể cũng có thể tiến hành loại bớt tạp chất

1.3.3.4 Cô đặc và sấy khô

Để điều chế cao thuốc thường phải tiến hành loại dung môi Dịch chiết được

cô đặc đến tỷ lệ dung môi quy định, với cao đặc và cao khô thì sau khi cô đặc,

sấy đến độ ẩm không quá 20% đối với cao đặc và không quá 5% đối với cao khô

giai đoạn cô đặc [1]

1.3.4 Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc

Cảm quan: Cao thuốc phải có thể chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định.

Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao Mất khối lượng do làm khô: Thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô

không quá 5%

Các chỉ tiêu khác: Độ nhiễm khuẩn, giới hạn thuốc bảo vệ thực vật, kim loại

nặng, chất bảo quản, định tính, định lượng… [2]

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

a Củ sắn dây tươi và khô thu ở Phú Thọ, Hải Dương, inh Bình Dược liệu tươi

đem rửa sạch, thái lát rồi xay thô trước khi đem vào chiết xuất

b Chất đối chiếu: Puerarin 82,31% (Trung Quốc)

c Hóa chất:

Bảng 2.1 óa chất sử dụng

STT Hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Ethanol 96% Việt Nam DĐV IV

2 Cloroform Trung Quốc Tinh khiết phân tích

3 Ethyl acetat Trung Quốc Công nghiệp

4 Methanol erck (Đức) Phân tích; HPLC

2.1.3 Phương tiện và máy móc

 áy siêu âm ltrasonic LC 60 (Đức)

 Máy cất quay Buchi B480 (Thuỵ Sỹ)

 Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ)

 Cân kỹ thuật artorius B 2001 (Đức)

 áy đo quang ITACHI U-1900

 Đèn tử ngoại

 Tủ sấy E ERT (Đức)

 Máy xay búa

 Máy xay sinh tố

 Hệ thống lọc hút Buchner

 Cân xác định hàm ẩm nhanh Precisa XM 60 (Thụy ĩ)

 áy đo tỷ trọng biểu kiến ERWEKA V (Đức)

 Hệ thống phun sấy LPG-5 Centrifugal Spray Dryer (Changzhou Jinqiao, Trung Quốc) công suất 5 L/giờ

 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao himadzu ( hật Bản), gồm:

+ Bộ phân loại khí DGU – 14A

+ Bơm cao áp LC – 10ADVP

+ Buồng chứa cột CTO – 10AVP

+ Bộ điều khiển SCL – 10AVP

+ Detector dãy diod quang SPD – M10AVP

+ Phần mềm Class vp 6.14

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu khô

 Xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin trong sắn dây khô

 Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô

 Tinh chế dịch chiết, khảo sát một số phương pháp loại tạp

2.2.2 Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi

 Xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin trong sắn dây tươi

 Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi

 Tinh chế dịch chiết, khảo sát một số phương pháp loại tạp: sử dụng nhiệt độ,

sử dụng ethanol, kết hợp cả ethanol và nhiệt độ

2.2.3 Điều chế cao khô

 Điều chế cao khô bằng phương pháp phun sấy

 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng cao khô

2.2.4 Phân lập puerarin và daidzin

 Phân lập daidzin và chứng minh cấu trúc sản phẩm

 Phân lập puerarin và chứng minh cấu trúc sản phẩm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin

2.3.1.1 Định lượng isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang

Qua tham khảo các tài liệu [11], [41], [45] chúng tôi xây dựng phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần trong dược liệu và trong dịch chiết bằng quang phổ hấp thụ V như sau

Cân chính xác khoảng 12,1 mg chất đối chiếu (chứa 82,31% puerarin) tương đương với khoảng 10,0 mg puerarin hòa tan trong khoảng 20ml ethanol 96%, sau đó chuyển vào bình định mức 50ml Thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều được dung dịch A Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch A cho vào bình định mức 25 ml, thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch, lắc đều được dung dịch chất đối chiếu có hàm lượng puerarin khoảng 8µg/ml Lọc qua màng 0,45µm, quét phổ để chọn ra bước sóng thích hợp cho định lượng

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Lấy chính xác 20,0 ml dung dịch A cho

vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều được dung dịch B Từ dung dịch B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 1,6; 3,2; 4,8; 6,4; 8 µg/ml theo như bảng sau:

Mẫu trắng là dung dịch ethanol 19,2% (10ml dung dịch ethanol 96% pha loãng với nước cất vừa đủ 50ml) Mẫu trắng và mẫu chuẩn sau khi pha được lọc qua màng 0,45µm, đo độ hấp thụ tại bước sóng đã chọn, đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để xây dựng đường chuẩn

Với mẫu thử là sắn dây tươi: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu,

thêm 100 ml ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố Chuyển hết vào bình định mức 500 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong

bể siêu âm au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn vào bình định mức 100

ml, thêm 5 ml ethanol 96% và nước cất vừa đủ, lắc đều được dung dịch thử

Với mẫu thử là sắn dây khô: Cân chính xác khoảng 0,4 g dược liệu,

thêm 40 ml ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong

bể siêu âm au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong Lấy chính xác khoảng 5 ml dịch trong vừa gạn vào bình định mức 50

ml, thêm 5 ml ethanol 96% và nước cất vừa đủ, lắc đều được dung dịch thử

Mẫu thử là cao đặc, cao khô: Cân chính xác khoảng 0,1 g cao xác định

hàm lượng, hòa tan bằng ethanol 96%, chuyển vào bình định mức 50 ml, thêm ethanol 96% đến vừa đủ, lắc đều Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 50 ml, thêm 9,0 ml ethanol 96% và bổ sung nước cất vừa đủ, lắc đều Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45µm trước khi đo quang

