Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 3 oxim isatin hướng tác dụng kháng ung thư

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT  ppm : Độ dịch chuyển hóa học phần triệu ADN : Acid desoxyribonucleic ALL : Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính AML : Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính A

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MƠ

TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-OXIM-ISATIN HƯỚNG TÁC

DỤNG KHÁNG UNG THƯ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MƠ

TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3-OXIM-ISATIN HƯỚNG TÁC

DỤNG KHÁNG UNG THƯ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: TS Phan Thị Phương Dung

PGS.TS Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình tổng hợp và hoàn thành luận văn tôi đã nhận được rất nhiều

sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Phan Thị Phương Dung, PGS.TS Nguyễn Hải Nam, những thầy cô đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo

và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm nghiên cứu tại Bộ Môn Hóa Dược – Trường Đại Học Dược Hà Nội

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các thày cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, các bạn sinh viên nhóm nghiên cứu Hóa Dược – Bộ Môn Hóa Dược – Trường Đại Học Dược

Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi làm tổng hợp hóa học tại đây

Trong thời gian thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các đơn vị, cá nhân trong và ngoài trường Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị Khoa hóa học – Trường đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường đại học quốc gia Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc)

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới chồng, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn bên cạnh động viên tôi, họ là động lực giúp tôi phấn đấu hoàn thành luận văn này

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu mà mọi người đã dành cho tôi

Hà Nội ngày 12 tháng 4 năm 2013

Nguyễn Thị Mơ

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Histon deacetylase 3

1.1.1 Khái niệm về HDAC 5

1.1.2 Phân loại HDAC 5

1.1.3 Cấu tạo HDAC 7

1.1.4 HDAC và ung thư 8

1.2 Các chất ức chế histon deacetylase 10

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC 10

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 16

1.2.3 Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC 16

1.3 Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic 18

1.3.1 Tổng hợp các acid hydroxamic từ ester 18

1.3.2 Tổng hợp các acid hydroxamic từ acid carboxylic 19

1.4 Các chất ức chế HDAC do nhóm nghiên cứu bộ môn Hóa Dược, đại học Dược Hà Nội thiết kế và nghiên cứu 19

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nguyên liệu 21

2.2 Thiết bị và dụng cụ 21

2.3 Nội dung nghiên cứu 21

2.3.1 Tổng hợp hóa học 22

2.3.2 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Phương pháp tổng hợp hóa học 22

2.4.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc 22

2.4.3 Phương pháp thử tác dụng sinh học 23

2.4.4 Kiểm chứng tác dụng của thuốc thông qua docking chất đại diện 25

2.4.5 Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được 26

CHƯƠNG 3 - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Tổng hợp hóa học 27

3.1.1 Tổng hợp các ester trung gian 1a-g 27

3.1.2 Tổng hợp các acid hydroxamic 2a-g 30

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc 33

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết 33

3.2.2 Khẳng định cấu trúc 34

3.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học 39

3.3.1 Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC 39

3.3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 39

3.4 Kết quả docking 40

3.5 Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được 41

CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN 42

4.1 Hóa học 42

4.1.1 Phản ứng tổng hợp các ester trung gian 1a-g 42

4.1.1 Phản ứng tổng hợp các acid hydroxamic 2a-g 42

4.2 Khẳng định cấu trúc 43

4.2.1 Phổ hồng ngoại 43

4.2.2 Phổ khối 44

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 46

4.3 Hoạt tính sinh học 50

4.3.1 Tác dụng ức chế HDAC 50

4.3.2 Tác dụng kháng tế bào ung thư in vitro 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 56

1 Kết luận 56

1.1 Về tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc 56

1.2 Về hoạt tính sinh học 56

2 Đề xuất 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC PHỤ LỤC

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

 (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu)

ADN : Acid desoxyribonucleic

ALL : Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính

AML : Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính

APL : Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính

Dòng tế bào ung thư tụy người Carbonyldiimidazol

Bệnh lympho mãn tính (Chronic lymphocytic leukemia)

Tế bào lymphoT dưới da (Cutaneous T cell lymphoma) Công thức phân tử

13C-NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân 13C

DMSO : Dimethyl sulfoxid

FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (Food and Drug Administration)

HAT : Histon acetyltranferase

HDAC : Histon deacetylase

HDIs : Các chất ức chế HDAC (histon deacetylase inhibition)

Hằng số tương tác (Hz)

Tế bào ung thư vú người Methanol

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid

MS

NCI-H460

NSCLC

: : :

Phổ khối lượng

Tế bào ung thư phổi người Ung thư phổi tế bào không nhỏ (Non-smali lung cell) NST

PC-3

: :

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Cấu trúc của histon trong nucleosom 3

Hình 1.2: Vai trò của cân bằng động giữa HDAC & HAT

đối với với sự phiên mã (DMMTs – DNA methyl transferase, HMT – Histon methyltransferase, hình tròn: nhóm methyl, hình tam giác: nhóm acetyl, hình vuông: nhóm methyl trên đuôi histon) 4

Hình 1.3: Phân loại HDAC ở người 6

Hình 1.4: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC 7

Hình 1.5: Vùng ion K+ của HDAC8 8

Hình 1.6: Vai trò sinh học của HDAC trong tế bào ung thư 10

Hình 1.7: Một số chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng 12

Hình 1.8: HDIs có cấu trúc peptid vòng 13

Hình 1.9: HDIs là các benzamid 13

Hình 1.10: HDIs là các acid béo mạch ngắn 14

Hình 1.11: HDIs có cấu trúc Hydroxamat 15

Hình 1.12: HDIs là các dẫn chất ceton 16

Hình 1.13: Cơ chế tác dụng trong tế bào của các chất ức chế HDAC 16

Hình 1.14: Cơ chế tác dụng giữa các tế bào của các chất ức chế HDAC 17

Hình 1.15: Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố 18

Hình 1.16: Liên quan cấu trúc – tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic 20

Hình 3.1: Kết quả docking của chất 2a và SAHA với HDAC8 40

Hình 3.2: Kết quả docking của chất 2a và N-(2-aminophenyl)benzamid với HDAC2 41

Hình 4.1: Phổ hồng ngoại của chất 2g 44

Hình 4.2: Phổ khối lƣợng của chất 2c 45

Hình 4.3: Phổ 1H-NMR của chất 2f 47

Hình 4.4: Phổ 1H-NMR dãn rộng của chất 2e 48

Hình 4.5: Phổ 13 C-NMR dãn rộng của chất 2f 49

Hình 4.6: Kết quả phân tích Western Blot của các chất 2a-g 50

Hình 4.7: Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào SW620 và MCF-7 của các chất 2a-g so với SAHA 52

Hình 4.8: Biểu đồ so sánh tác dụng kháng tế bào AsPC-1 của các chất 2a-g so với SAHA 53

DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng 12

Bảng 3.1: Giá trị Rf và Tonc của các acid hydroxamic 2a-g 34

Bảng 3.2: Số liệu phân tích phổ IR của các acid hydroxamic 2a-g 35

Bảng 3.3: Số liệu phân tích phổ MS của các acid hydroxamic 2a-g 36

Bảng 3.4: Số liệu phân tích phổ 1 H-NMR của các acid hydroxamic 2a-g 37

Bảng 3.5: Số liệu phân tích phổ 13C-NMR của các acid hydroxamic 2a-g 38

Bảng 3.6: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 2a-g theo qui tắc Lipinsky 41

Bảng 4.1: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ in vitro của các chất 2a-g 51

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.2: Tổng hợp các dẫn chất -alkoxy của SAHA 19

Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung 27

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp các ester trung gian 1a-g 28

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp các acid hydroxamic 2a-g 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những thập kỷ gần đây, việc nghiên cứu phát triển thuốc đã có những bước phát triển kỳ diệu Đặc biệt, nhờ có những tiến bộ trong các lĩnh vực di truyền học, sinh học phân tử… đã mở ra nhiều triển vọng mới cho việc tìm kiếm, phát hiện mục tiêu phân

tử thuốc mới Nghiên cứu chi tiết bản đồ gen người cho phép xác định được nhiều enzym, protein, thụ thể khác nhau đóng vai trò quan trọng trong bệnh ung thư đồng thời cũng là đích mà các thuốc điều trị ung thư hướng tới như histon deacetylase, các protein kinase, telomerase… càng tạo thêm thuận lợi cho việc nghiên cứu phát triển thuốc dựa trên đích tác dụng phân tử

Một trong những đích tác dụng phân tử đang được quan tâm hiện nay là histon deacetylase (HDAC) Các nghiên cứu về HDAC đã chỉ ra rằng HDAC có liên quan đến nhiều loại bệnh ung thư do chúng có thể gây ra những sai khác trong quá trình phiên mã tạo điều kiện cho sự hình thành khối u [26] Vì vậy, một số nhà khoa học đã và đang tập trung nghiên cứu các chất ức chế HDAC và đã thu được nhiều kết quả khả quan Acid suberoylanilid hydroxamid (biệt dược Vorinostat, Zolinza®) là một ví dụ điển hình Đây

là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên đã được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da (2006) Chất này là một trong số các chất được nghiên cứu phát triển từ TSA – là một chất ức chế HDAC tự nhiên cũng có chứa nhóm chức acid hydroxamic trong phân tử Bên cạnh đó còn có rất nhiều chất khác đang được nghiên cứu và đưa vào thử nghiệm lâm sàng [39]

Cùng với hướng tiếp cận này, trong thời gian gần đây, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược trường Đại Học Dược Hà Nội đã nghiên cứu thiết kế một số dãy chất mang khung benzothiazol với định hướng ức chế histon deacetylase [1,2,41]

Trong đó có một dãy dẫn chất với mạch 6 carbon thể hiện hoạt tính rất tốt khi thử

độc tính tế bào ung thư in vitro [1,2] Điều này cho thấy các chất ức chế HDAC có chứa

nhóm chức acid hydroxamic có triển vọng trong điều trị ung thư Nhằm tiếp tục mở rộng thiết kế tìm kiếm các dẫn chất mới chứa nhóm chức acid hydroxamic, luận văn:

“Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 3-oxim-isatin hướng tác dụng kháng ung thư” đƣợc thực hiện với 2 mục tiêu:

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

1.1.1 Khái niệm HDAC

Histon deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl

từ -N-acetyl lysin amino acid của phần histon làm cho nhiễm sắc thể bị đóng xoắn và

ức chế quá trình phiên mã [12,28,50]

Bộ gen của người được gói trong nhiễm sắc thể (NST), một phức hợp đại phân tử protein-ADN NST có cấu trúc động, được tổ chức cao, bao gồm: ADN, các protein histon và protein không phải histon Đơn vị cấu trúc cơ bản của NST là nucleosom Một nucleosom bao gồm 146 cặp base của ADN quấn quanh một lõi histon octamer Histon octamer bao gồm từng cặp của mỗi H2A, H2B, H3 và H4 (hình 1.1) [3,57]

Hình 1.1: Cấu trúc của histon trong nucleosom

Một nucleosom điển hình bao gồm 1octomer hình đĩa của 4 cặp histon (2 cặp của H2A với H2B và 2 cặp của H3 với H4) được quấn quanh bởi 146 cặp nucleotid (hình 1.1) Đầu amin của histon mang nhiều điện tích dương nên tương tác mạnh với phần

phosphat mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom và các cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể, quy định quá trình biểu thị gen Khi histon tích điện dương lớn, tương tác này mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch

mã và tổng hợp protein, làm ức chế sự biểu thị của gen Ngược lại khi tương tác điện tích này yếu nhiễm sắc thể tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra, đặc tính của gen đựợc biểu hiện thông qua các tính trạng Quá trình này diễn ra đặc biệt mạnh ở H3

và H4

Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon Acetyl hóa trung hòa điện tích dương của histon làm nới lỏng tương tác của nó với ADN trong khi đó deacetyl hóa có tác dụng ngược lại Trong

tế bào, enzym histon acetyltranferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) là 2 enzym điều hòa quá trình acetyl hóa này từ đó quyết định sự biểu hiện của gen [26,52,57] hình (1.2)

Hình 1.2: Vai trò cân bằng động giữa HDAC và HAT đối với sự phiên mã (DMMTs - DNA

methyl transferase, HMT- histon methyltransferase, hình tròn: nhóm methyl, hình tam giác:

nhóm acetyl, hình vuông: nhóm methyl trên đuôi histon)

HAT xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến liên kết với nhóm - amino của lysin ở phần đầu của histon

Trên histon H3 và H4 sự chuyển đổi xảy ra nhiều hơn [3,6] Sự acetyl hóa histon

làm tháo xoắn nhiễm sắc thể bằng cách trung hòa điện tích dương tại đầu N của histon

nên làm giảm ái lực của histon với phần điện tích âm trên ADN HAT không gắn trực tiếp với ADN mà tạo thành phức hợp với các HAT khác cũng như với các nhân tố sao chép mã [45] (hình 1.2)

1.1.2 Phân loại HDAC

Hiện nay đã có 18 HDAC khác nhau được biết đến và được chia thành 4 nhóm [15,42,47] Các HDAC khác nhau ở tính tương đồng chuỗi, cơ chất đặc hiệu và cofactor

phụ thuộc [20,54]

1.1.2.1 Nhóm I : gồm các loại sau: HDAC1, HDAC2, HDAC3 và HDAC8

Các enzym này có ở phần nhân của nhiều loại tế bào như nấm men, thực vật, động vật có vú Ở động vật có vú, các HDAC này được chia thành 2 phân nhóm HDAC1/2 và HDAC3/8 [3]

Cấu trúc của HDAC1 và HDAC2 có sự tương đồng cao (82%) Phosphorin hóa serin trên HDAC1, HDAC2 điều hòa hoạt động của chúng và tạo nên phức hợp các cofactor khác nhau [17]

HDAC3 có cấu trúc vùng tương tự các HDAC1 và HDAC2, đồng nhất khoảng 68% với HDAC1, HDAC2 ở vùng các acid amin [45]

HDAC8 có chủ yếu ở động vật có xương sống HDAC8 có 37% tương đồng vùng các acid amin với HDAC3 Hoạt động của HDAC8 giảm khi phosphoryl hóa bởi protein kinase A, trong khi đó HDAC1 và HDAC2 lại hoạt động bởi sự phosphoryl hóa HDAC8 là HDAC đầu tiên ở động vật có vú xác định được cấu trúc 3 chiều [48]

1.1.2.2 Nhóm II: gồm 2 phân nhóm: nhóm IIa (HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9)

và nhóm IIb (HDAC6, HDAC10)

HDAC nhóm II có kích thước phân tử lớn (855-1122 aa) và khác HDAC nhóm I khi tham gia vào quá trình ức chế phiên mã Các enzym này biểu thị mô đặc trưng, có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân

Hơn 70% vùng các acid amin của HDAC4, HDAC5 tương đồng với nhau, còn

HDAC7 chỉ tương đồng khoảng 57 - 58% với HDAC4, HDAC5

Các HDAC nhóm IIa có tương tác đặc hiệu với yếu tố phiên mã MEF2 (myogenic transcription factor 2)-đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hóa cơ Các HDAC này có thể

bổ sung cho nhau để kiểm soát sự điều hòa biệt hóa của quá trình biểu hiện gen trong các giai đoạn khác nhau của sự biệt hóa trong tế bào cơ [45]

HDAC6 và HDAC10 tương đồng khoảng 37% ở vùng acid amin Chúng có hai vùng xúc tác, tuy nhiên HDAC10 có một vùng xúc tác bị bất hoạt Một đặc điểm riêng chỉ

có ở HDAC6 là sự có mặt của HUB (HDAC6-, USP3- và Brap2-related zinc finger motif) Đặc điểm này là dấu hiệu cho sự ubiquitin hóa và cho thấy HDAC này thiên về sự

thoái hóa Nghiên cứu in vitro và in vivo đã xác định HDAC6 liên quan chặt chẽ đến các

bệnh thoái hóa mô thần kinh như bệnh Parkinson, bệnh Hutington HDAC10 có khả năng tương tác với HDAC1-7, nhưng không tương tác với HDAC6 [11,31,45]

HDAC Protein Phân bố Biến đổi sau Liên quan đến

trong tế bào phiên mã ung thư

Hình 1.3: Phân loại HDAC ở người [11]

* Chú thích: Hình chữ nhật màu xanh dương là vùng xúc tác được bảo tồn của HDAC; N: nhân; C: bào tương; Mit: ty thể; Ac: acetyl hóa; P: phosphoryl hóa; S: sumoyl hóa; Ub: ubiquitin hóa

N.D: chưa xác định

Các HDAC nhóm I, II, IV được gọi là các HDAC “kinh điển” phụ thuộc vào Zn2+

và bị ức chế bởi các chất tạo phức chelet với Zn2+

như các acid hydroxamic, thiol

Trong khi đó các HDAC nhóm III lại phụ thuộc vào NAD+ [47,53] HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà còn ảnh hưởng đến rất nhiều protein không histon khác Thuật ngữ các chất ức chế HDAC thường được dùng cho những chất có mục tiêu phân tử là các HDAC kinh điển và hiện đang được nghiên cứu trên lâm sàng [3,5] (hình 1.3):

1.1.3 Cấu tạo của HDAC

Cho đến nay, bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X người ta đã xác định được cấu trúc 3D của hầu hết các HDAC và các trung tâm xúc tác phản ứng deacetyl

của chúng Điều này giúp cho việc nghiên cứu tương tác của các chất ức chế HDAC bằng việc sơ bộ đánh giá tính tương tác vào trung tâm hoạt động của chúng Các kết quả này được ứng dụng trong việc thiết kế cấu trúc của nhiều dãy chất ức chế HDAC mới, đặc biệt

là các chất có tác dụng ức chế chọn lọc các HDAC riêng biệt Về cơ bản các HDAC có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau, chúng đều gồm các phần cơ bản sau (hình 1.4):

Hình 1.4: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC

+ Ion Zn2+ là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng Đây là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí Thông thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [25,34]

+ Kênh enzym là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls với cơ chất Kênh này có cấu trúc dạng túi, ở HDAC8 nó có chiều dài khoảng 1,2nm Nó được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất

và tham gia phản ứng deacetyl Đối với các hợp chất hydroxamic chiều dài của kênh này

là tối ưu với khoảng 5-6 liên kết carbon [25,52]

Ngoài ra ở HDAC8, người ta còn thấy 4 ion K+

(hình 1.5), mỗi tiểu phân gồm 2 ion Các ion này đều tham gia 6 liên kết phối trí Ion thứ nhất cách ion Zn2+ khoảng 0,7

nm và liên kết với 6 acid amin Ion thứ 2 nằm xa hơn liên kết với 4 acid amin và 2 phân

HAT có vai trò quan trọng trong sự di chuyển, xâm lấn, sự biểu thị quá mức hoặc

sự đột biến trong rất nhiều loại ung thư như ung thư máu, ung thư biểu mô Hai HAT bị biến đổi rõ nhất trong một số bệnh ung thư là p300 và CBP [18,44]

Tương tự, mối tương quan giữa hoạt động của HDAC và sự tạo thành khối u cũng

đã được xác định Sự huy động bất thường của các HDAC vào chuỗi điều hòa của gen đích có thể xảy ra thông qua tương tác biến đổi của chúng với việc tăng cường vai trò của các protein gắn kết ADN gây ung thư Ví dụ như receptor RAR gắn kết gen PML (promyelocytic leukemia gene) hoặc PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger) trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL) Trong điều kiện sinh lý, RAR là nhân tố sao mã hoạt hóa acid retinoic giúp giải phóng phức hợp đồng ức chế chứa HDAC và làm gia tăng các chất đồng hoạt hóa sao mã (bao gồm cả HAT) Điều này dẫn đến sự acetyl hóa histon và ức chế gen đẩy mạnh sự biệt hóa tế bào Trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL), protein gắn kết RAR PML hoặc RAR PPLZF giữ HDAC và phối hợp với phức hợp đồng ức chế Do đó tăng methyl transferase histon và ADN, dẫn đến ngăn cản

sự phiên mã [11,14,26] Do vậy, tế bào ung thư không trải qua giai đoạn biệt hóa và phát triển quá mức Biểu thị quá mức HDAC1 và hoặc HDAC2 và hoặc HDAC6 còn gặp trong một số bệnh ung thư tạng như ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ dày, trực tràng, ung thư vú và ung thư não [21,49] cũng như trong các bệnh lý ác tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T ngoại vi, bệnh u lympho tế bào B và bệnh u lympho da tế bào T) [38]

Hình 1.6: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư

Các nghiên cứu có ý nghĩa thống kê đã chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình, kể cả sự di chuyển, sự xâm lấn và sự tạo mạch Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thư được tóm tắt ở hình 1.6 [13,28,46]

Có thể thấy rằng việc ức chế phiên mã bị ảnh hưởng bởi sự gia tăng hoạt động của HDAC và có thể kiểm soát ung thư bằng cách ức chế HDAC Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã và đang được triển khai nhằm tìm kiếm các chất ức chế HDAC – một mục tiêu phân tử rất hấp dẫn trong điều trị ung thư [45]

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC (HDIs)

HDAC có vai trò quan trọng điều hoà chu trình tế bào bao gồm sự phát triển của tế bào, sự chết của tế bào theo chương trình, điều hoà sự sao chép Nếu các enzym HDAC được huy động quá mức có thể dẫn đến bất hoạt các tín hiệu của sự chết tế bào theo chương trình, bất hoạt các yếu tố điều hoà chu trình tế bào và tạo điều kiện hình thành khối u [53] Chính vì vậy, bắt đầu từ những năm 90 của thế kỷ trước, việc nghiên cứu tìm

ra các hợp chất có tác dụng ức chế HDAC đã được tiến hành và các kết quả nghiên cứu đã được công bố trên nhiều tạp chí dược học của thế giới

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng [35]

Các benzamid MS-275

CI-994 MGCD-0103

I, II

I, II

II

Tạng đặc, u lympho, AML, u hắc sắc tố ác tính di căn giai đoạn muộn

Tạng đặc, NSCLC, tế bào thận, tuỵ

Tạng đặc, ung thư bạch cầu, MDS

Acid béo mạch

ngắn

Butyrat AN-9 (tiền thuốc) Acid valproic Phenyl butyrat

Acid

hydroxamic

SAHA

PXD101 NVP-LAQ824

Tạng đặc, ung thư máu

LBH-589 ITF-2357 SB-939 CRA 024781

* Chú thích: NSCLC, carcinom tế bào phổi không nhỏ; AML, ung thư bạch cầu tủy bào cấp; MDS, hội chứng loạn sản tủy; CTCL, u lympho da tế bào T; ALL, ung thư bạch cầu cấp; CLL,

ung thư bạch cầu mạn

Hình 1.7: Một số chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng [12]

Hiện nay có khoảng 15 chất ức chế HDAC đang đƣợc thử nghiệm trên lâm sàng để điều trị ung thƣ (hình 1.7 – bảng 1.1)

1.2.1.1 Các peptid vòng

Nhóm này có cấu trúc phức tạp nhất trong các HDIs, tác dụng ức chế HDAC mạnh

tương tự như các acid hydroxamic gồm: Depsipeptid (FK-228), apicidin, trapoxin A và các CHAP (cyclic hydroxamic acid-containing peptide) (hình 1.8) Đa số các chất trong nhóm này có tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ nanomol Depsipeptid (biệt dược

Romidepsin) là polypeptid tự nhiên được phân lập từ nấm Chromobacterium violaceum

và là chất ức chế HDAC thứ 2 được FDA phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T (tháng 11/2009) [31]

Kết hợp peptid vòng và acid hydroxamic tạo ra sản phẩm là các CHAP Trong số

đó, CHAP31 có tác dụng tốt nhất (ức chế HDAC1 với IC50 3,32 nM), và bền hơn TSA trong tế bào (T1/2 dài hơn) [39]

nh 1 8: HDIs c cấu trúc peptid vòng

1.2.1.2 Các benzamid

Năm 1999, Suzuki và cộng sự thuộc công ty dược Mitsui đã công bố tác dụng ức

chế in vitro và in vivo của dẫn chất benzamid [38] Các Benzamid gồm một số chất

MS-275, CI-994, MGCD-103 (hình 1.9), chúng có hoạt tính kém hơn các acid hydroxamic và các peptid vòng, ức chế HDAC ở nồng độ micromol [18] MS-275 và CI-994 đang đƣợc thử nghiệm lâm sàng ở pha 2 [17]

nh 1 1 : HDIs là các acid b o mạch ng n

1.2.1.4 Acid hydroxamic và các dẫn chất

Hiện nay, acid hydroxamic là nhóm ức chế HDAC đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất,

nồng độ ức chế HDAC của chúng nằm trong khoảng nanomol đến micromol

Trichostatin A (TSA) là chất đầu tiên được phân lập từ Streptomyces hygroscopicus với tác dụng chống nấm bởi Tsuji và cộng sự năm 1976 (hình 1.11) Năm

1986, tác dụng làm giảm sự biệt hóa tế bào trong bệnh bạch cầu Friend và ức chế chu trình tế bào của TSA đã được Morioka và cộng sự cùng Yoshida và cộng sự chứng minh [58] Nghiên cứu gần đây xác định TSA đóng vai trò như chất ngăn cản sự di căn trong ung thư đại tràng Việc sản xuất TSA rất tốn kém mà lại không hiệu quả (qua 20 bước và hiệu suất 2%) nên TSA chủ yếu dùng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu tìm ra các chất

ức chế HDAC mới [45]

Chất ức chế HDAC tổng hợp là acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) (hình 1.11) đã được nghiên cứu Báo cáo cho thấy SAHA ức chế sự phát triển tế bào, dẫn đến kết thúc sự biệt hoá và ngăn ngừa hình thành khối u trên chuột Năm 2006, SAHA (Vorinostat, Zolinza) đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào

T [69] SAHA làm tăng sự acetyl hoá của các histon H2B, H3 và H4 dẫn đến hoạt hoá caspase 3 và sự chết tế bào theo chương trình Hiện nay, Zolinza đang tiếp tục được thử nghiệm lâm sàng ở dạng phối hợp với các hoá trị liệu khác như tamoxifen, bortezomib, temozolomid

nh 1 11: HDIs c cấu trúc hydroxamat

Bên cạnh đó, nhiều chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic vẫn đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu rộng rãi nhƣ: acid hydroxamic mạch thẳng, dẫn chất cinnamic (CBHA, LAQ 824, LBH 589, PXD101), dẫn chất phenyl (hình 1.11) Đặc điểm chung của nhóm này là nhóm chức acid hydroxamic dễ tạo phức với ion Zn2+ của HDAC nên ức chế không chọn lọc cả HDAC nhóm I, II và bị chuyển hóa nhanh [54]

Có thể thấy acid hydroxamic và các dẫn chất của nó có hiệu lực ức chế HDAC tốt

song chúng có nhƣợc điểm là ức chế không chọn lọc và nửa đời in vivo ngắn Chính vì

vậy, rất nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang nỗ lực tìm kiếm các dẫn chất mới dựa trên phiên mẫu của TSA, SAHA và các chất đã tìm đƣợc Dựa trên đặc điểm cấu trúc của các chất ức chế HDAC, các nghiên cứu có thể tiến hành thay đổi một trong 3 phần cấu trúc: nhóm khóa hoạt động, cầu nối hoặc nhóm chức hydroxamic

1.2.1.5 Các dẫn chất chất ceton

Nhóm này bao gồm các trifluoromethyl ceton và -ketoamid với hoạt tính ức chế HDAC ở mức nồng độ micromol (hình 1.12) [16]

CF3H

O

O

H N H

hướng nghiên cứu rất hấp dẫn để thiết kế ra các thuốc mới có hoạt tính sinh học cao chống ung thư

1.2.3 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

1.2.3.1 Cơ chế tác dụng trong tế bào của các chất ức chế DAC:

Hình 1.13: Cơ chế tác dụng trong tế bào của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC tác động trên một số gen bằng cách [7,12,26, 54] (hình 1.13):

- Thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình Hiện đã xác định được 2 con đường gây chết tế bào và cả hai đều có sự tham gia của các enzym cystein protease (các caspase) (hình 1.13)

- Hoạt hoá các chương trình biệt hoá, ức chế chu trình tế bào Quá trình này

đã được làm rõ ở nhiều loại bệnh ung thư Ví dụ như bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp ( APL)

- Ức chế sự tạo mạch trong khối u, do đó ngăn cản quá trình cung cấp oxy và dinh dưỡng cho khối u Kết quả là ngăn cản rõ rệt sự phát triển của khối u

1.2.3.2 Cơ chế tác dụng giữa các tế bào của các chất ức chế DAC:

Các chất ức chế HDAC ngăn cản các đuôi histon có nhóm acetyl tiến đến vị trí xúc tác (hình 1.14)

Hình 1.14: Cơ chế tác dụng giữa các tế bào của các chất ức chế HDAC

1.2.4 Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC

Nói chung, hiệu quả tác dụng của các chất ức chế HDAC dựa trên sự có mặt của 3 yếu tố chính là nhóm kết thúc, cầu nối, nhóm khóa hoạt động [9] (hình 1.15) Cụ thể:

- Nhóm kết thúc: tương đương với phần C ở hình 1.15, có thể gắn kết với Zn2+ trên

vị trí tác dụng của các enzym HDAC Đây là phần không thể thiếu trong cấu trúc, chúng quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của HDIs Nhóm này có thể là acid hydroxamic, các thiol, benzamid, mercaptoceton

- Cầu nối: quyết định sự phù hợp về cấu trúc của các chất với chiều dài kênh enzym Trong hình 1.15 được thể hiện ở phần B Phần này thường là các hydrocarbon thân dầu, có thể tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym

- Nhóm khoá hoạt động (capping group): tương đương với phần A trong hình 1.15, nhóm này thường là vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt của enzym

Cho đến nay, phần lớn các nghiên cứu liên quan cấu trúc – tác dụng đều tập trung tìm hiểu vai trò của nhóm gắn kết với Zn2+

, đồng thời nghiên cứu thay thế acid

hydroxamic cũng như cầu nối Tổng kết liên quan cấu trúc – tác dụng của một dãy các dẫn chất của acid hydroxamic đã được nghiên cứu dựa trên cấu trúc của SAHA như sau [56]:

Hình 1.15: Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC d n chất

acid hydroxamic

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC

1.3.1 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester

Phương pháp này được nhiều nhóm nghiên cứu ứng dụng để tổng hợp các acid hydroxamic Andrianov và cộng sự [6], Marson và cộng sự [36] đều tổng hợp các acid hydroxamic từ dẫn chất methyl ester bằng cách cho phản ứng với dung dịch hydroxylamin trong hỗn hợp NaOH, MeOH ở điều kiện 0oC đến nhiệt độ phòng với hiệu suất khá cao (sơ đồ 1.1)

Sơ đồ 1 1: Tổng hợp các d n chất -alkoxy của SAHA [31]

Tùy thuộc vào bản chất của chất tham gia phản ứng, điều kiện phản ứng và dung môi có thể thay đổi cho phù hợp Trong nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic có cầu

nối chứa vòng triazol, Chen và cộng sự [10] tiến hành tổng hợp acid hydroxamic từ dẫn chất methyl ester với dung dịch hydroxylamin trong hỗn hợp KCN:THF (1:1) ở nhiệt độ phòng, hiệu suất phản ứng cũng rất cao (>80%)

1.3.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic

Trong một số trường hợp, phản ứng trực tiếp giữa dẫn chất methyl ester và hydroxylamin không thể xảy ra Khi đó, nhiều nhóm nghiên cứu lựa chọn phương pháp sử dụng tác nhân hoạt hóa acid carboxylic đồng thời sử dụng hydroxylamin có nhóm bảo vệ -OH để tăng khả năng phản ứng vào nhóm -NH2

Để tổng hợp các dẫn chất acid 5-pyridin-2-yl-thiophen-2-hydroxamic, Price và cộng sự [43] đã sử dụng tác nhân hoạt hóa HATU để tạo ester hoạt hóa ngay trong phản ứng, đồng thời sử dụng hydroxylamin tetrahydropyran Sau đó, nhóm bảo vệ -OH được

tách bởi acid p-TSA hoặc HCl 4M trong dioxan Phản ứng trải qua 2 bước do vậy hiệu

suất tổng chỉ đạt được khoảng 40 – 50%

Sơ đồ 1 : Tổng hợp acid biaryl hydroxamic [35]

1.4 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC DO NHÓM NGHIÊN CỨU BỘ MÔN HÓA DƯỢC, ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU

Cùng với xu hướng chung về nghiên cứu phát triển thuốc mới theo hướng thuốc tác dụng tại đích, cụ thể đích tác dụng là enzym HDAC, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế và phát triển hàng loạt các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC

Nhiều kết quả đã được công bố trong các tạp chí trong nước và quốc tế [2,41], cũng như trong luận án tiến sĩ [1], (hình 1.16)

OH

O NH S

N

NH

R1

n ( )

n = 3,5

O

OH

O NH S

N

NH

R2

6 ( )

R3

O

O O

OH

NH ( )

N S

NH ( )

6

Hình 1.16: Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố

Việc tiếp cận các dẫn chất của acid hydroxamic hiện nay vẫn được tiếp tục triển khai ở bộ môn Hóa Dược Đây là hướng nghiên cứu rất hấp dẫn có thể tạo ra các dẫn chất thể hiện hoạt tính tốt kháng tế bào ung thư để thử nghiệm lâm sàng Vì vậy, luận văn đã thiết kế một số dẫn chất của acid hydroxamic mang khung 3-oxim-isatin với hy vọng đóng góp được phần nào vào sự phong phú của các dẫn chất acid hydroxamic trên việc thử hoạt tính ức chế HDAC và ức chế tế bào ung thư

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, pipet, phễu thủy tinh

- Sinh hàn hồi lưu, bình chiết, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Máy khuấy từ gia nhiệt, máy cất quay chân không Buchi R-210

- Máy siêu âm, máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal Melting Point Apparatus)

- Tủ lạnh, tủ sấy

- Cân phân tích, cân kỹ thuật

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh

- Máy Perkin Elmer ghi Phổ hồng ngoại (IR)

- Máy Agilent 6310 Ion Trap MS, máy LTQ Orbitrap XL và máy HP 5989B – MS ghi phổ khối (MS)

- Máy Bruker AV-500 ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon (13C-NMR)

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Thử độc tính tế bào ung thư in vitro

- Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất tổng hợp được

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp tổng hợp hóa học

- Tổng hợp 7 dẫn chất 2a-g có công thức cấu tạo dưới đây bằng phương pháp hóa

học Sơ đồ tổng hợp được trình bày trong phần 3.1

R

OH

OH O

NH O

4 1 Kiểm tra độ tinh khiết

- Dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng và kiểm tra

độ tinh khiết của các dẫn chất

- Đo nhiệt độ nóng chảy để kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất

2.4.2.2 Khẳng định cấu trúc

Các chất tổng hợp được xác định cấu trúc bằng các loại phổ: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1

H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon (13NMR)

C Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-600 cm-1

tại phòng thí nghiệm bộ môn hóa vật liệu – Khoa Hóa – Trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không

để loại bỏ hơi ẩm

- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng: máy HP 5989B-MS, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, máy Agilent 6310 Ion Trap LC/MS, Viện Hóa hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy LTQ Orbitrap XL , Khoa Hóa học – Trường Đại Học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon (13C-NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-500, dùng DMSO-d6 làm dung môi Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million – ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.4.3 1 Phương pháp thử tác dụng ức chế histon deacetylase

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng SW620 Phân tích dựa trên Western Blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng [13,56]

a Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào

Các tế bào ung thư đại tràng SW620 được nuôi cấy trong môi trường RPMI được bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò FBS (fetal bovine serum); gọi là môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium) Tất cả các tế bào được ủ ở 37o

C với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí

Trước khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan trong DMSO để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mM Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc Nồng độ thử cuối cùng với các mẫu là 1 μM

b Phân lập histon và Western Blot

Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) được ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (mẫu tế bào không ủ với mẫu thử) Sau đó, các tế bào được xử lý và rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý có đệm phosphate

Tiếp theo, tế bào được dung giải trong dung dịch dung giải đệm (20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150mM NaCl; 1mM Na2EDTA; 1mM EGTA; 1% triton; 2,5% Na pyrophosphate; 1 mM β-glycerophosphat; 1mM Na3VO4; 1 μg mL leupeptin), ủ trong đá

15 phút Hỗn dịch được ly tâm và phần dịch được thu hồi để tiến hành điện di trên gel

Histon được điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF Các màng được ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ Các dải có phản ứng dương tính được phát hiện nhờ sự phát quang đã được tăng cường Các thí nghiệm được làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập

2.4.3.2 Phương pháp thử độc tính trên tế bào ung thư

a Nguyên t c thử

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại khoa Dược, trường đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị IC50 được tính trên phần mềm GraphPad Prism

Dòng tế bào thử nghiệm:

- SW620: tế bào ung thư đại tràng

- MCF-7: tế bào ung thư vú

- AsPC-1: tế bào ung thư tụy

- PC-3: tế bào ung thư tiền liệt tuyến

- NCI-H460: tế bào ung thư phổi

Các tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò)

Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp MTT theo các bước sau:

b Chuẩn bị

Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào

trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 l Các đĩa sau đó được ủ ở 370Ctrong điều kiện 5% CO2 Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 L môi trường DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong DMSO rồi thêm 2 L mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%

c Tiến hành thử

Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 l thuốc nhuộm MTT (nồng độ MTT 5

mg mL trong muối đệm phosphat - PBS) Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 370Ctrong điều kiện 5% CO2 Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100 l dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan được hòa tan Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm

d tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5% Giá trị

IC50 được tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism Trong phương pháp thử này, IC50 

20 g mL được coi là có hoạt tính

2.4.4 Kiểm chứng tác dụng ức chế HDAC thông qua phương pháp docking chất đại diện

Để kiểm tra sơ bộ tính tương tác của các chất tổng hợp được với HDAC (docking),

chất 2a đã được tiến hành docking thử Quá trình docking được thực hiện tại phòng

nghiên cứu cấu trúc Đại học quốc gia Seul, Hàn Quốc Tại đây sử dụng mạng lưới cấu

trúc của HDAC8 tương tác với SAHA và HDAC2 tương tác với

N-(2-aminophenyl)benzamid HDAC8 có sự tương đồng cao với HDAC4 với điểm DALI Z score, điểm đánh giá độ giống) 40,4 và r.m.s.d (root-mean-square deviation, độ lệch) 2,1Ǻ, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC của động vật có vú đầu tiên được nghiên cứu kỹ nhất HDAC2 cũng có sự tương đồng cao với HDAC3, thứ tự acid amin giống nhau (67%) Thử nghiệm lắp ghép các chất vào HDAC8 và HDAC2 được kiểm soát bằng chương trình AutoDock Vina, tiếp theo dự đoán năng lượng của tương tác liên kết từ

(Z-sự lắp ghép trên

Kết quả sẽ được minh họa bằng hình ảnh mô hình và số liệu dự đoán năng lượng liên kết

2.4.5 Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được

Tính giá trị logP của các chất tổng hợp bằng phần mền EPTsuite cung cấp bởi US Environmental Protection Agency's Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC) Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP

Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinsky [32]:

+ Khối lượng phân tử của chất không lớn hơn 500 g mol

+ Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10

+ Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5

+ Giá trị logP của chất không lớn hơn 5

+ Số liên kết linh động không lớn hơn 15