Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3 methoxim isatin hướng ức chế histon deacetylase

Trong các chất đã tổng hợp, nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế histon deacetylase đã cho thấy có hoạt tính tốt trên tế bào ung thư trong th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-  -

LÊ THỊ THẢO

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƯỚNG ỨC

CHẾ HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-  -

LÊ THỊ THẢO

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-METHOXIM-ISATIN HƯỚNG ỨC

CHẾ HISTON DEACETYLASE

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Đào Thị Kim Oanh

2 PGS.TS Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một

số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase”, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, bạn bè và

đồng nghiệp

Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Đào Thị Kim Oanh, PGS TS Nguyễn Hải Nam – những người thầy đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài tạiBộ môn Hóa dược – Trường Đại học Dược Hà Nội

Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Huỳnh Kim Thoa – người Thầy đã tạo điều kiện cho tôi cơ hội được nâng cao kiến thức và có thời gian để thực hiện cơ hội đó

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, các bạn sinh viên nhóm nghiên cứu Hóa dược - Bộ môn Hóa dược – Trường Đại học Dược Hà Nội, các anh chị Khoa hóa học – Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường Đại học Quốc gia Chungbuk (Cheongji, Hàn Quốc) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài này

Cuối cùng, xin gửi lời tri ân sâu sắc đến chồng, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày 29 tháng 8 năm 2014

Lê Thị Thảo

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và sự hoạt động bất thường của HDAC 5

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC

HƯỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY

10

1.3.1 Các nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic trên thế giới 10

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 27

37

3.1.2.6 Tổng hợp

ethyl-7-(3-(methoxyimino)-5-methyl-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIf)

37

3.1.2.7 Tổng hợp ethyl-7-(7-cloro-3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanoat (IIIg)

37

3.1.3 Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-methoxyimino-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và dẫn chất (IVa-g)

3.6 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ GIỐNG THUỐC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP 49

4.1.1 Tổng hợp 3-(methoxyimino)-2-oxoindolin và các dẫn chất (IIa-g) 50

4.1.3 Phản ứng tổng hợp dãy chất acid hydroxamic (IVa-g) 51

HAT Histon acetyl transferase

HDAC Enzym histon deacetylase

SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic

SW620 Tế bào ung thư ruột kết

TLC Phương pháp sắc ký lớp mỏng

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV 4

Hình 1.3: Vai trò của HDAC trong sinh lý tế bào ung thư 5

H h 1.4: HDACIs có cấu trúc hydroxamat 10

Hình 1.5: Các dẫn chất thế 2’ của SAHA 12

Hình 1.6: Các dẫn chất -alkoxy của SAHA 12

Hình 1.7: Các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid 13

Hình 1.8: SAR của các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC 14

Hình 1.9: Các dẫn chất amid ngược của SAHA 14

Hình 1.10: Các dẫn chất có gắn thêm O, S vào cầu nối của SAHA 16

Hình 1.11: Các dẫn chất phenyl-hydroxamic tương tự SAHA 16

Hình 1.12: Các aryl-hydroxamic tương tự SAHA 17

Hình 1.13: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic 17

Hình 1.14: Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự SAHA 18

Hình 1.15: Một số acid phenylthiazol hydroxamic 19

Hình 1.23: Cấu trúc của các dẫn chất 3-oxim-isatin 24

Hình 3.1: Kết quả phân tích Western blot của các chất IVa – g 47

Hình 3.2: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC8 48

Hình 3.3: Kết quả docking của chất IVa và SAHA với HDAC2 48

Hình 4.1: Hiện tƣợng hỗ biến của nhóm chức hydroxamic 53

Hình 4.2: Phổ hồng ngoại của chất IVa 54

Hình 4.3: Phổ khối lƣợng của chất IVa 55

Hình 4.9: Kết quả phân tích Western blot của 2 dãy chất 19a-g và IVa-g 64

Hình 4.10: Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào ung thƣ in vitro của các dẫn

chất IVa-g

67

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại các chất ức chế HDAC 7

Bảng 1.2: Khả năng ức chế của một số HDACIs trên HDAC nhóm I, II, IV 8

Bảng 1.3: Hoạt tính ức chế HDAC và kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

in vitro của các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid

13

Bảng 1.4: Tác dụng kháng các tế bào ung thư in vitro của N25 21

Bảng 1.5: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và tác dụng ức chế

enzym HDAC của các chất 18a-d

Bảng 3.4: Giá trị Rf và Tnc của các chất IVa-g 41

Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ IR của các chất IVa-g 42

Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất IVa-g 43

Bảng 3.7: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất IVa-g 44

Bảng 3.8: Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất IVa-g 46

Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất IVa-g theo quy tắc

Lipinsky

49

Bảng 4.1: Bảng so sánh phổ cộng hưởng từ 1H – NMR của 2 chất 19e và IVe 60

Bảng 4.2: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các chất IVa-g 66

Bảng 4.3: So sánh tác dụng kháng tế bào ung thư của 2 dãy IVa-g và 19a-g 69

Bảng 4.4: So sánh giá trị logP của các chất 19a-g và IVa-g 70

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp các dẫn chất -alkoxy của 24

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp acid biaryl hydroxamic 25

Sơ đồ 1.3: Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic 25

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các dẫn chất mang khung

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIa - g 33

Sơ đồ 3.3: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IIIa - g 36

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp các chất IVa-g 38

Sơ đồ 4.1: Cơ chế phản ứng thế ái nhân alkyl tạo IIIa-g 50

Sơ đồ 4.2: Phản ứng thế ái nhân acyl 51

Sơ đồ 4.3: Cơ chế phản ứng tổng hợp acid hydroxamic IVa-g từ ester 51

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là bệnh khó có thể điều trị khỏi mặc dù đã có những tiến bộ vượt bậc trong y học trong hai thập kỷ qua Theo ước tính và thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 9 – 10 triệu người mắc ung thư mới và một nửa trong số đó chết vì căn bệnh này Chỉ tính riêng năm 2012 đã có 8,2 triệu người chết vì ung thư, đây trở thành căn bệnh gây tử vong nhiều nhất trên Thế giới [51]

