Tách chiết, tinh chế ribonuclease từ trứng động vật lưỡng cư (amphibia) và xác định một số tính chất của enzym

Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein thu được bằng phương pháp tủa phân đoạn bằng muối amoni sulfat.. Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tí

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN QUỐC TOẢN

TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG

ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ (AMPHIBIA) VÀ XÁC ĐỊNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN QUỐC TOẢN

TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG

ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ (AMPHIBIA) VÀ XÁC ĐỊNH

MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu của mình, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ và hỗ trợ cả về vật chất cũng như tinh thần của các thầy cô giáo, các quý đồng nghiệp, gia đình và bạn bè

Trước tiên, từ đáy lòng mình tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Rư - Trưởng bộ môn Hóa sinh - Trường đại học Dược Hà Nội và PGS.TS Vũ Mạnh Hùng - Trưởng bộ môn Dược lý - Học viện Quân y, những người thầy luôn ở bên để hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quí báu trong suốt quá trình làm thí nghiệm

và hoàn thành quyển luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể các cán bộ và bạn đồng nghiệp tại phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Mặc dù đã cố gắng rất nhiều, song quyển luận văn này chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót về các thuật ngữ chuyên môn, nội dung, bố cục và hình thức trình bày Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp từ những nhà chuyên môn, các quý đồng nghiệp và bạn đọc xa gần

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình cũng như bạn bè đã hết sức ủng hộ, luôn bên cạnh động viên, chia sẽ và giúp

đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2014 Tác giả

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát chung về RNase 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 3

1.1.2 Tính đặc hiệu cơ chất 4

1.1.3 Cấu trúc phân tử 4

1.1.4 Cơ chế xúc tác 6

1.2 Các chức năng sinh học của RNase 7

1.2.1 Chức năng tiêu hoá 7

1.2.2 Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN 7

1.2.3 Tham gia vào quá trình hiệu chỉnh của ARN 8

1.3 Các chức năng sinh học mới của RNase 8

1.3.1 Tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus 8

1.3.2 Hoạt tính cytotoxicity 9

1.3.3 Các chức năng sinh học khác 11

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đển hoạt tính RNase 13

1.4.1 Nhiệt độ 13

1.4.2 pH môi trường 13

1.4.3 Các chất kìm hãm (Inhibitor) 14

1.4.4 Các chất hoạt hoá 15

1.5 Các công trình nghiên cứu về RNase từ nội tạng động vật 15

1.6 Khả năng ứng dụng của RNase trong y học 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu và hoá chất 20

2.1.1 Nguyên liệu 20

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 20

2.1.3 Hóa chất 21

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp chiết rút enzym 22

2.2.2 Phương pháp thử tính bền nhiệt của RNase 22

2.2.3 Phương pháp tủa phân đoạn protein bằng muối amoni sulfat 23

2.2.4 Định tính hoạt tính của RNase bằng phương pháp đục lỗ trên gel agarose 25

2.2.5 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 25

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính RNase 26

2.2.7 Xác định sơ bộ băng RNase bằng phương pháp điện di Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel agarose 28

2.2.8 Phương pháp loại muối amoni sulfat bằng cột Sephadex G25 30

2.2.9 Tinh chế RNase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 31

2.2.10 Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH dung dịch đệm lên hoạt tính của RNase 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Kết quả thử tính bền nhiệt của RNase thu được từ DCTE và DCTC 35

3.1.1 Kết quả thử tính bền nhiệt của RNase thu được từ DCTE 35

3.2.2 Kết quả thủ tính bền nhiệt của RNase thu được từ DCTC 38

3.3 Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein thu được bằng phương pháp tủa phân đoạn bằng muối amoni sulfat 47

3.3.1 Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein thu được từ DCTE 47

3.3.2 Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase từ các phân đoạn protein thu được từ DCTC 51

3.4 Xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase bằng phương pháp điện di Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel Agarose 54

3.4.1 Kết quả xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase trong các phân đoạn protein thu được từ DCTE 54

3.4.2 Kết quả xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase trong các phân đoạn

protein thu được từ DCTC 55

3.5 Loại muối amoni sulfat bằng cột Sephadex G25 57

3.6 Tinh sạch RNase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 58

3.7 Kết quả nghiên cứu một số tính chất của RNase từ DCTE và DCTC 59

3.7.1 Xác định giá trị t0opt 59

3.7.2 Xác định giá trị pHopt 61

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 63

4.1 Về việc lựa chọn môi trường để chiết rút RNase từ trứng cóc nhà và trứng ếch đồng 63

4.2 Về kết quả nghiên cứu tính bền nhiệt của các RNase chiết rút từ trứng cóc nhà và trứng ếch đồng 63

4.3 Về sự phân bố hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein thu được bằng phương pháp tủa phân đoạn bằng muối amoni sulfat 64

4.4 Xác định sơ bộ khối lượng phân tử RNase từ các loại dịch chiết bằng phương pháp điện di Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel agarose 65 4.5 Tinh sạch RNase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT

A Hoạt tính enzym

A0 Hoạt tính riêng của enzym

ADN Acid Deoxyribonucleic

ARN Acid Ribonucleic

BS - RNase Ribonuclease từ tinh dịch bò (Bovine seminal ribonuclease)

Pr Protein

RNase Ribonuclease

TC Trứng cóc nhà

TE Trứng ếch đồng

topt Nhiệt độ tối ưu

TTHĐ Trung tâm hoạt động

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Bảng tính khối lượng muối amoni sulfat khan thêm vào[33] 24Bảng 3.1 Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại

trong dịch ly tâm từ DCTEa sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong

5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 35Bảng 3.2 Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại

trong dịch ly tâm từ DCTEb sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong

5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 37Bảng 3.4 Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại

trong dịch ly tâm từ DCTCa sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở

1000C trong các khoảng thời gian khác nhau 41Bảng 3.5 Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại

trong dịch ly tâm từ DCTCb sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 43Bảng 3.6 Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase còn lại

trong dịch ly tâm từ DCTCb sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở

1000C trong các khoảng thời gian khác nhau 45Bảng 3.7 Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase trong

các phân đoạn protein nhận được từ DCTEa 48Bảng 3.8 Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính Rnase trong

các phân đoạn protein nhận được từ DCTEb 50Bảng 3.9 Kết quả xác lượng protein tổng số và hoạt tính Rnase trong các

phân đoạn protein nhận được từ DCTCa 51Bảng 3.10 Kết quả xác định lượng protein tổng số và hoạt tính RNase trong

các phân đoạn protein nhận được từ DCTCb 53Bảng 3.11 Kết quả xác định hoạt tính RNase sau khi ủ hỗn hợp phản ứng

trong 1 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 59Bảng 3.12 Kết quả xác định hoạt tính RNase sau khi cho hỗn hợp phản ứng

1 phút trong môi trường đệm Natri phosphat ở các giá trị pH khác nhau 61

DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc không gian của RNase A 5Hình 1.2 Ảnh chụp 2AAS-NMR 3D của RNase (màu xanh là nhóm amino,

màu đỏ là nhóm carboxyl, màu trắng là vùng trung tâm hoạt động) 6Hình 2.1 Thứ tự các lỗ đục trên gel Agarose 25Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch

ly tâm từ DCTEa ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 36Hình 3.3 Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ DCTEb

sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 37Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch

ly tâm từ DCTEb ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 38Hình 3.5 Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ

DCTCa sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 39Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch

ly tâm từ DCTCa ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 40Hình 3.7 Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ

DCTCa sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 1000C trong các khoảng thời gian khác nhau 41Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch

ly tâm từ DCTCa sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 1000C trong các khoảng thời gian khác nhau 42Hình 3.9 Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ

DCTCb sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các nhiệt độ khác nhau 43Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch

ly tâm từ DCTCb sau khi gia nhiệt bằng máy PCR trong 5 phút ở các nhiệt độ khác nhau 44Hình 3.11 Kết quả định tính hoạt tính RNase còn lại trong dịch ly tâm từ

DCTCb sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 1000C trong các khoảng thời gian khác nhau 45

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase còn lại trong dịch

ly tâm từ DCTCb sau khi gia nhiệt bằng máy PCR ở 1000C trong các khoảng thời gian khác nhau 46Hình 3.13 Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein

nhận được từ DCTEa 48Hình 3.14 Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein

nhận được từ DCTEb 49Hình 3.15 Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein

nhận được từ DCTCa 51Hình 3.16 Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein

nhận được từ DCTCb 52Hình 3.17 Kết quả xác định Mr RNase trong các phân đoạn protein thu được

từ DCTEa 54Hình 3.18 Kết quả xác định Mr RNase trong các phân đoạn protein thu được

từ DCTEb 55Hình 3.19 Kết quả xác định Mr RNase trong các phân đoạn protein thu được

từ DCTCa 56Hình 3.20 Kết quả xác định Mr RNase trong các phân đoạn protein thu được

từ DCTCb 56Hình 3.21 Kết quả định tính hoạt tính RNase trong các mẫu thu được sau khi

