Nghiên cứu vai trò của alginat trong quá trình tạo nguyên liệu probiotics chứa lactobacillus acidophilus

acidophilus với tá dược bảo vệ khác nhau theo thời gian 34 Bảng 3.5 Hàm ẩm của các mẫu đông khô với tá dược bảo vệ là hỗn hợp sữa gầy với alginate ở các nồng độ 40 Bảng 3.6 Số lượng vi s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NINH THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALGINAT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN

LIỆU PROBIOTICS CHỨA

Lactobacillus acidophilus

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NINH THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA ALGINAT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN

LIỆU PROBIOTICS CHỨA

1.2.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm

probiotics trên thế giới

1.3.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý 10

1.3.2 Khả năng chuyển hóa carbohydrat 11 1.3.3 Các dạng chế phẩm probiotics chứa L acidophilus 11

1.4.3 Một số nghiên cứu sử dụng alginate trong bào chế probiotics 13

1.5.1 Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô 16

1.5.3 Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 16

1.6.1 Đặc điểm dạng thuốc nang cứng 19

1.6.2 Đánh giá chất lượng nang cứng 20 Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

21

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 21 2.1.1 Nguyên vật liệu sử dụng 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối 23

2.2.3 Phương pháp đông khô 24

2.2.4 Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall 25

2.2.5 Phương pháp tạo thuốc bột chứa L acidophilus 25

2.2.6 Phương pháp tạo nang cứng chứa L acidophilus 25 2.2.7 Phương pháp xác định hàm ẩm 25

2.2.8 Phương pháp xác định số lượng VSV theo nguyên tắc pha loãng

liên tục

26

2.2.9 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống 27

sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột

2.2.10 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của alginate đến khả năng

sống sót của Lactobacillus acidophilus trong quá trình đóng thuốc nang

cứng

28

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi

khuẩn Lactobacillus acidophilus trong quá trình đông khô

30

3.1.1 Đánh giá thể chất của các nguyên liệu chứa Lactobacillus

acidophilus tạo thành sau khi đông khô

30

3.1.2 Đánh giá độ ẩm và tốc độ hút ẩm của các mẫu đông khô vi sinh

vật với tá dược bảo vệ là sữa gầy và alginate

33

3.1.3 Khảo sát số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sống sót

sau đông khô

36

3.1.4 So sánh khả năng sống sót của vi sinh vật trong nguyên liệu đông

khô có và không có kết hợp alginate và sữa gầy

39

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi

khuẩn Lactobacillus acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột và đóng

nang cứng

42

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi

khuẩn L acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột

43

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi

khuẩn L acidophilus trong quá trình tạo nang cứng

45

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Cfu (Colony- Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc

FAO (Food and Agriculture Organization) : Tổ chức nông lương thế giới Glass : một trạng thái nhiệt động quá bão hòa không bền với độ nhớt cao

HDL (High density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng cao

IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn bơ sữa thế giới

L acidophilus : Lactobacillus acidophilus

LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn lactic

LDL (Low density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng thấp MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

PPI (Proton Pump Inhibitor) : Ức chế bơm proton

S boulardii : Saccharomyces boulardii

WHO (World Health Organization) : Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thể chất của các mẫu đông khô L acidophilus với các tá

dược bảo vệ tại thời điểm ngay sau khi đông khô

31

Bảng 3.2 Biến thiên hàm ẩm (%) của một số mẫu đông khô L

acidophilus với tá dược bảo vệ khác nhau theo thời gian

34

Bảng 3.5 Hàm ẩm của các mẫu đông khô với tá dược bảo vệ là hỗn

hợp sữa gầy với alginate ở các nồng độ

40

Bảng 3.6 Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột sau đông khô

trong các mẫu đông khô sử dụng kết hợp alginate và sữa

gầy

41

Bảng 3.8 Số lượng vi sinh vật sống sót trong 1 viên nang trong môi

trường acid HCl pH 1,2 với tốc độ khuấy 50 v/phút

45

Bảng 3.9 Tỷ lệ vi sinh vật sống sót của mẫu alginate so với mẫu tinh

bột trong môi trường pH 1,2

46

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- D-

mannuronic

12

Hình 3.2 Đồ thị biểu thị hàm ẩm trung bình của các mẫu ngay sau

đông khô và trong thời gian bảo quản

34

Hình 3.3 Hình ảnh mẫu đông khô với alginate ngay sau khi tháo khỏi

máy và sau 3 phút để ngoài môi trường

35

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn L acidophilus sống sót

trong các mẫu sau đông khô

38

Hình 3.5 Hàm ẩm của các mẫu đông khô với tá dược bảo vệ là hỗn

hợp sữa gầy với alginate ở các nồng độ

40

Hình 3.6 Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột sau đông khô

trong các mẫu đông khô sử dụng kết hợp alginate và sữa gầy

42

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện số lượng vi sinh vật sống sót sau khi thử

trong môi trường acid HCl pH 1,2

44

Hình 3.8 Số lượng vi sinh vật sống sót trong 1 viên nang trong môi

trường acid HCl pH 1,2 với tốc độ khuấy 50 v/phút

46

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và long biết ơn sâu sắc tôi xin g i l i c ơn ến TS Đàm

