Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 2 aryl 4 quimazolinon

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUYỀN TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2- ARYL-4-QUINAZOLINON LUẬN VĂN THẠC SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

2- ARYL-4-QUINAZOLINON

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HUYỀN

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: TS Văn Thị

Mỹ Huệ và TS Lê Nguyễn Thành là những người cô, người thầy đã tận tình hướng

dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Em cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của: TS Nguyễn Minh Hằng, TS Cao Bích Huệ, ThS Đào Đình Cường, cử nhân Trần Hữu Giáp, cử nhân Nguyễn Anh Dũng, cử nhân Hà Thị Thoa, cử nhân Nguyễn Thị Tú Oanh (Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc - Viện hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), các thầy cô giáo Bộ môn Hóa hữu cơ cùng các thầy cô giáo trong các Bộ môn, phòng ban, thư viện - Trường Đại học Dược Hà Nội

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng như tài liệu tham khảo nên luận văn của em không thể tránh khỏi những sai sót trong nội dung và hình thức, em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để luận văn của

em được hoàn thiện hơn

Cuối cùng, con xin cảm ơn bố mẹ, em cảm ơn anh chị, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ con/ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Huyền

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư 17

3.1.3 Tổng hợp dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon (14a-k; 15a-c) 25

4.1 VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC 46 4.1.1 Tổng hợp dẫn chất trung gian 2-amino benzamid và khẳng định cấu

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ATCC Tiêu chuẩn Mỹ (the American Type Culture Collection )

Hep-G2 Hepatocellular carcinoma - tế bào ung thƣ gan

IC50 Nồng độ ức chế 50% tế bào ung thƣ thử nghiệm

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectrometry)

MCF-7 Human breast carcinoma - tế bào ung thư vú

2 Bảng 3.2 Giá trị Rf và Tnc của các dẫn chất 14a-k và 15a-c 36

3 Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ khối lượng (LC-MS) của các dẫn

chất 14a-k và 15a-c

38

5 Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H-NMR của các dẫn chất 14a-k và 15a-c 40

6 Bảng 3.6 Số liệu phổ 13

C-NMR của các dẫn chất 14a-k và 15a-c 42

7 Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 14a-k và 15a-c

trên 4 dòng tế bào ung thư người

45, 57

8 Bảng 4.1 Phổ 1H-NMR của các dẫn chất trung gian 4, 6, 11 48

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ HÌNH VẼ

1 Hình 1.1 Cấu trúc hợp chất

7,8-dimethoxy-2-methyl-3-(4,5-methylendioxy-2-vinylphenyl) isoquinolin-1(2H)-on

2

2 Hình 1.2 Cấu trúc dãy hợp chất 3-arylisoquinolinon trong nghiên

cứu của Cho và cộng sự

3

3 Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất 3-arylisoquinazolinon trong nghiên

cứu của Cho và cộng sự

9 Hình 1.9 Cấu trúc hợp chất 2- aryl-6-substituted quinazolinon 8

1 Sơ đồ 1.1 Thiết kế các dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon dựa trên

phương pháp nhóm thế đẳng cấu sinh học

6

7 Sơ đồ 1.7 Phản ứng ngưng tụ anthranilamid và benzoyl clorid cải

tiến

13

9 Sơ đồ 1.9 Phản ứng tổng hợp của Na Yeun Kim và Cheol-Hong

Cheon

14

10 Sơ đồ 3.1 Tổng hợp các dẫn chất trung gian 2-amino benzamid 19

11 Sơ đồ 3.2 Tổng hợp dẫn chất trung gian 2-(dimethylamino)

benzaldehyd

19

12 Sơ đồ 3.3 Tổng hợp các dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon 20,25

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay tỷ lệ mắc các bệnh ung thư có xu hướng gia tăng ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, đứng thứ hai sau bệnh tim mạch ở các nước phát triển [4] Theo tổ chức Y tế Thế giới ước tính trên toàn cầu có khoảng 20 triệu người đang mắc ung thư, trong đó có khoảng 6 triệu người chết hàng năm Tỷ lệ chết do ung thư chiếm 12% trong các nguyên nhân gây tử vong ở người Cùng xu hướng trên thế giới thì tại Việt Nam theo ước tính có đến 150.000 ca mới mắc và khoảng 75.000 người chết vì ung thư hàng năm [3]

Trong quá trình tìm kiếm các thuốc chống ung thư mới, nhiều nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc tìm kiếm các chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư [24] Một trong những dãy hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào được chú ý hiện nay là dãy hợp chất 3-arylisoquinolinon được phát hiện vào những năm cuối thế kỷ 19 [9] Dựa trên phát hiện này nhiều nghiên cứu phát triển cấu trúc của 3-arylisoquinolinon nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có tác dụng kháng tế bào ung thư đã được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu [6-10] Một trong những hướng phát triển cấu trúc là thay đổi các nhóm chức, nhóm thế tương đương sinh học của 3-arylisoquinolinon để tạo nên dãy hợp chất 2-aryl-4-quinazolinon Kết quả của một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất này thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [6-11;15-19]

