Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất thiazolidindion

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÂM THỊ HÒA NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT THIAZOLIDINDION LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊ

BỘ GIÁO DỤC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÂM THỊ HÒA

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

THIAZOLIDINDION

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÂM THỊ HÒA

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

THIAZOLIDINDION LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: TS Phan Thị Phương Dung

PGS.TS Nguyễn Hải Nam

HÀ NỘI 2013

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin được gửi sự cảm ơn chân thành của mình của mình đến với

thầy cô: TS Phan Thị Phương Dung và PGS.TS Nguyễn Hải Nam Các thầy cô

đã tạo điều kiện tốt nhất và chỉ bảo tận tình giúp tôi hoàn thành luận văn này Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Hóa Dược - trường đại học Dược Hà nội trong suốt thời gian qua đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận tại bộ môn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến cô Đỗ Thị Nguyệt Quế và các cán bộ tại

khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc đã hỗ trợ tôi trong việc thử hoạt tính sinh học Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị cán bộ giúp đỡ tôi trong quá trình kiểm tra, đo đạc các loại phổ tại Viện Hóa học Việt nam, Viện Hóa học các hợp chất tự nhiên

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên tạo động lực cho tôi đi đến ngày hôm nay

Hà Nội, tháng 08 năm 2013

Lâm Thị Hòa

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 10

1.1 Tác dụng sinh học của thiazolidindion và dẫn chất 10

1.1.1 Tác dụng kháng tế bào ung thư 10

1.1.2 Tác dụng chống đái tháo đường 17

1.1.3 Tác dụng khác 24

1.2 Phương pháp tổng hợp thiazolidin-2,4-dion và dẫn chất 24

1.2.1 Phương pháp tổng hợp thiazolidin-2,4-dion 24

1.2.2 Phương pháp tổng hợp dẫn chất 5-arylidenthiazolidin-2,4-dion 25

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………27

2.1 Nguyên liệu, hóa chất 27

2.1.1 Hóa chất chính 27

2.1.2 Dung môi và các hóa chất khác 27

2.2 Thiết bị, dụng cụ 27

2.3 Nội dung nghiên cứu 28

2.3.1 Tổng hợp hóa học 28

2.3.2 Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp 28 2.3.3 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

2.4.1 Phương pháp tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 29

2.4.2 Phương pháp khẳng định cấu trúc 29

2.4.3 Phương pháp thử tác dụng sinh học 29

`CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Hóa học 33

3.1.1 Tổng hợp các dẫn chất 33

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 42

3.1.3 Khẳng định cấu trúc 43

3.2 Hoạt tính sinh học 48

3.2.1 Tác dụng ức chế HDAC 48

3.2.2 Tác dụng gây độc tế bào 49

3.2.3 Tác dụng ức chế PTP1B 50

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 52

4.1 Hóa học 52

4.2 Khẳng định cấu trúc 54

4.2.1 Phổ hồng ngoại 54

4.2.2 Phổ khối lượng 55

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 56

4.2.4 Phổ cộng hưởng từ carbon 57

4.3 Hoạt tính sinh học 57

4.3.1 Tác dụng ức chế HDAC 58

4.3.2 Tác dụng độc tế bào 58

4.3.3 Tác dụng ức chế PTP1B 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

I KẾT LUẬN 60

II KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Tế bào thận khỉ Diclomethan N,N-dimethylformamid Dimethyl sulfoxid Effective dose 50% (lượng chất gây chết 50% số cá thể thí nghiệm) Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

Histon 3, Histon 4 Histon deacetylase (enzym histon deacetylase)

Tế bào ung thư gan người Inhibitory concentration 50 (nồng độ chất gây ức chế 50% số cá thể thí nghiệm) Insulin-like growth factor 1 receptor

Phổ khối lượng Insulin receptor 5 (thụ thể insulin 5) Phổ khối lượng

Peroxisom proliferator gamma (thụ thể peroxisom proliferator gamma) Proliferator peroxisom (phức hợp proliferator peroxisom)

Protein tyrosin phosphatase 1B (enzym protein tyrosin phosphatase 1B) Receptor X retinoid (thụ thể X retinoid)

Tế bào ung thư đại tràng

N-(6-(2,4-dioxothiazolidin-3-yl)hexyl)benzamid

N-(6-(2,4-dioxothiazolidin-3-yl)hexyl)benzenesulfonamid Triethanolamin

Sắc ký lớp mỏng Thiazolidindion

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Kết quả tác dụng của dẫn chất IIa và IIb trên đường huyết và mỡ máu.11

Bảng 3.1 Bảng tổng hợp các thông số của các dẫn chất 4a-f 35

Bảng 3.2 Kết quả phân tích phổ IR của dãy chất 4a-f 36

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ MS của dãy chất 4a-f 37

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất 4a-f 37

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của các chất 4a-f 39

Bảng 3.6 Kết quả thử độc tính trên tế bào SW620 41

Bảng 3.7 Kết quả thử tác dụng ức chế PTP1B 42

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Các dẫn chất đƣợc tổng hợp trong nghiên cứu của Alegaon 2