Thanh Xuân và ThS Nguyễn Thị Trinh Lan, nh ng ng i th t n t nh h ớng n

và ch b o cho tôi t nh ng b ớc u ti n cho ến khi tôi hoàn thi n lu n văn nà

Đồng th i, tôi xin g i l i c ơn tới Ds Lê Ngọc Khánh cùng các th cô giáo, các anh chị kỹ thu t vi n trong bộ ôn Công Nghiệp Dược tạo ọi iều ki n giúp ỡ

tôi trong suốt quá tr nh thực hi n ề tài, ch b o tôi trong th i gian là thực nghi

hân ịp nà tôi c ng xin g i l i c ơn ến an giá hi u c ng toàn th các

th cô giáo tr ng Đại học c à ội ạ và tạo ọi iều ki n thu n l i cho tôi trong th i gian tôi học t p tại tr ng

Và cuối c ng là l i c ơn tôi g i tới Mẹ của tôi, gia nh, ng i thân và bạn b ộng vi n, giúp ỡ tôi trong suốt quá tr nh học t p và hoàn thành lu n văn tốt nghi p

o th i gian là thực nghi c ng nh kiến th c của b n thân c hạn, kh a lu n

nà c n c nhiều thiếu s t ôi r t ong nh n c sự g p của các th cô, bạn b

kh a lu n c hoàn thi n hơn

ôi xin chân thành c ơn

à ội, ngà 30, tháng , nă

ọc viên

s inh hị Kim Thu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotics thuộc nhóm các vi sinh vật sống không thể thiếu đối với sức khỏe con người Những vi sinh vật này đưa vào cơ thể khi còn sống với một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ Chúng thường được bổ sung kèm với chế độ ăn hoặc qua các chế phẩm chứa probiotics

Vi sinh vật hay được sử dụng nhất trong các chế phẩm probiotics là

nhóm vi sinh vật sinh acid lactic, mà trong đó điển hình là Lactobacillus

acidophilus

Tuy nhiên, probiotics kém ổn định do bất lợi của điều kiện bảo quản cũng như hàng rào sinh học của vật chủ Do vậy, các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới hiện nay đều được thực hiện với mục tiêu giúp ổn định

vi sinh vật Trong đó, alginat là tá dược được nghiên cứu nhiều nhất trên thế giới Nhưng trong nước các nghiên cứu về tá dược này còn rất hạn chế

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

N a alginat o q á ì ạo y l ệ

p ob o s Lactobacillus acidophilus”

Với các mục tiêu:

alginat

alginat

ộ à

C ươ 1 TỔNG QUAN 1.1 Đạ ươ ề probiotics

1.1.1 Khái niệm

Probiotics bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “sự sống” Khái niệm probiotics đầu tiên xuất phát từ nhà khoa học Eli Metchnikoff, trong cuốn sách “Kéo dài sự sống” của ông đưa ra 1908 Ông cho rằng những người nông dân Bulgary sống lâu là vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa vi khuẩn lactic, các vi khuẩn này có lợi cho vi sinh vật đường ruột [55]

Thuật ngữ “probiotics” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi Kollath Probiotics được định nghĩa là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn, kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác” [55]

Năm 1974, Parker đã phát triển định nghĩa này, ông cho rằng probiotics

là “những vi sinh vật và những cơ chất giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột” Sau đó đến năm 1989, Fuller đã thay đổi định nghĩa này, ông cho rằng probiotics là “thực phẩm” bổ sung một số vi sinh vật sống có ích cho vật chủ nhằm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột của nó Định nghĩa này nhấn mạnh vai trò khả năng sống của vi sinh vật Năm 1998, Salminen đã định nghĩa probiotics là “những thực phẩm chứa vi khuẩn sống ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ” Năm 2002 Marteau đã định nghĩa probiotics hoàn chỉnh hơn

“probiotics là những chế phẩm chứa tế bào vi sinh vật hay những thành phần của tế bào vi sinh vật mà ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ” [23], [55]

Năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Lương thực thế giới (FAO) đưa ra định nghĩa probiotics được coi là hoàn chỉnh nhất hiện nay:

“Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với lượng phù hợp sẽ đem lại lợi ích cho sức khỏe của sinh vật chủ” [23], [55]

1.1.2 Các vi sinh vậ ợc sử dụng trong ch ph m probiotics

Probiotics được chia làm 3 nhóm chính sau [6]:

- Nhóm vi khuẩn lactic (chiếm phần lớn): gồm 2 chi phổ biến là chi

Lactobacillus và Bifidobacterium

- Nhóm không phải vi khuẩn lactic:

+ Chi Propionibacterium: P freudenreichii, P cyclohexanicum,

+ Chi Bacillus: B subtilis, B clausii,

+ Chi Brevibacillus: B laterosporus,…

+ Chi Sporolactobacillus: S laevolacticus,…

+ Chi Escherichia: E coli,

- Nhóm nấm men: chủ yếu là chi Saccharomyces cerevisiae

Việc lựa chọn các vi sinh vật trên dùng làm nguyên liệu probiotics đều phải dựa vào các tiêu chí sau:

 Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ

 Chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non

 Không sinh độc tố và không gây bệnh cho vật chủ

 Có khả năng sinh enzym, chất kháng sinh hoặc các sản phẩm cuối cùng

mà vật chủ có thể sử dụng được

 Có khả năng sống và cư trú trong ruột

 Dễ nuôi cấy và có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài

L acidophilus là trực khuẩn chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật có