Để giảm thiểu tỷ lệ tử vong trong ung thư, việc phòng và điều trị ung thư đóng vai trò vô cùng quan trọng Với những tiến bộ trong y học, di truyền học và sinh học phân tử thế kỷ 21, đặc biệt khi tìm ra bản đồ gen người, điều trị ung thư đã

có những bước tiến mới trong phẫu thuật, xạ trị, điều trị hóa chất và gần đây nhất là điều trị ung thư hướng đích Phương pháp điều trị này có hiệu quả hơn và ít gây độc hơn so với các phương pháp điều trị ung thư đã có trước đó Mục tiêu phân tử trong điều trị ung thư hướng đích bao gồm các enzym đặc hiệu, protein hoặc thụ thể khác nhau có liên quan đến sự phát triển tế bào ung thư, ví dụ như: proteasome, telomerase, histon deacetylase, hoặc protein kinase, [12] Nghiên cứu thuốc điều trị ung thư hướng đích hiện nay chủ yếu ở giai đoạn tiền lâm sàng, một số đang trong giai đoạn lâm sàng và số ít đã được FDA phê duyệt đưa vào điều trị Trong số

đó, histon deacetylase (HDAC) là mục tiêu phân tử đem lại nhiều kết quả khả quan khi nghiên cứu, thiết kế và thử nghiệm lâm sàng các thuốc tác dụng hướng ức chế

enzym này [5, 8, 33, 50] Acid suberoylanilid hydroxamic (Vorinostat, Zolinza ®)

là chất ức chế HDAC đầu tiên đã được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào

T dưới da [37] Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC khác cũng đã được nghiên cứu và đang đưa vào thử nghiệm lâm sàng như NVP-LAQ824, MS-275, cyclodepsipeptid FK-228, Đáng ngạc nhiên, các chất ức chế HDAC thử nghiệm

có hiệu quả điều trị cao và độc tính thấp đối với tế bào lành tính [33], vì thế hiện nay chất ức chế HDAC trở thành mục tiêu hấp dẫn và mang đầy tính khả quan trong công cuộc nghiên cứu tìm ra chất chống ung thư của các công ty dược phẩm và các

tổ chức chính phủ

Tại Trường Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thiết kế công thức

và tổng hợp các chất ức chế HDAC Trong các chất đã tổng hợp, nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế histon

deacetylase đã cho thấy có hoạt tính tốt trên tế bào ung thư trong thử nghiệm in

vitro, đặc biệt là một số dẫy chất mang khung benzothiazol [1, 40, 41],

3-oxim-isatin [4] Với mong muốn đem lại nhiều ứng viên lâm sàng để tìm ra thuốc điều trị ung thư mới, theo hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 3-methoxim-isatin hướng ức chế histon deacetylase” với mục tiêu:

1 Tổng hợp N-hydroxy-7-(3-(methoxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)heptanamid và một số dẫn chất

2 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase và hoạt tính kháng tế bào ung thư in

vitro trên một số dòng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

Chươ g 1 TỔNG QUAN

1.2 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

1.2.1 Khái niệm HDAC

Histon – một phần của cấu trúc nhiễm sắc thể, là các protein cơ bản giàu acid amin như lysine, arginin, được chia thành 5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4) [26] Các cặp histon lõi (H2A, H2B và H3, H4) có 2 phần quan trọng: đuôi C nằm

bên trong lõi và đầu N nằm bên ngoài nucleosom Phần đầu N tận của histon, đặc

biệt H3, H4 là nơi diễn ra rất nhiều quá trình biến đổi khác nhau trong phiên mã như acetyl hóa/deacetyl hóa lysin, methyl hóa lysin và arginin, phosphoryl hóa serin và ubiquinin, sumoyl hóa lysin [52]

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo nucleosom [52]

Histon có thể tồn tại ở một trong hai dạng đối lập nhau là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa Các enzym đóng vai trò trong sự chuyển đổi này là histon acetyl transferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) [13, 50] Histon acetyl transeferase (HAT) xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến liên kết với nhóm ε-amino của lysine ở phần đầu N của histon, sự chuyển đổi này xảy ra nhiều hơn trên histon H3 và H4 Sự acetyl hóa histon làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dương của phần đầu N của histon, do vậy làm giảm ái

lực của histon với phần điện tích âm trên ADN [45] Ngược lại, histon deacetylase (HDAC) xúc tác việc loại bỏ nhóm acetyl của lysin ở phần đầu N của histon, dẫn đến nhiễm sắc thể bị đóng xoắn và ức chế quá trình phiên mã [18]

1.1.2 Phân loại HDAC

HDAC được bảo tồn trong quá trình tiến hóa và biểu hiện trong tổ chức của các sinh vật từ đơn bào nguyên thủy cho tới loài người Hiện nay, 18 HDAC được tìm thấy và chia thành 4 nhóm: I, II, III và IV [13, 35]

HDAC nhóm I, II, IV là những enzym phụ thuộc Zn2+ và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelat với Zn2+ [50], khác với các HDAC nhóm III có cơ chế hoạt động phụ thuộc cofactor NAD+ Các HDAC đều có trung tâm hoạt động gồm 2 phần chính: ion Zn2+ là coenzym của các HDAC và kênh enzym dạng túi hình ống Cấu trúc túi rất linh động, có thể biến đổi để phù hợp với chiều dài của các cơ chất khác nhau Trên miệng túi có 1 vành nhỏ được tạo nên từ 1 vài vòng xoắn protein, phần vành này sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC [25, 49]

Hình 1.2 Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV [25]

(Ion Zn2+ biểu thị là hình tròn màu tím) HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà rất nhiều protein không histon cũng bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của các HDAC Thuật ngữ các chất ức chế HDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC “kinh điển” nhóm I, II và IV [9] – mục tiêu phân tử mà các nghiên cứu điều trị ung thư hướng đích đang tiến hướng đến

1.1.3 Mối liên quan giữa u g thư và sự hoạt động bất thường của HDAC

Hoạt động của HDAC ảnh hưởng tới quá trình acetyl hóa histon Do đó, sự mất cân bằng trong hoạt động của enzym này có thể dẫn tới những thay đổi trong cấu trúc của NST và sự rối loạn điều hòa phiên mã các gen tham gia vào điều khiển chu trình tế bào, phân hóa và/hoặc gây chết tế bào, do đó dẫn đến ung thư [13]

Sự gia tăng bất thường của HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6 được quan sát trong một số bệnh ung thư tạng đặc như ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ dày, trực tràng, ung thư vú và ung thư não cũng như các bệnh lý ác tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T ngoại vi, bệnh u lympho tế bào B) và bệnh u lympho da tế bào T Việc tìm ra các cơ chất của HDAC là các protein như p53, GATA1, GATA2, E2F, Rb, Bc16, Gli1,… liên quan đến xu hướng gây ung thư và tiến triển của bệnh ung thư đã khẳng định vai trò của HDAC trong ung thư [16], chúng có liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết

tế bào theo chương trình trình kể cả sự xâm lấn, sự di chuyển và sự tạo mạch [20,