Hội nhập với xu hướng nghiên cứu của thế giới trong việc tìm kiếm các dẫn

chất 2-aryl-4-quinazolinon có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt, luận văn: “Tổng hợp

và thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ của một số dẫn chất quinazolinon” được tiến hành với hai mục tiêu :

2-aryl-4-1- Tổng hợp được một số dẫn chất của 2-aryl-4-quinazolinon

2- Thử hoạt tính của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư

có tác dụng kháng tế bào ung thư rất tốt ở nồng độ nanomol là methyl-3-(4,5-methylendioxy-2-vinylphenyl)-isoquinolin-1(2H)-on (Hình 1.1) [10]

7,8-dimethoxy-2-N O

H3CO

OCH3

O O

3

NH O

R1

R2

R1= H; 6-CH3; 5-N(CH3)2

R2= H; 3,4-OCH2O; 4-CF3; 4-CH3; 2-CH3; 4-Cl; 4-Br; 4-OCH3

Hình 1.2: Cấu trúc dãy hợp chất 3-arylisoquinolinon trong nghiên cứu của

Cho và cộng sự

Cũng cùng xu hướng nghiên cứu trên năm 2009, Cho và cộng sự tiếp tục tổng hợp được 9 dẫn chất 3-arylisoquinolinon (Hình 1.3) và thử nghiệm hoạt tính sinh học trên 3 dòng tế bào ung thư gồm: ung thư phổi, ung thư đại tràng, và ung thư buồng trứng Trong đó, hợp chất có nhóm thế R1 = CH3; R2 = R3 = R4 = H; R5 = PMB (p-

methylbenzyl); và hợp chất có nhóm thế R2 = CH3; R1 = R3 = R4 = H; R5 = PMB là 2 hợp chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư cao trên cả 3 dòng tế bào ung thư với IC50

từ 2,37μg/ml đến 13,27μg/ml [8]

NH O

Trên thế giới cũng có rất nhiều nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế

bào ung thư của các dẫn chất 3-arylisoquinolinon Trong một thử nghiệm in vitro trên

5 dòng tế bào ung thư người (phổi, buồng trứng, khối u ác tính, đại tràng và thần kinh trung ương), các dẫn chất 3-arylisoquinolinon có tác dụng kháng tế bào ung thư tốt [10, 11] Một trong những dẫn chất của 3-arylisoquinolinon có hoạt tính sinh học cao

đó là dẫn chất 3-napthalenylisoquinolinon [6] Một số dẫn xuất 3-arylisoquinolinon có tác dụng chống khối u rất tốt tương tự như các thuốc chống lại sự tăng sinh của khối u

4

ác tính [17,18] Bên cạnh dẫn chất chứa vòng thơm ở vị trí số 3 của vòng quinazolinon các dị vòng khác có đặc tính thơm như: thiophen, pyridin, furan cũng có hoạt tính kháng tế bào ung thư [18].(Hình 1.4)

NH O

Hình 1.4: Cấu trúc một số dẫn chất 3-arylisoquinolinon có hoạt tính chống ung

thƣ cao

Đặc biệt tác giả Kazuo Hatturi và cộng sự ở công ty dược phẩm Chugai, Nhật Bản cũng đã tổng hợp và đăng ký bản quyền về dãy hợp chất 3-arylisoquinolinon với hoạt tính chống ung thư Nhóm hợp chất tổng hợp được thử tác dụng sinh học trên tế bào ung thư trực tràng và thể hiện tác dụng rất cao ở nồng độ IC50 khoảng 1 nanomol (Hình 1.5) [15,16]

NH O

(H3C)2N NH

O (H3C)2N

NH O (H3C)2N

5

1.1.2 Phát triển khung 3-arylisoquinolinon thành 2-aryl-4-quinazolinon

Với mục tiêu tìm kiếm các chất có hoạt tính chống ung thư, luận văn sử dụng phương pháp nhóm thế đẳng cấu sinh học trong thiết kế thuốc để phát triển cấu trúc hóa học của dẫn chất 3-arylisoquinolinon Phương pháp nhóm thế đẳng cấu sinh học là một phương pháp tiếp cận thay đổi chất dẫn đường, hoặc thay đổi trong quá trình chuyển hóa thuốc mà không làm thay đổi nhiều về mặt cấu trúc hóa học [2,20] Trong lĩnh vực nghiên cứu và phát triển thuốc, nhóm thế đẳng cấu sinh học đã trở thành một trong các công cụ được ứng dụng rất có hiệu quả để thiết kế cấu trúc Sở dĩ như vậy là

vì sự thay thế bằng các nhóm đẳng cấu sinh học thường đem lại các chất có hoạt tính sinh học khá tương tự nhau nhưng lại có sự khác nhau rõ rệt về các tính chất lí hóa học khác như độ phân cực, độ bền hóa học, v.v… Cho đến nay nhóm đẳng cấu sinh học thường được coi là những nhóm hoặc chất có tính chất lý hóa học tương tự nhau và có một loại hoạt tính sinh học tương tự nhau [2]