ích cư trú ở đoạn trên của ống tiêu hóa Nó có khả năng làm giảm số lượng các vi sinh vật hoặc nấm có hại ở ruột non; có khả năng sinh lactase - một enzym quan trọng trong chuyển hóa sữa; có liên quan đến quá trình sản xuất một số vitamin nhóm B như: niacin, acid folic, pyridoxin; tăng cường chức năng của hệ thống miễn dịch; giảm sự tiêu diệt vi sinh vật có ích do sử dụng kháng sinh dài ngày.[6]

Với các đặc điểm trên, L acidophilus là vi sinh vật được lựa chọn đầu

tiên để sản xuất các chế phẩm probiotics

1.1.3 Cơ tác dụng c a probiotics

1.1.3.1 Cơ tác dụng [3],[4],[6],[7]

- Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám: Probiotics cạnh tranh chất dinh

dưỡng và năng lượng với các vi khuẩn gây bệnh để duy trì và phát triển Bằng cách chiếm lĩnh và bám chặt vào thành ruột, probiotics ngăn ngừa các vi khuẩn có hại tấn công và phát triển

- Tăng cường chức năng chống đỡ của niêm mạc ruột: Probiotics sống

tại đường ruột cũng đồng thời tăng cường chức năng chống đỡ của niêm mạc ruột và giảm thiểu sự di chuyển của các vi khuẩn và kháng nguyên từ ruột vào mạch máu Chức năng này giúp giảm sự nhiễm khuẩn và dị ứng đối với các kháng nguyên có trong thực phẩm

- Sản sinh ra các chất ức chế: Một số probiotics sản sinh ra các kháng

sinh như bacteriocins giúp ngăn ngừa và tiêu diệt mầm bệnh Trong quá trình lên men đường, các thành phần khác nhau của probiotics sản sinh ra acid lactic giúp làm giảm pH của ruột và ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn không cần thiết Một số sản phẩm sinh ra trong quá trình trao đổi chất, quá trình lên men chuyển hóa carbohydrat như butyrat và acid butyric có khả năng chống ung thư

- Kích thích đáp ứng miễn dịch: Probiotics có khả năng làm tăng cả

phản ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằng cách kích thích các tế bào phản ứng miễn dịch (macrophases, lymphocytes) và tăng cường sự sản xuất ra các thành phần miễn nhiễm (cytolines, immunoglobulins, interferon)

- Tăng cường chức năng tiêu hóa: Probiotics trong ruột non giúp giảm

lượng mật trong cơ thể và giảm cholesterol Probiotics sản sinh ra các enzym khắc phục quá trình tiêu hủy carbohydrate và làm thuận tiện hơn quá trình ruột hấp thụ năng lượng từ các chất dinh dưỡng Probiotics cũng đồng thời lên

men những carbohydrat không tiêu hóa được trong ruột non và sản xuất ra

vitamin B, K

1.1.3.2 Ứng dụng c a probiotics:

Probiotics được ứng dụng:

 Trong các bệnh tiêu hóa [16], [20], [27]

- Tăng khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzym khác

- Hỗ trợ trong điều trị tiêu chảy do sử dụng kháng sinh

- Tác dụng lên Helicobacter pylori

 Tăng cường miễn dịnh [22], [39]

- Kích thích miễn dịch niêm mạc

- Tăng cường miễn dịch, giảm phản ứng dị ứng

- Giảm nguy cơ nhiễm vi khuẩn, nấm

- Giảm nguy cơ mắc ung thư

 Chống tăng huyết áp, giảm cholesterol máu [14], [26]

 Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

1.2 Tình hình nghiên c u và sử dụng probiotics trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên c u s n xuất và sử dụng các ch ph m probiotics trên th giới

Việc sử dụng thực phẩm có probiotics (như 1 thành phần tự nhiên của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotics mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thể kỷ 20 Những nghiên cứu về đặc điểm phân loại và quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởi Apajalahti và cs (1998) [13]; Vander Wielen và cộng sự (2000) [49] đã

cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus Bằng kỹ thuật gen,

các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài vi sinh

vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn probiotics Netherwood và cs (1999) [38]; Gong và cs (2002) [23]; Zhu và cs (2002) [54]

đã sử dụng kỹ thuật gen để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của probiotics Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên một

hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotics đối với đời sống động vật như tác động của probiotics đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Mayer, 1991)[46]; (Hersbberg và Mayer, 2000) [25] đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (McCracken và Lorenz, 2001) [37]

Những ảnh hưởng có lợi của probiotics thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotics còn rất hạn chế Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotics trong việc

ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh ), cạnh tranh vị trí bám dính

ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột [22], [40]

Đa phần các sản phẩm probiotics sử dụng theo đường uống, chúng phải chịu tác dụng của dịch vị, cũng như của acid mật vì thế vi sinh vật bị chết rất nhiều và không đến ruột được hoặc đến ruột với số lượng rất ít không đủ gây tác dụng Việc đảm bảo khả năng sống sót của vi sinh vật probiotics trong sản xuất, bảo quản, lưu hành, và tỉ lệ sống sót cao khi đến ruột không đơn giản, do vậy đã có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau như cải tiến phương pháp đông khô tạo bột [32], [33], áp dụng phương pháp lên men 2 bước, phương pháp vi nang hóa [15], [21], phương pháp sử dụng kết hợp với tá dược bảo vệ [41],