28, 48, 50]

Hình 1.3 Vai trò của HDAC trong sinh lý tế bào ung thư [50]

Như vậy ức chế quá trình phiên mã được điều hòa bởi sự gia tăng HDAC và

có thể kiểm soát ung thư bằng cách ức chế hoạt động của HDAC, chính điều này đã

mở ra tương lai mới hứa hẹn hơn cho điều trị ung thư hướng đích

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACIs)

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC

Trichostatin (TSA) là dẫn chất hydroxamat tự nhiên đầu tiên có tác dụng ức chế trực tiếp HDAC được Yoshida và cộng sự phát hiện ra năm 1990 với tác dụng chống nấm Sau đó, dựa vào những hiểu biết về mối liên quan giữa HDAC và ung thư đồng thời xác định được cấu trúc 3D của các HDAC, một số dẫn chất ức chế HDAC đã được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng để ứng dụng trong điều trị ung

thư [36] Năm 2006 và 2009, SAHA (Vorinostat ® , Merck) và Depsipeptid

(Istodax®, Celgene) đã được FDA cấp phép dùng trong điều trị u lympho tế bào T dưới da

Cho tới nay, nhiều HDACIs được tìm thấy có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với cấu trúc đa dạng Dựa vào những cấu trúc hóa học này, HDACIs được chia thành 5 nhóm: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton (bảng 1.1)

Mỗi nhóm HDACIs có những hạn chế riêng.Các acid hydroxamic là những chất bị chuyển hóa nhanh và ức chế không chọn lọc các HDAC Các benzamid và các acid béo có hiệu lực hạn chế Dẫn chất ceton dễ bị khử hóa trong huyết tương Trong khi các peptid vòng có cấu trúc phức tạp, khó tạo thành về mặt hóa học, gây

ra sự chảy máu khó chữa và FK-228 trong cấu trúc có một phần liên kết với ion

Zn2+ có chứa lưu huỳnh không mong muốn [24]

Khi nghiên cứu về hoạt tính của HDACIs trên các HDAC kinh điển, các nhà khoa học nhận thấy hoạt tính sinh học của các HDACIs phụ thuộc vào khả năng liên kết với túi enzym và khả năng tạo phức với ion Zn2+ ở phần đáy kênh của các chất này Do HDAC được bảo vệ trong túi enzym, hầu hết các HDACIs đều không thể ức chế chọn lọc riêng một HDAC nào, chúng có thể ức chế tất cả các HDAC hoặc ức chế đồng thời nhiều thành viên HDAC khác nhau (bảng 1.2)

Bảng 1.1.Phân loại các chất ức chế HDAC [18]

N

O

Oxamflatin

O NHOH H

S O O

NVP-LAQ-824

H

NHOH O

O

N OH

H 3 C

CH 3

O NH O

CH 3

CH 3

O HN O S

Acipidin CHAP

Benzamid

MS-275

N O O N

Alpha-Bảng 1.2 Khả năng ức chế của một số HDACIs trên HDAC nhóm I, II, IV [50]

Ức chế yếu nd: không có dữ liệu công bố

Trong số các HDACIs, nhiều chất đang được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng pha I, II hoặc III trên các đối tượng bệnh nhân ung thư máu, ung thư thể rắn hoặc ung thư các cơ quan khác trong cơ thể như: Phenyl butyrate, SAHA, LAQ824, Acid valproic, PXD101, ITF-2357, Depsipeptid, MS275, CI-994, Pyroxamid,… [36] Những dữ liệu bước đầu của các thử nghiệm lâm sàng cho thấy, HDACIs có hiệu quả tốt trong điều trị ung thư và độc tính thấp đối với các tế bào lành tính Các

ưu điểm trong lâm sàng này khiến HDACIs trở thành mục tiêu phân tử đầy hứa hẹn cho tương lai điều trị ung thư và là hướng nghiên cứu khả quan cho các nhà khoa học.

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Có nhiều bằng chứng cho rằng HDACIs có tác dụng chống ung thư do tác động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào, làm mất sự điều hòa trong

tế bào ác tính Trong đó, các cơ chế chính quyết định hoạt tính chống ung thư của HDACIs là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và gián tiếp gây ra sự chết

tế bào theo chương trình Ngoài ra, HDACIs còn ức chế sự phát triển của khối u bằng cách ngăn cản cung cấp oxy và chất dinh dưỡng, từ đó ức chế quá trình tạo mạch của khối u, làm giảm khả năng hình thành và sống sót của khối u; đồng thời làm tăng sự nhận dạng và hoạt hóa của tế bào miễn dịch, ngăn cản rõ rệt sự phát triển khối u ban đầu và sự di căn [5, 26]

1.2.3 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC được chia thành nhiều nhóm khác nhau, nhưng cấu trúc đều có các phần chính sau [2, 16, 38]:

- Nhóm gắn với Zn2+ trên vị trí tác dụng của các enzym HDAC (A) như acid hydroxamic, các thiol, benzamid, mercaptoceton quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực tác dụng của các HDACIs

Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC cho thấy phần B, C và một phần của A nằm trong túi enzym, làm đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym Phần

Zn2+ (A, ZBG)

còn lại của A tương tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym Việc nghiên cứu thiết kế công thức cho các HDACIs mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ HDAC HIỆN NAY

1.3.1 Các nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic trên thế giới

Năm 1986, TSA đã được Morioka và cộng sự chứng minh tác dụng rất tốt trong việc làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh bạch cầu Friend và ức chế chu trình tế bào bình thường ở cả pha G1 và G2 [53] Bên cạnh đó, TSA có tác dụng ức

chế mạnh, đặc hiệu với HDAC (K i = 3,4nM) [46, 48] và đóng vai trò như chất ngăn cản sự di căn trong ung thư đại tràng Tuy nhiên, hiện nay TSA chủ yếu dùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra các chất ức chế HDAC mới [46] do việc sản xuất TSA rất tốn kém mà lại không hiệu quả (trải qua 20 bước và hiệu suất 2%) Năm 2006, sau khi trải qua các pha trong tiến trình thử nghiệm lâm sàng, SAHA

(Vorinostat, Zolinza) đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da

tế bào T, được chứng minh nhạy cảm với các dòng tế bào Hut78, HH, M [53]