Hàm lượng isoflavonoid trong nguyên liệu được tính theo công thức sau:

Trong đó

At, Ac : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Cc : Nồng độ dung dịch chuẩn

Vchiết : Thể tích dịch chiết

K : Tích các hệ số pha loãng

mt : Khối lượng dược liệu đem vào chiết xuất

àm lượng isoflavonoid trong cao được tính theo công thức

Trong đó

At, Ac : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

 Thông số máy sắc ký:

 Bộ phân loại khí DGU – 14A

 Bơm cao áp LC – 10ADVP

 Buồng chứa cột CTO – 10AVP

 Bộ điều khiển SCL – 10AVP

 Detector dãy diod quang SPD – M10AVP

 Phần mềm Class vp 6.14

 Cột sắc ký Alltech C18 với kích thước cột 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm

 ha động: methanol nước = 30:70, pha động được lọc qua màng 0,45

µm, siêu âm trong 15 phút

 Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

 Thể tích tiêm mẫu: 5 µl

 Detector UV phát hiện ở bước sóng 250 nm

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,125 g chất đối

chiếu puerarin 82,31% Hòa tan trong khoảng 50ml ethanol 96% sau đó chuyển vào bình định mức 100 ml Thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch được dung dịch

A Lấy chính xác khoảng 5,0 ml dung dịch A, pha loãng 10 lần bằng nước cất được dung dịch B

Từ dung dịch B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,01 mg/ml đến 0,2 mg/ml theo bảng sau:

Mẫu thử là sắn dây khô: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu, thêm 40 ml

ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố Chuyển hết vào bình định mức 100

ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong Lấy chính xác khoảng 5

ml dịch trong vừa gạn pha loãng với pha động thành 25ml Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký

Mẫu thử là sắn dây tươi: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu, thêm 40 ml

ethanol 70%, xay mịn bằng máy xay sinh tố Chuyển hết vào bình định mức 100

ml, thêm ethanol 70% đến vừa đủ, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm au đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong Lấy chính xác khoảng 5

ml dịch trong vừa gạn pha loãng với pha động thành 25ml Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký

Mẫu thử là cao đặc, cao khô: Cân chính xác khoảng 0,115g cao Hòa tan

trong khoảng 20ml ethanol 96% sau đó chuyển vào bình định mức 50 ml Thêm

ethanol 96% vừa đủ đến vạch Pha loãng dung dịch này 10 lần bằng pha động, sau đó lọc qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký

àm lượng puerarin trong nguyên liệu, trong cao đặc và cao khô được tính theo công thức:

Trong đó

St, Sc : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

 Bản mỏng: Silicagel 60F254, hoạt hoá ở 110 oC trong 1 giờ

 Dung môi khai triển:

Hệ 1: Cloroform-methanol-nước (7:2,5:0,25)

Hệ 2: Cloroform-methanol (7:3)

 Dung dịch thử:

+ Mẫu thử là dịch chiết: Lấy một thể tích dịch chiết tương đương với 1

mg isoflavonoid toàn phần, cô cách thủy đến cắn Hoà cắn trong 1 ml ethanol

+ Mẫu thử là chất chưa biết: Hòa tan trong ethanol 96% để được dung

dịch có nồng độ khoảng 1 mg/ml

 Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chất đối chiếu trong methanol để có nồng

độ puerarin khoảng 1 mg/ml

Sau khi khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra, để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

2.3.3 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô

Hầu hết các isoflavonoid trong sắn dây đều ở dạng glycosid, chỉ có một vài chất là aglycon như daidzein, genistein Vì vậy có thể lựa chọn dung môi phân cực

để chiết isoflavonoid từ sắn dây u tiên chọn dung môi rẻ tiền, không độc, dễ kiếm, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các dung dịch ethanol có nồng độ khác nhau và nước Cân xác định khối lượng cao thu được với mỗi dung môi, định lượng hàm lượng isoflavonoid và puerarin trong dịch chiết và cao thu được Tính hiệu suất của quá trình chiết dựa vào hàm lượng isoflavonoid chiết được

Hiệu suất của quá trình chiết được tính theo công thức:

Trong đó misoflavonoid/dl là lượng isoflavonoid có trong dược liệu đưa vào chiết

misoflavonoid/cao là lượng isoflavonoid có trong cao thu được

2.3.4 Phương pháp chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi

Nhằm tận dụng quy trình chế tinh bột từ sắn dây tươi, chúng tôi kết hợp quá trình chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi với quá trình thu tinh bột Quy trình chiết xuất được tóm tắt theo sơ đồ trong hình 2.1

ô tả các bước tiến hành

Bước 1 Chuẩn bị nguyên liệu: Sắn dây tươi mua về được xử lý trong vòng 3

ngày, củ được rửa sạch đất và vỏ đen bên ngoài, cắt bỏ những phần bị hỏng

Để ráo nước và cân xác định khối lượng au đó xay mịn thành bột nhão, trước đó có thể thái thành lát để xay dễ dàng hơn

Bước 2 Tiến hành chiết xuất: Bột nhão được hòa vào nước với tỷ lệ 1:2 (w/w)

rồi vắt loại bã bằng túi vải Bã sắn được rửa lại một lần với lượng nước như lần một Gộp các dịch chiết, để lắng qua đêm, gạn, lọc qua vải lấy phần dịch trong; đây là dịch chiết chứa isoflavonoid Lấy 100ml dịch chiết này