đi qua cột loại muối Sephadex G25 57Hình 3.22 Sắc ký đồ của các phân đoạn DCTEb và DCTCb trên cột Hitrap

SP XL 58Hình 3.23 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase từ DCTEb vào

nhiệt độ 60Hình 3.24 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase từ DCTCb vào

nhiệt độ 60Hình 3.25 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase từ DCTEb vào pH 62Hình 3.26 Đồ thị biểu diễn mối phụ thuộc hoạt tính RNase từ DCTCb vào pH 62

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, ung thư là một bệnh có tỷ lệ tử vong cao, chi phí điều trị lớn nhưng hiệu quả lại rất thấp Cho đến nay con người vẫn chưa biết chính xác nguyên nhân gây ra bệnh ung thư do đó chưa tìm được thuốc nào điều trị đạt được kết quả một cách triệt để Nguyên nhân gây ra bệnh ung thư chủ yếu do

sự sai hỏng của phân tử ADN, tạo nên các đột biến ở các gene thiết yếu điều khiển quá trình phân bào Một hoặc nhiều đột biến sẽ gây ra sự tăng sinh tế bào không thể kiểm soát được và tạo thành khối u

Người ta đã nghiên cứu để tìm ra nhiều phương pháp chữa bệnh ung thư, dùng nhiều tiến bộ khoa học vào việc chẩn đoán sớm bệnh để điều trị bằng thuốc hoặc cắt bỏ sớm không cho tế bào ung thư di căn vào các cơ quan khác trong cơ thể Trong các phương pháp để điều trị ung thư thì phương pháp hóa trị liệu sử dụng các hóa chất có tác dụng ngăn cản sự phát triển của

tế bào ung thư là một phương pháp rất quan trọng, đang được sử dụng phổ biến hiện nay

Việc sử dụng enzym ribonuclease (RNase) làm thuốc chữa bệnh đã được phôi thai cách đây hàng nửa thế kỉ Đó là vào cuối những năm 50 của thế kỉ XX một số nhà khoa học đã phát hiện ra hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính cytotoxicity) của các RNase và nghĩ tới khả năng sử dụng nuclease

để chữa bệnh do virus Hiện nay một trong những hướng nghiên cứu quan trọng đang được tiến hành trên thế giới là kiếm tìm nguồn RNase tự nhiên có hoạt tính gây độc tế bào và chuyển các RNase từ dạng không hoạt tính cytotoxicity thành các dạng có hoạt tính cytotoxicity, nhất là với các enzym tuýp tụy, để làm thuốc điều trị ung thư Hơn nữa, ngày càng có nhiều nghiên cứu thông báo về vai trò của nhiều loại RNase trong hệ thống phòng thủ và tự

vệ của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh là vi khuẩn và virus Tuy nhiên RNase từ nội tạng của động vật còn ít được nghiên cứu Để góp phần tìm hiểu

thêm về các nguồn RNase tự nhiên ở nước ta chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Tách chiết, tinh chế Ribonuclease từ trứng động vật lưỡng cư (Amphibia) và xác định một số tính chất của enzym”, cụ thể ở đây là trứng

ếch đồng (Ranna rugulosa) và trứng cóc nhà (Duttaphrynus melanostictus)

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này với các mục tiêu sau:

1 Xác định được hoạt tính RNase trong các phân đoạn protein từ dịch chiết trứng ếch đồng và trứng cóc nhà

2 Tách chiết, tinh chế và xác định được một số tính chất của RNase phân lập từ trứng ếch đồng và trứng cóc nhà

Những năm 1960 -1970, RNase tụy bò (RNase A, EC 3.1.27.5) trở thành mô hình mẫu trong các công trình nghiên cứu enzym học nhờ ưu thế

về nguồn tiếp cận, khả năng tinh chế dễ dàng cũng như kích thước phân tử nhỏ (~14 kDa) [15] RNase A cũng là enzym đầu tiên được xác định trình tự amino acid (Stein, Moor và cộng sự, 1960) và là enzym thứ ba được xác định cấu trúc (sau Lysozyme và Carboxypeptidase A) Năm 1972, giải thưởng Nobel hóa học được trao cho Stanford Moore, William Stein và Christian Anfinsen với những công trình nghiên cứu về RNase Năm 1984, Bruce Merrifield vinh dự nhận giải thưởng cao quý này với công trình nghiên cứu cũng liên quan đến RNase A[37] Từ sau những năm cuối thập

kỷ 80, nhiều nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu theo hướng ứng dụng RNase

đã được tiến hành song song và phối hợp chặt chẽ với nhau, đặc biệt là sau khi có các bằng chứng khoa học cho thấy enzym này có biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity)

1.1.2 Tính đặc hiệu cơ chất

Tính đặc hiệu cơ chất là điểm khác biệt chủ yếu giữa enzym với các chất xúc tác khác cũng như giữa enzym này với enzym khác Nhóm nuclease tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất của các acid nucleic Chúng được đặc trưng bởi tính đặc hiệu cơ chất rộng và che phủ (chồng chéo) nhau

Hầu hết các RNase tìm thấy ở động vật có xương sống đều có tính đặc hiệu pyrimidin Nó phân cắt liên kết C5’-O-P đứng sau pyrimidin (của base cytocil và uracil đầu tiên) mà không phân cắt liên kết C5’-O-P đứng sau purin để tạo thành dẫn xuất pyrimidin-2’,3’-phosphat vòng Sau đó các sản phẩm vòng này được tích lũy hoặc bị thủy phân thành các nucleotide-3'-phosphat bằng cách phân cắt liên kết C2'-O-P RNase cũng xúc tác thủy phân tạo nên các phosphat vòng cytidin-2’,3’-phosphat và uridin-2’,3’-phosphat Những phosphat vòng này

là tiền chất của các mononucleotide pyrimidin được tìm thấy trong quá trình tiêu hóa ARN Phù hợp với tính chất đặc hiệu này là các RNase không tác động đến các phosphat vòng adenosin-2',3'-phosphat và guanosin-2',3'-phosphat Cũng xuất phát từ tính đặc hiệu pyrimidin, RNase chỉ thuỷ phân các acid polythymidylic, polyuridylic, polypseudouridylic và acid polyguanylic [30, 39]

1.1.3 Cấu trúc phân tử

Trong thế kỉ XX, RNase từ tụy bò (RNase A) được coi là mô hình mẫu

và được nghiên cứu nhiều nhất, đầy đủ nhất về cấu trúc hoá học, tính bền vững, quá trình bao gói, cơ chế xúc tác cũng như hướng tiến hoá phân tử Nhờ vậy chúng ta có thêm thông tin về các enzym thành viên thuộc siêu họ RNase ngoại tiết (hay siêu họ RNase A) Hiện nay hơn 100 thành viên thuộc siêu họ RNase A đã được biết đến bao gồm tất cả các RNase ngoại tiết thuộc ngành động vật có xương sống, từ lớp lưỡng cư cho đến lớp thú Hầu hết các enzym thành viên thuộc siêu họ này khác nhau ít nhiều về trình tự amino acid nhưng lại giống nhau về cấu trúc không gian (dạng monomer), trung tâm hoạt động

và các tính chất xúc tác [37, 39]

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của RNase A

RNase A được tiết từ các tế bào ngoại tiết tuyến tụy bò để phân huỷ một lượng lớn ARN được tạo bởi những vi sinh vật khu trú trong dạ cỏ Nó có khối lượng phân tử nhỏ (~14 kD) với 124 gốc amino acid trong các chuỗi polypeptide, 19 trong tổng số 20 loại amino acid có trong protein có mặt trong cấu trúc này (không có Trytophan) Công thức phân tử dạng không tích điện là

C575H907N171O192S12 với Mr = 13 686 Da Về hình dạng, RNase A giống quả thận, các gốc của trung tâm hoạt động nằm trong vùng hốc (cleft) -là vùng lõm của quả thận Cấu trúc bậc hai điển hình của RNase bao gồm 4 phiến cấu trúc đối song song ngược chiều kề bên cạnh 3 chuỗi xoắn ỏ ngắn Trong phân tử có

4 cầu nối disunfide được hình thành từ 8 gốc cystein ở các vị trí 26-84; 40-95; 58-110 và 65-72 Các cầu nối này có thể bị phá vỡ bởi mercaptoethanol dư thừa, tạo thành 8 nhóm -SH tự do làm phân tử enzym bị duỗi ra và mất hoạt tính xúc tác [37]