Ngoài TSA, SAHA, nhiều dẫn chất acid hydroxamic ức chế HDAC khác đang được nghiên cứu và chia thành nhiều phân nhóm nhỏ: acid hydroxamic mạch thẳng, dẫn chất cinnamic, dẫn chất phenyl (hình 1.4)

H h 1.4 HDACIs có cấu trúc hydroxamic

Cho tới nay, dẫn chất acid hydroxamic đã trở thành nhóm chất ức chế HDAC được nghiên cứu rộng rãi nhất, với nồng độ ức chế nằm trong khoảng micromol đến nanomol Giống như các HDACIs khác, cấu trúc của các dẫn chất acid hydroxamic cũng gồm 3 phần chính: Nhóm khóa hoạt động (C), cầu nối sơ nước (B) và nhóm gắn Zn2+(Zinc Binding Group, ZBG) là acid hydroxamic Nhiều nghiên cứu đã thay đổi nhóm gắn Zn2+ này bằng nhiều nhóm chức khác với mong muốn tìm ra nhiều chất ức chế HDAC có hiệu lực Tuy nhiên,khi thay nhóm chức hydroxamic bằng một số nhóm chức như sulfonamid, thiocarbonat, dithiocarbonat và trithiocarbonat, hoạt tính ức chế HDAC của các chất tổng hợp được đều giảm so với SAHA, thậm chí có chất còn không có hoạt tính [17, 24, 34] Như vậy có thể thấy, các acid hydroxamic là nhóm có cấu trúc đơn giản, hoạt tính ức chế HDAC mạnh do rất dễ tạo phức với ion Zn2+ Tuy nhiên, cũng vì nhóm chức acid hydroxamic dễ tạo phức với ion Zn2+ của HDAC nên các dẫn chất này ức chế không chọn lọc cả HDAC

nhóm I, II Thêm vào đó, chúng bị chuyển hóa nhanh nên nửa đời in vivo ngắn [21,

38] Chính vì vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu của TSA, SAHA và các dẫn chất acid hydroxamic

đã tìm được trước đó nhằm tìm ra sự liên quan về cấu trúc tác dụng của các dẫn chất này, phục vụ cho việc nghiên cứu thiết kế và tổng hợp các ứng viên lâm sàng mới cho điều trị ung thư Một số nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành thay đổi cấu trúc cầu nối và nhóm nhận diện bề mặt của SAHA và thu được các kết quả dưới đây

1.3.1.1 Thay đổi cầu nối

Nhằm hiểu rõ hơn về vai trò của cầu nối trong cấu trúc hoạt động của các dẫn xuất acid hydroxamic tương tự SAHA, nhóm nghiên cứu do Anton V Bieliauskas (Mỹ) đứng đầu đã thiết kế và tổng hợp các hydroxamic khác nhau bằng cách gắn thêm các nhóm thế vào nguyên tử C liền kề với nhóm chức acid hydroxamic của SAHA (hình 1.5) Kết quả khi thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

- 226 µM) so với SAHA (IC50 = 0,09 µM) trong cùng thử nghiệm Điều này cho thấy vùng không gian tham gia tạo phức với nhóm chức acid hydroxamic trong

trung tâm hoạt động của các HDAC có kích thước rất hạn chế và các nhóm thế ở vị trí gần với nhóm chức này sẽ làm giảm hoạt tính của các HDACIs [14]

Hình 1.5 Các dẫn chất thế 2’ của SAHA

Phân tích cấu tạo trung tâm hoạt động dạng túi của HDAC, nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm nghiên cứu Sigma-Tau (Pomezia, Ý) đặc biệt chú ý phần miệng túi với các vòng acid amin có thể tham gia nhiều tương tác quan trọng với nhóm nhận diện bề mặt hoặc các nhóm lân cận Dựa trên cơ sở này, nhóm nghiên cứu đã thiết

kế và tổng hợp dãy dẫn chất -alkoxy của SAHA (hình 1.6) [23] Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC2 cho thấy tất cả các dẫn chất -alkoxy (dạng racemic) của SAHA đều cho giá trị IC50 ở mức rất thấp (0,05-0,5 µM), nhiều chất tác dụng tương đương SAHA Kết quả này cho thấy các nhóm thế -alkoxy đã có hiệu quả tăng cường tác dụng sinh học cho các dẫn chất này, có thể do chúng đã tạo thêm các tương tác với các aminoacid thuộc vùng mép túi tại trung tâm hoạt động của enzym, đồng thời các dẫn chất -alkoxy có cầu nối với chuỗi alkyl có 6C cho hoạt tính tốt hơn so với cầu nối có chuỗi alkyl 5C Đáng chú ý là cấu hình của nhóm chức -alkoxy không ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học

Hình 1.6 Các dẫn chất -alkoxy của SAHA [23]

Một hướng thay đổi cầu nối của SAHA được thực hiện bởi các Maurizio Taddei và cộng sự (Italia) bằng cách gắn các lactam-carboxyamid vào C7 trong chuỗi alkyl của SAHA (hình 1.7) đã thu được kết quả rất đáng lưu ý Việc gắn

lactam vào cầu nối này đã tăng cường đáng kể tác dụng kháng tế bào ung thư in

vitro Nhiều dẫn chất được tạo ra có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II B và IV với

IC50 ở mức nanomol, thấp hơn SAHA hàng trăm lần, điển hình là 2 dẫn chất 3a, 3b

(bảng 1.3) [39]

Hình 1.7 Các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid

Kết quả trên cho thấy sự có mặt của vòng amid trên C7 của cầu nối alkyl gần với nhóm khóa hoạt động có ảnh hưởng đặc biệt lên ái lực với enzym Có thể sự xuất hiện của vòng amid đã làm tăng thêm tương tác với các acid amin ở lối vào trung tâm hoạt động của HDAC đem lại hoạt tính ức chế HDAC mạnh cho các dẫn chất này Điều này được minh chứng khi tiếp tục nghiên cứu tác dụng kháng tế bào

ung thư in vitro trên dòng tế bào H460, các dẫn chất 7-aminosuberoylamid

hydroxamic acid cho hoạt tính rất mạnh, đặc biệt các chất 3a, 3b có IC50 = 0,5 µM, mạnh hơn SAHA 6 lần (bảng 1.3)

Bảng 1.3 Hoạt tính ức chế HDAC và kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in

vitro của các dẫn chất 7-aminosuberoylamid hydroxamic acid [39]