[42] Việc bảo vệ các vi sinh vật probiotics để chúng sống sót và phát huy tác dụng khi đến ruột là một vấn đề quan trọng và đang được giải quyết

1.2 T x ấ à ử ụ m

V ệ am

Ở nước ta, các chế phẩm probiotics đã chiếm lĩnh thị trường hơn 10 năm; tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất probiotics phục vụ cho đời sống còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây Đến nay, trên thị trường nước ta đã có mặt các sản phẩm probiotics của bốn thế hệ bào chế như sau: [6]

VSV gần như không sống sót khi qua dạ dày

và dịch mật

cấy, sản xuất, lưu hành

Mất nhiều thời gian phát triển thành VSV → chậm tác dụng, hạn chế khả năng cạnh tranh với VSV gây bệnh

Mất thời gian màng bao tan rã để giải phóng VSV

Đòi hỏi công nghệ cao,

kỹ thuật bào chế hiện đại, trang thiết bị đắt tiền

Giá thành cao

Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotics ở nước ta là Công ty TNHH một thành viên Pasteur Đà Lạt, Công ty TNHH một thành viên vaccin

và sinh phẩm Nha Trang, với một số chế phẩm quen thuộc trên thị trường như

Enzym biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio, Healthy liver Tuy nhiên,

nguyên liệu chủ yếu trong các chế phẩm probiotics của Công ty TNHH một thành viên Pasteur Đà Lạt cũng như công ty TNHH một thành viên vaccin và

sinh phẩm Nha Trang đều là chủng vi sinh vật Bacillus subtilis Và mới đây

đã xuất hiện thêm công ty ANABIO R$D, có nhà máy sản xuất nguyên liệu probiotics hiện đại không kém so với các nước trên thế giới Ngoài việc sản xuất nguyên liệu probiotics cổ điển trong nước như nguyên liệu chứa chủng vi

sinh vật Bacillus subtilis, ANABIO còn có thêm nguyên liệu chứa các chủng

vi sinh vật lactic Do vậy, thị trường chế phẩm probiotics không chỉ lớn về số lượng mà còn đa dạng về chủng loại vi sinh vật, đồng thời giá thành sản phẩm các chế phẩm probiotics đã được hạ nhiều lần, người sử dụng có thể sử dụng

sản phẩm chất lượng cao mà giá thành lại rẻ Tuy nhiên, sản phẩm ở đây vẫn chủ yếu thuộc thế hệ 1 nên khả năng bảo vệ VSV vẫn còn rất thấp (Bảng 1.2.)

B ng 1.2: Một số chế phẩm probiotics trên thị trường Việt Nam

II Dong - Hàn Quốc

men Saccharomyces cerevisiae

L Imexpharm –

acidophilus Việt Nam

acidophilus

Dae Han New Pharm – Hàn Quốc

Lactic Acid Bacteria 0,5 x 109, L

acidophilus (100 tỉ cfu/g), B

longum (50 tỉ cfu/g), B breve (50

tỉ cfu/g), Enterococcus faecium

(100 tỉ cfu/g)

Cell-biotech – Hàn Quốc

1.3 Lactobacillus acidophilus

1.3.1 Đặ ểm hình thái, sinh lý

L acidophilus thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic, là trực khuẩn

Gram dương, kích thước từ 0,6 – 0,9 × 1,5 – 6,0 µm, mọc đơn hoặc đôi hoặc tạo chuỗi ngắn, không có bào tử, không di động, kỵ khí không bắt buộc, phản

ứng catalase âm tính, phát triển tối ưu ở 370

C, không phát triển ở 20 – 220C hoặc ở nhiệt độ cao hơn 480C [4], [12], [44]

Hình 1.1: Hình ảnh L acidophilus trên kính hiển vi điện tử

1.3.2 Kh yển hóa carbohydrat

L acidophilus chuyển hóa glucose, lactose, sucrose sinh acid lactic,

nhưng không sinh khí; không chuyển hóa glycerol, erythritol, D-arabinose, arabinose, D-ribose, D-xylose [6], [12]

L-1.3.3 Các dạng ch ph m probiotics ch a L acidophilus

Trên thị trường dược phẩm hiện nay, các chế phẩm chứa L acidophilus

chủ yếu là dược phẩm và thực phẩm chức năng bào chế dưới dạng bột, cốm, nang cứng

Khác với chế phẩm khác, chế phẩm probiotics phải duy trì số lượng VSV sống sót nhất định trong thời hạn sử dụng cũng như trong hệ thống tiêu hóa của người sử dụng Do đó, phương pháp sản xuất và thành phần chế phẩm probiotics được cải biến khác so với chế phẩm thông thường

Về thành phần, chế phẩm probiotics thường có thêm các tá dược bảo vệ như chất xơ, đường,…

Về phương pháp sản xuất nguyên liệu, hiện nay có rất nhiều phương pháp sản xuất nhằm tăng khả năng bảo vệ VSV Điển hình là phương pháp bẫy bằng cách tạo vi nang [21], phương pháp phun sấy [15],…Trong đó, một trong những phương pháp tỏ ra hiệu quả và được sử dụng nhiều là phương

pháp đông khô Phương pháp đông khô giúp cho VSV ổn định và giúp VSV

có tỷ lệ sống sót cao trong thời gian bảo quản [17]

1.4 Alginate

1.4.1 Tính chất

Alginate có nguồn gốc chủ yếu là từ tảo nâu, rong mơ Alginate là tên chỉ chung acid alginic và 1 số muối của nó như natri alginate, kali alginate Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M).[43]