Hình 1.2 Ảnh chụp 2AAS-NMR 3D của RNase (màu xanh là nhóm amino, màu đỏ là nhóm carboxyl, màu trắng là vùng trung tâm hoạt động)

Hầu hết các RNase thuộc siêu họ RNase A đều cấu tạo từ một mạch polypeptide, tức là có cấu trúc monomer, chỉ có một ngoại lệ là RNase trong tinh dịch bò (BS-RNase) có cấu trúc bậc 4 -dimer BS-RNase được tách ra ở dạng dimer, trong đó hai tiểu đơn vị thành phần (subunit) được nối với nhau bởi hai cầu disunfide Ở trạng thái cân bằng, BS-RNase dimer là một hỗn hợp gồm hai cấu trúc bậc 4 hoàn toàn khác nhau, được ký hiệu là M=M (không có

sự trao đổi chéo các đoạn mạch đầu N giữa 2 tiểu đơn vị thành phần) và MxM (có sự trao đổi chéo trên: một đoạn mạch peptide ngắn đầu N của mỗi tiểu đơn

vị này sẽ liên kết với phần cấu trúc thân chính của tiểu đơn vị kia) [29, 34]

1.1.4 Cơ chế xúc tác

Phản ứng hoá học do RNase xúc tác là phản ứng thuỷ phân liên kết phosphodiester trong phân tử acid nucleic Quá trình thuỷ phân ARN do RNase xúc tác xảy ra qua 2 giai đoạn theo cơ chế xúc tác kiềm – acid chung với sự tham gia của 2 gốc His-12 và His-119:

- Giai đoạn 1: Phản ứng diễn ra nhanh, phân cắt chuỗi polymer tạo ra sản phẩm trung gian là phosphat vòng mà không giải phóng nhóm acid Trong giai đoạn này, His-12 đóng vai trò là chất xúc tác kiềm chung (nhận proton H+ ở vị trí 2') còn His-119 đóng vai trò là acid chung

- Giai đoạn 2: Diễn ra chậm hơn và giải phóng nhóm acid thứ hai thuộc gốc phosphat trong quá trình thuỷ phân dẫn xuất phosphat vòng Trong giai đoạn này vai trò của 2 gốc His-12 và His-119 lại ngược lại: His-119 tương tác với H2O theo cơ chế xúc tác kiềm chung (nhận proton) còn His-12 đảm nhận việc proton hoá nhóm đi khỏi (sản phẩm) ở vị trí C-2' [30, 37, 39]

1.2 Các chức năng sinh học của RNase

1.2.1 Chức năng tiêu hoá

Trong cơ thể con người cũng như trong cơ thể động vật bậc cao, tuyến tụy có một vai trò vô cùng quan trọng đối với quá trình tiêu hoá Các acid ribonucleic có trong thức ăn bị phân giải ở tá tràng dưới tác động của RNase do tuyến tụy tiết ra RNase sẽ thuỷ phân các ARN thành các mononucleotide, phosphat vô cơ và oligonucleotide Sau đó các dạng này mới tiếp tục bị các enzym khác trong hệ tiêu hoá phân giải thành các dạng mới giúp cơ thể dễ hấp thụ [39]

1.2.2 Tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN

Một vai trò rất quan trọng của RNase trong tế bào là tham gia trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp ADN và ARN [13, 37, 39] Điển hình trong vai trò này phải kể đến RNase H RNase H thuỷ phân mạch ARN trong thành phần phân tử lai (heteroduplex) ARN-ADN tạo thành các đoạn

có đầu cuối 5'-P và 3'-OH Enzym này không thể hiện hoạt tính với cả

ds-và ss-ARN (ARN có cấu trúc mạch kép ds-và cấu trúc mạch đơn) RNase H chính của người (HI) được tách từ các tế bào tăng bạch hồng cầu K562, đây

là một loại tế bào ung thư RNase H được phân ra làm 2 loại: RNase HI và RNase HII [39]

- RNase HI đóng vai trò loại bỏ ARN mồi trong quá trình sao chép ADN RNase này có Mr = 89 kDa, cần cation hoá trị 2 cho hoạt tính xúc tác,

pH tối ưu trong khoảng 8,0 – 8,5 khi có mặt 10 mM Mg2+ cho thực hiện chức năng của nó

- RNase HII có Mr = 33 kDa và được tách chiết từ nhau thai, tham gia vào quá trình sao mã (tổng hợp ARN) [39], để thực hiện chức năng của mình

nó cần ion Mg2+, pH tối ưu trong vùng 8,5 -9

1.2.3 Tham gia vào quá trình hiệu chỉnh của ARN

Quá trình chế biến và chín của ARN là những quá trình sinh hoá phức tạp với sự tham gia của nhiều loại RNase khác nhau [39] Một trong những RNase đó là RNase P Enzym này có mặt ở cả sinh vật thuộc nhóm đơn giản

như vi khuẩn cổ (Archaea), vi khuẩn (Bacteria) tới các loài nhân chuẩn (Eucaria) RNase P là một enzym có hai thành phần chính là ARN và protein

gắn với nhau, trong đó tiểu đơn vị protein chiếm trọng lượng phân tử nhỏ còn tiểu đơn vị ARN đóng vai trò là TTHĐ và chiếm trọng lượng chủ yếu trong thành phần enzym ARN có cấu trúc bậc 2 và có thể biểu hiện hoạt tính ngay

cả khi không có tiểu phân tử protein [31]

RNase P giữ vai trò thuỷ phân liên kết phosphodiester trên phân tử tiền chất tARN (pre-tARN) tạo nên tARN hoạt động tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein Ngoài ra RNase P còn cắt mARN đặc hiệu trình tự bằng cách dùng các trình tự định hướng để liên kết với cơ chất qua các liên kết cặp đôi base, sau đó cắt rồi phân li sản phẩm [31, 39]

1.3 Các chức năng sinh học mới của RNase

1.3.1 Tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus

Phản ứng miễn dịch của cơ thể xảy ra để chống lại các yếu tố gây bệnh xâm nhập vào cơ thể như các vi sinh vật (vi khuẩn, virus), độc tố vi sinh vật, các phân tử lạ Đến nay, chúng ta đã tìm ra được nhiều loại RNase có khả năng tham gia vào phản ứng miễn dịch chống virus như RNase L, RNase bạch cầu ưa axit ECP và EDP, Onconase, Amphinase, BS-RNase…

RNase L là endonuclease được tế bào tổng hợp cảm ứng bởi interferon, được hoạt hoá bởi 2', 5'-oligoriboadenylat (các gốc A liên kết với nhau bằng các liên kết 2', 5'-phosphodiester) và được phosphoryl hoá, có Mr = 83,5 kDa

RNase L thuỷ phân cả ARN của vi khuẩn và của tế bào theo các trình tự UpN, ApU trong cùng một mạch của ARN tạo thành sản phẩm có các đầu cuối 3'-phosphat và 5'-OH Hoạt động của enzym này cần sự có mặt của các ion Mg2+

và ATP RNase L bị ức chế bởi protein-inhibitor đặc hiệu RL-I (là protein cản trở thực hiện cơ chế chống virus của interferon) [39]

Ngoài RNase L đã nêu trên, còn nhiều RNase khác có hoạt tính chống virus như ECP, EDN của bạch cầu [21, 25] BS-RNase [25] và cả Onconase [25] Chúng có hoạt tính kháng khuẩn, thể hiện hoạt tính cytotoxicity, neurotoxin và helmintotoxin EDN là glycoprotein, trong trình tự amino acid của nó, có 5 trình tự glycosyl hoá tại Asn (tại các vị trí 17, 59, 65, 84 và 95) ECP là một protein rất kiềm (với điểm đẳng điện pI = 10,8), có 3 điểm glycosyl hoá bởi oligosacchatide phức tạp giống với EDN [39]

1.3.2 Hoạt tính cytotoxicity

Hoạt tính cytotoxicity là một trong các hoạt tính sinh học quan trọng của RNase Trong số hơn 100 enzym thuộc siêu họ RNase A được biết cho đến nay, chỉ có BS-RNase (enzym từ tinh dịch bò) và các RNase từ 3 loài ếch:

ếch báo phương Bắc Rana pipiens, ếch bò Rana catesbeiana và ếch đồng Nhật Bản Rana japonica -là có hoạt tính cytotoxicity [13, 19, 32, 37, 41] Cơ

sở của hoạt tính cytotoxicity là khả năng thoát khỏi sự kiểm soát của protein

ức chế (RI) trong bào tương [11, 12, 14, 18, 37], nhờ đó RNase dễ dàng phân cắt cơ chất ARN đặc hiệu trong tế bào, giúp hiệu quả diệt khối u được nâng cao Ba enzym có hoạt tính cytotoxicity được nghiên cứu nhiều là Onconase (ONC), Amphinase (Amph) và BS-RNase:

- ONC là một protein được tinh sạch từ trứng và phôi sớm của loài ếch

Rana pipiens có hoạt tính chống ung thư Protein này còn được kí hiệu là P

30 Đó là một protein-monomer, có phân tử cấu tạo từ một chuỗi polypeptide với Mr = 12 000 Da và có tính tương đồng cao với RNase A [16, 32] ONC bám vào tế bào với 2 lực bám khác nhau: một lực bám có Kd = 6,2x10-6 và

một lực bám có Kd = 2,5x10-7 Ủ ở 40C làm tăng tỉ lệ ONC bám vào tế bào tỉ

lệ với nồng độ bám ở 370C và cũng làm tăng độ mẫn cảm của tế bào với hoạt tính gây độc của ONC Các dẫn liệu này cho thấy rằng bước mà ONC bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào là bước khởi đầu cho sự thể hiện độc tính của

nó Hoạt tính này có thể bị ức chế bởi NaN3 và 2-deoxyglucose Hoạt tính gây độc tế bào của nó gấp 10 lần Monensin Hoạt tính RNase rất cần thiết cho sự thể hiện độc tính vì khi ONC được alkyl hoá hoạt tính ribonucleolytic của nó chỉ còn lại 2% so với hoạt tính này của enzym ban đầu và khả năng ức chế sự tổng hợp protein tế bào của ONC đã được alkyl hoá cũng bị giảm đi tương ứng 100 lần [40] Không giống như RNase A, ONC không bị ức chế bởi protein ức chế RNase có trong tế bào chất (RI), chất ức chế RNase từ nhau thai (PRI) [13, 32] ONC bám trên bề mặt các tế bào nhờ các thụ thể, chúng xâm nhập vào trong tế bào và thực hiện quá trình phân huỷ ARN của tế bào

đó, nhờ đó ức chế quá trình tổng hợp protein và làm cho tế bào bị chết [32]

- Amphinase (Amph) được phát hiện có trong trứng loài ếch Rana

pipiens Ở động vật lưỡng cư, Amph vượt qua được các chất ức chế để phá

hủy tế bào ung thư Amph có khả năng nhận biết và gắn vào một loại đường trên màng tế bào ung thư, qua đó xâm nhập được vào bên trong tế bào ung thư, phá hủy ARN, ngăn cản quá trình nhân lên của tế bào ung thư [42] Hiện nay, trên thế giới có công trình của GS Ravi Acharya - Trường Đại học Bath (Anh) hợp tác với tập đoàn Alfacell (Mỹ) đã phân lập và giải trình tự thành công Amph Theo GS Acharya, Amph là một phân tử sinh học hoạt động rất mạnh mẽ Amph khi tiêm trực tiếp vào vùng có khối u không gây hại cho các

tế bào lành xung quanh [28]

- BS-RNase được tách chiết từ tinh dịch bò, chúng là một dạng đồng đẳng dimer của RNase A từ tụy bò, có độc tính với các tế bào của động vật có vú Trái ngược với BS-RNase dimer, dạng monomer của BS-RNase lại không có độc tính và bám chặt với chất ức chế của RNase trong tế bào chất BS-RNase dimer

đi vào trong tế bào theo phương thức hấp thụ chứ không phải là nội nhập bào qua trung gian thụ thể tế bào và sau đó không tương tác với chất ức chế của RNase trong tế bào chất, thể hiện hoạt tính phân huỷ ARN của tế bào [34] Hoạt tính gây độc tế bào của BS-RNase có liên quan đến cấu trúc bậc bốn của nó: chỉ dạng BS-RNase dimer có hoạt tính cytotoxicity, còn dạng BS-RNase monomer hoàn toàn không độc với tế bào [34] Ở trạng thái cân bằng, BS-RNase dimer là một hỗn hợp gồm hai cấu trúc bậc bốn hoàn toàn khác nhau, có thể biến đổi qua lại: M=M và MxM (Picolli và cộng sự 1992) Sự biến đổi thuận nghịch của M=M và MxM là kết quả của sự biến đổi của các chuỗi xoắn  ở đầu tận cùng N giữa các tiểu đơn vị như là nó đã diễn ra trong suốt quá trình dimer hoá nhân tạo RNase A [12] Hoạt tính cytotoxicity của dạng MxM cao hơn của dạng M=M vì

nó tồn tại bền vững trong môi trường khử của bào tương Thay thế Cys-31 hay Cys-32 bằng Ser không ảnh hưởng đến hoạt tính enzym, nhưng làm giảm lượng của dạng MxM ở trạng thái cân bằng và giảm hoạt tính cytotoxicity [34]

Hiện nay, ngoài các RNase tự nhiên có hoạt tính chống ung thư người ta

đã tạo ra nhiều dạng biến thể (variant) của RNase A và RNase tụy người mang hoạt tính cytotoxicity, kể cả ở dạng dimer [11, 12] và monomer [14, 20, 22]

1.3.3 Các chức năng sinh học khác

Ngoài những chức năng chính đã kể trên đây, RNase còn biểu hiện nhiều hoạt tính khác đặc trưng cho từng loại tế bào, từng loại mô trong các cơ quan khác nhau của cơ thể:

- RNase 5 (Angiogenin) tham gia vào sự hình thành mao mạch -kích thích sự phát triển mao mạch mới [39]

- BS-RNase gây ức chế miễn dịch [34]

- Một số RNase thể hiện độc tính chọn lọc: hoạt tính kháng khuẩn (ECP, EDP), kháng giun, kháng côn trùng [39]

Bên cạnh các RNase, trong cơ thể người còn có một số protein biểu hiện hoạt tính ribonucleolytic như Lactoferrin, ABzyme

- Lactoferrin có trong sữa, huyết thanh và dịch ngoại tiết (mật, nước mắt),

Mr = 80 kDa Chức năng sinh lý chính của Lactoferrin trước đây được cho là vận chuyển sắt Tuy nhiên, protein này còn có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích phân chia tế bào, tham gia điều hoà quá trình tạo nguyên bào tủy xương và có các tính chất kích thích miễn dịch Protein này có 3 dạng iso khác nhau là Lf-, Lf- và Lf- Người ta đã chỉ ra rằng 2 trong 3 isoform của Lactoferrin (Lf- và Lf-) không liên kết sắt, mà là các RNase đặc hiệu pyrimidin (tạo các sản phẩm với đầu cuối 3'-phosphat và 5'-OH) pH tối ưu của phản ứng là 7,5  8,0, isoform thứ 3 (Lf-) liên kết sắt và không có hoạt tính RNase [39]

- Các kháng thể thuỷ phân ARN: cách đây không lâu các nhà khoa học

đã chỉ ra rằng, trong máu của các bệnh nhân mắc chứng lao ban đỏ và cả nhiều loại bệnh tự miễn khác có mặt các kháng thể thuỷ phân ARN hay ABzyme Các ABzyme cũng đã phát hiện thấy có trong sữa người Giả định rằng, các kháng thể này là các antiidiotip thứ cấp (cấp II) bắt chước trung tâm hoạt động của RNase Hoạt tính thuỷ phân ARN của kháng thể còn chưa được đặc trưng kỹ với các cơ chất chuẩn, nhưng đã rõ rằng trong các kháng thể này

có cả các protein giống và khác nhau, đã phát hiện được các hoạt tính tương ứng với tính đặc hiệu cuả RNase 1 (RNase tuýp tụy) trong các chế phẩm Ig Ngoài ra còn tìm thấy các tuýp hoạt tính RNase khác được kích thích (hoạt hoá) bởi ion Mg2+ [17, 39]

Cho đến nay vẫn chưa rõ về vai trò sinh lí của hoạt tính ribonucleolytic của lactoferrin và ABzyme Có thể giả định rằng các protein này cũng có một vai trò nào đó trong phản ứng tự vệ của cơ thể Giả định này rất phù hợp với các dẫn liệu

về việc phát hiện được nhiều protein có hoạt tính RNase với chức năng tự vệ ở cả

vi sinh vật và thực vật, như các ribotoxin -sarcin từ nấm mốc Aspergillus giganters, antigen Asp f1 của Aspergillus fumigatus góp phần đa dạng hoá nguồn RNase tự nhiên tạo cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị bệnh

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đển hoạt tính RNase

Hoạt tính của RNase phụ thuộc vào nhiều yếu tố hoá lí như: nhiệt độ,

pH, môi trường, chất ức chế, chất hoạt hoá, các tác nhân biến tính…Sự thay đổi hàm lượng hay nồng độ các yếu tố trên dù rất nhỏ cũng gây ảnh hưởng ít nhiều đến hoạt tính chung của RNase trong tế bào

1.4.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong phản ứng thuỷ phân ARN Khi nhiệt