Từ kết quả trên có thể nhận thấy 3a (ST8078AA1) là một chất dẫn đường

hấp dẫn, với các biến đổi đơn giản nhưng tạo được được một chất kháng ung thư mới hướng ức chế HDAC đầy triển vọng

Dựa trên cấu trúc của SAHA, Andrianov Victor và cộng sự đã thiết kế hàng loạt các dẫn chất hydroxamic có cấu trúc amid hướng ức chế HDAC nhằm khảo sát

liên quan về mặt cấu trúc tác dụng của các dẫn xuất này Nhóm nghiên cứu đã thay đổi cấu trúc nhóm nhận diện bề mặt của các HDACIs này bằng một loạt các aryl rất

đa dạng, đồng thời thay đổi chiều dài của cầu nối sơ nước theo số nhóm –CH2 và thu được kết quả về sự liên quan cấu trúc tác dụng của các dẫn chất này như sau:

Hình 1.8 SAR của các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC [11]

Nhóm nghiên cứu thuộc công ty TopoTarget (Anh) đã thiết kế và tổng hợp gần 40 dẫn chất amid ngược của SAHA (hình 1.9) [10] Nhiều chất trong số này có hoạt tính ức chế HDAC tương đương, thậm chí mạnh hơn SAHA

Hình 1.9 Các dẫn chất amid ngược của SAHA

Trong các dẫn chất ngược của SAHA, hai chất đã được thử nghiệm mô hình

ung thư in vivo trên chuột và cho kết quả rất khả quan, định hướng cho các nghiên

cứu tiếp theo Liên quan cấu trúc - tác dụng rút ra được từ các dãy chất này cho thấy những đặc điểm tương tự SAHA, đó là: i) nhóm acid hydroxamic là cần thiết cho hoạt tính ức chế HDAC mạnh; ii) cầu nối 5-6 C là tối ưu; iii) liên kết amid có vai trò trong tương tác với trung tâm hoạt động song có thể thay đổi; iv) phần Ar là nhân thơm cho hoạt tính mạnh hơn, nếu có cầu nối giữa nhân thơm với nhóm amid thì cầu nối không no tốt hơn [10]

Acid hydroxamic cần thiết để gắn kết Zn2+

Ngoài việc tiến hành gắn thêm các nhóm thế, nhiều nhà khoa học cũng tiến hành gắn thêm các nguyên tử nguyên tố khác C như O, S,…vào chuỗi alkyl trong cầu nối của SAHA (hình 1.10) và tiến hành khảo sát hoạt tính của các dãy dẫn chất này Hầu hết hoạt tính ức chế HDAC của các dẫn chất này đều giảm so với SAHA trong cùng thử nghiệm, cụ thể như các nghiên cứu của nhóm Soon-Ai Kim và Dong Hoon Kim (Hàn Quốc)

Nhóm nghiên cứu của Soon-Ai Kim đã nghiên cứu thiết kế và tổng hợp các

dẫn chất oxo-SAHA (5) với nguyên tử O được thêm vào phần cầu nối alkyl của

SAHA (hình 1.10) Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym cho thấy tất cả các chất tổng hợp đều có tác dụng ức chế HDAC với IC50 = 0,64 – 37,69 µM, thấp hơn so với SAHA trong cùng thử nghiệm [29]

Nhóm nghiên cứu của Dong Hoon Kim đã thay thế nhóm amid trong cầu nối của SAHA bằng nguyên tử S, thu được N-hydroxy-7-(2-naphthylthio) heptanomide

(HNHA) (hình 1.10) có hoạt tính ức chế HDAC in vitro mạnh với IC50 = 0,1 µM, nhưng vẫn chỉ bằng một nửa hoạt tính so với SAHA (IC50 = 0,05µM) [27] Ngoài

ra, khi thay thế S trong HNHA bằng O hoặc N với chiều dài của chuỗi alkyl là 5C

hoặc 7C hoạt tính ức chế HDAC của các chất đều giảm [27]

Charles Marson và các cộng sự (Anh) đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất

aryloxyalkanoic acid hydroxamic (7) (hình 1.10) với mong muốn có thể làm tăng

khả năng liên kết với miệng túi của kênh enzym nhờ liên kết hydro của O nằm giữa vòng thơm và chuỗi alkyl với các acid amin ở phần vành miệng túi, qua đó làm tăng hiệu lực của các HDACIs hướng ức chế HDAC Kết quả thu được nhiều dẫn chất có

hoạt tính in vitro mạnh, thậm chí mạnh hơn cả Trichostatin A và SAHA trong cùng

thử nghiệm với IC50 = 0,9 - 70 nM, hoạt tính mạnh nhất là 7a (IC50 = 0,9nM) [38]

Hình 1.10 Các dẫn chất có gắn thêm O, S vào cầu nối của SAHA

1.3.1.2 Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt

Phần nhận diện bề mặt tại trung tâm hoạt động của HDAC chấp nhận một hệ vòng khá đa dạng, từ indol, benzofuran, quinolin, benzodioxol… Nhóm Nitơ trong cấu trúc của phần nhân thơm R có thể tạo liên kết Hydro với các nhóm aminoacid trong cấu trúc túi, tăng tương tác với mép túi tại trung tâm hoạt động của HDAC, do

đó tăng hoạt tính của các chất ức chế HDAC [23] Vì vậy, các nghiên cứu khảo sát dẫn chất ức chế HDAC bằng cách thay đổi nhóm khoá hoạt tính (thay thế vị trí phenyl bằng các nhân thơm như benzothiazol, phenylthiazol, isoxazol ) trong SAHA có tính khả quan cao Một số nghiên cứu trên thế giới về thay đổi nhóm khóa hoạt động của dãy chất này đã thu được những kết quả bước đầu

 Các acid phenyl-hydroxamic tương tự SAHA

Một loạt các dẫn chất thay đổi nhóm khóa hoạt động của SAHA bằng cách thay đổi vị trí của các nhóm thế khác nhau trên khung phenyl của SAHA đã được Chanaz Salmi – Smail và các cộng sự (Pháp) nghiên cứu thiết kế tổng hợp (hình

1.11) Đánh giá hoạt tính kháng ung thư in vitro trên các dòng tế bào ung thư ở

người của các dẫn chất này, có nhiều chất có hoạt tính tương đương với SAHA,

thậm chí mạnh hơn SAHA tới 10 lần như 8a [47]