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- D-

mannuronic

Tùy theo nguồn gốc của alginate mà độ dài trung bình của mạch phân

tử, độ dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau Điều này làm cho tính chất của alginate biến đổi trong một dải rộng

Muối natri của acid alginic dễ hút ẩm, tuy nhiên khá ổn định nếu được bảo quản trong điều kiện mát mẻ và độ ẩm tương đối thấp Dung dịch Natri alginate ổn định nhất ở pH 4÷10, ở pH < 3 acid alginic bị kết tủa lại, hấp tiệt khuẩn có thể làm giảm độ nhớt của dung dịch [24], [43], [50]

Thực tế natri alginate không tan trong ethanol (95%), ether, chloroform, và hỗn hợp ethanol nước có chứa hơn 30% ethanol Không tan trong các dung môi hữu cơ khác và trong dung dịch acid có pH<3 Tan chậm trong nước, tạo dung dịch keo nhớt [43], [18]

Tùy theo nguồn gốc của phương pháp sản xuất mà natri alginate có độ nhớt khác nhau, dao động từ 10 ÷ 3000.u Thông thường độ nhớt của dung dịch natri alginate 1% (kl/tt) có độ nhớt khoảng 20-400 mPas Độ nhớt của natri alginate thay đổi theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của các ion kim loại [43] Dung dịch natri alginate 1% với dung môi nước có pH đạt 7,2 [43]

1.4.2 Ứ ụ

Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginate được sử dụng làm tá dược rã, tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng trong bào chế viên giải phóng kéo dài Natri alginate còn được sử dụng làm tá dược độn trong dạng viên nang, tá dược tăng độ nhớt, ổn định thể chất trong các chế phẩm dạng kem, gel, bột nhão dùng tại chỗ, chất nhũ hóa giúp ổn định thể chất nhũ tương, hỗn dịch Trong thời gian gần đây natri alginate được sử dụng

để bào chế dạng vi nang và siêu vi nang chứa dược chất, hay được sử dụng trong một số dạng chế phẩm tác dụng tại chỗ khác như thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi [43] Trong công nghệ vi sinh, alginate được sử dụng trong kĩ thuật bất động tế bào và bất động enzym, ngoài ra hiện nay nó đang được nghiên cứu ứng dụng để tạo vi nang chứa vi sinh vật để tăng khả năng sống của chúng

trong các điều kiện bất lợi [21], [31], [41]

Trong ngành y tế, loại vải sợi sản xuất từ natri và calci alginate được sử dụng để băng vết thương, cầm máu và làm vết thương mau lành hơn Ngoài

ra, do tính trương nở trong nước và khả năng bám dính của dạng gel trong

nước, natri alginate được sử dụng trong một số thuốc dùng để ngăn cản trào ngược dạ dày- thực quản, giảm chứng ợ hơi… [43]

1.4.3 Mộ ử ụ alginate à s

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu tìm ra phương pháp và tá dược thích hợp nhằm cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn probiotics ngày càng được quan tâm Một số nghiên cứu gần đây về vi nang hóa vi sinh vật bằng việc kết hợp dung dịch alginate với dung dịch CaCl2 đã làm gia tăng

số lượng VSV sống sót trong các điều kiện bất lợi như: nhiệt độ cao, acid thấp

dạ dày, muối mật [21], [31], [43] Latha Sabikhi đã thực hiện nghiên cứu

năm 2010 về đánh giá khả năng bảo vệ L acidophilus trong chế phẩm

probiotics bằng phương pháp tạo vi nang với alginate Với nguyên liệu ban

cfu/g, mẫu không được bảo vệ đều có số lượng sống sót

÷106 cfu/g (giảm khoảng 1000 lần), còn với phương pháp tạo vi nang thì sau 1h trong pH 1 số

lượng Lactobacillus acidophilus LA1 giảm từ 107 cfu/g lúc ban đầu xuống

cfu/g (nghĩa là giảm khoảng 10 lần), sau 2h trong điều kiện

cfu/g (giảm 100 lần so với ban đầu) Còn trong thí nghiệm có sử dụng alginate làm tá dược độn thì sau 1h trong môi trường acid HCl pH 1,2 số lượng vi sinh vật giảm từ 1,7 x

cfu/g (giảm khoảng 155 lần so với ban đầu) [31]

Một số nghiên cứu khác lại cho thấy việc tạo nang cứng với các muối alginate của các kim loại hóa trị một (muối natri alginate hoặc kali alginate) cũng cho tác dụng bảo vệ vi sinh vật Randolph Stanley Porubcan nghiên cứu tạo nang cứng probiotics chứa natri alginate với hàm lượng biến thiên từ 10% đến 99% Kết quả của nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phối hợp tối ưu này là 20 ÷

60% Cũng theo nghiên cứu của Randolph Stanley Porubcan, số lượng VSV

bị chết trong môi trường acid pH 1,6 không nhiều, cụ thể trước khi thử trong

môi trường acid pH 1,6 trong 90 phút số lượng cfu/ nang không chứa alginate nhỏ hơn 104, còn số lượng cfu/ nang chứa alginate là 4x108 Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khi sử dụng alginate làm tá dược độn trong nang cứng đã làm gia tăng tỷ lệ VSV sống sót trong môi trường acid pH thấp [42]