độ tăng, các nguyên tử của phân tử enzym thu được một năng lượng lớn hơn nên

có xu hướng chuyển động nhanh hơn Năng lượng mà chúng thu được có thể đủ

để thắng các tương tác yếu vốn quyết định cấu trúc của các protein hình cầu dẫn đến một sự biến đổi hình thể protein và do đó làm giảm hoạt tính của enzym Nếu nhiệt độ cao quá enzym sẽ bị biến tính, ít có khả năng phục hồi hoạt độ Ở nhiệt

độ thấp dưới 00C, hoạt độ enzym tuy giảm nhưng vẫn có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường Hầu hết các RNase có nhiệt độ thích hợp khoảng 40-700C (Invitro) Ví dụ: RNase tụy có nhiệt độ tối ưu là 600C; RNase tinh khiết tách từ

nọc rắn hổ mang Naja naja vùng Guntur Ấn Độ hoạt động tốt ở 37-600C với nhiệt

độ tối ưu là 370C [38]; một số enzym rất bền với nhiệt nhưng hoạt tính không tăng tuyến tính với nhiệt độ như RNase nọc rắn hổ mang đen của Việt Nam: ở 25-490C hoạt tính enzym được tăng cường, từ 59-900C thì hoạt tính enzym giảm đáng kể

và tới 1000C thì hoạt tính lại cao nhất [3, 4, 7, 8, 10] Một số enzym khác thì kém

bền nhiệt, ví dụ: RNase trong nọc rắn hổ mang vùng Trung Á Liên Xô (Naja

oxiana) bị mất 50% hoạt tính khi đun cách thuỷ 5 phút ở 500C và mất hoàn toàn hoạt tính khi xử lý như vậy ở 700C [27, 36]

1.4.2 pH môi trường

pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym cũng như độ bền của protein enzym Các nghiên cứu trước đây về RNase cho thấy hầu hết các enzym này thể hiện hoạt tính cao nhất ở vùng pH 6 đến pH 9, nhưng pH thích hợp nhất

cho RNase hoạt động là từ 7 đến 8 Nếu pH quá cao hay quá thấp hoạt tính RNase đều bị giảm hay biến mất Ví dụ, RNase tụy bò có pHopt = 7,7; RNase nấm men rượu có pHopt = 7,6 [30, 39]

1.4.3 Các chất kìm hãm (Inhibitor)

RNase có mặt trong mọi cơ thể sống kể cả ở người và đóng vai trò quan trọng trong rất nhiều quá trình nền tảng của tế bào do đó hoạt tính của nó được kiểm soát chặt chẽ bởi một hệ thống điều hoà tinh vi, đó là các chất kìm hãm có bản chất protein do chính tế bào sản sinh ra Các protein kìm hãm ribonuclease (RI) có nhiều trong dịch bào của động vật có vú, phân bố ở nhiều mô và giữ vai trò bảo vệ tế bào khỏi độc tính của các RNase

RI có khối lượng phân tử khoảng 50 000 Da, chiếm 0,01-0,1% tổng số protein trong bào tương Riêng ở nhau thai và não tỉ lệ này lớn hơn, tương ứng là 0,1% và 0,08% [18, 37, 39]

Phân tử RI có ái lực mạnh với RNase, chúng tạo phức với nhiều thành viên thuộc siêu họ RNase A theo tỉ lệ 1:1 Mỗi phân tử RI chứa từ 30-32 gốc Cys dạng khử nên môi trường khử như dịch bào rất phù hợp để duy trì hoạt tính RI Việc oxy hoá một gốc Cys sẽ kéo theo sự oxy hoá các gốc còn lại Khi bị oxy hoá, RI mất khả năng liên kết với RNase và nhanh chóng bị thuỷ phân bởi protease trong tế bào [1]

Tuy nhiên, khả năng bảo vệ tế bào của RI cũng bị hạn chế bởi một số enzym Chẳng hạn, BS-RNase có cấu trúc bậc 4 dạng dimer có thể thoát khỏi

sự kiểm soát của RI nên độc với tế bào Chỉ khi hai cầu nối disunfide bị khử, dạng dimer này chuyển thành hai tiểu đơn vị BS-RNase monomer bị RI kìm hãm nên mất hoàn toàn hoạt tính Hầu hết các thành viên thuộc siêu họ RNase

A có cấu trúc monomer đều bị kìm hãm bởi RI có trong dịch bào, ngoại trừ ONC và Amph Chúng nằm ngoài vùng kiểm soát của RI nhờ những đặc trưng về mặt cấu trúc với vòng ngoài của phân tử protein bị cắt ngắn, đa số

các gốc của phân tử RNase A tiếp xúc với RI được thay thế bởi các gốc không đồng dạng ở ONC, Amph Do vậy, các enzym này có cơ hội biểu hiện hoạt tính cytotoxicity

Một số chất kìm hãm khác cũng có mặt trong tế bào như các polimer mang điện âm, một số chất ức chế lấy từ tế bào gan chuột, nhân tế bào sao

biển, trứng của loài Chaetopterusp, từ lá cây tử đinh hương…các ion kim loại

nhất là các ion kim loại hoá trị 2 cũng có khả năng ức chế RNase

1.4.4 Các chất hoạt hoá

RNase muốn hoạt động tốt thì sự có mặt của các chất hoạt hoá (activator) là rất cần thiết Các chất hoạt hoá giúp tăng cường hoạt tính thuỷ phân của RNase trong giới hạn nồng độ xác định và thường có bản chất hoá học khác nhau:

- Các ion kim loại, ví dụ Mg2+ cần cho hoạt động của RNase P, Mg2+ hoặc Mn2+ cần cho hoạt động của RNase 1

- Các hợp chất hữu cơ như 5,6-dimethylbenzimidazole, benzynimidazole, các chất tẩy rửa tích điện dương cũng có khả năng làm tăng hoạt tính RNase

- Các amino acid tự nhiên có trong cơ thể như glycin, histidin… cũng hoạt hoá RNase

Các chất trên hoạt hoá RNase theo những cơ chế khác nhau nhưng cùng thống nhất ở khả năng kết hợp trực tiếp với phân tử RNase, làm thay đổi cấu trúc không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác hoặc giúp loại trừ các yếu tố kìm hãm khỏi môi trường phản ứng [39]

1.5 Một số công trình nghiên cứu về RNase từ nội tạng động vật Trên thế giới, những năm vừa qua đã có nhiều công trình nghiên cứu về RNase có nguồn gốc từ nội tạng động vật, đặc biệt là từ trứng của các loài ếch Đáng chú ý trong đó có công trình nghiên cứu của K.Saxena và cộng sự

đã phân lập được một loại RNase mới từ trứng loài ếch báo phương bắc

(Rana pipiens) và được đặt tên thương mại là Onconase (ONC) ONC được

biết đến là một RNase nhỏ nhất trong các RNase thuộc siêu họ RNase A Kết quả giải trình tự acid amin cho thấy ONC có khối lượng phân tử khoảng 12 kDa, có tính tương đồng cao với RNase tụy A Ở pH 6.0 ONC thể hiện hoạt tính tối ưu nhất ONC có khả năng xâm nhập vào nội bào và tác động lên sự hoạt động của ARN của các tế bào bị bệnh Các nghiên cứu vivo cho thấy ONC thể hiện hoạt tính kháng virus, điều hòa miễn dịch và có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư rất mạnh mẽ Tất cả các hoạt tính của ONC đều phụ thuộc vào trung tâm hoạt động của enzym ONC không bị bất hoạt bởi RI Hiện nay, ONC đang được thử nghiệm trên lâm sàng giai đoạn pha 3 với tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung trung biểu mô ác tính Mặc dù ONC là một protein từ động vật lưỡng cư nhưng có thể dùng làm thuốc điều trị trên người mà không gây ra các phản ứng đáp ứng miễn dịch[28] Năm 2007, công trình nghiên cứu của P.Singh và cộng sự sử dụng đệm Natri acetat 0,15M (pH 5.0) để làm dung môi chiết rút RNase từ trứng

loài ếch báo phương bắc (Rana pipiens), sau đó sử dụng sắc ký trao đổi ion với

cột SP-Sepharose Fast Flow để phân lập RNase và đã phân lập được 3 đỉnh protein chính có hoạt tính RNase Kết quả giải trình tự acid amin cho thấy đỉnh thứ nhất và đỉnh thứ hai chính là Onconase (ONC) và biến thể của nó Đỉnh thứ