Hình 1.11 Các dẫn chất phenyl-hydroxamic tương tự SAHA

Từ kết quả nghiên cứu, nhóm nghiên cứu nhận thấy bản chất nhóm thế hút

(-NO2, -CN, -F) hay đẩy điện tử (-NH2, -NMe2, -OH) trên khung phenyl không ảnh

hưởng tới hoạt tính của các chất, tuy nhiên nhóm thế ở vị trí ortho làm giảm hoạt tính của các chất này Điều này chứng tỏ sự cản trở về cấu trúc không gian và bản chất sơ nước của các nhóm thế là yếu tố chủ yếu ảnh hưởng tới hoạt tính kháng

HDAC của các dẫn chất 8 Với căn cứ này, để tăng kích thước vùng sơ nước, nhóm

nghiên cứu đã thay đổi nhóm phenyl của SAHA bằng các hệ vòng thơm khác nhau

và thu được dẫn chất 9a (hình 1.12) có hoạt tính kháng HDAC in vitro mạnh hơn so

với SAHA (EC50 = 1,2 µM) [47]

Hình 1.12 Các aryl-hydroxamic tương tự SAHA

Hai chất 8a và 9a đã được đánh giá độc tính trên các tế bào ung thư của bệnh

nhân ung thư bạch cầu và các tế bào máu ngoại vi của người tình nguyện khỏe

mạnh để so sánh với SAHA trong cùng thử nghiệm Kết quả cho thấy 9a thể hiện khả năng điều trị tốt hơn so với 8a và SAHA Vì thế, cùng với SAHA, các chất này

được tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng HDAC in vivo trên dòng tế bào ung thư bạch

cầu ở chuột khi cho dùng thuốc bằng đường uống Đây là một trong những ứng viên khả quan để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn trong điều trị ung thư, đặc biệt là ung thư bạch cầu [47]

 Các acid biphenyl-hydroxamic tương tự SAHA

Nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski đã tiến hành thiết kế và tổng hợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tương tự SAHA (hình 1.13)

Hình 1.13 Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic

Kết quả các dẫn chất biphenyl ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC (HDAC1, 2, 3, 8, 6, 10) [30] Khi gắn thêm nhóm -NH2 vào vị trí ortho trên vòng phenyl thứ 2 hoạt tính giảm, xong khi nhóm -NH2 này được acyl hóa bằng

những nhóm aminoacyl cồng kềnh, tác dụng ức chế HDAC lại được tăng cường Điều này chứng tỏ phần nhận diện bề mặt của trung tâm hoạt động của HDAC có thể chấp nhận nhiều nhóm có kích thước lớn Kết quả này cũng gợi ý các tương tác được tạo lập thêm từ những nhóm aminoacyl này với các acid amin tại vành của túi hoạt động đã làm tăng ái lực đối với HDAC của các dẫn chất

 Các acid phenylthiazol-hydroxamic tương tự SAHA

Các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cứu quân đội Walter Reed (Mỹ) đã thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần phenylthiazol thay thế vào vị trí của phenyl của SAHA (hình 1.14), trong đó có nhiều chất có khả năng ức chế HDAC tương đương hoặc mạnh hơn SAHA [19]

Kết quả đánh giá tác dụng trên HDAC cho thấy dẫn chất WR301801 (11a)

với nhóm khóa hoạt động là 3-aminophenyl-5-thiazolyl có tác dụng ức chế mạnh nhất với IC50 = 10,4 nM, mạnh hơn cả SAHA trên cùng thử nghiệm Đồng phân vị

trí của WR301801 là WR301826 (11b) (nhóm thế amino ở vị trí ortho) cũng có tác

dụng mạnh tương đương SAHA [19]

Hình 1.14.Các acid phenylthiazol hydroxamic tương tự SAHA

Sử dụng hai chất WR301801 và WR301826 làm những chất dẫn đường mới, nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) tiếp tục thiết kế dãy acid phenylthiazol-hydroxamic dẫn chất hóa dựa trên nhóm amino của vòng phenyl (hình 1.15) [30] Kết quả cho thấy, khi nhóm amin thế trên vòng phenyl được acyl hóa bằng những nhóm cồng kềnh, tác dụng ức chế nhiều týp

HDAC tăng Tác dụng mạnh nhất thu được với dẫn chất 11d (hình 1.15) IC50 của dẫn chất này với HDAC2, HDAC3 thấp dưới mức 0,2 nM Kết quả thử độc tính trên

5 dòng tế bào ung thư tụy công bố với 11a, 11b, 11c cho thấy các dẫn chất này đều

có IC50 nhỏ hơn 3 M [30]

Hình 1.15 Một số acid phenylthiazol hydroxamic

 Các acid isoxazol-hydroxamic tương tự SAHA

Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất acid phenylthiazol-hydroxamic, nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski thuộc Đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đã tổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR3018049 (hình 1.16) Dẫn chất isoxazol này có tác dụng ức chế các HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC50 thấp đến 0,002 nM [31]

Hình 1.16 Dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR3018049

 Các dẫn chất 1,3,4-thiadiazol hydroxamic acid

Nhóm nghiên cứu của Peng Guan (Trung Quốc) đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động là 1,3,4-thiadiazol (hình 1.17) Kết quả đánh giá tác dụng trên HDAC cho thấy nhiều chất có khả năng ức chế

mạnh tương đương với SAHA, thậm chí mạnh hơn SAHA như 12a với IC50 = 0,089

µM [22]

Hình 1.17 Dẫn chất 1,3,4-thiadiazol hydroxamic

Giữ nguyên nhóm khóa hoạt động 5-phenyl-1,3,4-thiazol, nhóm nghiên cứu của Harish Rajak (Ấn Độ) đã thiết kế tổng hợp dãy dẫn chất acid hydroxamic với cầu nối 2-amino pyrimidin, thu được 8 dẫn chất có nhóm thế khác nhau ở vị trí 2,3,4 trên nhóm phenyl của nhóm khóa hoạt động (hình 1.18) Tất cả các dẫn chất

tổng hợp đều có hoạt tính mạnh hơn hoặc tương đương với SAHA, cụ thể như 13a,

13b đều có hoạt tính ức chế HDAC với IC50 = 0,007 µM; 13, 13c với IC50 = 0,008

µM [44]

Hình 1.18 Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol hydroxamic

Kết quả docking của các dẫn chất 1,3,4-thiazol cho thấy 2 nguyên tử N trên nhóm khóa hoạt động này tạo liên kết hydro với các acid amin ở phần vành của miệng túi enzym Điều này chứng tỏ nhóm khóa hoạt động có khung 1,3,4-thiazol

có khả năng tương tác rất mạnh với trung tâm hoạt động của HDAC, làm tăng hoạt tính của các chất