1.5 P ươ p áp đô k ô

Đông khô được định nghĩa như là một quy trình tạo sự ổn định mà trong

đó vật cần đông khô được làm đông lạnh trước, tiếp theo lượng dung môi có trong vật (dung môi thường là nước) được loại đi nhờ quá trình thăng hoa, sau

đó là quá trình khử ẩm liên kết còn lại đến giá trị mà sẽ không thể khiến VSV phát triển hoặc xúc tác các phản ứng hóa học [17], [32]

Đông khô gồm có 3 giai đoạn chính: tiền đông, thăng hoa và làm khô

 G đoạ ề đô

Tiền đông là giai đoạn đầu tiên của quá trình đông khô, thường được tiến hành ở nhiệt độ -700C đến -800

C Ở giai đoạn này phần lớn nước được tách

ra khỏi dược chất và tá dược, hệ tách thành nhiều pha Kết thúc giai đoạn này, có thể có trạng thái kết tinh, vô định hình hoặc kết tinh kết hợp với vô định hình [17], [11]

 G đoạ ă o

Ở giai đoạn này vật được đặt trong buồng sấy, tiến hành hút chân không Nước được chuyển trực tiếp từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua giai đoạn lỏng Trong giai đoạn này nhiệt độ và áp suất bên trong buồng sấy được duy trì ở mức dưới nhiệt độ đóng băng [17], [11]

 Giai đoạ làm k ô

Ở giai đoạn này nhiệt độ tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết và ở trạng thái lỏng Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết bị sấy chân không bình thường Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [11]

1.5.1 Ư ợ ểm ơ

Đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác như: Giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; Giữ được hoạt tính sinh học; Bảo vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin… Giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ nước để trở lại trạng thái ban đầu Tuy nhiên, phương pháp đông khô cũng

có những nhược điểm riêng khiến nó chưa được sử dụng rộng rãi: giá thành thiết bị cao; vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao; tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao [11]

1.5.2 Ứ ụ

Do những ưu nhược điểm ở trên nên phương pháp đông khô chỉ được áp dụng trên các sản phẩm có yêu cầu chất lượng cao, đồng thời kém bền với nhiệt độ cao Trong ngành Dược được ứng dụng để sản xuất các bột đông khô

để pha tiêm (ví dụ: kháng sinh penicillin, cephalexin…), làm khô các chế phẩm sinh học như albumin, vi sinh vật Ngoài ra đông khô cũng được sử dụng như một phương pháp bảo quản trong ngành công nghiệp thực phẩm để bảo quản 1 số sản phẩm khác

1.5.3 C ợ ệ ờ ù ậ

Quá trình đông khô vi sinh vật tuy có nhiều ưu điểm nhưng nó cũng là

1 trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót trong quá trình tạo nguyên liệu và chế phẩm probiotics Đặc biệt giai đoạn tiền đông là nguyên nhân gây lên áp lực cho thành tế bào vi khuẩn Đông lạnh làm cho lớp lipid màng tế bào dễ bị tổn thương Một nghiên cứu khác lại cho rằng sự thay

đổi hình thái tự nhiên của lipid màng và sự thay đổi cấu trúc của các protein nhạy cảm là nguyên nhân chính gây ra sự suy giảm số lượng tế bào trong quá trình đông khô [29] Một số tài liệu lại cho rằng chính việc hình thành tinh thế

đá nội phân tử có thể là nguyên nhân gây phá vỡ màng tế bào Các tá dược bảo vệ được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm: bảo

vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của vi sinh vật trong quá trình làm khô [32]

Một trong những phương pháp được sử dụng để gia tăng sự sống sót của vi sinh vật trong quá trình này là bổ sung vào nguyên liệu đông khô các tác nhân bảo vệ Các tác nhân này nhằm bảo vệ tế bào vi sinh vật trong quá trình đông khô Các tá dược chia thành các nhóm chính sau: nhóm carbohydrate (surcrose, lactose, trehalose, maltose, glucose, galactose, raffinose), nhóm polymer (gelatin, xanthan gum, maltodextrans, dextran…), nhóm protein (sữa gầy, trypsin, pepton, trytone, cao thịt,…), polyols (mannitol, glycerol, sorbitol, butanol,…), nhóm amino acid (Na glutamate, proline, glutamate,…), nhóm chống oxy hóa (acid ascorbic, Na thiosulfate,…)

và một số tá dược bảo vệ khác như mật ong, Na acetate, Ca chloride,…[17]

Cơ chế bảo vệ của các nhóm tá dược này trong quá trình đông khô được tóm tắt trong bảng 1.3 [17]:

B 3: Cơ chế bảo vệ của tá dược trong quá trình đông khô

lipid kép

protein thành acid amin, vitamin, làm tăng khả năng đệm

 Sữ ầy

Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành phần có chứa không quá 0,5 % chất béo (trong khi sữa nguyên chất chứa hàm lượng chất béo khoảng 3,5%, sữa tách bơ-butter milk chứa khoảng 1% chất béo)

Sữa gầy có trong các chế phẩm đông khô probiotic vì nó có tác dụng bảo vệ tốt probiotic trong quá trình đông khô Theo nhiều tổng kết nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước từ trước tới nay thì sữa gầy sử dụng ở nồng