3 có hoạt tính ribonucleolytic yếu, là một chuỗi ARN trùng hợp cao Khi sử dụng sắc ký đảo pha HPLC trên cột C18 để thu các phân đoạn protein và giải trình tự acid amin thi cho thấy có 4 biến thể khác nhau của một loại RNase mới

và được đặt tên là Amphinase 1- 4 [42] Kết quả giải trình tự acid amin cho thấy các biến thể của Amphinase có chứa 114 acid amin và bị glycosyl hóa ở 2

vị trí Tất cả 4 biến thể của Amphinase đều thể hiện hoạt tính cytotoxicity yếu

và có khả năng chống tăng sinh tế bào Nghiên cứu cho thấy Amphinase có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư A-253 Hiện nay, các biến thể của Amphinase đang được nghiên cứu trên lâm sàng theo hướng sử dụng làm thuốc điều trị ung thư não và những kết quả bước đầu thu được là rất khả quan

Tại Việt Nam, một số công trình nghiên cứu về RNase trong nọc rắn hổ

mang Naja naja cho thấy đây là một enzym rất đặc biệt, có pH tối ưu rất thấp

(pHopt = 2,0 - 2,6), rất bền nhiệt, có nhiều dạng phân tử khác nhau và không tương tác với RI nội bào và có khả năng thể hiện hoạt tính cytotoxicity[2] Công trình sử dụng ARN toàn phần từ nấm men để làm cơ chất cho RNase RNase từ nọc rắn hổ mang chúa được phân tách bằng các phương pháp sắc ký trao đổi ion với các chất mang khác nhau như Carboxyl methyl cellulose, SP Sepharose 4 Fast Flow, Superdex 75 và được thực hiện trên thiết bị FPLC, đồng thời sử dụng sắc ký sàng lọc phân tử trên cột với chất mang là Sephadex G-75 để xác định khối lượng phân tử của RNase Kết quả cho thấy RNase từ

nọc rắn hổ mang Naja naja có khối lượng phân tử vào khoảng 40kDa Xác

định nồng độ protein bằng phương pháp quang phổ và xác định hoạt tính RNase bằng phương pháp đo OD260 Kết quả sắc ký trao đổi ion trên cột CMC với chất mang cationit cho thấy ở giá trị pH 5,25 các protein nọc rắn khác biệt không nhiều về điện tích bề mặt cho nên chúng được thôi ra khỏi cột không thành các đỉnh protein riêng biệt mà hầu hết đều tập trung trong một đỉnh protein lớn và một số đỉnh protein nhỏ về 2 phía của protein chính Các protein trong nọc rắn hổ mang chúa khác biệt nhau khá nhiều về kích thước phân tử, có

ít nhất 4 dạng phân tử khác nhau về kích thước và điện tích về mặt [10]

1.6 Khả năng ứng dụng của RNase trong y học

RNase có một ý nghĩa hết sức to lớn đối với nhiều loại bệnh trong y học Ngoài chức năng tiêu hoá và tham gia vào các hoạt động sao mã, phiên

mã, sinh tổng hợp protein, các RNase còn thực hiện nhiều vai trò trong phòng chống virus, vi khuẩn, kháng giun…

Các nghiên cứu y - sinh học cho thấy luôn tồn tại mối quan hệ giữa nồng độ và cả hoạt tính của các RNase trong các dịch bào và dịch cơ thể với các trạng thái bệnh lý của nhiều loại bệnh khác nhau: nồng độ enzym tăng là kết quả của phản ứng cơ thể chống lại bệnh tật Đôi khi chính RNase lại là tác

nhân gây bệnh vì chúng gây độc cơ thể [39] Trong một số bệnh lý thấy có liên quan đến nồng độ RNase trong máu như bệnh tăng bạch cầu tuỷ mãn tính, hội chứng mệt mỏi kinh niên đã phát hiện thấy lượng RNase 1 tăng lên trong các tế bào máu ngoại vi; nồng độ RNase huyết thanh tăng khi sử dụng prednison, giảm khi sử dụng steroid dị hoá Vì vậy tăng lượng RNase trong máu có thể là marker (dấu hiệu) về trạng thái dinh dưỡng nghèo [1]

Những ứng dụng trực tiếp của RNase trong điều trị bệnh virus cho người và vật nuôi đã được tiến hành ở Liên Xô vào những năm 70 của thế kỉ trước [23] Trong liệu pháp người ta có thể sử dụng các chất hoạt hoá (activator) hoặc các chất ức chế (inhibitor) của RNase, thậm chí cả những RNase và dạng hợp thể của RNase để trị bệnh [39] Ức chế hoạt tính RNase là cần thiết trong điều trị dị ứng và các hội chứng ngộ độc thần kinh Chất ức chế RNase của người làm giảm hiệu ứng gây dị ứng của các tác nhân gây dị ứng có hoạt tính RNase ở một số loại thực vật

Các activator của RNase có thể được sử dụng để điều trị bệnh nhiễm trùng virus Hoạt hoá RNase L cần thiết để ức chế sinh sản của nhiều virus trong tế bào Các chất đồng đẳng phosphothoiat của 2’,5’-oligoadenylat (hoạt hoá hiệu quả RNase L) ngăn chặn phát triển nhiễm trùng virus Các inhibitor của RNase L đang được thử nghiệm lâm sàng đã chỉ ra rằng, các chế phẩm hoạt hoá RNase L như oragen và poli-I.poli-(C12U), bảo vệ tế bào khỏi nhiễm trùng virus Oragen ức chế quá trình nhân đôi ADN virus trong các đại thực bào màng bụng in vitro và trong gan chuột nhiễm virus viêm gan chuột (MHV)-in vivo Sau liệu pháp bằng poly-I.poli-(C12U) thói quen nhận biết của bệnh nhân với hội chứng mệt mỏi kinh niên được cải thiện tốt lên [39]

RNase cũng như các hợp thể của chúng là các chế phẩm thuốc Ví dụ:

sử dụng RNase tụy chữa viêm não do ve Các RNase có hoạt tính cytotoxicity như ONC, Amph – các enzym có hoạt tính thấp, nhưng xâm nhập vào các tế bào ung thư rất hiệu quả và làm tổn thương các rARN Một số thông tin cho

biết RNase trong nước tiểu của phụ nữ đang mang thai có hoạt tính chống ưng thư Các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu các chế phẩm thuốc là hợp phần của RNase có khả năng nhận biết các mạch nucleotide trải dài trong một phạm vi và có tính đặc hiệu với một tuýp ARN nhất định Các RNase tự chúng có tính đặc hiệu rất thấp Người ta còn sử dụng RNase H thuỷ phân ARN Nhờ tác động của enzym này có thể hướng vào những trình tự nhất định nhờ các oligonucleotide bổ trợ tương ứng

Những năm gần đây, ngoài việc tìm được một số RNase nguồn gốc tự nhiên có nhiều đặc tính quí báu (như ONC, Amph, BS-RNase) các nhà khoa học còn tập trung sản xuất ra các chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống ung thư nhờ việc vận dụng thành công các kĩ thuật và phương pháp công nghệ sinh học hiện đại ở mức độ phân tử Dạng biến thể của RNase được tạo ra bằng cách thay thế một hay vài gốc amino acid cần cho tương tác protein-enzym hoặc tạo thêm liên kết disunfide làm tăng độ bền vững cấu trúc

và giảm bớt sự nhạy cảm với chất ức chế hay các protease trong tế bào Các biến thể của RNase cũng được tạo ra bằng cách gắn đặc hiệu vào RNase những phân tử protein liên kết đặc hiệu với những tế bào nhất định cho phép tạo ra những toxin chọn lọc hiệu quả [28, 42]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và hoá chất

2.1.1 Nguyên liệu

- Trứng Cóc nhà (Duttaphrynus melanostictus)

- Trứng ếch đồng (Rana rugulosa)

Cóc nhà và ếch đồng mua ở các chợ thuộc khu vực Quận Hoàng Mai -

TP Hà Nội, sau đó mang về mổ bụng tách riêng lấy trứng, cho vào các ống Falcon sạch mỗi ống 10g trứng, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ - 200C

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị

- Pipetman các loại (0,5-10μl; 10-100μl; 100-1000μl)

- Đầu col các loại (0,5-10μl; 10-100μl; 100-1000μl)

- Ống Falcon Corning các loại (15ml; 50ml)

- Ống Eppendorf các loại (0,2ml; 0,5ml; 1,5ml; 2ml)

- Cân phân tích 4 số Precisa XT 220A

- Máy nghiền đồng thể

- Máy đo pH210 Microprocessor pH Meter của hãng Hanna Instruments

- Máy khuấy từ KIKA LABORTECHNIK RCT basic

- Màng thẩm tích Catalog D306 của hãng BioDesign, Mỹ

- Cột loại muối Sephadex G25 của hãng Amersham Pharmacia Biotech

- Máy đo quang phổ IMPLEN nanophotometer P330

- Máy PCR PTC-100 Peltier Thermal Cycler

- Máy ly tâm lạnh Sorvall Legend RT

- Máy ly tâm lạnh Biofuge fresco Heraeus

- Máy biến tính protein Techne Dri-blook DB 1M

- Hệ thống sắc ký tinh sạch protein FPLC AKTA của hãng Amersham pharmacia biotech