 Các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol hydroxamic acid

Trong quá trình tổng hợp các dẫn chất 1,3,4-thiazol, nhóm nghiên cứu của Harish Rajak cũng tiến hành tổng hợp các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol tương

tự (hình 1.19) Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế HDAC cho thấy các dẫn chất này cho thấy dãy dẫn chất này có khả năng ức chế mạnh từ 0,006 – 0,017 µM, trong đó

mạnh nhất là chất 14 và 14a với IC50 = 0,006 µM [44]

Hình 1.19 Các dẫn chất 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol hydroxamic

Tương tự như nhóm khóa hoạt động 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol, nhóm nghiên cứu nhận thấy nhóm khóa hoạt động 5-phenyl-1,3,4-oxadiazol tương tác mạnh với các acid amin ở lối vào trung tâm hoạt động của kênh enzym theo tương tác Van der Waals, làm tăng hoạt tính ức chế HDAC

Gần đây nhất, Zhang Song cùng các cộng sự (Trung Quốc) đã đăng ký bằng sáng chế (CN 103159646) cho một dẫn chất mới của SAHA là N1-(2,5-

dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid (N25) (hình 1.20) [54]

Hình 1.20 Cấu trúc N1-(2,5-dimethoxyphenyl)-N(8)-hydroxyoctandiamid

Khi kiểm tra hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro, N25 cho thấy hoạt tính

mạnh hơn SAHA trên các dòng tế bào ung thư phổi H460, A549, H1299 và ung thư

thần kinh đệm U251 (bảng 1.4) Thêm vào đó, khi thử nghiệm trên chuột, N25 thấm

qua được hàng rào máu não với độc tính thấp (LD50 = 240,84 mg/kg) Điều này mở

ra hi vọng mới cho điều trị ung thư, đặc biệt là ung thư thần kinh đệm

Bảng1.4 Tác dụng kháng các tế bào ung thư in vitro của N25 [54]

N25 6,28±0,89 11,33±0,51 15,44±1,01 2,44±0,31 3,46±0,84 2,93±0,64 SAHA 6,32±1,27 6,41±0,08 10,04±2,00 5,16±0,97 7,20±1,29 6,87±1,13

1.3.2 Các nghiên cứu tro g ước

Từ những năm 90 của thế kỷ trước, rất nhiều nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu và hàng trăm bài báo đã được công bố trong quá trình tìm

kiếm các chất ức chế HDAC Cho đến nay, bên cạnh 2 chất là vorinostat (Zolinza®)

và Depsipeptid (Romidepsin®) đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào T, còn có khoảng hơn 10 chất đang được nghiên cứu ở pha lâm sàng I, II Ở Việt Nam, vẫn chưa có nhà khoa học nào quan tâm đến thiết kế, tổng hợp các chất ức chế HDAC ngoài các công bố mà nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Hóa dược – Trường Đại học Dược đang tiến hành Nhiều kết quả đã được công bố trong các tạp chí trong nước và quốc tế, cũng như trong các khóa luận thạc sĩ, Dược sĩ đại học

Khi khảo sát hoạt tính ức chế HDAC của các chất có cấu trúc tương tự SAHA với nhóm khóa hoạt động khác là benzothiazol, tác giả Đào Thị Kim Oanh

đã chỉ ra rằng khi thay đổi nhóm nhận diện bề mặt là vòng benzothiazol thì độ dài cầu nối có 6 carbon là tối ưu cho hoạt tính Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu trước đây về độ dài cầu nối của các hydroxamat tương tự SAHA Quan trọng hơn, kết quả ức chế HDAC2 còn cho thấy sự có mặt của vòng

benzothiazol cho tác dụng tốt hơn Cả 8 chất 16a-h ức chế HDAC2 với IC50 = 0,013 – 0,262 µg/ml, cao hơn cả SAHA (IC50 = 0,530 µg/ml) [6]

Hình 1.21 Cấu trúc các hydroxamic tương tự SAHAvới nhóm khóa hoạt động

benzothiazol [6]

Nghiên cứu thiết kế dãy các hydroxamic tương tự SAHA với nhóm thế là

5-phenyl-1,3,4-thiadiazol (17) của nhóm nghiên cứu tại Bộ môn cũng thu được một

số chất có triển vọng trong phát triển thuốc mới (hình 1.22) [1, 2, 6, 7]

Hình 1.22 Cấu trúc các hydroxamic tương tự SAHAvới nhóm khóa hoạt động

5-phenyl-1,3,4-thiadiazol

Khi thử hoạt tính kháng tế bào in vitro của các dẫn chất

5-phenyl-1,3,4-thiadiazol (17), chất 17b thể hiện độc tính mạnh trên cả 5 dòng tế bào, đặc biệt là

chất có hoạt tính mạnh nhất trên 3 dòng tế bào SW620 (IC50 = 0,34 µM), AsPC-1 (IC50 = 0,63 µM), NCI-H460 (IC50 = 0,11 µM) so với các dẫn chất còn lại và có hiệu lực mạnh gấp 11, 6, 25 lần so với SAHA trên các dòng tế bào trên trong cùng

thử nghiệm Ngoài ra, 17a có hoạt tính mạnh trên dòng tế PC-3 với IC50 = 0,88

µM, mạnh gấp 5 lần so với SAHA; 17c có hoạt tính mạnh trên dòng tế bào MCF-7

với IC50 = 0,73µM, mạnh gấp 9 lần so với SAHA Điều này cho thấy các chất có cấu trúc 1,3,4 – thiadiazol ở giữa vòng phenyl và nhóm amid cho kết quả độc tính tốt hơn SAHA

Kết quả này tạo điều kiện cho nhóm nghiên cứu tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu trong thiết kế công thức mới bằng việc giữ nguyên cấu trúc acid hydroxamic với dị vòng 5 cạnh 1,3,4-thiadiazol ở giữa vòng thơm và nhóm amid,

và thay vòng phenyl bằng dị vòng chứa O hoặc S, các chất thu được cho những kết quả khả quan về độc tính trên tế bào và tác dụng ức chế HDAC, đặc biệt là chất

18c có khả năng kháng tế bào ung thư mạnh gấp 15 lần SAHA (bảng 1.5) [1]

Bảng 1.5 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và tác dụng ức chế

enzym HDAC của các chất 18a-d

Chú thích: 1 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào

Gần đây nhất, khi khảo sát các hydroxamic tương tự SAHA với nhóm khóa hoạt động là 3-oxim-isatin, cầu nối 6C (hình 1.23), nhóm nghiên cứu ở Bộ môn đã

thu được một loạt các dẫn chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro mạnh hơn