Hình 1.2 Cơ chế gây độc tế bào có liên quan tới sự kích thích PPAR 4

Hình 1.3 Sơ đồ vai trò của HAT và HDAC điều hòa quá trình phiên mã 6

Hình 1.4: Cấu trúc một số hoạt chất ức chế HDAC 7

Hình 1.5 Cấu trúc chung của một số dãy chất ức chế HDAC được thực hiện tại bộ môn Hóa Dược……….8

Hình 1.6 Cấu trúc liên quan đến tác dụng của các chất ức chế enzym HDAC….8 Hình 1.7 SRR1 và SRR2 tạo liên kết với Z……… 9

H nh 1.8 Kết quả ức chế HDAC của các chất sau 8h 9

Hình 1.9 Cấu tạo của các TZD đang đƣợc nghiên cứu hiện nay 10

Hình 1.10 Sơ đồ cơ chế hoạt động của thụ thể PPAR 11

Hình 1.11 Cấu tạo của peroxisom proliferator gamma 12

Hình 1.12 Cấu trúc của các dẫn chất TZD liên quan đến tác dụng hoạt hóa PPARγ Hình 1.13 Sơ đồ vai trò của enzym PTP1B với đáp ứng của insulin 14

Hình 1.14 Cấu trúc PTP1B 15

Hình 1.15 Các TZD ức chế PTP1B mới đƣợc nghiên cứu 15

Hình 1.16 Các TZD ức chế PTP1B mới đƣợc nghiên cứu 17

Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất 4a-f 24

Hình 3.2 Kết quả ức chế HDAC của các chất 4a-f 40

Hình 4.1 Phổ IR của chất 4e 47

Hình 4.2 Phổ MS của chất 4b 47

Hình 4.3 Phổ 1 H-NMR của chất 4c 48

Hình 4.4 Phổ 13C-NMR của chất 4d 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, các dẫn chất thiazolidindion (TZD) đã và đang thu hút được sự quan tâm của các nhà nghiên cứu phát triển thuốc do TZD có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao, chống viêm, chống viêm khớp Đặc biệt là tác dụng chống đái tháo đường và kháng tế bào ung thư Và đã có hai thuốc đã được phê duyệt để điều trị đái tháo đường type 2 là rosiglititazon (năm 1999) và pioglitazon (năm 2000) [1, 2, 18, 30]

Bên cạnh đó, các công trình nghiên cứu trên thế giới đã tiếp tục đi sâu tìm hiểu cơ chế chống đái tháo đường của các dẫn chất TZD Nhiều tài liệu đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của TZD là do chúng hoạt hóa thụ thể peroxisom proliferator gamma (PPAR-γ) và ức chế enzym protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) [9, 10] Các thụ thể và enzym này hiện nay là mục tiêu phân tử của các thuốc điều trị đái tháo đường và béo phì do có vai trò quan trọng trong điều hòa glucose, triglycerid và cholesterol huyết

Năm 2011, công trình nghiên cứu của Mohan R và cộng sự cho kết quả: hai dẫn chất của TZD là N-(6-(2,4-dioxothiazolidin-3-yl)hexyl)benzensulfonamid và N-(6-(2,4-dioxothiazolidin-3-yl)hexyl)benzamid ức chế hoạt động của enzym histon deacetylase (HDAC) trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 Nghiên cứu mở ra tiềm năng tương lai để tối ưu dẫn chất TZD có hoạt tính kháng tế bào ung thư hướng tác dụng trên enzym HDAC [29]

Các cơ chế tác dụng kể trên mở ra triển vọng nghiên cứu và phát triển TZD theo phương pháp hiện đại, đó là dựa trên mục tiêu phân tử cụ thể Nhằm thăm dò hoạt tính sinh học nổi bật dựa trên đích tác dụng của các dẫn chất TZD và góp phần

tạo ra các dẫn chất mới, đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất thiazolidindion” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Tổng hợp N-(2-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl) benzensulfonamid và một số dẫn chất

2 Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase, thử độc tính trên tế bào ung thư

và thử tác dụng ức chế protein tyrosin phosphatase 1B của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tác dụng sinh học của thiazolidindion và dẫn chất

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước tiến hành tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất TZD Các nghiên cứu cho thấy các dẫn chất TZD có nhiều tác dụng sinh học như: tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng lao, chống viêm, chống xơ cứng bì [1, 6, 8, 12, 18, 27, 34] Đáng chú ý và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất hiện nay là tác dụng chống đái tháo đường và tác dụng

kháng tế bào ung thư của các dẫn chất TZD

1.1.1 Tác dụng kháng tế bào ung thư

Năm 2012, Alegaon và cộng sự [6] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất mang nhóm TZD có công thức cấu tạo như sau:

N S

O O

COOH H

Hình 1.1 Các dẫn chất được tổng hợp trong nghiên cứu của Alegaon

Và tác giả đã tiến hành thử độc tính in vitro trên 7 dòng tế bào ung thư bao

gồm: HeLa (ung thư cổ tử cung), HT-29 (ung thư đại trực tràng), A549 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú) Sự ức chế phát triển của các tế bào ung thư sau 24h được ghi nhận qua giá trị IC50(µM)

Kết quả nghiên cứu cho thấy: hợp chất với nhóm thế là vòng benzen (Ia) và methyl benzen (Id) cho độc tính tế bào thấp với các giá trị IC50 từ 60-100 µM Khi

vòng benzen có thêm các nhóm thế halogen là brom (Ib) hoặc flo (Ic) hoạt tính tăng

lên đáng kể với giá trị IC50 thu được trong khoảng 40-50 µM Hợp chất có tác dụng

mạnh nhất là 3,4,5-trimethoxyl (Ie) benzen với các giá trị IC50 thấp nhất từ 30-36

μM Ngoài ra, các hợp chất dị vòng chứa Nitơ (Ig, Ih) và Oxy (Ii) cho các giá trị

IC50 ở mức trung bình và cao từ 60-90 μM

Năm 2012, Avupati và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất 5-aryl và thử tác dụng độc tế bào bằng phương pháp BSLA (khảo nghiệm ngâm nước muối gây chết tôm) [8] Các dẫn chất có công thức cấu tạo:

S NH O

O R

O

Kết quả cho thấy, trong các dẫn chất tổng hợp được thì hợp chất ((E)-3-oxo-3-(thiophen-2-yl)prop-1-enyl)benzyliden)-1,3-thiazolidin-2,4-dion) có tác dụng độc tế bào tốt nhất với giá trị ED50 là 4.00 ± 0.25 g/ml gần tương đương với tác dụng của podophyllotoxin với giá trị ED50 là 3.61 ± 0.17 g/ml Trong nghiên cứu này, tác giả đã phân tích mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng độc tế bào của các dẫn chất TZD Tác giả đã thấy rằng tác dụng ức chế tế bào có liên quan đến nhân thiazolidin-2,4-dion và các nhóm thế khác nhau làm tăng cường hoặc giảm bớt tác dụng ức chế tế bào như:

((Z)-5-(4 Nhóm thế halogen tại vị trí meta hoặc para trên vòng benzen làm tăng tác dụng ức chế tế bào

- Tác dụng ức chế tế bào bị giảm khi thay thế phenyl bằng naphtalen hoặc khi có thêm nhóm thế hoạt động như hydroxyd trên vòng phenyl

- Tác dụng ức chế mất hẳn khi có nhóm thế nitro trên vòng benzen

- Và điều thú vị nhất là hoạt động ức chế tế bào tăng mạnh nhất khi thay thế phenyl bằng thiophen-2-yl (có 2 carbonyl ở vị trí , ) [8]

Nghiên cứu ở trong nước gần đây cũng tổng hợp được một số dẫn chất của TZD có tác dụng trên tế bào ung thư Năm 2003, công trình nghiên cứu luận án tiến

sĩ dược sĩ của tác giả Đinh Thị Thanh Hải [1] đã tổng hợp dẫn chất của 5-nitro furfural và thiazolidin-2,4-dion cùng các dẫn chất base Mannich của chúng có tác dụng kháng tế bào ung thư người: tế bào ung thư biểu mô (KB) và tế bào ung thư màng tử cung (FL)

Như vậy, qua rất nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới và trong nước cho thấy, các dẫn chất TZD có tác dụng ức chế nhiều loại tế bào ung thư

in vitro như: tế bào ung thư gan, thận, tim Và tác dụng độc tế bào của chúng có mối

liên quan đến khung thiazolidin-2,4-dion Việc gắn các nhóm thế khác nhau trên mạch nhánh sẽ làm tăng hoặc giảm tác dụng độc tế bào của dẫn chất TZD

Tác dụng gây độc tế bào của TZD là do hai cơ chế: có liên quan tới kích hoạt PPAR và không liên quan tới PPAR [8, 18]

1.1.1.1 Cơ chế gây độc tế bào liên quan đến PPAR

Thông qua hai tác dụng: gây chết tế bào theo chương trình và ức chế tăng trưởng tế bào (hình 1.2) [18, 21]

Hình 1.2 Cơ chế gây độc tế bào có liên quan tới sự kích thích PPAR

Ghi chú: CKTB (chu kỳ tế bào).