Hiện nay có 6 kiểu thay thế hay được áp dụng trong phương pháp sử dụng nhóm đẳng cấu sinh học cho thiết kế cấu trúc, bao gồm: thay thế nguyên tử hoặc nhóm

có hóa trị 1, thay thế nguyên tử hoặc nhóm có hóa trị 2, thay thế nguyên tử hoặc nhóm

có hóa trị 3, thay thế bằng các vòng tương đương, thay thế bằng các nhóm có độ phân cực tương tự nhau, và thay thế bằng các nhóm chức có cấu trúc đảo ngược [2]

Phương pháp thay thế bằng vòng tương đương được coi là các nhóm đẳng cấu sinh học của nhau (các vòng đẳng cấu sinh học), là một trong các kỹ thuật thiết kế cấu trúc được sử dụng phổ biến nhất đặc biệt hiệu quả Có thể tìm thấy rất nhiều nghiên cứu khoa học sử dụng kỹ thuật thay thế bằng các vòng đẳng cấu sinh học đã được công

bố Đặc biệt, sự thay thế -CH= bằng –N= trong các vòng thơm là trường hợp hay gặp

và hiệu quả nhất trong số các nhóm đẳng cấu sinh học kinh điển [2]

Như vậy, dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon là hợp chất tương đương sinh học với dẫn chất 3-arylisoquinolinon, vốn được biết đến là có tác dụng kháng tế bào ung thư tốt Trong luận văn này, một số dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon với các nhóm thế tương tự ở khung dị vòng cũng như tại vòng phenyl được thiết kế với mong muốn tìm

ra các hợp chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư triển vọng (Sơ đồ 1.1)

6

NH O 3-arylisoquinolinon

R2

NH N

1.1.3 Một số tác dụng sinh học của dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học cho thấy các dẫn chất được tổng hợp từ quinazolinon có nhóm thế ở vị trí số 2 có tác dụng sinh học phong phú như: chống ung thư, an thần, kháng khuẩn, kháng nấm, v.v … Đặc biệt, các dẫn chất có nhóm thế ở vị trí số 6 hay vị trí số 7 ở vòng quinazolinon và các nhóm thế (CH3, OCH3, OCF3, …) ở vị tri 2’,3’, của vòng thơm ở

vị trí số 2 của vòng quianzolinon cho thấy hoạt tính sinh học của các dẫn chất tăng lên đáng kể

R7 = R2' = R4' = R5' = H; và R3' = -OCH3 có hoạt tính kháng tế bào ung thư rất tốt ở cả

9 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị EC50 < 1,0µg/mL [23]

7

NH N

và ở chuột thử nghiệm với giá trị EC50 từ 0,30 10,10µM Trong đó, nhóm thế R là

-F, -Cl và -N(CH3)2 cho hoạt tính kháng tế bào ung thư cao nhất [22]

NH N

O N

R = F,Cl, OCF3, OH, OCH3, OC2H5, N(CH3)2

8

NH N

O N

Hình 1.8: Cấu trúc hợp chất 2- (naphtalen-1-yl)-6-pyrolidinyl-4-quinazolinon

Gần đây nhất năm 2013, tác giả Mann-Jen Hour và các cộng sự tiếp tục công bố kết quả thử tác dụng sinh học trên 5 dòng tế bào ung thư người: khối u ác tính, ung thư phổi, ung thư biểu mô không nhỏ ở phổi, ung thư gan và ung thư vòm họng của 15 dẫn chất 2- aryl-6-substituted quinazolinon tổng hợp được Kết quả cho thấy có 6 dẫn chất

có tác dụng gây độc tế bào mạnh ở nồng độ IC50 từ 0,07 μM đến 8,89 μM trên cả 5 dòng tế bào ung thư Trong đó hợp chất có nhóm thế R6 là pyrrolidinyl và R2 là vòng napthalenyl cho tác dụng gây độc tế bào mạnh nhất ở nồng độ IC50 từ 0,03-1,35 μM trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm [21]