- Cột sắc ký trao đổi cation Hitrap SP XL 1ml

- Thiết bị điện di đứng Mini Trans-Blot cell của hãng Bio-Rad

- Thiết bị điện di ADN Mupid-2 Plus của hãng Advance

- Máy soi ADN - UV - Transilluminator

2.1.3 Hóa chất

- Cơ chất ARN nấm men tuýp VI của hãng Sigma Aldrich

- Các hóa chất dùng để chiết rút RNase: H2SO4 0,25N; đệm PBS 0,1M pH 7,4

- Hóa chất dùng để tủa phân đoạn protein: (NH4)2SO4 của hãng Merck

- Nước UltraPure Distilled Water của hãng Invitrogen (free RNase, DNase)

- Dung dịch RNase A nồng độ 10mg/ml

- Các hóa chất dùng định lượng protein theo phương pháp Bradford: Bradford Reagent của hãng Sigma (Coomassie brilliant blue G250, Ethanol,

H3PO4), dung dịch BSA 10mg/ml của hãng Merck

- Các hóa chất dùng chạy điện di SDS-page:

+ Các hóa chất pha gel cô và gel tách: Acrylamid 30%; Tris- HCl pH 8,8; Tris-HCl pH 6,8; Glycerol 50%; SDS 10%; APS 10%; TEMED của hãng Bio-rad

+ Sample buffer (Tris-HCl, Glycerol, SDS, 2-Mecaptoethanol, Bromophenol blue)

+ Marker Unstained protein MW #SM0431 của hãng Fermentas

+ Marker PageRuler Prestained protein #SM0671 của hãng Fermentas + Coomassie (Methanol, acetic acid, comassie brilliant blue, dH2O) + Dung dịch đệm Running buffer (Tris-HCl, Glycin, SDS, dH2O)

+ Dung dịch Destaining (Methanol, acid acetic, dH2O)

- Các hóa chất dùng chạy điện di ADN trên gel Agarose: Agarose 0,8%; đệm TAE (Tris-HCl, Acid acetic, EDTA); Loading dye; giấy parafilm; dung dịch Ethidium bromide

- Các hóa chất dùng tinh sạch RNase bằng sắc ký trao đổi ion: Đệm amonium acetat 0,05 M pH 5,0; NaCl của hãng Merck

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết rút enzym

Môi trường chiết rút enzym có thể là: các dung dịch đệm Tris-HCl có

pH trong vùng trung tính, đệm Citrat, dung dich H2SO4, các dung dịch saccaroza đẳng trương, ưu trương hay nhược trương Tuỳ từng mục đích mà

sử dụng môi trường chiết rút thích hợp [22]

Trong phạm vi của nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch H2SO40,25N và dung dịch đệm PBS 0,1M pH 7,4 để chiết rút RNase từ trứng cóc nhà/trứng ếch đồng Dung dịch H2SO4 0,25N có tác dụng vô hiệu hoá các enzym thuỷ phân có trong lizosom (bào quan giàu enzym trong các tế bào động vật) Theo nhiều tài liệu thì dung dịch acid này đã được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng để nghiền mô của động vật nhằm tách nhiều enzym trong đó

có RNase [1, 22] Dung dịch đệm PBS 0,1M có pH và thành phần ion (chứa

K+, Na+) gần giống với điều kiện trong tế bào

Trứng cóc nhà/trứng ếch đồng (10g) được nghiền bằng máy nghiền đồng thể với 50 ml dung dịch H2SO4 0,25N (có pH 1,2) hoặc 50 ml dung dịch đệm PBS 0,1M pH 7,4 Sau đó dịch nghiền được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C để loại cặn và thu dịch nổi, gọi là dịch chiết mô

Dịch chiết trứng cóc nhà/ trứng ếch đồng trong dung dịch H2SO4 được

ký hiệu là DCTCa/DCTEa Dịch chiết trứng cóc nhà/ trứng ếch đồng trong dung dịch đệm PBS được ký hiệu là DCTCb/DCTEb

2.2.2 Phương pháp thử tính bền nhiệt của RNase

Xử lý nhiệt là một phương pháp biến tính chọn lọc để loại bỏ những protein tạp kém bền nhiệt và giữ lại các protein bền nhiệt hơn bằng cách ly tâm Đây là một trong những phương pháp làm sạch nhanh enzym rất hiệu quả trong trường hợp các enzym bền nhiệt, vì vậy nghiên cứu tính bền nhiệt của enzym không chỉ cho phép đánh giá khả năng sử dụng xử lý nhiệt để làm

sạch enzym, mà còn giúp cho việc thao tác với enzym trong quá trình thực nghiệm được thuận tiện

Quá trình xử lý nhiệt được tiến hành như sau: Chuẩn bị 07 ống eppendorf 0,5ml chứa cùng một lượng thể tích 200 µl dịch chiết mô Đem xử

lý nhiệt các mẫu trên bằng cách sử dụng máy PCR để gia nhiệt trong 5 phút ở các giá trị nhiệt độ khác nhau: 400C, 500C, 600C, 700C, 800C, 900C và 1000C Sau đó các mẫu dịch được làm lạnh ngay bằng nước đá đang tan rồi ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C Loại bỏ cặn, thu dịch ly tâm và mang đi kiểm tra hoạt tính RNase còn lại bằng các phương pháp:

- Định tính hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ trên gel agarose

- Định lượng hoạt tính bằng đo OD260

Từ kết quả ta chọn được ống có hoạt tính tối ưu nhất (loại được nhiều protein tạp nhất nhưng vẫn giữ được hoạt tính)

Mẫu enzym ở 250C (t0 phòng) được dùng làm mẫu đối chứng để so sánh, hoạt tính của mẫu này được coi là 100%

Từ các kết quả xử lý nhiệt có thể kết luận được tính bền với nhiệt của dịch chiết RNase trong acid và trong đệm PBS Từ đó chọn được điều kiện nhiệt độ tối ưu để xử lý protein tạp đối với từng loại dịch chiết

2.2.3 Phương pháp tủa phân đoạn protein bằng muối amoni sulfat

Tủa phân đoạn protein bằng muối amoni sulfat là một phương pháp rất phổ biến trong tách chiết tinh sạch để nghiên cứu tính chất của protein Khả năng kết tủa của một protein phụ thuộc nhiều vào hình dạng và kích thước phân tử của nó Muối amoni sulfat là một muối trung tính vừa làm trung hòa điện tích (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm điện tích trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử keo làm cho phân tử protein kết tụ lại

Để tìm vùng nồng độ muối tối ưu để tủa RNase từ dịch chiết trứng cóc nhà/ếch đồng chúng tôi tiến hành phương pháp tủa phân đoạn protein ở các

vùng nồng độ muối amoni sulfat bão hòa khác nhau: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% và dịch chiết còn lại sau tủa 80%

Bảng 2.1: Bảng tính khối lượng muối amoni sulfat khan thêm vào[33]

(Tính cho 5ml thể tích dịch chiết mô)

% nồng độ amoni sulfat bão hòa

Khối lượng amoni sulfat khan thêm vào

- Để tiếp dịch trên đá trong 20 phút (không khuấy từ)

- Ly tâm lạnh ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, mẫu dịch tách thành 2 phần dịch nổi và tủa Rót phần dịch nổi vào ống Falcon sạch, phần tủa bảo quản lạnh

- Bổ sung tiếp lượng muối theo nồng độ ở bảng trên vào dịch nổi và tiến hành các bước tương tự tới nồng độ muối cuối cùng

- Tủa ở các nồng độ muối khác nhau được hòa trở lại trong 1ml đệm PBS pH 7,4 (đối với trường hợp dùng đệm PBS để chiết rút) hoặc 1ml dung dịch H2SO4 0,25N (đối với trường hợp dùng H2SO4 để chiết rút) Tất cả các mẫu dịch này được mang đi thẩm tích loại muối Đo hoạt tính các phân đoạn tủa protein sau khi thẩm tích (Định lượng hoạt tính bằng đo OD260, định tính

hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ gel agarose, định lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford) Từ đó chọn được phân đoạn protein có hoạt tính tốt nhất

2.2.4 Định tính hoạt tính của RNase bằng phương pháp đục lỗ trên gel agarose

Chuẩn bị gel Agarose 0,8%: Cân 0,8g Agarose, hòa tan bằng 100ml đệm TAE 1X (đun sôi) Dùng ống Falcon lấy ra 10ml gel Agarose nóng chảy,

bổ sung thêm 50µl dung dịch ARN nồng độ 10mg/ml, trộn đều Đổ gel Agarose đã trộn với ARN vào khuôn Để khoảng 20 phút cho gel đông lại Dùng ống hút đã khử trùng đục lỗ trên bản gel