- Các dẫn chất TZD kích hoạt PPAR sau đó gắn kết với thụ thể X retinoid (RXR) từ đó kích hoạt sự phiên mã, cuối cùng gây ra sự chết tế bào theo chương trình bằng cách giảm protein kháng sự chết tế bào (Bcl-2 /BCL-x và survivin) và tăng protein kích thích sự chết tế bào (p53, BAD, phosphatase và PTEN)

- Sự kích hoạt PPAR gamma có thể làm giảm sự phát triển khối u thông qua việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và tác động lên trạm kiểm soát chu kỳ

TZD

+ PPAR

Giảm protein ức chế

sự chết tế bào theo chương trình

Tăng protein gây

ức chế CKTB (p21,p27)

Giảm protein gây hoạt hóa CKTB (cd1,cd2 )

Tăng protein gây

tế bào Kích hoạt PPAR gamma từ đó gây giảm nồng độ protein của cyclin có vai trò làm tăng tiến độ của chu kỳ tế bào D1 (Cd1), cyclin phụ thuộc kinase 4 (CDK4), Cyclin E, Cd2, và CDK2) và gây tăng nồng độ protein của cylin có vai trò làm chậm tiến độ của chu kỳ tế bào (p21 và p27)

1.1.1.2 Cơ chế gây độc tế bào không liên quan tới PPAR

Có rất nhiều đề xuất về cơ chế gây độc tế bào không phụ thuộc vào PPAR gamma [18, 26, 29, 34]

- Năm 2010, Liu và cộng sự [18] đã tổng hợp dẫn chất 5-benzyliden thiazolidin-2,4-dion và 5-(furan-2-ylmethylen)thiazolidin-2,4-dion là các hợp chất

ức chế mạnh và chọn lọc trên thụ thể tăng trưởng liên quan insulin-1 (IGF-1R) IGF-1R là một thụ thể tăng trưởng của nhóm tyrosine kinase hoạt động như một trung gian quan trọng của sự phát triển và tồn tại của tế bào Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy, IGF-1R được biểu hiện quá mức trong tế bào ung thư ở người và chịu trách nhiệm chính cho sự phát triển của khối u Các các tác giả cũng tối ưu hóa công thức để có tác dụng tốt nhất lên thụ thể IGF-1F với IC50=57nM

- Năm 2012, Liu và cộng sự [18] đã tổng hợp một loạt các dẫn chất thế ở vị trí 3,5 của TZD nhằm ức chế hai tín hiệu: Raf/ MEK/ ERK và phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K/Akt) Hai con đường tín hiệu đã được chứng minh có liên quan đến

sự phát triển và sự sống còn của tế bào ung thư Vì vậy, phát triển hợp chất mới có thể cùng nhắm tới các tín hiệu Raf/ MEK/ ERK và PI3K/Akt là chiến lược nhằm cung cấp các thuốc chống ung thư ở người Một số chất đã được tổng hợp và cho khả năng chống tăng sinh của U937 (tế bào bạch cầu), gây chết tế bào theo chương trình của U937, M12 (ung thư tuyến tiền liệt) và thể hiện mối tương quan với hoạt động phong tỏa tín hiệu Raf/ MEK/ ERK và PI3K/Akt

- Trong các cơ chế được đề xuất, tác động ức chế enzym HDAC là mục tiêu phân tử đáng quan tâm nhất hiện nay nhằm hướng tác dụng độc tế bào ung thư [29]

a Vai trò của HDAC

Nucleosom là đơn vị cơ bản cấu tạo lên nhiễm sắc thể Một nucleosom điển hình bao gồm 1 octomer hình đĩa của 4 cặp histon (2 cặp của H2A với H2B và 2

cặp của H3 và H4) được quấn quanh bởi 146 cặp nucleotid Đầu amin của histon

mang điện dương nên tương tác mạnh với phần phosphat mang điện âm trên phân tử ADN tạo nên cấu trúc nucleosom và cấu trúc bậc cao hơn của nhiễm sắc thể, quy

định quá trình biểu hiện gen Bỏ nhóm acetyl từ phần amin làm trung hòa điện tích

dương của histon, dẫn đến giảm tương tác điện giữa histon với ADN Khi tương tác điện này yếu, nhiễm sắc thể tháo xoắn và quá trình tổng hợp protein diễn ra từ đó đặc tính của gen được biểu hiện thông qua các tính trạng Quá trình đặc biệt diễn ra mạnh ở H3 và H4 Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon Acetyl hóa trung hòa điện tích dương của histon làm nới lỏng tương tác của nó với ADN trong khi hóa deacetyl hóa có tác dụng ngược lại [16, 33]

Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl từ ε-N-acetyl lysin amino acid của phần histon Trong khi, enzym histon acetyltranferase (HAT) xúc tác quá trình acetyl hóa có tác dụng ngược lại Trong tế bào, HAT và HDAC là 2 enzym điều hòa quá trình acetyl hóa từ đó quyết định sự biểu hiện gen [35] (hình 1.3)