N

N

O N

R6

R2

O

Hình 1.9: Cấu trúc nhóm hợp chất 2- aryl-6-substituted quinazolinon

Trong những năm gần đây một số dẫn chất 4(3H)-quinazolinon có nhóm thế ở

vị trí số 2 đã được sử dụng làm tác nhân chống ung thư Ratitrexed (ZD 1694) có độ tan tốt trong nước, là tác nhân ức chế thymidalat synthase Chất này tương tự acid folic được vận chuyển một cách có hiệu quả vào tế bào của động vật có vú qua tác nhân vận chuyển folat Hợp chất này đã được đưa vào điều trị bệnh ung thư kết tràng tiến triển dưới tên biệt dược Tomudex® ( Astra Zeneca) [19]

9

NH N

O

CH3N

S NH

CH 3

O HOOC(H2C)2HOOC

Hình 1.10: Cấu trúc của hợp chất Ratitrexed

Như vậy, tác dụng chống ung thư hay hoạt tính độc tế bào trên tế bào ung thư của các dẫn chất quinazolinon là tác dụng sinh học được các nhà khoa học quan tâm nhất Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung nghiên cứu hoạt tính kháng các

tế bào ung thư Ngoài ra, dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon còn nhiều tác dụng sinh học phong phú khác như: an thần, gây ngủ, kháng khuẩn, kháng nấm…

1.1.3.2 Một số tác dụng khác

Tác dụng an thần, gây ngủ

Methaqualon là thuốc an thần được nhà khoa học người Ấn Độ Gujiral M.L phát minh vào năm 1955 trong chương trình nghiên cứu thuốc phòng chống sốt rét và được đưa ra thị trường như là một thuốc an thần không gây nghiện vào năm 1966 dưới tên biệt dược: Renonal®, Melsed®, hay Mandrax® [30]

Mặc dù, Methaqualon có nhiều tác dụng phụ, nhưng vẫn có nhiều nghiên cứu tiếp theo để tìm kiếm thuốc có tác dụng an thần, gây ngủ tương tự như Methaqualon nhưng độc tính thấp hơn, chủ yếu là các nghiên cứu tổng hợp và thử sàng lọc tác dụng

an thần, gây ngủ của các hợp chất 2-alkyl-3-aryl-4-quinazolinon [12]

N N

O

Hình 1.11: Cấu trúc của hợp chất Methaqualon

Ngoài ra còn có một số hoạt chất phát triển về sau này như mecloqualon, ethaqualon có tác dụng an thần gây ngủ nhưng đều có vấn đề về dung nạp thuốc và sự

lệ thuộc thuốc nên các hoạt chất này đều bị kiểm soát chặt chẽ [12]

Gần đây nhất năm 2012, G.Khodarahmi và Hassanzadeh cùng các cộng sự tiếp tục nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và hoạt tính gây độc tế bào của một

số dẫn chất Quinazolinon mới tổng hợp Kết quả thử nghiệm cho thấy các dẫn xuất tổng hợp có hiệu lực với cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm đặc biệt trên hai chủng

Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa có hiệu lực cao ở nồng độ mg/ml

[13]

Ngoài ra, dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon còn nhiều tác dụng sinh học phong phú khác như: tác dụng chống động kinh, tác dụng làm mềm cơ, tác dụng lợi tiểu, v.v…

Tại Việt Nam, hiện nay chưa có nghiên cứu nào về dẫn chất quinazolinon Như vậy, trong luận văn này sử dụng phương pháp thay thế vòng đẳng cấu sinh học trong thiết kế cấu trúc các dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon từ dẫn chất 3-arylisoquinolinon, vốn được biết đến là dẫn chất có tác dụng kháng tế bào ung thư tốt, với mong muốn tìm kiếm sàng lọc những hợp chất có hoạt tính kháng ung thư có triển vọng

2-aryl-4-1.2 PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP

Hiện nay nhiều dẫn chất của quinazolinon ngoài việc được ứng dụng làm thuốc còn được sử dụng làm nguyên liệu trong tổng hợp hóa học, trong hóa phân tích và nhiều ứng dụng khác Do tiềm năng ứng dụng đa dạng của các dẫn chất quinazolinon, nên từ cuối thế kỉ 19 đến nay đã có nhiều phương pháp tổng hợp quinazolinon và dẫn chất được công bố trong nhiều tài liệu khác nhau

11

1.2.1 Phản ứng Niementowski V và phản ứng Niementowski V mở rộng

Phương pháp tổng hợp dẫn chất quinazolin-4-on phổ biến nhất là phản ứng lần đầu tiên đươc Niementowski V mô tả năm 1885 và ngày nay phản ứng mang tên ông [28] Khi đun nóng acid anthranilic với một lượng dư formamid ở 120oC, nước được giải phóng và hầu như acid anthranilic được chuyển hoàn toàn thành quinazolin-4-on