độ khoảng 10% cho tỉ lệ sống sót cao nhất Tác dụng bảo vệ này có thể do nó chứa tỉ lệ dinh protein và carbohydrat- những chất mà có khả năng bảo vệ tế bào Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gầy gồm 32- 35,7 % protein và 48,4- 54,1 % lactose

Lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có thể thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường- protein

Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại đi Protein giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra một môi trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của tế bào ở mức thấp nhất [17]

Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa gầy có thể tạo thành lớp áo bảo vệ trên thành tế bào, đồng thời sữa gầy còn cung cấp những chất đệm tan trong nước (muối phosphat, muối citrat) giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [32]

Nguyên liệu đông khô với sữa gầy vừa tạo cấu trúc xốp giúp quá trình

bù nước dễ dàng, nhưng đồng thời cũng làm cho nguyên liệu đông khô hút ẩm khá nhanh nếu không được bảo quản tốt

1.6 Nang c ng

1.6.1 Đặ ểm dạng thu c nang c ng

Nang cứng gelatin là một dạng thuốc phân liều gồm một vỏ rỗng để đựng thuốc (bằng gelatin), gắn liền với thuốc và đưa vào cơ thể cùng với thuốc Sau khi tan rã giải phóng thuốc, vỏ đựng được tiêu hóa trong cơ thể [2] Hiện nay, nang cứng là dạng bào chế phổ biến nhất với các chế phẩm probiotics sau dạng tinh bột

Đối với chế phẩm probiotics, việc tạo dạng thuốc nang cứng giúp bảo

vệ vi sinh vật tránh một phần tác động bất lợi của ngoại môi như ẩm, ánh sáng

do vậy làm tăng tỷ lệ sống sót của vi sinh vật Thành phần tá dược chủ yếu trong nang cứng là tá dược độn, với điển hình là tinh bột, các loại đường đơn, đường đôi như saccarose, lactose, glucose, Ngoài ra, có thêm một số thành phần khác như tá dược trơn, tá dược màu, tá dược điều hương điều vị,…

Đối với nang cứng chứa probiotics, thành phần còn có thêm các tá dược giúp bảo vệ vi sinh vật trong điều kiện bảo quản, điều kiện ngoại môi, ánh sáng, độ ẩm, hay bảo vệ vi sinh vật bền vững qua acid dạ dày Điển hình là

nhóm chất xơ Fructo–oligosaccharide, Vegetable cream, inulin,… là nhóm tá dược hay được sử dụng nhất

1.6.2 Đ ấ ợng nang c ng

Muốn hoàn thiện công thức và quy trình sản suất nang cứng, đồng thời đảm bảo thu được các nang cứng có chất lượng đồng nhất qua các lô mẻ khác nhau cần phải đánh giá chất lượng nang cứng dựa trên các chỉ tiêu chất lượng Một số chỉ tiêu chất lượng của nang cứng cần đánh giá là: [2]

Độ đồng đều về hàm lượng

Độ đồng đều về khối lượng

Độ rã: nang cứng phải rã trong vòng 30 phút

Trắc nghiệm hòa tan: Thử độ hòa tan giúp đánh giá tốc độ giải phóng dược chất, giúp cho các nhà sản suất lựa chọn, sàng lọc công thức và các thông số kỹ thuật trong quá trình sản xuất, đồng thời đây cũng là một chỉ tiêu đánh giá chất lượng sản phẩm

Các thử nghiệm khác: Xác định hàm lượng dược chất, mức độ đồng nhất về hàm lượng dược chất, tiến hành theo như chỉ dẫn trong các chuyên luận cụ thể của Dược điển đối với từng loại chế phẩm cụ thể

C ươ 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 N y ậ l ệ à ế bị

2.1.1 y ậ ệ ử ụ

- Alginat:

 Sử dụng ở dạng muối Natri alginat

 Nguồn gốc: tảo nâu

- Vỏ nang gelatin:

 Cỡ nang: cỡ số 1

 Màu sắc: màu xanh

- Dưới đây là bảng các tá dược được sử dụng trong nghiên cứu

Acetat natri Trung Quốc TC NSX

Đĩa petri, ống nghiệm, đầu côn, …

2.2 P ươ p áp

2.2.1 P ơ â

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công

thức nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan hết các thành phần Phân chia môi trường

vào các ống nghiệm sạch bằng phễu thủy tinh, mỗi ống nghiệm 10ml MRS

lỏng Đậy kín bằng nút bông Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115o

C / 20 ph trong nồi hấp tiệt khuẩn Sau khi tiệt khuẩn để nguội xuống khoảng 37 ÷

tủ cấy vô trùng) Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống VSV trong tủ ấm 5%

CO2 trong 24h ở 37 ± 1o

C [9]

2.2.2 P ơ ấy

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (theo công thức nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan các thành phần trong công thức trong cốc có mỏ Chuyển 100ml môi trường MRS lỏng vào bình nón dung tích thích

C /20ph trong

bình nón trên trong tủ cấy vô trùng, mỗi bình 1 ống giống 10ml Ủ trong tủ

ấm CO2 5% trong 24h ở nhiệt độ 37±1oC

2.2.3 P ơ

Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS ở điều kiện

Đồng nhất dịch nuôi cấy bằng cách lắc bình chứa dịch nuôi cấy và khuấy từ trong 10 phút, đong vào các ống li tâm mỗi ống 10ml hỗn dịch sinh khối (HDSK) trên, li tâm các ống này với tốc độ 4000 vòng/ph Lấy các ống li tâm khỏi máy, loại bỏ phần dịch trong, giữ lại phần cắn sinh khối phía dưới, cho tá dược độn đã chuẩn bị sẵn và được hấp tiệt khuẩn, để nguội, lắc trên máy lắc (Vortex) cho sinh khối thu được phân tán đều trong dung dịch tá dược độn