Hình 1.3 Sơ đồ vai trò của HAT và HDAC điều hòa quá trình phiên mã

Hoạt động này của HDAC làm sai lệch quá trình phiên mã và là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự hình thành khối u Các nghiên cứu có ý nghĩa thống

kê gần đây đã chỉ ra rằng các HDAC có liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình, kể cả sự di chuyển, sự xâm lấn và sự tạo mạch [17, 21]

b Cấu tạo của HDAC

Phiên mã gen

Về căn bản, các HDAC có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau, chúng đều gồm các phần cơ bản sau :

- Ion Zn2+: là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng Đây

là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí Thông thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng

ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [20, 23]

- Kênh enzym: là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls với cơ chất Kênh này được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl hóa [19]

c.Liên quan cấu trúc và tác dụng của thuốc ức chế HDAC

Cho đến nay, đã có hai chất ức chế HDAC được FDA cấp phép lưu hành trên thị trường có tác dụng điều trị u lympho tế bào T dưới da: SAHA (Vorinostat, Zolina®) - chất có nguồn gốc tổng hợp, Romidepsin (Istodax®) - chất được phân lập từ Chromobacterium violaceum [11] Ngày nay có khoảng 15 chất ức chế HDAC đang được nghiên cứu thử nghiệm trên lâm sàng để điều trị ung thư (hình 1.4)

H

N

O

N H

O OH SAHA

H3C

CH3

OH O

Hình 1.4: Cấu trúc một số hoạt chất ức chế HDAC

Nhóm tổng hợp của bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà nội cũng đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất có tác dụng ức chế HDAC dựa trên cấu trúc của SAHA Các kết quả thu được về khả năng ức chế HDAC cũng như độc tính tế bào trên một số dòng tế bào ung thư là rất khả quan [4, 5]

R

H N O

H N O

NHOH O

Hình 1.5 Cấu trúc chung của một số dãy chất ức chế HDAC được thực hiện tại bộ

môn Hóa Dược

Theo một số tài liệu tham khảo, hiệu quả tác dụng của các chất ức chế HDAC dựa trên sự có mặt của 3 yếu tố chính [11,14,18] (hình 1.6)

- Nhóm C: nhóm kết thúc có thể liên kết với Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các enzym HDAC như: acid hydroxamic, thiol, benzamid, mecaptoceton

- Nhóm B: nhóm cầu nối thường là các mạch hydrocarbon, nằm trong lòng enzym

- Nhóm A: nhómkhoá hoạt động thường là vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt của enzym

H

H OH

A B C

Hình 1.7 SRR1 và SRR2 tạo liên kết với Zn

Nghiên cứu đã chứng minh rằng các hợp chất này gây độc tế bào song song với khả năng ức chế hoạt động HDAC của tế bào gan dòng HepG2 ở người Ức chế tối đa hoạt động của HDAC trong khoảng thời gian là 8 giờ trong đó SRR1 ức chế HDAC 42,11% và SRR2 là 56,85% thông qua tình trạng acetyl hóa H3 Mức độ ức chế của SRR2 gần bằng với hai chất ức chế HDAC mạnh là SB (sodium butyrat) và SAHA:

nh 8 ết qu ức chế HDAC của các chất sau h 1.1.2 Tác dụng chống đái tháo đường

Hợp chất TZD có tác dụng hạ đường huyết được phát hiện đầu tiên vào năm

1982 tại Nhật Bản bởi Sohda và cộng sự trong khi tìm kiếm các hợp chất làm giảm cholesterol và triglycerid, đó là ciglitazon [2] Cuối những năm 1990, có nhiều hợp chất TZD được tổng hợp và cho thấy tác dụng hạ đường huyết: pioglitazon, rosiglitazon, troglitazon, darglitazon và englitazon Trong đó, troglitazon,

% HDAC của HepG2 bị ức chế sau 8h

rosiglitazon và pioglitazon được phát triển nghiên cứu để thử nghiệm lâm sàng Troglitazon (Rezulin) là loại thuốc đầu tiên được chấp nhận sử dụng để điều trị đái tháo đường typ II Nhưng do tác dụng phụ trên gan nên đã rút khỏi thị trường năm

2000 Tiếp đó, hai thuốc rosiglitazon (Avandia) (phê duyệt năm 1999) và pioglitazon (Actos) (đã được phê duyệt năm 2000) đều cho hiệu quả tốt trong việc kiểm soát đường huyết Rosiglitazon do phát hiện tác dụng phụ trên tim đã ngừng

sử dụng vào năm 2010 Một số chất khác như: englitazon, ciglitazon, darglitazon cũng đã từng được nghiên cứu trên lâm sàng [18, 36] (hình 1.9)

O

Englitazon Ciglitazon

Hình 1.9 Cấu tạo của các TZD đang được nghiên cứu hiện nay

Năm 2011, Munj S M và cộng sự [28] đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất arylidenthiazolidin-2,4-dion, từ đó thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết và kiểm soát mỡ máu Kết quả là tổng hợp được 2 dẫn chất (Z)-5-(2-(4-((2,4-