Có nhiều cải tiến đối với phản ứng Niementowski V., phản ứng có thể tiến hành với các dẫn chất của acid anthranilic thế cho các dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon Tuy nhiên, theo quy luật cần tiến hành phản ứng ở nhiệt độ cao hơn và thời gian phản ứng kéo dài hơn

H N

COOH

2

R O

N

R1

NH O R

Sơ đồ 1.2: Phản ứng tổng hợp của Niementowski V

Phản ứng cũng có thể thực hiện được với các amid mạch thẳng tạo thành các dẫn chất thế alkyl ở vị trí số 2 [7] Nói chung phải tiến hành phản ứng ở nhiệt độ cao hơn và hiệu suất giảm đi khi khối lượng phân tử amid tăng lên

Phản ứng Niementowski V cũng có thể tiến hành bằng cách ngưng tụ giữa amid của acid anthranilic với ethyl orthoformat [25]

NH2CONH2

Cl

NH N

O

Cl

CH2(OC2H5)2O(CH2CH2OH)2

Sơ đồ 1.3: Phản ứng tổng hợp Niementowski V cải tiến

Patel V.S và Patel S.R đã cải tiến phản ứng Niementowski V bằng phản ứng đóng vòng giữa các acid N-acylantharanilic thế với formamid ở nhiệt độ từ 100oC đến

180oC trong khoảng 3 giờ thu được dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon với hiệu suất từ 60% đến 83% [29]

H N

COOH

2

R O

N

R1

NH O R

Sơ đồ 1.4: Phản ứng tổng hợp của Patel V.S và Patel S.R

12

1.2.2 Phản ứng của Shishoo C J

Theo Shishoo C.J và cộng sự, các dẫn chất quinazolin-4-on thế ở vị trí số 2 có

thể tổng hợp dễ dàng bằng phản ứng giữa ester methyl anthranilat với các nitril với sự

có mặt của khí hydroclorid khan trong dioxan [32] (Sơ đồ 1.5)

NH2OR' O

NH N

O

R

C NH

Sơ đồ 1.5: Phản ứng tổng hợp của Shishoo C.J và cộng sự

Phản ứng này có nhược điểm là khí hydroclorid bay hơi trong quá trình phản ứng dễ ăn mòn dụng cụ và thiết bị thí nghiệm nên ít được sử dụng

1.2.3 Phản ứng ngưng tụ anthanilamid và benzoylclorid

Phản ứng ngưng tụ anthranilamid và benzoylclorid là phản ứng hay được sử dụng trong tổng hợp các dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon

Hour M J và cộng sự đã có rất nhiều nghiên cứu về hợp chất quinazolinon Trong nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của nhóm dẫn chất 6-pyrrolidinyl-2-(2-substited phenyl)-4-quinazolinon, ông và cộng sự đã tổng hợp được hợp chất 2-(2-dimethylaminophenyl)-6-pyrrolidinyl-4-quinazolinon bằng cách sử dụng NaHSO3 làm xúc tác trong môi trường N,N-dimethylacetamid (DMAC) Phản ứng được đun hồi lưu ở 150o

2-aryl-4-C trong khoảng 2 giờ, sau đó đổ hỗn hợp phản ứng vào nước đá (Sơ đồ 1.6) Hiệu suất phản ứng là 25,0% [23]

NH2

NH2O

N NH O

NaHSO3, DMAC

150 o C

Cl O

Sơ đồ 1.6: Phản ứng ngƣng tụ anthranilamid và benzoylclorid

Phản ứng cho hiệu suất thấp có thể do hợp chất benzoylclorid kém bền dễ bị thủy phân và khó bảo quản

13

Năm 2013, hai nhà khoa học Monireh Shakiba Nahad và Ghodsi Mohammadi Ziarani đã nâng cao hiệu suất phản ứng ngưng tụ anthranilamid và benzoylclorid bằng cách sử dụng chất xúc tác SBA-Pr-SO3H, một acid có cấu trúc nano, trong dung môi ethanol hoặc dimethylformamid (DMF), hỗn hợp phản ứng được đun nóng ở 130oC Hiệu suất phản ứng là 52 - 91% [26] (Sơ đồ 1.7)

NH2

NH2

O

N NH O

SBA-Pr-SO3H

C2H5OH/DMF, 130 o C Cl

O

R

R

R = 3-Cl; 4-Cl; 2,4-(Cl)2; 2-CH3

Sơ đồ 1.7: Phản ứng ngƣng tụ anthranilamid và benzoyl clorid cải tiến

1.2.4 Phản ứng ngưng tụ anthranilamid và aldehyd

Cũng theo Hour M J và cộng sự thì các dẫn chất 2-aryl-4(3H)-quinazolinon được tổng hợp bằng cách ngưng tụ dẫn chất của anthranilamid và benzaldehyd Tương

tự phản ứng ngưng tụ anthranilamid và benzoyl clorid, phản ứng này sử dụng NaHSO3làm chất xúc tác phản ứng ngưng tụ và DMAC làm dung môi phản ứng Phản ứng được đun hồi lưu trong 2 giờ ở nhiệt độ 150oC Hiệu suất phản ứng là 75 - 95%