Đổ hỗn dịch các mẫu này ra đĩa petri đã được làm sạch và hấp tiệt khuẩn từ

toàn, sau đó tiến hành giai đoạn làm khô trong máy đông khô Tạo các mẫu đông khô với thành phần như sau:

 Làm khô: Các mẫu được làm khô trong không gian lạnh của máy đông

C, 0,055mbar Làm khô trong thời gian 24h

Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị chuyển vào bao polyme có khóa, xác định số vi sinh vật sống sót hoặc đậy kín rồi bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4o

C

2.2.4 P ươ p áp ệ k ẩ Ty d ll

Cho nguyên liệu cần tiệt khuẩn vào trong cốc có mỏ, đậy kín Để cốc ở

70 ÷ 80oC trong 1h Lấy ra, ủ cốc đựng nguyên liệu vào tủ ấm 37oC trong 24h Sau 24h, lấy cốc đựng nguyên liệu ra, lặp lại như trên 3 lần

2.2.5 P ươ p áp ạo ố bộ L acidophilus

pháp Tyndall

 Tạo thuốc bột chứa L acidophilus: Tiến hành trong tủ cấy vô trùng,

trộn tá dược và bột đông khô theo tỷ lệ 1:1 để tạo thành khối bột đồng nhất, thu được bột thuốc chứa tinh bột và bột thuốc chứa Natri alginate

2.2.6 P ươ p áp ạo nang c ng ch a L acidophilus

 Chuẩn bị các tá dược: Tinh bột, Natri alginat được tiệt khuẩn theo phương pháp Tyndall

 Tạo nang cứng chứa L acidophilus: Sau khi được hấp tiệt trùng, tá

dược và bột đông khô trộn đồng lượng tạo thành khối đồng nhất Sau đó đem đóng thành nang cứng bằng máy tạo nang thủ công

2.2.7 P ươ p áp xá đị àm ẩm

Tiến hành đo trên thiết bị đo hàm ẩm Prescisa

Làm nhỏ mẫu cần đo hàm ẩm Cho lên mặt đĩa của thiết bị khoảng 1g mẫu, dàn đều mẫu ra mặt đĩa, đậy nắp, chạy máy Chờ máy gia nhiệt trong

khoảng 5 phút hoặc đến khi máy hiện kết quả Đọc, ghi lại số liệu hiện trên màn hình (a1) Hàm ẩm của mẫu là hiệu số của (100- a1) %

2.2.8 P ươ p áp xá đị số lượ VSV eo y ắc pha loãng liên ụ

Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS đặc (nêu trong mục 2.1.2) Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp Đậy kín bằng nút bông

trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín

Chuẩn bị các ống nghiệm sạch mỗi ống chứa 9ml nước cất, đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115oC / 20 phút, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37 ÷ 40o

C

 Xác định số lượng VSV trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu

đều Hút chính xác 1ml dịch đã được đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ 2 (chứa 9ml nước cất đã được hấp tiệt khuẩn

 Mẫu xác định số lượng VSV còn sống sau đông khô

Làm nhỏ nguyên liệu, cân chính xác khối lượng của mẫu, sau đó pha

C / 20 phút

bình nón pha vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất, rồi tiếp tục pha loãng, cấy như đối với mẫu là chất lỏng như trên

 Mẫu xác định số lượng VSV sống sót trong điều kiện môi trường pH thấp:

+ Mẫ ố bộ : Cân chính xác khoảng 1,0g mẫu cần thử, cho vào bình nón

chứa 100ml acid HCl pH 1,2 (pha theo Phụ lục 2) đã được hấp tiệt khuẩn ở

các thời điểm 0h, 1h, 2h, tiến hành pha loãng liên tục như các bước đã nêu ở

, 10-5; 10-6; 10-7), cấy trải dịch trong 3 nồng

độ pha loãng cuối cùng lên mặt thạch MRS, mỗi đĩa 0,5ml, dàn đều dịch trên

bề mặt thạch bằng que chang đã được tiệt khuẩn

+ Mẫ : Tại các thời điểm 15ph, 30ph, 1h, 2h, hút lấy 1 ml dịch

mẫu thử, pha loãng liên tục đến nồng độ 10-3

, 10-4, sau đó cấy trải dịch trong 3 nồng độ pha loãng cuối cùng lên mặt thạch MRS, mỗi đĩa 0,5 ml, dàn đều dịch lên trên bề mặt thạch bằng que chang đã được tiệt khuẩn

Ủ các đĩa này trong tủ CO2 5%, ở nhiệt độ 37o

C

Tiến hành xác định số lượng VSV trên các mẫu:

- 1ml dịch nuôi cấy sau 24h

- Mẫu tạo thành sau đông khô

- Mẫu sau khi ủ trong dịch acid pH 1,2

Sau 48h đọc kết quả

Số lượng VSV có trong 1g nguyên liệu hoặc 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu được tính theo công thức:

Trong đó:

m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng

X: số VSV có trong 1 g hoặc 1 ml mẫu

An: Số khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có cấy các nồng độ pha loãng n