5-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)-phenoxy)acetyl)-2-hydroxybenzamid (IIa) và (Z)

-2-(4-((2,4dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)-N(5-nitro-thiazol-2-yl)

acetamid (IIb) Hai chất này đều kiểm soát đường huyết (glucose), cholesterol

(CHL) và triglycerid (TG) trên chuột đực Sprague–Dawley có chế độ ăn giàu mỡ sau 14 ngày sử dụng (hình 1.10) [28]

Bảng ết qu tác dụng của dẫn chất IIa và IIb trên đường huyết và mỡ máu

IIb 56.08 ± 2.04 N.S 78.11 ± 1.46** 92.46 ± 0.54**

Pioglitazon HCl 51.57 ± 3.15** 78.38 ± 1.80* 86.83 ± 3.24**

Ghi chú: * P=0.05, ** P=0.01*, N.S: không có ý nghĩa thống kê.

Cho đến nay, tác dụng hạ đường huyết của các TZD được biết đến thông qua hai cơ chế: hoạt hóa thụ thể PPAR và ức chế enzym PTP1B

1.1.2.1 Tác dụng hoạt hóa thụ thể peroxisom proliferator gamma

a Vai trò của peroxisom proliferator gamma

Peroxisom proliferator gamma (PPARγ) có mặt trong các tế bào nội mô và các tế bào cơ trơn mạch máu, tập trung nhiều nhất ở mô mỡ PPARγ là một thụ thể

ở màng nhân tế bào, có chức năng như những yếu tố phiên mã điều chỉnh sự biểu hiện của gen [7, 13, 17, 22, 32] Khi được gắn với tác nhân đặc hiệu, những receptor này tạo dimer với receptor X retinoid (RXR) (đã được gắn với chất chủ vận nội sinh 9-cis retionic acid) thành phức hợp proliferator peroxisom (PPRE) Phức hợp này sẽ gắn với ADN làm điều hòa quá trình phiên mã, dịch mã của gen trong nhân tế bào (hình 1.11)

Tác nhân PPAR 9-cis retionic acid

Gen mục tiêu của PPAR

Hình 1.10 Sơ đồ cơ chế hoạt động của thụ thể PPAR

Quá trình phiên mã

Các đáp ứng sinh học liên quan đến hoạt hóa thụ thể PPARγ [13]:

- Kích thích sử dụng glucose, ức chế sự tổng hợp glucose ở gan Từ đó, cải thiện sự nhạy cảm với insulin của tế bào, giảm nồng độ glucose trong máu

- Kích thích biệt hóa tế bào mỡ, kích thích các enzym vận chuyển tế bào mỡ như lipoprotein lipase và làm thay đổi các hormon đặc hiệu do tế bào mỡ sản xuất (adipokin) Kết quả hoạt hóa PPARγ tại mô mỡ là: tăng hấp thu và tích trữ acid tự

do Ngoài ra, còn tăng cường sự oxy hóa các cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) ở đại thực bào nên làm giảm acid béo tự do trong máu

Vì vậy, PPARγ đã được biết đến như một mục tiêu của các thuốc điều trị đái tháo đường typ 2 và giảm tình trạng béo phì [18] TZD có ái lực cao với thụ thể PPAR và hoạt động như chất chủ vận trên thụ thể này Thông qua hoạt hóa PPARγ, TZD điều chỉnh sự biểu hiện của một số gen mục tiêu của PPARγ và tác động lên quá trình chuyển hóa lipid và glucosid của tế bào [13, 30]

b Cấu tạo của peroxisom proliferator gamma

Tương tự như với các thụ thể ở nhân khác, PPARγ có năm hoặc sáu vùng cấu trúc với bốn chức năng, được gọi là A/ B, C, D và E/ F [17] (hình 1.11)

- Vùng A/B chứa nhóm NH2 kết thúc, hoạt động độc lập với tác nhân

- Vùng C (DBD - DNA binding domain) gồm 70 amino acid là vùng gắn PPRE với ADN

- Vùng D là vùng khớp nối với vùng C, là phần bản lề của 2 đầu

- Vùng E (LBD - ligand binding domain) là vùng gắn với các tác nhân đặc hiệu và kích hoạt PPAR liên kết với RXR làm tăng sự biểu hiện của gen mục tiêu

Hình 1.11 Cấu tạo của peroxisom proliferator gamma

c Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của thiazolidin-2,4-dion lên thụ thể

Từ năm 1989 Yoshioka và cộng sự [18] đã chứng minh: các dẫn chất TZD liên kết được với PPARγ là nhờ cấu trúc gồm có 3 phần: phần đầu có tính acid kết nối với phần đuôi kỵ nước bằng một mối liên kết phenoxyalkyl (phần giữa)