NH2R

NH2O

R

NH O

R' NaHSO3, DMAC

150 o C

Sơ đồ 1.8: Phản ứng tổng hợp của Hour M J và cộng sự

Phương pháp của Hour M J được sử dụng để tổng hợp nhiều dẫn chất thế ở C2,

C6, C7 của vòng quinazolinon Năm 2013, Hour M J và cộng sự đã tổng hợp được 16 dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon

Đặc biệt gần đây nhất năm 2014, Na Yeun Kim và Cheol-Hong Cheon đã phát triển phương pháp tổng hợp các hợp chất quinazolion bằng phản ứng ngưng tụ anthranilamid và các aldehyd trong điều kiện oxy hóa chân không trong dung môi

Sơ đồ 1.9: Phản ứng tổng hợp của Na Yeun Kim và Cheol-Hong Cheon

15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI

Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình tổng hợp có xuất xứ từ các công ty như: Merk, Sigma-Aldrich, Trung Quốc,v.v… Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm Các hóa chất được trình bày ở bảng dưới đây:

1 2- Methylbenzaldehyd Merk 16 Ethylacetat Trung

Quốc

3 2-Trifloromethylbenzaldehyd Merk 18 CDCl3 Merk

4 3-Trifloromethylbenzaldehyd Arcros 19 DMSO-d6 Merk

7 2- Florobenzaldehyd Merk 22 Acid 5-cloro-2-nitrobenzoic Merk

8 3- Florobenzaldehyd Merk 23 2-amino-4-methylbenzonitril Merk

9 Naphthalen-1-carbaldehyd Merk 24 Acid5-methyl-2-nitrobenzoic Merk

12 Diclomethan Merck 27 N,N-dimethylacetamid Merk

13 n-N-hexan Malaysia 28 Dimethylamin 40% Fischer

16

2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM

Dụng cụ thủy tinh: bình cầu 2 cổ dung tích 100ml, bình cầu 100ml, 50ml, sinh hàn, phễu, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner, bình nón, bình chiết… Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản)

Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)

Máy cất quay Buchi R – 210 (Thụy Sỹ)

Tủ sấy Memmert (Đức)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) được ghi trên máy phổ AVANCE Spectrometer AV500 (BRUKER, Đức), Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Máy đo phổ khối khối lượng LC-MSD-Trap-SL - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Máy đo phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.2 Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc

Sử dụng phương pháp sắc ký như: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng (SKLM) và phương pháp kết tinh để tinh chế các hợp chất tổng hợp được

Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được như: phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR), phổ khối lượng (LC_MS)

17

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được theo phương pháp MTT là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất

có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro [14,

31]

2.3.3.1 Nguyên tắc:

Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế

bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng

Hợp chất MTT có tên khoa học là diphenyltetrazolium bormid, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ

3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-ở 37oC, 5% CO2 Màu vàng biến đổi thành formazan tím trong ty thể của tế bào sống Khả năng hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600nm Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzym reductase trong ty thể hoạt động, và như vậy sự chuyển đổi liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của các dẫn chất tổng hợp được trên bốn dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư biểu

mô - KB, tế bào ung thư gan - Hep – G2, tế bào ung thư phổi - LU, tế bào ung thư vú - MCE – 7 Phương pháp này hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI)

2.3.3.2 Dòng tế bào thử nghiệm:

Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:

- KB (Human epidemic carcinoma) – tê bào ung thư biểu mô

- Hep – G2 (Hepatocellular carcinoma) – tế bào ung thư gan

- LU (Human lung carcinoma) – tế bào ung thư phổi

- MCF - 7 (Human breast carcinoma) – tế bào ung thư vú

-

2.3.3.3 Chất chuẩn dương tính: Ellipticin của hãng Sigma - Aldrich

Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính

b Quy trình xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư

- Pha 200 l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa

96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB, LU

- Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 g/ml; 32 g/ml;

8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml Ủ ở 37oC, 5% trong 3 ngày

- Giếng điều khiển (đối chứng dương) chỉ gồm 200 l dung dịch tế bào 3 x 104 tế bào/ml

- Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2mg/ml ở 37oC trong 4 giờ

- Loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều để formazan có thể hòa tan hoàn toàn

- Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm trên máy Spectrophotometter Genios TECAN Mật độ quang phản ánh số lượng tế bào còn sống sót

19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC

Dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon được tổng hợp theo các bước sau:

Tổng hợp các dẫn chất trung gian 2-aminobenzamid

Sơ đồ 3.1: Tổng hợp các dẫn chất trung gian 2-aminobenzamid

Tổng hợp dẫn chất trung gian 2-(dimethylamino)benzaldehyd

N

CH3

H3C

OHC OHC

20

Tổng hợp các dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon bằng phản ứng ngưng tụ các dẫn chất 2-aminobenzamid với các aldehyd thơm theo sơ đồ phản ứng sau: (Sơ đồ 3.3)

150oC

NH N

O

R1

R2

123 5 6 7

8 1'

2' 3'

4'

5' 6'

150 o C

NH N

O

5 6 7 8

Nhỏ từ từ thionyl clorid (7ml; 90mmol) vào bình cầu chứa 5,43g (30mmol) acid

5-methyl-2-nitrobenzoic 1 Hỗn hợp này được đun hồi lưu ở 50oC trong 4 giờ, sau đó

loại thionyl clorid bằng hút chân không Sản phẩm 2 được hòa tan trong 30ml DCM,

sau đó nhỏ từ từ 25ml dung dịch NH4OH ở 0oC, tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng khoảng 4h Kết thúc phản ứng cất loại dung môi dưới áp suất giảm Lọc rửa tủa bằng

nước, sấy khô thu được 5-methyl-2-nitrobenzamid 3 (4.418g dạng bột màu trắng)

Hiệu suất 82%

22

Tổng hợp 2-amino-5-methylbenzamid (4)

Thêm 200ml dung dịch methanol vào bình cầu chứa 4,418g (24,5mmol)

5-methyl-2-nitrobenzamid 3 ở trên Sau đó thêm từ từ 250mg 10%Pd/C vào bình phản

ứng Hỗn hợp phản ứng được hydro hóa ở nhiệt độ phòng Sau 8h kết thúc phản ứng

làm lạnh, lọc loại bỏ xúc tác, cất loại dung môi thu được 2-amino-5-methylbenzamid 4

(3,458g chất bột màu trắng) Hiệu suất 94%

3.1.1.2 Tổng hợp 2-amino-4-methylbenzamid (6)

Công thức:

CONH21

2

3 4 5

6CTPT: C8H10N2O; KLPT: 150,18

Lấy 1,32g(10mmol) 2-amino-4-methylbenzonitril 5 cho vào bình cầu 100ml

Thêm từ từ 24ml EtOH vào khuấy đến khi tan hoàn toàn, sau đó thêm 2,8g (50mmol) KOH vào hỗn hợp trên Hỗn hợp được đun hồi lưu ở 90oC trong môi trường khí N2 và

theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi triển khai n-hexan-ethylacetat (1:1)

Sau 24h kết thúc phản ứng, thêm nước vào và chiết hỗn hợp phản ứng bằng ethylacetat Dịch ethylacetat được làm khô qua natri sulfat, cuối cùng cô cất loại dung

môi Cặn được tinh chế bằng sắc ký cột để thu được 2-amino-4-methylbenzamid 6 là

chất bột màu trắng ngà

Khối lượng sản phẩm: 1,10g Hiệu suất phản ứng: 73%

Sơ đồ:

NO2COCl

NH4OH Dicloromethan

NO2CONH2

(H3C)2N

NH2CONH2

H2, 10% Pd/C

CH3OH DMF, 110 0 C

5-cloro-2-Khối lượng sản phẩm: 480mg chất bột màu trắng Hiệu suất 96%

Tổng hợp 5-(dimethylamin)- 2-nitrobenzamid(10)

Cho từ từ 1,5ml (11,5mmol) dimethylamin 33% vào bình kín có chứa 480mg

(2,4mmol) 5-cloro-2-nitrobenzamid 9 ở trên, thêm 3ml DMF Tiến hành đun hồi lưu ở

110oC Sau 16h kết thúc phản ứng, đổ hỗn hợp phản ứng vào nước đá, lọc rửa tủa thu

được 5-(dimethylamin)- 2-nitrobenzamid 9 (480mg chất bột màu trắng) Hiệu suất

96%

24

Tổng hợp 2-amino-5-(dimethylamin)benzamid(11)

Các bước tiến hành tổng hợp chất 11 tương tự chất 4 Chất trung gian 5-(dimethylamin)benzamid 11 được tổng hợp từ 480mg (2,3mmol) 5-(dimethylamin)- 2-nitrobenzamid 10 ở trên và 30mg 10%Pd/C trong 20ml dung dịch methanol Sản phẩm thu được 2-amino-5-(dimethylamin)benzamid 11 (300mg chất bột màu trắng)