Bơm 10µl/mẫu vào các lỗ đã đục theo thứ tự đã đánh dấu trước

• • •

• • •

•

Hình 2.1 Thứ tự các lỗ đục trên gel Agarose

- Đối chứng (-): dung dịch H2SO4 0,25N hoặc đệm PBS 0,1M pH 7,4 tương ứng với từng loại mẫu

- Đối chứng (+): dung dịch RNase A nồng độ 0,1mg/ml

Ủ bản gel ở 370C trong 30 phút Lấy bản gel ra nhuộm Ethidium bromid trong 7 phút, đem soi dưới ánh sáng tử ngoại

2.2.5 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford

Nguyên tắc của phương pháp Bradford: các protein (có chứa các acid amin vòng thơm như tyrosin, tryptophan, phenylalanin) khi phản ứng với

coomassie (coomassie brilliant blue - CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng

độ protein trong dung dịch Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài mg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian

- Xây dựng đường chuẩn albumin:

Từ dung dịch BSA gốc nồng độ 10 mg/ml pha loãng thành dãy nồng độ: 100µg/ml, 80µg/ml, 60µg/ml, 40µg/ml, 20µg/ml Hút 100µl mỗi loại nồng độ BSA trộn đều với 1ml dung dịch thuốc nhuộm Bradford Reagent Thiết bị đo quang phổ IMPLEN nanophotometer P330 cho phép tự động xây dựng đường chuẩn với chương trình Bradford cài sẵn Phương trình đường chuẩn có dạng: y = ax + b, giá trị độ lệch chuẩn R2 ≥ 0,96 cho phép kết quả

đo đạt độ chính xác từ 96% trở lên

- Đo mẫu:

Qua khảo sát, chúng tôi nhận thấy phải pha loãng mẫu cần đo 300 lần

để có nồng độ protein tổng số nằm trong giới hạn cho phép của phép đo (mẫu phải có nồng độ protein tổng số ≤ 100µg/ml)

Hút 100µl/mẫu đã pha loãng trộn đều với 1ml dung dịch thuốc nhuộm Bradford Reagent Theo khuyến cáo của nhà sản xuất nên đo trong khoảng thời gian từ 2 đến 60 phút sau khi trộn mẫu với thuốc nhuộm Bradford Reagent để có kết quả chính xác nhất

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính RNase

- Nguyên lý: ARN hấp phụ cực đại ở bước sóng 260 nm Độ hấp phụ (OD260) phụ thuộc vào nồng độ của ARN Khi có mặt, RNase sẽ thuỷ phân ARN thành các oligonucleotide làm mật độ quang học tăng lên Dựa vào sự thay đổi OD260 ta đo được hoạt tính enzym

- Một đơn vị (đv) hoạt tính RNase là lượng RNase xúc tác phản ứng thuỷ phân ARN tổng số trong những điều kiện tiêu chuẩn xác định làm tăng

mật độ quang học của dịch phản ứng (OD260) lên 0,01 đv OD sau thời gian phản ứng là 60 giây

OD260 được đo trực tiếp trên máy quang phổ IMPLEN nanophotometer P330 và hoạt tính RNase được tính theo công thức:

A = OD260 (E+S) tại 60s x 100 (đv hoạt tính) Mẫu dùng để Blank chính là hỗn hợp phản ứng enzym + cơ chất tại thời điểm 0 giây

Hoạt tính riêng của enzym (A0) được xác định bằng số đơn vị hoạt tính của enzym/µg protein [1] Hàm lượng protein tổng số được xác định bằng phương pháp Bradford

Trước khi đo hoạt tính RNase cần phải khảo sát sơ bộ động học của enzym để xác định khoảng tuyến tính của OD260 (nghĩa là phải thỏa mãn điều kiện giá trị OD260 tăng dần đều trong khoảng thời gian 60 giây kể từ khi trộn dung dịch cơ chất với dung dịch enzym) Ưu điểm của thiết bị quang phổ IMPLEN nanophotometer P330 là có thể đo mẫu với thể tích cực nhỏ với ứng dụng NanoVolume Applications (cỡ 1µl đến 2µl mẫu khi sử dụng Lid 10, 1mm), trả kết quả cực nhanh với độ chính xác rất cao Ngoài ra với ứng dụng Kinetic cài sẵn cho phép khảo sát sơ bộ động học của enzym Các bước thực hiện như sau:

- Pha dung dịch cơ chất ARN:

Pha dung dịch ARN mẹ có nồng độ 10mg/ml: cân 10mg ARN nấm men, hòa tan vào 1ml nước UltraPure Distilled, ly tâm tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ các thành phần không tan do trong quá trình sản xuất tạo ra Từ dung dịch ARN mẹ nồng độ 10mg/ml tiến hành pha loãng 10 lần để được nồng độ 1mg/ml

- Xác định tỷ lệ thể tích cơ chất ARN nồng độ 1mg/ml và thể tích mẫu (chứa RNase) cho vào tham gia phản ứng bằng cách khảo sát dãy tỷ lệ thể tích

cơ chất/enzym sau đây với tổng thể tích tham gia phản ứng là 100 µl:

V ARN 99 µl 90 µl 80 µl 70 µl 60 µl 50 µl 40µl 30µl 20µl 10µl

VMẫu 1 µl 10 µl 20 µl 30 µl 40 µl 50 µl 60µl 70µl 80µl 90µl Cài đặt các thông số để khảo sát động học enzym như sau: Truy cập vào ứng dụng Kinetic; chọn Lid 10; chọn OD 260; chọn tự động đo OD liên tục, đặt mỗi lần đo cách nhau 5 giây; đặt tổng thời gian khảo sát là 60 giây Hút thể tích cơ chất ARN và mẫu chứa RNase theo dãy tỷ lệ trên vào ống eppendorf 200µl, trộn đều, hút ngay 2µl hỗn hợp phản ứng để Blank, đồng thời giữ nguyên bấm nút để đo OD Máy sẽ tự động đo giá trị OD260 liên tục theo các thông số đã cài đặt, đồng thời vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giá trị

OD260 theo thời gian thực Chọn mẫu có giá trị OD260 tăng đều trong khoảng giới hạn của phép đo (máy chỉ có thể đo được OD260 ≤ 2,5) trong thời gian 60 giây

Kết quả khảo sát chúng tôi thấy với tỷ lệ thể tích cơ chất/thể tích enzym

= 9:1 là phù hợp với khoảng tuyến tính của sự tăng OD260, đồng thời nằm trong khoảng giới hạn của phép đo và cũng là để tiết kiệm mẫu enzym

2.2.7 Xác định sơ bộ băng RNase bằng phương pháp điện di Polyacrylamid không biến tính kết hợp ép gel agarose

a) Điện di protein không biến tính

Các phân đoạn protein thu được sau khi tủa bằng muối amoni sulfat được mang đi điện di protein không biến tính Quy trình thực hiện như sau:

Công thức pha gel polyacrylamid không có SDS (tính cho 01 bản):

- Hút 10µl/mẫu vào các giếng (dùng lược 10 giếng) theo thứ tự:

Tủa 10% -> Tủa 20% -> Tủa 30% -> Tủa 40% -> Marker màu -> Tủa 50% -> Tủa 60% -> Tủa 70% -> Tủa 80% -> Dịch còn lại sau tủa 80%

- Lắp đặt điện cực, cài đặt theo thông số: 22 mA giai đoạn chạy gel cô, 42mA giai đoạn chạy gel tách (khi chạy 02 bản gel cùng một lúc)

Chạy đến khi vạch xanh lá cây của marker màu gần chạm mép dưới cùng của bản gel thì dừng lại Thảo bản gel ra mang đi ép lên gel agarose

b) Ép gel agarose

- Chuẩn bị gel agarose 0,8%:

Đun chảy gel agarose 0,8%, dùng ống falcon lấy ra 25ml, chờ cho gel nguội bớt, bổ sung thêm 150µl dung dịch ARN nồng độ 10mg/ml, trộn đều và

đổ vào khuôn Chờ khoảng 20 phút cho gel đông lại hoàn toàn Lấy bản gel ra khỏi khuôn cho vào đĩa petri

- Ép gel agarose:

Đặt bản gel polyacrylamid lên trên gel agarose, dùng dao cắt gel agarose sao cho vừa bằng với gel polyacrylamid, ủ ở 370C trong 30 phút Lấy bản gel polyacrylamid ra, gel agarose mang đi nhuộm ethidium bromid trong

7 phút, rửa qua bằng nước deion, đặt lên bàn soi đèn tử ngoại Đặt lại gel polyacrylamid lên trên agarose, bật đèn tử ngoại để xác định băng RNase