S NHO

O

O

Phần đuôi Phần giữa Phần đầu

Hình 1.12 Cấu trúc của các dẫn chất TZD liên quan đến tác dụng hoạt hóa PPARγ

- Phần đầu: nhóm TZD là nhóm gây tác dụng chính lên receptor do có tính acid tạo liên kết hydro với vùng LBD (ligand binding domain) trên PPAR-γ Loại

bỏ tính acid của nhóm TZD bằng cách methyl hóa nito dẫn đến mấtkhả năng liên kết với PPAR-γ

- Phần giữa gồm: một nguyên tử carbon đệm no, nhóm aryl trung tâm được thế ở vị trí para với oxy (phenoxy), nếu thay thế O bằng C sẽ làm giảm hoạt động gắn với thụ thể của dẫn chất, hoặc thế oxy ở vị trí meta và ortho cũng làm giảm hoạt tính Và nhóm alkoxy có hai nguyên tử carbon xen kẽ bởi một nguyên tử oxy được báo cáo là cấu trúc lý tưởng cho hoạt động

- Phần đuôi kỵ nước: có thể là 1 vòng thơm hoặc hệ thống nhiều vòng thơm

có nhóm thế Một số dị vòng làm giảm hoạt tính của dẫn chất còn nếu là vòng phenyl thì dẫn chất có nhóm thế sẽ cho tác dụng tốt hơn không có nhóm thế [18]

1.1.2.2 Tác dụng ức chế enzym protein tyrosin phosphatase 1B

a Vai trò của protein tyrosin phosphatase 1B

Protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) là một phosphotyrosin phosphatase, enzym thủy phân nhóm phosphat gắn trên acid amin tyrosin [31] PTP1B có thể dephosphoryl hóa phosphotyrosin của enzym kinase (enzym gây hoạt hóa insulin và leptin) Vì vậy, PTP1B làm giảm thông tin dẫn truyền của thụ thể insulin và thụ thể

leptin ở mô mỡ, gan và cơ Ức chế PTP1B vì thế làm tăng độ nhạy và đáp ứng của

insulin tại thụ thể và giảm nồng độ glucose trong máu (hình 1.13)

Hình 1.13 Sơ đồ vai trò của enzym PTP1B với đáp ứng của insulin

Chính vì vậy, PTP1B đã được chứng minh là một mục tiêu phân tử quan trọng cho nghiên cứu phát triển của các thuốc điều trị đái tháo đường type II hiện nay Trong thập kỷ qua, nhiều chất ức chế PTP1B khác nhau đã được báo cáo Trong số đó, chỉ có hai hợp chất: ertiprotafib và trodusquemin có tiến triển để thử nghiệm lâm sàng Ertiprotafib đã phải dừng lại ở thử nghiệm giai đoạn II do tác dụng kém trong cơ thể và trodusquemin đang trong thử nghiệm giai đoạn I [15,18]

b Cấu tạo của PTP1B

Gồm 1 chuỗi polypeptide tạo thành từ 10 sợi hỗn hợp có dạng cấu trúc xoắn bậc cao, bao trùm toàn bộ chiều dài của phân tử là các liên kết motif hình thành các mạng lưới có khả năng nhận dạng các dẫn chất phosphat và các vòng [26]:

- Các vòng lặp WPD chứa dư lượng Aspartic bất biến (Asp 181), vòng lặp tham gia vào cả hai bước của quá trình xúc tác

- Các vòng lặp Q chứa Glutamin 262, trung gian thủy phân của xúc tác cysteinyl-phosphat

- Các vòng lặp pTyr chứa dư lượng tyrosine (Tyr 46 trong PTP1B) tạo độ sâu của khe và tạo tính đặc thù tuyệt đối nhằm hiển thị PTP1B cho chất nền chứa phosphotyrosin

Phiên mã gen quy định leptin

Chuyển hóa

glucose

Tổng hợp

glucogen

Hình 1.14 Cấu trúc PTP1B

Ghi chú: Các liên kết motif đánh dấu (vàng), WPD vòng lặp (màu đỏ), pTyr vòng lặp

(màu cam) và Q loop (màu xanh))

tính sinh học mạnh nhất là IIIa và IIIb (hình 1.15)