2-amino-Hiệu suất 72%

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất trung gian aldehyd thơm

Đa số các hợp chất trung gian aldehyd thơm được sử dụng là các hợp chất có sẵn sử dụng trực tiếp Ngoài ra, có một dẫn chất trung gian là 2-

(dimethylamino)benzaldehyd 13 được tổng hợp thêm

Công thức:

N

CH3

H3C OHC

Lấy 1ml (1,178g, 9,5mmol) 2-fluorobenzaldehyd 12 vào bình cầu 50ml Thêm

1,3g (9,5mmol) K2CO3 và 5ml dung môi DMF vào bình cầu Sau đó cho thêm 6,4ml (dung dịch 33%, 47,5mmol) dimethylamin vào bình phản ứng Hỗn hợp phản ứng được đun ở 110o

C Sau phản ứng 8h kiểm tra phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi

n-hexan : ethylacetat = 95:05, phản ứng đã xảy ra hoàn toàn Thêm nước vào và chiết

hỗn hợp phản ứng bằng ethylacetat Dịch ethylacetat được làm khô qua natri sulfat,

25

cuối cùng cô cất loại dung môi Cặn được tinh chế bằng sắc ký cột để thu được

2-(dimethylamino)benzaldehyd 13 là chất dầu màu trắng ngà

Khối lượng sản phẩm: 1,3g Hiệu suất phản ứng : 92%

3.1.3 Tổng hợp dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon (14a-k; 15a-c)

150oC

NH N

O

R1

R2

123 5 6 7

8 1'

2' 3'

4'

5' 6'

150 o C

NH N

O

5 6 7 8

14a-k

15a-c

Sơ đồ 3.3: Tổng hợp các dẫn chất 2-aryl-4-quinazolinon

Quy trình tổng hợp chung:

Cho vào bình cầu 2mmol (4 hoặc 6 hoặc 11), tương ứng 2 mmol aldehyd thơm,

208mg NaHSO3 và 2ml DMAC Khuấy đều cho hỗn hợp tan hoàn toàn và đun hồi lưu

ở nhiệt độ 150o

C trong 2 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi triển

khai n-hexan/ ethylacetat Sau khi kết thúc phản ứng để nguội bình phản ứng, đổ hỗn

hợp phản ứng vào nước đá, thấy có kết tủa tạo thành thì tiến hành lọc hút kiệt, rửa tủa nhiều lần bằng nước cất Rửa tiếp vài lần bằng dung môi thích hợp (EtOH lạnh, methanol, etylacetat…) Sấy khô tủa thu được trong chân không Sau đây là kết quả cụ thể:

6-Methyl-2-o-tolyl quinazolin-4(3H)-on (14a)

26

Tiến hành:

Hợp chất 14a được tổng hợp từ (2mmol) chất 4; 0,23ml(2mmol)

2-methylbenzaldehyd; 208mg (2mmol) NaHSO3; trong 2ml DMAC

Sản phẩm thu được là 386mg chất bột màu trắng ngà Hiệu suất 77%.(bảng 3.1) Nhiệt độ nóng chảy: 215-216oC (bảng 3.2)

Rf = 0,75 (TLC, Silicagel 60 F254, hệ dung môi n-hexan: EtOAc (2:1))(bảng 3.2)

Sản phẩm thu được là 450mg chất bột màu trắng ngà Hiệu suất 90%.(bảng 3.1) Nhiệt độ nóng chảy: 235-236oC (bảng 3.2)

Rf = 0,68 (TLC, Silicagel 60 F254, hệ dung môi n-hexan: EtOAc (2:1))(bảng 3.2)

Tiến hành:

Các bước tiến hành tổng hợp chất 14c tương tự chất 14a, từ 300mg (2mmol) chất 4; 0,26ml(2mmol) 2-trifluoromethylbenzaldehyd; 208mg (2mmol) NaHSO3 trong 2ml DMAC

Sản phẩm thu được là 290mg chất bột màu vàng nhạt Hiệu suất 48%.(bảng 3.1) Nhiệt độ nóng chảy: 195-196oC (bảng 3.2)

Rf = 0,58 (TLC, Silicagel 60 F254, hệ dung môi n-hexan: EtOAc (1:1))(bảng 3.2)

29

6-Methyl-2-(3-(trifluoromethoxy)phenyl)quinazolin-4(3H)-on (14f)

Công thức:

NH N

Sản phẩm thu được là 455mg chất bột màu vàng Hiệu suất 90% (bảng 3.1) Nhiệt độ nóng chảy: 308-309oC (bảng 3.2)

Rf = 0,70 (TLC, Silicagel 60 F254, hệ dung môi n-hexan: EtOAc (1:1))(bảng 3.2)