SAHA trên cả 5 dòng tế bào SW620, MCF-7, PC-3, AsPC-1, NCI-H460 Chất 19a

có hoạt tính mạnh trên dòng tế bào AsPC-1 với IC50 = 0,08 µM, gấp 46 lần so với SAHA trong cùng tử nghiệm [4]

Như vậy, nhóm khóa hoạt động 3-oxim-isatin đã làm tăng hoạt tính của các chất ức chế HDAC tương tự SAHA nhờ tăng tương tác với các acid amin ở lối vào trung tâm hoạt động của kênh enzym

Hình 1.23 Cấu trúc của các dẫn chất 3-oxim-isatin [4]

Tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính của dãy dẫn chất tương tự SAHA với cầu nối 6 carbon nhưng nhóm khóa hoạt động là 3-methoxim-isatin nhằm khai thác sự khác biệt ở phần miệng của kênh enzym khi thay đổi nhóm nhận diện bề mặt giữa các HDAC Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu đó, có thể thiết kế công thức làm tăng hoạt tính và tăng khả năng ức chế chọn lọc, nhằm đưa ra các ứng viên thử tiền lâm sàng và lâm sàng cho điều trị ung thư Cho tới hiện nay, chưa có công bố nào sử dụng 3-methoxim-isatin làm nhóm khóa hoạt động thay thế cho phenyl trong SAHA, vì vậy nghiên cứu mà chúng tôi tiến hành trong luận văn là phù hợp với xu hướng nghiên cứu trên thế giới

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC

1.4.1 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester

Đây là phương pháp được nhiều nhóm nghiên cứu ứng dụng để tổng hợp các acid hydroxamic Hanessian và cộng sự [23], Andrianov và cộng sự [11], Marson

và cộng sự [38] đều tổng hợp các acid hydroxamic từ dẫn chất methyl ester bằng cách cho phản ứng với dung dịch hydroxylamin trong hỗn hợp NaOH, MeOH ở điều kiện 0oC đến nhiệt độ phòng với hiệu suất khá cao (sơ đồ 1.1)

Sơ đồ 1.1 Tổng hợp các dẫn chất -alkoxy của SAHA [23]

Tùy thuộc vào bản chất của chất tham gia phản ứng, điều kiện phản ứng và dung môi có thể thay đổi cho phù hợp Trong nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic có cầu nối chứa vòng triazol, Chen và cộng sự [15] tiến hành tổng hợp acid hydroxamic từ dẫn chất methyl ester với dung dịch hydroxylamin trong hỗn hợp KCN:THF (1:1) ở nhiệt độ phòng, hiệu suất phản ứng cũng rất cao (>80%)

1.4.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic

Trong một số trường hợp, phản ứng trực tiếp giữa dẫn chất methyl ester và hydroxylamin không thể xảy ra Khi đó, nhiều nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp sử dụng tác nhân hoạt hóa acid carboxylic đồng thời sử dụng hydroxylamin có nhóm bảo vệ -OH để tăng khả năng phản ứng vào nhóm -NH2

Để tổng hợp các dẫn chất acid 5-pyridin-2-yl-thiophen-2-hydroxamic, Price

và cộng sự đã sử dụng tác nhân hoạt hóa HATU để tạo ester hoạt hóa ngay trong phản ứng, đồng thời sử dụng hydroxylamin tetrahydropyran Sau đó, nhóm bảo vệ -

OH được tách bởi acid p-TSA hoặc HCl 4M trong dioxan Phản ứng trải qua 2 bước

do vậy hiệu suất tổng chỉ đạt được khoảng 40 – 50%

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp acid biaryl hydroxamic [43]

Song song, nhiều tác nhân hoạt hóa khác cũng được các nhóm nghiên cứu sử dụng trong tổng hợp acid hydroxamic Isobutyl cloroformat được Kozikowski và cộng sự [31] dùng trong phản ứng tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic Phản ứng tiến hành ở 0oC, tạo anhydrid hỗn tạp ngay trong phản ứng Đây là tác nhân acyl hóa mạnh nên hydroxylamin phản ứng trực tiếp, không cần sử dụng loại

có nhóm bảo vệ -OH Tuy nhiên, hiệu suất phản ứng không cao, khoảng 26-30% (sơ

đồ 1.3)

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic [31]

Chươ g 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình tổng hợp được nhập từ Mecrk, Sigma – Aldrich và Trung Quốc Bao gồm:

6 5-Methylisatin Aldrich 15 Acid hydrocloric Trung quốc

9 Ethyl 7-Bromoheptanoat Merck 18 Tetrahydrofuran Merck

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu Tủ lạnh, tủ sấy Memmert

- Máy cất quay Buchi R-210, máy siêu âm, máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC, máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Gallenkamp Melting Point Apparatus

- Máy đo phổ hồng ngoại: GX-Perkin Elmer-USA, khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ khối: Agilent 6310 Ion Trap LC/MS (Agilent Technologies), Viện Hóa hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đọc kết quả Western blot: molecular Imaging® ChemiDocTM XRS+ (với phần mềm ImageTM) kết nối máy quét HP 4850

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

 Tổng hợp 7 dẫn chất mang khung 3-methoxim-isatin:

 Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên phân tích dữ liệu phổ khối (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

Sắc ký lớp mỏng: Dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm

kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế

Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 60 (240 –

400 mesh) tráng sẵn, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút Hệ dung môi DCM:MeOH (9:1) Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp Để bản mỏng trong bình sắc

ký đã bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng, cho dung môi chạy khoảng 8 cm Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

Nhiệt độ nóng chảy: Đo bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện

Gallenkamp Melting Point Apparatus để kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất

2.3.2.3 Phương pháp phân tích cấu trúc

Để phân tích, khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp, luận văn đã sử dụng các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

 Phổ hồng ngoại: Phổ hồng ngoại được tiến hành ghi trên máy GX-Perkin Elmer-USA với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000 - 600 cm-1 Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1 Các mẫu rắn được phân tán tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

 Phổ khối lượng: Phổ khối lượng được tiến hành ghi trên máy Agilent 6310 Ion Trap LC/MS (Agilent Technologies), Viện hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân:

Phổ NMR được đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz,

dung môi DMSO-d 6 Phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần

số 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học (, ppm) được tính theo chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300oK

2.3.2.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng