Thăm dò cơ chế tác dụng hạ đường huyết của phân đoạn n hexan rễ cây chóc máu nam trên mô hình nuôi cấy tế bào cơ vân c2c12

Một vài nét về bệnh đái tháo đường Theo Tổ chức Y tế thế giới WHO đái tháo đường ĐTĐ l “một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose huyết do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THÙY LINH

THĂM DÒ CƠ CHẾ TÁC DỤNG

HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA PHÂN ĐOẠN N-HEXAN

RỄ CÂY CHÓC MÁU NAM TRÊN MÔ HÌNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THÙY LINH

THĂM DÒ CƠ CHẾ TÁC DỤNG

HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA PHÂN ĐOẠN N-HEXAN

RỄ CÂY CHÓC MÁU NAM TRÊN MÔ HÌNH

h h h i TS Trần Thị Oanh – Cục Khoa h c công nghệ ạo, Bộ

Y t và ThS Đỗ Thị Nguyệt Quế - Bộ D c l ờ g Đại h D c

Hà Nội, nhữ g g ời th h ng d n, chỉ b o nhiệ h h ể tôi

có thể hoàn thành lu

Xin trân tr ng c gi hiệ h g ạ ại h

ờ g Đại D ội ạ i iệ h i gi i g

h h h h h

Xi c gửi lời c i các th y cô, các anh chị kỹ thu t viên Bộ

D c l ờ g Đại h D c Hà Nội gi nhiệt tình và tạ i u kiệ ể tôi th c hiện lu

Cu i ù g i i c gửi lời c c t i gi h ạn bè và ồng nghiệp, nhữ g g ời luôn ở bên qu ộng viên tôi trong nhữ g hó h gi tôi v m i mặt trong su t thời gian h c t p và

th c hiện lu

Hà Nội, tháng 8 năm 2013

Học viên Trần Thị Thùy Linh

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đề……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……… 2

1.1 Một vài nét về bệnh đái tháo đường……… 2

1.1.1 Đái tháo đường typ 1……… 2

1.1.2 Đái tháo đường typ 2……… 4

1.1.3 Các typ đái tháo đường đặc hiệu khác……… 5

1.1.4 Đái tháo đường ở người mang thai……… 6

1.2 Adenosin monophosphat – activated protein kinase (AMPK)…… 6

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc……… 6

1.2.2 Sự hoạt hóa phức hợp AMPK……… 8

1.2.3 Vai trò của AMPK trong đái tháo đường……… 10

1.2.4 Một số chất hoạt hóa AMPK……… 14

1.3 Cây Chóc máu Nam (Salacia cochinchinensis Lour.)……… 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 21

2.1 Nguyên liệu……… 21

2.2 Tế o d ng trong nghi n cứu……… 21

2.3 Hóa chất dụng cụ v thiết bị dùng trong nghiên cứu……… 21

2.4 Phương pháp nghi n cứu……… 23

2.4.1 Thăm dò khả năng gây độc tế bào C2C12 của dịch chiết PĐ 23

2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của PĐ đến khả năng thu nhận glucose của tế bào C2C12……… 25

2.4.3 Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của PĐ v các chất chiết tách được từ PĐ tr n tế o C2C12 27

2.5 Xử lý số liệu……… 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 32 3.1 Kết quả thăm dò khả năng gây độc tế bào C2C12 của PĐ………… 32 3.2 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của PĐ đến khả năng thu nhận glucose

3.2.1 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của PĐ đến khả năng thu nhận

glucose vào tế bào C2C12 khi không có mặt insulin……… 33 3.2.2 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của PĐ đến khả năng thu nhận

glucose vào tế bào C2C12 khi có mặt insulin……… 34 3.3 Kết quả đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của PĐ v các chất chiết

tách được từ PĐ ……… 35 3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của PĐ ở các nồng độ khác nhau

đến mức độ biểu hiện của p-AMPK và AMPK tổng……… 35 3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các chất chiết tách được từ PĐ

đến mức độ biểu hiện của p-AMPK ……… 37

4.3.1 Ảnh hưởng của PĐ ở các nồng độ khác nhau đến mức độ biểu

4.3.2 Ảnh hưởng của các chất chiết tách được từ PĐ đến mức độ biểu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng3.1 Giá trị mật độ quang của các lô tế bào sau khi ủ với MTT 32 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của PĐ đến mức độ thu nhận glucose của tế bào

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của PĐ đến mức độ thu nhận glucose của tế bào

Bảng 3.4 Tỷ lệ phần trăm mức độ biểu hiện p-AMPK và AMPK tổng

Bảng 3.5 Tỷ lệ phần trăm mức độ biểu hiện p-AMPK so với mức độ

biểu hiện của β-actin trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của SCC1,

DANH MỤC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ACC Acetyl – CoA carboxylase

AICAR 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1β-ribofuranoside AMP Adenosine monophosphat

AMPK Adenosine monophosphat – activated protein kinase ATP Adenosine triphosphat

CaMKK Calmodulin-dependent protein kinase kinase

CBS cystathionine – β – synthase

ChREBP Carbohydrate Response Element Binding Protein CPT1 Carnitin palmitoyltransferase 1

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethyl sulfoxid

FAS Fatty acid synthase

FBS Fetal bovine serum

FFA Free fatty acid

GLUT Glucose transporter (Hệ vận chuyển glucose)

HGO Hepatic glucose output

HLA Human leucocyte antigen

HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A

HNF 4-α Hepatocyte nuclear factor 4-α

HRP Horseradish peroxidase

HS Horse serum

HSL Hormone-sensutive lipase

LKB1 Liver kinase B1

MODY Maturity onset diabetes of the Young

mTOR Mammalian target of rapamycin

MTT 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromid OGTT Oral glucose tolerance test

PEPCK Phosphoenol pyruvate carboxy kinase

PPAR Peroxisome proliferator – activated receptor

PVDF Polyvinylidene difluoride

SREBP Sterol Regulatory Element-Binding Protein

TAK1 Transforming growth factor–β–activated kinase – 1 TBS-T Tris Buffer Saline Tween20

TNFα Tumour necrosis factor α

TORC2 The transducer of regulated CREB protein 2

TZD Thiazolidindion

UCP1 Uncoupling protein 1

WHO World Health Organization

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Trang Hình 1.1 Các con đường chuyển hóa glucose chính ở bệnh nhân ĐTĐ typ1 4

Hình 1.3 AMPK hoạt hóa l m tăng sự oxy hóa acid béo trong ty thể

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của AICAR và một số hợp chất tương tự 17 Hình 2.1 Kháng thể thứ cấp d ng “đầu dò” l enzym HRP 30 Hình 3.1 Hình ảnh mức độ biểu hiện cảu p-AMPK, AMPK tổng v β-actin

khi ủ tế bào với PĐ ở nồng độ khác nhau trong thời gian 60 phút 35 Hình 3.2 Số lần tăng mức độ biểu hiện của p-AMPK và AMPK tổng so với

Hình 3.3 Hình ảnh thể hiện ảnh hưởng của SCC1, SCC2 và SCC3

Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện mức độ tăng iểu hiện p-AMPK

Hình 4.1 Vai trò của AMPK trong chuyển hóa glucid và lipid trong tế bào 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường là rối loạn chuyển hóa dẫn đến tăng glucose huyết và nhiều biến chứng Đái tháo đường đặc biệt là đái tháo đường typ 2 vẫn luôn được xem là vấn đề cấp bách của thời đại [7], [39] Theo thống k năm 2006 tr n thế giới có

246 triệu người mắc đái tháo đường Năm 2011 số bệnh nhân mắc đái tháo đường

là 346 triệu người Năm 2004 có tới 3,8 triệu người chết do đái tháo đường, trong

đó hơn 80% l ở các nước có thu nhập thấp và trung bình Tổ chức Y tế thế giới (WHO) dự báo số người chết do đái tháo đường sẽ tăng gấp đôi từ năm 2005 đến năm 2030 [44] Đã có một số thuốc d ng điều trị đái tháo đường nhưng hiệu quả còn nhiều hạn chế v đã có hiện tượng kháng thuốc sau một thời gian điều trị [14]

Tại một số nước trên thế giới, một số loài thuộc chi Salacia đã được sử dụng

để điều trị éo phì v đái tháo đường Salacia cochinchinensis Lour (còn gọi là

Chóc máu Nam hay Chóc máu Việt) là loài được tìm thấy ở Việt Nam cũng đã ắt đầu được nghiên cứu chứng minh tác dụng điều trị đái tháo đường Những nghiên cứu ước đầu tại Việt Nam đã phát hiện và chứng minh tác dụng hạ glucose huyết

rõ rệt trên chuột nhắt gây đái tháo đường bằng streptozocin của dịch chiết phân đoạn n – hexan rễ cây Chóc máu Nam [4] Để tiếp tục phát triển nghiên cứu ở giai đoạn sâu hơn góp phần sơ ộ xác định cơ chế tác dụng hạ glucose huyết của dược

liệu này, chúng tôi thực hiện đề tài: “Thăm dò cơ chế tác dụng hạ đường huyết của phân đoạn n-hexan rễ cây Chóc máu Nam trên mô hình nuôi cấy tế bào cơ vân C 2 C 12 ” với 3 mục tiêu:

1 Thăm dò khả năng gây độc tế bào C 2 C12 của cắn dịch chiết phân đoạn hexan rễ cây Chóc máu Nam

n-2 Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của cắn dịch chiết phân đoạn n – hexan rễ cây Chóc máu Nam theo cơ chế l m tăng khả năng thu nhận glucose của tế

o cơ vân C2C12

3 Đánh giá tác dụng hoạt hóa adenosin monophosphat protein kinase (AMPK)

và ức chế acetyl coenzym A carboxylase (ACC) của cắn dịch chiết phân đoạn n – hexan rễ cây Chóc máu Nam.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét về bệnh đái tháo đường

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đái tháo đường (ĐTĐ) l “một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose huyết do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc li n quan đến sự suy yếu trong hoạt

động của insulin” [7]

Đái tháo đường là một rối loạn xảy ra trong cơ thể do cả yếu tố di truyền

và yếu tố môi trường được đặc trưng ởi sự thay đổi trong chuyển hóa glucid, lipid và protein do sự thiếu hụt tương đối hoặc tuyệt đối insulin được bài xuất

và do sự kháng insulin ở các mức độ khác nhau Ở những bệnh nhân bị ĐTĐ trong khoảng thời gian dài, có thể gặp các biến chứng tiến triển gồm sự thay đổi và mất hoạt tính của nhiều cơ quan (đặc biệt là ở những bệnh nhân không phụ thuộc insulin) như mắt (bệnh lý võng mạc gây mất thị lực), thận (các bệnh lý ở thận dẫn đến suy thận), thần kinh (bệnh lý thần kinh ngoại vi và tự trị), tim và mạch máu (bệnh lý tim mạch sớm và nghiêm trọng xơ vữa động mạch não động mạch ngoại vi) Đái tháo đường gồm nhiều bệnh lý lâm sàng với nguy n nhân khác nhau m đa phần đều có tăng đường huyết đây được coi như l một triệu chứng của bệnh chứ không phải là một bệnh riêng [7]

1.1.1 Đái tháo đường typ 1

- Đ i h ờng typ 1 qua trung gian miễn dịch

Đái tháo đường typ 1 (còn gọi l ĐTĐ phụ thuộc insulin) chiếm khoảng 5 – 10 % bệnh nhân ĐTĐ, dễ gặp ở những bệnh nhân có mang một yếu tố di truyền chưa được biết rõ li n quan đến Human leucocyte antigen (HLA) Bệnh thường xuất hiện ở trẻ em khỏe mạnh không béo phì hoặc người trẻ tuổi ĐTĐ typ 1 là hậu quả của sự thiếu hụt tuyệt đối trong bài xuất insulin (bằng chứng là sự giảm hoặc thiếu hụt peptid C trong huyết tương) do sự phá

hủy tế o β đảo tụy chủ yếu theo cơ chế tự miễn qua trung gian tế bào [7], [15]

Một số bệnh nhân đái tháo đường typ 1 không rõ nguyên nhân, có sự di truyền mạnh mẽ và rõ rệt (không li n quan đến hệ thống HLA), không có dấu

hiệu của sự tự miễn dịch [7]

- Biểu hiện lâm sàng

ĐTĐ typ 1 được đặc trưng ởi các triệu chứng li n quan đến hội chứng tăng đường huyết như đái nhiều (do glucose l m tăng áp lực thẩm thấu), khát nhiều (để bù lại lượng nước bị mất do đái nhiều) ăn nhiều (để đắp năng lượng do glucose mất đi trong nước tiểu), giảm cân và mệt mỏi (do mất glucose trong nước tiểu và mất nước), giảm thị lực (do rối loạn áp suất thẩm thấu ở mắt) Bệnh nhân dễ bị nhiễm thể ceton, chậm tăng trưởng, nhạy cảm hơn với một số bệnh nhiễm tr ng tăng huyết áp, rối loạn chuyển hóa lipoprotein, thường bị bệnh nha chu và rối loạn chức năng tâm lý Những

bệnh nhân này cần phải được điều trị bằng insulin [7], [39]

- Sinh lý bệ h Đ Đ 1

Có thể nhận thấy khá rõ những thay đổi sinh lý trong bệnh ĐTĐ typ 1

là hậu quả của sự thiếu hụt insulin khi so sánh con đường chuyển hóa ở người ình thường với sự chuyển hóa ở bệnh nhân ĐTĐ typ 1 (hình 1.2.) Ở bệnh nhân ĐTĐ typ 1 sự thiếu hụt insulin và sự tăng các hormon gây tăng đường huyết, chủ yếu là glucagon, dẫn đến tăng thủy phân glycogen và tăng tân tạo glucose trong gan l m tăng giải phóng glucose từ gan (Hepatic glucose output - HGO) [7]

Hình 1.1 Các con đường chuyển hóa glucose chính ở người bệnh ĐTĐ typ1 [7]

( ũi ê m thể hiện s g h ể hó ũi ê hạt thể hiện s gi m

chuyển hóa so v i g ời h h ờng)

1.1.2 Đái tháo đường typ 2

Đái tháo đường typ 2 (ĐTĐ không phụ thuộc insulin) chiếm khoảng 90-95% số bệnh nhân ĐTĐ xảy ra do sự kháng insulin và suy giảm bài tiết insulin Bệnh khởi phát và tiến triển âm thầm, không bộc lộ các triệu chứng lâm sàng và khó chẩn đoán trong một thời gian dài, ngay cả khi sự tăng glucose huyết trung bình có thể dẫn đến nguy cơ iến chứng muộn ĐTĐ typ

2 liên quan chặt chẽ đến yếu tố di truyền Tuy vậy, mặc d có tính gia đình cũng như có sự phù hợp cao (80%) trong tỷ lệ mắc ĐTĐ typ 2 ở các cặp song sinh cùng trứng cơ chế của sự di truyền trong ĐTĐ typ 2 vẫn chưa được biết

rõ Đây có thể là một bệnh đa gen [7], [39]

Ngo i cơ chế di truyền, bệnh cũng có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như chế độ ăn quá nhiều năng lượng, tình trạng thừa cân, béo phì với sự tăng tích mỡ trong vùng ổ bụng (nội tạng) thói quen lười vận động,… Nồng độ insulin có thể vẫn ình thường, thậm chí tăng (đặc biệt ở bệnh nhân

béo phì) trong một thời gian d i nhưng thường giảm ở giai đoạn cuối của bệnh Sự bất thường trong chuyển hóa carbohydrat có thể được xác định sớm bằng cách định lượng đường huyết lúc đói hoặc bằng nghiệm pháp thử khả năng dung nạp glucose đường uống (OGTT) Dạng bệnh này không phụ thuộc insulin và không dễ bị nhiễm toan ceton Hội chứng tăng đường huyết có thể được cải thiện bằng cách điều chỉnh chế độ ăn hợp lý, giảm cân và dùng các thuốc hạ đường huyết đường uống Trong ĐTĐ typ 2 có thể gặp một biến chứng cấp tính đe dọa tính mạng l hôn m do tăng áp lực thẩm thấu máu không li n quan đến thể ceton, sự nhiễm toan ceton hiếm khi xảy ra một cách

tự phát, nhưng cũng có thể xuất hiện khi có stress, nhiễm trùng hoặc có mắc các bệnh kèm theo khác [7], [16] [39]

- Sinh lý bệnh

Đái tháo đường typ 2 là do xảy ra đồng thời sự kháng insulin và sự giảm tiết insulin (đặc biệt là ở giai đoạn muộn của bệnh) Những thay đổi trong chuyển hóa ít rõ rệt hơn so với ĐTĐ typ 1 (thể hiện trên hình 1.1.) Kháng insulin (và sự tăng tiết các hormon l m tăng đường huyết) dẫn đến tăng vận chuyển glucose từ gan ra ngoài (góp phần chủ yếu l m tăng đường huyết) và giảm sử dụng glucose ở ngoại vi Nồng độ acid béo tự do trong huyết tương tăng cao (do quá trình thủy phân lipid và/hoặc do tăng khối lượng chất béo ở bệnh nhân béo phì), góp phần gây kháng insulin thông qua chu trình glucose-aicd béo tự do (Chu trình Randle) [7], [16], [39]

1.1.3 Các typ đái tháo đường đặc hiệu khác

Các typ ĐTĐ đặc hiệu khác bao gồm:

- ĐTĐ thể MODY (Maturity onset diabetes of the Young – glucose huyết tăng lúc trẻ tuổi) do khiếm khuyết dẫn đến giảm chức năng thế o β gây giảm tiết insulin

- Giảm hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen

- Bệnh lý tụy ngoại tiết

- Bệnh nội tiết

- ĐTĐ do thuốc, hóa chất, do nhiễm trùng

- Các thể khác: kháng thể kháng thụ thể insulin, hội chứng người cứng… Một số hội chứng di truyền đôi khi kết hợp với ĐTĐ: hội chứng Down,

thất điều vận động Friedrich, múa vờn Huntington,… [7], [39]

1.1.4 Đái tháo đường ở người mang thai

Đái tháo đường do thai nghén là tình trạng rối loạn dung nạp glucose huyết ở các mức độ khác nhau, khởi phát hay phát hiện đầu tiên khi có thai Định nghĩa n y không loại trừ tình trạng rối loạn glucose xảy ra trước hay trong thời kỳ thai nghén m không được nhận biết trước đó [39]

1.2 Adenosin monophosphat – activated protein kinase (AMPK)

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc

AMPK thuộc họ enzym cảm ứng năng lượng được hoạt hóa do suy giảm nồng độ adenosin triphosphat (ATP) trong tế bào do đó nó hoạt động như một thước đo năng lượng của tế bào Sau khi hoạt hóa, AMPK có vai trò khôi phục lượng ATP trong tế bào theo cả hai cách: ức chế sự tiêu thụ ATP và kích thích quá trình sinh ATP

AMPK là một protein cấu tạo bởi 3 tiểu đơn vị: 1 tiểu đơn vị xúc tác α (63 kDa) và hai tiểu đơn vị điều hòa (β 30 kDa v γ 38-63 kDa) Các tiểu đơn vị đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì độ ổn định của phức hợp trimer này Các tiểu đơn vị n y được mã hóa bởi các gen khác nhau và mỗi tiểu đơn vị đều có các dạng đồng phân khác nhau: α1 α2 β1 β2 γ1 γ2 v γ3

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử AMPK

- Tiể ị α ủa phức h p AMPK

Tiểu đơn vị xúc tác α của AMPK chứa một vùng serin/threonin protein kinase ở đầu N-tận Các tiểu đơn vị α tự do thường không hoạt động do sự có mặt của một vùng ức chế tự động ở trung tâm Mặc d có c ng cơ chất đặc hiệu nhưng các tiểu đơn vị α1 v α2 lại phân bố không giống nhau: α2 chủ yếu có trong nhân tế o trong khi α1 chủ yếu được tìm thấy trong o tương

Sự phân bố khác nhau của các tiểu đơn vị này trong tế bào có thể giải thích cho sự đa dạng về chức năng của AMPK

- Tiể ị β ủa phức h p AMPK

Đầu C–tận của tiểu đơn vị β chứa các chuỗi peptid nhận biết tương tác với 2 tiểu đơn vị còn lại của AMPK v đóng vai trò như ộ khung cấu trúc của phức hợp Ngoài ra, vùng trung tâm của tiểu đơn vị β chứa một vùng cấu trúc có khả năng gắn với phân tử glucose Tương tác n y được cho là có liên quan chặt chẽ đến chức năng điều tiết quá trình chuyển hóa glucose của AMPK Vùng ức chế tự động nằm ở đầu N-tận của tiểu đơn vị β có vai trò quan trọng trong sự điều chỉnh tự động hoạt tính của phức hợp Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng ngoài chức năng như ộ khung cấu trúc, tiểu đơn vị β

cũng có chức năng điều chỉnh tự động quan trọng đối với phức hợp AMPK

- Tiể ị γ ủa phức h p AMPK

Tiểu đơn vị γ có hai v ng li n kết chọn lọc với các phân tử chứa adenosin như AMP hay ATP gọi l v ng Bateman được tạo thành từ bốn đoạn lặp song song của các chuỗi cystathionin- β-synthase (CBS) nằm ở đầu N-tận của tiểu đơn vị này Sau khi liên kết, nhóm phosphat của AMP/ATP gắn với một rãnh trên bề mặt tiểu đơn vị γ v tương tác với các acid amin ở

đó Các đột biến trên các acid amin này dẫn đến một số rối loạn chuyển hóa di truyền ở người như sự ứ đọng glycogen gây suy tim Liên kết của AMP với các vùng Bateman gây hoạt hóa AMPK tương tác dị lập thể n y l m tăng sự nhạy cảm của AMPK với những thay đổi nhỏ của nồng độ AMP Ngược lại, liên kết của các phân tử ATP với các vùng Bateman chống lại sự hoạt hóa phức hợp AMPK Những biến đổi dị lập thể khác nhau này trong phức hợp, gây ra bởi liên kết với AMP hoặc ATP, tạo nên nền tảng phân tử cho chức năng điều hòa chuyển hóa của AMPK và khiến cho enzym này trở thành một mục tiêu tác dụng cho các chất hóa học tổng hợp

Các đột biến tại các đoạn kỵ nước trên tiểu đơn vị γ (Arg171

-Phe179) nơi tương tác với vùng liên kết glycogen của tiểu đơn vị β gây cản trở đáng kể hoạt tính phụ thuộc AMP của phức hợp AMPK Vì vậy, có vẻ như quá trình hoạt hóa phức hợp cũng chịu ảnh hưởng của tiểu đơn vị γ Người ta cũng phát hiện ra rằng tiểu đơn vị γ2 ảnh hưởng đến quá trình hoạt hóa này nhiều nhất,

còn tiểu đơn vị γ3 chỉ ảnh hưởng vừa phải [6]

1.2.2 Sự hoạt hóa phức hợp AMPK

AMPK được hoạt hóa bởi hiệu ứng dị lập thể khi tỷ lệ AMP/ATP và creatin/phosphocreatin (Cr/pCr) trong tế o tăng v /hoặc thông qua cơ chế

li n quan đến sự phosphoryl hóa các tiểu đơn vị bởi các enzym AMPK kinase (AMPKK) Trong số các yếu tố kích thích, những yếu tố làm cạn kiệt ATP dự trữ v tăng lượng AMP trong tế o như shock nhiệt, tình trạng thiếu oxy,

tăng áp suất thẩm thấu, thiếu glucose, thiếu máu cục bộ và tình trạng co cơ vân kéo d i được nghiên cứu nhiều nhất [6] AMP trong tế bào liên kết với vùng Bateman trong tiểu đơn vị γ của AMPK l m thay đổi cấu trúc của phức hợp thúc đẩy sự phosphoryl hóa phân tử threonin 172 (Thr 172) nằm trên tiểu đơn vị α của AMPK thông qua một số enzym kinase

Những thay đổi về năng lượng và sự chuyển hóa calci trong tế bào chính

l cơ sở cho quá trình hoạt hóa AMPK Trong số các tác nhân nội sinh gây phosphoryl hóa Thr172 thì Liver kinase B1 (LKB1), các protein kinase phụ thuộc calmodulin (CaMKKβ) và Transforming growth factor–β–activated

kinase–1 (TAK1) là những tác nhân quan trọng nhất [6], [32]

Liver kinase B1 (LKB1) là một serin/threonin kinase có vai trò chủ yếu trong thúc đẩy phản ứng phosphoryl hóa tiểu đơn vị α v hoạt hóa AMPK Người ta đã phát hiện ra rằng AMP không trực tiếp hoạt hóa LKB1, mà AMP gây ra sự thay đổi trong cấu trúc của AMPK và biến AMPK trở th nh cơ chất thích hợp của LKB1 Khi đó phân tử threonin 172 trên tiểu đơn vị α của AMPK bị phosphoryl hóa dẫn đến hoạt hóa AMPK Khi không gắn với LKB1, phức hợp AMPK vẫn có khả năng tự phosphoryl hóa threonin 172 trên tiểu đơn vị α Nói cách khác AMPK có khả năng tự hoạt hóa không phụ thuộc vào nồng độ AMP và khả năng duy trì hoạt tính nội tại này của phức hợp AMPK cho phép các tế bào phản ứng tức thì với các kích thích về năng lượng

Các protein kinase phụ thuộc calmodulin (CaMKK) I v IV cũng có thể phosphoryl hóa Thr172 và hoạt hóa AMPK CaMKK có hai dạng đồng phân: CaMKKα v CaMKKβ Trong đó CaMKKβ phổ biến hơn CaMKKα l dạng đồng phân chính gây hoạt hóa AMPK

Transforming growth factor–β–activated kinase–1 (TAK1) trực tiếp phosphoryl hóa AMPK trong nấm men Gần đây người ta đã tìm thấy trong

nhiều mô khác nhau của động vật có vú một enzym tương tự TAK1 (trước đây được gọi là AMPK-kinase) cũng phosphoryl hóa Thr172 trong AMPK Người ta cho rằng yếu tố gây hoại tử khối u (TNF- α) v transforming growth factor-β có tác dụng hoạt hóa TAK1 Ngoài ra, 5-aminoimidazol-4-carboxamid-1β-ribofuranosid (AICAR) v metformin cũng hoạt hóa TAK1 Protein phosphatase 2A và 2C làm bất hoạt AMPK bằng cách dephosphoryl hóa phân tử Thr172 Hoạt tính của các enzym này không chịu sự điều tiết của AMP hay các acid béo tự do

1.2.3 Vai trò của AMPK trong đái tháo đường

AMPK là một protein quan trọng điều hòa năng lượng của tế bào và được coi như một yếu tố chính tham gia điều hòa chuyển hóa glucose và lipid

ở nhiều cơ quan đặc biệt l cơ vân v gan [6] [32]

1.2.3.1 Vai trò củ AM K g

Cơ vân l nơi sử dụng glucose chính của cơ thể Có hai con đường kích thích sự thu nhận glucose v o cơ vân: con đường phụ thuộc insulin và con đường không phụ thuộc insulin Kháng insulin là một trong những khiếm khuyết được phát hiện trong cơ vân của bệnh nhân ĐTĐ v chủ yếu là do sự sai lệch trong quá trình truyền tín hiệu của insulin Tuy nhiên, hiện nay biện pháp hữu hiệu để khắc phục những sai lệch trong con đường truyền tín hiệu insulin vẫn còn rất hạn chế Vì vậy, cải thiện quá trình sử dụng glucose ở cơ vân theo con đường không phụ thuộc insulin được coi là biện pháp thay thế có hiệu quả

Các số liệu in vivo và ex vivo đã chứng minh rằng AMPK tác dụng lên sự

hấp thu glucose thông qua cả cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc insulin Nhiều nghiên cứu đã chứng minh giả thuyết cho rằng tập luyện có thể

l m tăng sử dụng glucose trong cơ ở bệnh nhân ĐTĐ thông qua cơ chế không

phụ thuộc insulin [6], [26] Sự co cơ l m tăng tỷ lệ AMP/ATP và Cr/pCr dẫn đến sự tăng mạnh mẽ hoạt tính của AMPK Co cơ cũng l m tăng AICAR một chất kích thích AMPK Điều này cho thấy AMPK đóng vai trò quan trọng trong việc tăng sử dụng glucose khi co cơ Hoạt hóa AMPK l m tăng iểu hiện của gen mã hóa GLUT-4 và hexokinase II và kích thích tổng hợp glycogen trong cơ ằng cách hoạt hóa dị lập thể glucose–6–phosphatase AMPK còn thể hiện chức năng đồng hóa của mình trong cơ vân thông qua hoạt hóa 2 enzym chính của chu trình acid citric: citrat synthase và succinat dehydrogenase [6]

Ngoài việc l m tăng vận chuyển glucose trong cơ AMPK còn đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa chất béo ở cơ Hoạt hóa AMPK làm giảm tổng hợp acid béo tự do v l m tăng quá trình β-oxy hóa trong ty thể thông qua ức chế enzym acetyl coenzym A carboxylase (ACC), do đó l m giảm nồng độ acid béo tự do và cải thiện sự kháng insulin [32]

Hình 1.3 AMPK hoạt hóa làm tăng sự oxy hóa acid béo trong ty thể

thông qua ức chế ACC

1.2.3.2 Vai trò của AMPK trong gan

Chức năng chính của AMPK trong gan l l m tăng oxy hóa acid éo v

ức chế tổng hợp cholesterol và triglycerid (TG) Gây đột biến AMPKα2 trong gan chuột l m tăng thủy phân lipid trong gan tăng nồng độ TG huyết tương

v tăng sản xuất glucose trong gan AMPK cũng l m giảm lượng mARN của Sterol Regulatory Element-Binding Protein (SREBP) Sự thể hiện quá mức chức năng của yếu tố n y có li n quan đến sự tăng tỷ lệ rối loạn lipid máu ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2 Hoạt hóa AMPK cũng l m giảm lượng mARN trong tế bào của Carbohydrate Response Element Binding Protein (ChREBP) (protein gắn với yếu tố đáp ứng carbohydrat trong gan).Yếu tố n y l m tăng sự thủy phân lipid do đó AMPK đóng vai trò quan trọng trong việc làm giảm sự tăng lipid máu ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2

AMPK làm giảm sản xuất glucose trong gan do ức chế quá trình tân tạo glucose, ức chế sản xuất glucose từ các nguồn không phải carbohydrat trong gan AMPK ức chế quá trình tân tạo glucose do ức chế quá trình sao chép của phosphoenol pyruvate car oxy kinase (PEPCK) enzym chính điều tiết quá trình này Bên cạnh đó AMPK l m giảm tổng hợp cholesterol và glycogen trong tế bào gan do làm bất hoạt HMG-CoA reductase và glycogen synthase Ngoài ra, AMPK làm giảm biểu hiện của các enzym có li n quan đến sự tổng hợp acid béo và các enzym của quá trình tân tạo đường do ức chế các yếu tố phiên mã SREBP-1c, ChREBP và HNF-4α v do l m giảm hoạt động của các đồng yếu tố của quá trình phi n mã như p300 và TORC2

AMPK cũng gây phosphoryl hóa ACC trong gan vì vậy gây bất hoạt enzym này, làm giảm tổng hợp malonyl – CoA do đó tăng hoạt tính của Carnitin palmitoyltransferase 1 (CPT1) l m tăng vận chuyển các acid béo vào

ty thể để β-oxy hóa Bên cạnh đó AMPK cũng trực tiếp kích thích hấp thu

acid béo tự do vào tế bào thông qua việc chuyển enzym chuyển vận acid béo CD38 tới màng tế bào [6], [32]

AMPK còn có tác dụng ức chế gen mã hóa cho enzym tổng hợp acid béo trong gan li n quan đến sự tăng nồng độ glucose huyết do đó có tác dụng là giảm glucose huyết [17]

1.2.3.3 Vai trò của AMPK trong mô m

Hoạt hóa AMPK trong mô mỡ làm giảm tổng hợp lipid tăng oxy hóa các aicd béo và giảm tổng hợp TG Nhịn ăn tập luyện thể chất hoặc điều trị bằng các thuốc kháng β-adrenergic gây hoạt hóa AMPK thông qua cơ chế phụ thuộc AMP vòng (cAMP)

AMPK cũng điều tiết sự thủy phân lipid trong tế bào mô mỡ bằng cách làm bất hoạt enzym hormon-sensutive lipase (HSL) thông qua phosphoryl hóa phân tử serin tr n HSL AMPK ngăn chặn sự tái tổng hợp và giải phóng acid béo từ TG, một quá trình cần tiêu thụ ATP

Hoạt hóa AMPK trong mô mỡ ở người l m tăng iểu hiện của adiponectin, một adipokin l m tăng mức độ nhạy cảm với insulin của cơ vân Các tác dụng ngoại vi của adiponectin có thể giải thích cho vai trò đáng kể của các thuốc hoạt hóa AMPK trong việc ngăn ngừa và cải thiện tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân đái tháo đường béo phì [6]

1.2.3.4 Vai trò của AMPK trong các t β o tụy

Nồng độ glucose trong máu thấp sẽ hoạt hóa AMPK trong các tế bào β Người ta cho rằng metformin ảnh hưởng đến sự tiết insulin của tế o β do hoạt hóa AMPK

Không giống như ở các mô ngoại vi như cơ vân (chủ yếu có AMPK α2), trong tế o β ở các loài gặm nhấm có nhiều tiểu đơn vị α1 hơn so với tiểu đơn vị α2 α1 tìm thấy nhiều hơn ở trong o tương trong khi α2 phân ố cả

trong o tương v trong nhân Người ta cho rằng phức hợp AMPKα1 tham gia vào hoạt động điện hóa của tế bào, trong khi phức hợp AMPKα2 trong nhân li n quan đến điều hòa sự phiên mã gen Ức chế các tiểu đơn vị α2 trong

tế o β l m tăng sự phiên mã của gen mã hóa preproinsulin Vì vậy, có vẻ như sự điều chỉnh quá trình phiên mã của AMPKα2 trong các tế o β khác khá nhiều so với sự điều chỉnh quá trình n y trong cơ vân

Các nghiên cứu gần đây về vai trò của AMPK trong việc điều chỉnh sự bài tiết insulin của các tế o β cho thấy vai trò này có mối quan hệ với nguồn năng lượng sẵn có, sự tổng hợp protein, sự phát triển của tế bào và cái chết theo chương trình Nhìn chung những kết quả này cho thấy sự phức tạp trong chức năng của AMPK trong việc điều hòa sự bài tiết insulin của các tế o β

và sự cần thiết phải nghiên cứu kỹ lưỡng tính phức tạp của các tương tác trực tiếp và/hoặc gián tiếp này [6]

1.2.4 Một số chất hoạt hóa AMPK

Một số chất có tác dụng hoạt hóa AMPK đã được nghiên cứu và ứng dụng

tr n lâm sang như metformin thiazolidindion AICAR

- Metformin và các thiazolidindion

Hai nhóm thuốc uống điều trị ĐTĐ phổ biến, biguanid và thiazolidindion (TZD) được cho là có tác dụng một phần thông qua hoạt hóa AMPK Biguanid đặc biệt là metformin, ức chế quá trình tân tạo đường trong gan và tăng tỷ lệ hấp thu glucose trong cơ vân Một vài tác dụng trong số đó được cho là do hoạt hóa AMPKα2 trong cơ vân Metformin không l m giảm sự phosphoryl hóa và hoạt tính của LKB1 trong cơ vân không l m tăng dòng calci đi v o tế bào v không l m thay đổi hoạt tính của protein phosphatase Điều trị bằng metformin trong 10 tuần cho bệnh nhân ĐTĐ typ 2 l m tăng hoạt tính của AMPKα2 trong cơ vân li n quan đến sự phosphoryl hóa phân tử

threonin 172 của AMPK đồng thời giảm hoạt tính của ACC-2 Tác dụng tăng hoạt tính của AMPKα2 được cho l do metformin l m thay đổi tình trạng năng lượng trong cơ do giảm nồng độ ATP và làm giảm phosphocreatin trong

cơ Tác dụng n y l m tăng sử dụng glucose v tăng nồng độ glycogen trong

- AICAR

AMP là một chất hoạt hóa AMPK nội sinh Như đã nhắc đến ở trên, hai cặp phân tử AMP tương tác với hai vùng Bateman trên tiểu đơn vị γ v hoạt hóa phức hợp AMPK AICAR được chuyển hóa trong trong tế bào tạo thành ZMP (5-aminoimidazol-4-carboxamid-1-β-D-ribofuranotid) bởi adenosin kinase ZMP là một chất tương tự AMP tương tác với các vùng Bateman trên tiểu đơn vị γ của AMPK và gây ra sự thay đổi dị lập thể trong cấu trúc của AMPK, gây hoạt hóa AMPK Bên cạnh đó một vài nghiên cứu đã công ố cho thấy ZMP có thể điều hòa sự chuyển hóa glucose bằng cách ức chế trực tiếp fructose-1,6-biphosphatase trong tế o gan do đó ngăn chặn quá trình

tân tạo đường độc lập với sự hoạt hóa AMPK AICAR được thử nghiệm trên

mô hình động vật ĐTĐ v thể hiện tác dụng chống ĐTĐ thông qua cải thiện nồng độ glucose máu lượng lipid lượng glucose sản xuất ở gan và quá trình

sử dụng glucose Truyền AICAR cho cả người khỏe mạnh và bệnh nhân tiểu đường đều l m tăng hấp thu glucose ở cơ vân AICAR cũng l m giảm đáng

kể sự tạo thành các dạng oxy hoạt động trong máu và duy trì chức năng tế bào nội mô ình thường ở bệnh nhân ĐTĐ Trong một nghiên cứu khác, AICAR

l m tăng lượng glucose trong cơ vân chuột, chủ yếu thông qua tăng dòng glucose vào trong tế bào [6]

AICAR cũng điều hòa biểu hiện của gen IL-6 và IL-8 cũng như sự tiết các chất này từ các tế bào mỡ và các tế o cơ vân Hai chất trung hòa tiền miễn dịch n y được tiết ra từ mô mỡ v đóng vai trò quan trọng trong việc gây nên tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân éo phì Như vậy, AICAR có thể l m tăng độ nhạy cảm với insulin trong các mô ngoại vi [29]

Tuy nhiên, AICAR có các tính chất dược động học bất lợi (như có nồng

độ có tác dụng cao, sinh khả dụng thấp, thời gian bán thài ngắn) và có thể gây các biến chứng chuyển hóa nghiêm trọng (tạo ra acid lactic và một lượng lớn acid uric) Một nhược điểm nghiêm trọng khác của AICAR là AICAR không chỉ tác dụng lên m còn tương tác với nhiều enzym khác như S-adenosylhomocystein hydrolase v glycogen phosphorylase Để giải quyết các vấn đề n y người ta tiến hành nghiên cứu tìm ra các dẫn xuất có tác dụng tốt hơn của AICAR Một ví dụ là dẫn xuất imidazo [4, 5-b] pyridin S27847, một chất l m tăng hoạt tính của AMPK lên 7 lần trong tế bào gan ở các nồng

độ micromol Các dẫn xuất imidazol tương tự AICAR và S27847 là các hợp chất C4 và C58 Các dẫn xuất này hiệu quả kém hơn S27847.[29]

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của AICAR và một số hợp chất tương tự

1.3 Cây Chóc máu Nam (Salacia cochinchinensis Lour.)

Chóc máu Nam (Salacia cochinchinensis Lour.) là cây tiểu mộc đứng

hay trườn; nhánh non vuông Lá có phiến d i đến 11 cm, từ từ hẹp trên cuống, nâu đen mặt tr n đo đỏ mặt dưới lúc khô, gân phụ 6 – 8 cặp Chụm trên một u; hoa 5 phân, cánh hoa vàng sáp, có sọc đỏ, cao 3 – 4 nm; đĩa mật; tiểu nhụy

3, vàng ngà Phì quả tròn, rộng 1,5 – 3,5 cm, vàng; nạc đo đỏ; hạt 1 – 3

Phân bố: rừng, ven rừng, rừng còi: Huế Đồng Nai, Côn Sơn [2]

Dân gian dùng rễ và thân cây chữa viêm khớp, phong thấp v đau lưng mỏi bắp cơ thể suy nhược Dự án bảo tồn cây thuốc cổ truyền (do TS Nguyễn Duy Thuần làm chủ nhiệm) đã phát hiện cây Chóc máu Việt được đồng bào dân tộc Kata sử dụng làm thuốc tiêu khát, chống viêm, bồi bổ cơ thể Kết quả định tính sơ ộ cho thấy trong rễ cây Chóc máu Việt có: flavonoid, anthranoid, saponin, tannin, acid hữu cơ Trong đó saponin v polyphenol (favonoid và tanin) là các thành phần chính có trong rễ cây Chóc máu Việt

Tính cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu li n quan đến đặc điểm và

tác dụng của các cây thuộc chi Salacia

Rễ Salacia được sử dụng trong y học Ayurvedic cho người bệnh tiểu

đường và béo phì từ xưa v được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Mỹ và một số nước khác như thực phẩm bổ sung hay thực phẩm chức năng cho người bệnh ĐTĐ v éo phì Những nghiên cứu dược lý gần đây đã chứng minh rễ

Salacia điều hòa nhiều đích: PPARs angiotensin II α-glucosidase, aldose

reductase và lipase tụy Những tác dụng đa dạng này có thể góp phần cho rễ

Salacia có tác dụng tốt trong điều trị bệnh ĐTĐ typ 2 v tăng huyết áp liên quan đến béo phì và lipid máu cao [48] Trong những năm gần đây Salacia chinensis có nguồn gốc từ Thái Lan đã được nghiên cứu nhiều về hóa học và hoạt tính sinh học Rễ của cây Salacia chinensis được d ng để điều trị ĐTĐ

lợi kinh, trị kinh nguyệt đau chứa ducitol chống ướu [2] Bằng phương pháp

sắc ký cột cặn dịch chiết n-hexan (6,81 g) trên cột silicagel với dung môi rửa giải là hỗn hợp n-hexan/ethyl acetat theo tỷ lệ tăng dần lượng ethyl acetat (0 – 100%), Trần Thị Minh và cộng sự đã phân lập và nhận dạng được 3 chất

triterpen từ cặn dịch chiết n-hexan của cành cây Salacia chinensis là

29-nor-21-αH-hopan-3,22-dion; 21-αH-hop-22(29)-en-3β-30-dion và

20(29)-lupen-3,28-diol, có tên là Bentulin [3]

Dưới đây l một số báo cáo từ những nghiên cứu tác dụng hạ glucose

huyết của loài Salacia (S oblonga, S reticulata, S prinoides, S chinensis và

S macrosperma) [48]

- Trên chuyển hóa lipid:

Hwang và cộng sự (2006) đã chứng minh rằng dịch chiết rễ Salacia làm

giảm triglycerid huyết tương giảm cholesterol toàn phần, giảm triglycerid gan và acid béo không ester hóa, giảm tỷ lệ hạt lipid trong mô của gan trên chuột ĐTĐ éo phì Zucker Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dịch chiết

Salacia oblonga l m tăng chuyển hóa và tuần hoàn lipid gan bằng cách hoạt

hóa PPARα [23] Mangiferin là một trong những thành phần chính của dịch

chiết rễ Salacia oblonga (14%) có tác dụng làm giảm nồng độ lipid máu trên

động vật gây ĐTĐ typ 2 [30]

- Ức ch α-glucosidase:

Các nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng tăng đường huyết sau khi ăn l

một yếu tố nguy cơ trực tiếp v độc lập đối với các bệnh lý tim mạch ở bệnh nhân ĐTĐ Vì vậy, kiểm soát ảnh hưởng của sự tăng nồng độ glucose trong máu sau khi ăn sẽ giúp giảm thiểu các biến chứng li n quan đến ĐTĐ Các enzym trong đường ruột như α-glucosidase v α-amylase phá vỡ liên kết trong các phân tử tinh bột, dextrin, maltose, sucrose tạo thành các monosaccharid hấp thu được Ức chế các enzym này sẽ làm giảm quá trình hấp thu polysaccharid vào máu và làm giảm hiện tượng tăng đường huyết sau khi ăn do đó giúp kiểm soát tốt tình trạng đường huyết của bệnh nhân Trên thị trường hiện nay đã có thuốc ức chế α-glucosidase như acar ose được sử dụng khá hiệu quả trong điều trị ĐTĐ typ 2 tuy nhi n các thuốc này có nhiều tác dụng phụ như gây đầy hơi đau ụng, tiêu chảy Các tác dụng không mong muốn n y hướng các nghiên cứu đến việc tìm ra các thuốc mới và an toàn

hơn Test dung nạp sucrose ở người tình nguyện cho thấy dịch chiết rễ cây Salacia oblonga, Salacia chinensis ức chế tăng đường huyết ở bệnh nhân ĐTĐ typ 2 sau ữa ăn gi u car ohydrat Dịch chiết methanol của cành và rễ các cây S reticulata và S oblonga làm giảm sự tăng đường huyết sau khi ăn gây bởi maltose, sucrose, tinh bột ở chuột [37]

- Ức ch aldose reductase:

Aldose reductase là một enzym quan trọng trong con đường polyol xúc tác cho phản ứng khử các đường aldo và các aldehyd no và không no khác Aldose reductase có rất nhiều cơ chất khác nhau gồm các hydroxynonenal và các catecholamin Sự hoạt động quá mức của aldose reductase li n quan đến

sự phát triển của các biến chứng tim mạch và thần kinh ở bệnh nhân ĐTĐ

Thực tế điều trị cũng cho thấy, sử dụng các chất ức chế aldose reductase có thể giúp cải thiện các biến chứng về mạch và các biến chứng khác ở bệnh nhân ĐTĐ như ệnh lý thần kinh ngoại biên, bệnh võng mạc đục thủy tinh thể Ức chế aldose reductase cũng giúp ảo vệ tim chuột khỏi sự tổn thương

do thiếu máu cục bộ cũng như thúc đẩy sự hồi phục chức năng sau khi tưới máu lại [25]

Dịch chiết methanol rễ S chinensis và S reticulata đã được chứng minh

là có tác dụng ức chế aldose reductase [46]

- Ức ch enzym lipase tụy:

Lipase tụy là enzym quan trọng nhất trong quá trình tiêu hóa chất béo của thức ăn Dịch chiết rễ S oblonga đã được chứng minh là có tác dụng ức

chế sự tăng glycerid huyết tương sau khi cho chuột ĐTĐ éo phì Zucker uống dầu oliu trong khi đó lại không có tác dụng trên triglycerid huyết tương của

chuột nhịn ăn [24] Những kết quả này cho thấy dịch chiết S oblonga ức chế

sự tăng triglycerid huyết tương kích thích ởi dầu Oliu Dịch chiết trong nước

nóng của rễ S reticulata làm giảm hoạt động của lipase tụy nhưng ít tác động

lên sự hoạt động của hormon nhạy cảm lipase ở mô mỡ của chuột

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

- Rễ cây Chóc máu Nam, tên khoa học là Salacia cochinchinesis Lour

được định danh bởi cử nhân Ngô Văn Trại – Viện Dược liệu, Bộ Y tế Mẫu tiêu bản số 9694 được lưu tại Phòng tiêu bản, Viện Dược liệu

Sau khi thu hái, rễ cây được đem rửa sạch, sấy khô ở 40o, tán nhỏ Chiết bằng methanol, cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm rồi hòa cắn v o nước v tiếp tục đem lắc với n-hexan Cất thu hồi dung môi để thu lấy cắn dịch chiết phân đoạn hexan (đặt t n l PĐ)

- Các chất chiết tác được từ cắn dịch chiết phân đoạn n-hexan rễ cây Chóc máu Nam: friedelan-3β-ol (SCC1)

-sitosterol hay stigmast-5-en-3 (SCC2)

21,30-dihydroxyfriedelan-3-on (SCC3)

2.2 Tế o n t on n hi n ứu

Tế o C2C12 (tế o cơ vân nguy n phát của chuột nhắt) được cung cấp

ởi American Type Culture Collection (clone CRL-1772) được lưu giữ trong nitơ lỏng

2.3 H hất ụn ụ v thiết bị dùng trong nghiên cứu

Hóa chất:

Môi trường nuôi cấy tế o Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) huyết thanh ngựa (HS) huyết thanh thai ò (FBS) của hãng Invitrogen-Đức

Các kháng thể: anti-rabbit IgG HRP-linked antibody, anti-mouse IgG HRP-linked antibody kháng thể kháng AMPK-Thr172, kháng thể kháng

AMPK tổng của hãng Cell Signaling Technologies (USA) kháng thể kháng

-Actin của hãng Santa Cruz Biotechnology (USA);

Thuốc thử 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid (MTT) của hãng Cell Signaling Technologies

Các hóa chất thí nghiệm khác (KH2PO4 NaOH NaHCO3 KCl NaCl sodium dodecyl sulfat β-mecarptoethanol, glycerol, Tris - Cl )

Máy điện di và chuyển màng bio-rad;

 Một số thiết bị cần thiết khác (máy đo pH ơm chân không …)

2.4 Phươn pháp n hi n ứu

2.4.1 Thăm dò khả năng gây độc tế bào C 2 C 12 của PĐ

Trước khi đánh giá tác dụng của dịch chiết PĐ trên tế bào C2C12, tiến

h nh đánh giá nhằm thăm dò khả năng gây độc tế bào C2C12 của dịch chiết này

Phương pháp được sử dụng để đánh giá độc tính trên tế bào của dịch chiết PĐ l kỹ thuật định lượng MTT (MTT assay) [27]

Quy trình tiến hành

 Hoạt hóa và nuôi cấy t bào: Hoạt hoá và nuôi cấy tế bào C2C12trong môi trường DMEM đã ổ sung 10% huyết thanh ò penicillin 100UI/mL; streptomycin 0,1mg/mL ở 37oC trong môi trường không khí có 5% CO2 Nuôi tế o đến khi tế bào phát triển ổn định Cấy chuyển tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 2.103

tế o/100 μl môi trường

 Ủ t bào v i m u thử

Hút loại bỏ môi trường cũ v thay ằng môi trường mới Các giếng chứa

tế o được chia thành các lô và ủ với mẫu thử PĐ như sau:

Lô 1: Ủ với PĐ với nồng độ 20,00 μg/mL;

Lô 2: Ủ với PĐ với nồng độ 50,00 μg/mL;

Lô 3: Ủ với PĐ với nồng độ 125,00 μg/mL;

Lô 4: Ủ với PĐ với nồng độ 250,00 μg/mL

Lô chứng: không ủ với PĐ chỉ bổ sung DMSO

Tế o được ủ với PĐ (hòa tan trong dimethyl sulfoxid - DMSO) với các nồng độ khác nhau (20,00 – 50,00 – 125,00 và 250,00 µg/ml) trong 48 giờ, đảm bảo nồng độ DMSO trong mỗi giếng < 0,1% Tiến hành song song với

các giếng chứng (chỉ bổ sung dung môi pha mẫu thử là DMSO) Tế o được chia thành các lô, mỗi lô 3 giếng:

 Đ h gi ộc tính trên t bào của m u thử

- Th m 20 μl thuốc thử MTT (nồng độ 5 mg/mL) vào mỗi giếng

- Ủ các đĩa 5h ở 37oC trong môi trường không khí có 5% CO2, ủ trong bóng tối

- Hút bỏ dung dịch ủ tế o Th m 200 μl dung dịch DMSO, trộn đều

v để trong 15 phút Đem đo quang ở ước sóng 540 nm bằng máy ELISA Thí nghiệm được lặp lại 2 lần ở c ng điều kiện

Cách đánh giá kết quả

So sánh giá trị mật độ quang giữa các giếng có ủ với mẫu thử PĐ với các giếng không ủ với mẫu thử PĐ (giếng chứng) để đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết PĐ đến chức năng sống của tế bào

Mức độ gây chết tế bào của PĐ so với lô chứng được tính theo công thức:

Trong đó: X : Phần trăm tế bào chết của lô thử so với lô chứng (%)

ODchứng: mật độ quang của giếng tế bào lô chứng

ODthử : mật độ quang của giếng tế bào lô thử

2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của PĐ đến khả năng thu nhận glucose của tế bào C 2 C 12

Nguyên t c ti n hành:

Xác định ảnh hưởng của PĐ đến khả năng thu nhận glucose (glucose uptake) vào tế bào C2C12 bằng cách ủ các tế bào với dịch chiết PĐ ở các nồng

độ khác nhau trong môi trường có chứa glucose (các tế o không được tiếp xúc với glucose trong một thời gian để đảm bảo tình trạng cạn kiệt glucose

ho n to n trước khi tiến hành thí nghiệm) Lượng glucose được thu nhận vào

tế o được xác định gián tiếp thông qua định lượng nồng độ glucose còn lại trong môi trường nuôi cấy sau khi ủ với mẫu thử So sánh mức độ thu nhận glucose ở lô tế bào có ủ với mẫu thử và lô tế bào không ủ với mẫu thử để đánh giá tác dụng của mẫu thử

Các ước tiến hành:

 Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào

Hoạt hoá và nuôi cấy tế bào C2C12 trong môi trường DMEM đã ổ sung 10% huyết thanh ò penicillin 100UI/mL; streptomycin 0 1mg/mL ở 37o

C trong môi trường không khí có 5% CO2 Nuôi tế o đến khi tế bào phát triển

ổn định

Cấy chuyển các tế o v o đĩa 96 giếng với mật độ 5000 tế bào/giếng, tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện như tr n trong 1 ngày Biệt hóa tế bào C2C12 bằng cách thay môi trường nuôi cấy DMEM đã ổ sung 10% huyết thanh ò bằng môi trường nuôi cấy DMEM đã ổ sung 5% huyết thanh ngựa trong 72h

 Ủ tế bào với mẫu thử:

Các tế bào sau khi nuôi cấy và biệt hóa được chia thành các lô, mỗi lô 3 giếng:

Lô 1: Ủ với PĐ (pha trong DMSO) với nồng độ 20,00 μg/mL;

Lô 2: Ủ với PĐ (pha trong DMSO) với nồng độ 50,00 μg/mL;

Lô 3 (lô chứng): không ủ với PĐ chỉ bổ sung DMSO

Lô 4 (lô insulin): ủ với insulin với nồng độ 0,1μM

Lô 5: Ủ với PĐ (pha trong DMSO) với nồng độ 20,00 μg/mL; có th m insulin với nồng độ 0 1μM

Lô 6: Ủ với PĐ (pha trong DMSO) với nồng độ 50,00 μg/mL; có th m insulin với nồng độ 0 1μM

Tiến hành ủ tế bào với mẫu thử như trên trong 1 giờ ở 37oC với môi trường DMEM chứa 8 mM glucose và 0,1% albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin – BSA)

 Xác định mức độ thu nhận glucose vào trong tế bào:

Hút 10 μL môi trường ở mỗi giếng tế bào sau khi đã ủ với mẫu thử và glucose ở trên cho vào một đĩa 96 giếng mới có chứa sẵn 200 μL enzym glucose oxydase trong mỗi giếng, trộn đều

Ủ tiếp trong 15 phút ở nhiệt độ 37o