O

Br IIIb

Hình 1.15 Các TZD ức chế PTP1B mới được nghiên cứu

Thử nghiệm in vitro cho thấy, hai dẫn chất này đồng thời có hai tác dụng: ức

chế enzym PTP1B và hoạt hóa PPAR-γ Hai dẫn chất hoạt hóa PPAR-γ ở nồng độ

1m tương đương với các glitazon: troglitazon, rosiglitazon và pioglitazon Và hoạt

tính ức chế PTP1B của IIIa ở IC50=1.3m tương đương với IC50=1.4m của

ertiprotafib, còn IIIb tác dụng yếu hơn với IC50=5m Đặc điểm cấu trúc đặc biệt là

sự có mặt của nhóm sulfonyl của hợp chất IIIa có vai trò quan trọng trong việc tạo

tương tác với cả thụ thể PTP1B và PPAR-γ

Trên in vivo, IIIa và IIIb có tác dụng như là chất chống béo phì và hạ đường

huyết, cải thiện đáng kể dung nạp glucose Hai hợp chất này cũng ức chế đáng kể tăng cân và giảm các thông số máu như nồng độ glucose, cholesterol và triglycerid Các dẫn chất này đồng thời có tác dụng hạ đường huyết và tác dụng hạ triglicerid, cholesterol huyết [9, 10]

Các nghiên cứu này mở ra hướng phát triển các thiazolidindion dùng như

những thuốc điều hòa lipid máu, chống béo phì, giảm thiểu các bệnh về tim mạch

Với các kết quả nghiên cứu khoa học đã được công bố trên đây, cho thấy tiếp cận các dẫn chất TZD là một hướng nghiên cứu đầy tiềm năng để thiết kế các dược chất có hoạt tính sinh học trên đái tháo đường và ung thư Chúng tôi hi vọng, luận văn sẽ góp phần làm phong phú hơn các dẫn chất của TZD và tìm ra được những dược chất có tác dụng sinh học tốt có thể ứng dụng được trong lâm sàng

Mameli E và Zorgi L tìm ra năm 1954, với hiệu suất tương đối cao và dễ thực hiện [25]

HN C SH

NH2 + ClCH2 COOH -NH4 Cl S NH

O

O Phản ứng xảy ra theo hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: Tạo 2-imino-thiazolidin-4-on:

NH

Giai đoạn 2: Thủy phân 2-imino-thiazolidin-4-on dưới tác dụng của acid

clohydric mới sinh ở giai đoạn 1:

S NHO

NH

+HCl; +H2O -NH4Cl S NH

O

O

1.2.2 Phương pháp tổng hợp dẫn chất 5-arylidenthiazolidin-2,4-dion

1.2.2.1 h năng tham gia ph n ứng của thiazolidin-2,4-dion

Nhân thizolidin-2,4-dion có nhóm imid (–NH) ở vị trí số 3 và nhóm methylen (-CH2) ở vị trí số 5 có hydro linh động và dễ tham gia phản ứng Nhóm methylen ở vị trí số 5 có khả năng tham gia các phản ứng thế vào phản ứng ngưng

tụ [3] Trong đó, phản ứng ngưng tụ giữa hydro linh động của nhóm –CH2 và aldehyd (phản ứng ngưng tụ aldol) là phản ứng quan trọng được ứng dụng để tổng hợp các dẫn chất thế ở vị trí số 5 của thiazolidin-2,4-dion

1.2.2.2 Ph n ứng ngưng tụ Aldol

Đây là phương pháp tổng hợp 5-arylidenthiazolidin-2,4-dion bằng cách ngưng tụ thiazolidin-2,4-dion với các aldehyd thơm (Ar-CHO) [3]:

S NH

S NH CHO

O

O +

- Giai đoạn đầu (giai đoạn cộng hợp aldol): tạo dẫn chất dimer (môi trường kiềm)

- Giai đoạn tiếp theo là dehydrat hóa tạo alken

b Điều kiện phản ứng

- Xúc tác: Xúc tác base thường được sử dụng làm xúc tác cho phản ứng

aldol Kiềm mạnh cũng xúc tác cho quá trình dehydrat hóa Vì vậy, nếu mục đích của quá trình là cộng hợp aldol thì nên sử dụng muối kim loại kiềm của các acid yếu như acid HCN, phosphoric, carbonic làm xúc tác Với các aldehyd có khả năng phản ứng mạnh, có thể sử dụng các amin bậc nhất hoặc bậc hai làm xúc tác: pyrolidin, Piperidin, piperazin Xúc tác acid ít được sử dụng

- Dung môi: thường dùng là methanol hoặc ethanol có thể pha loãng bằng

nước nếu cần Trong nhiều trường hợp có thể sử dụng tetrahydrofuran, dimethoxyethan, dimethylformamid và dimethylsulfocid

1,2 Nhiệt độ: Phản ứng aldol thường thực hiện ở nhiệt độ thấp, ít khi vượt quá

nhiệt độ phòng

- Thời gian: thường được phản ứng ở 1-5 giờ Các phản ứng có cản trở

không gian có thể phải thực hiện ở 12-20 giờ

- Tỷ lệ mol: Tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng thường là 1:1

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

 Bình chạy sắc kí lớp mỏng và bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh

 Máy đo nhiệt nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital), máy khuấy từ gia nhiệt, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm, máy hút chân không

 Máy GX - Perkin Elmer - USA đo phổ hồng ngoại, máy LTQ Orbitrap

XLTM và Agilent 6310 Ion Trap đo phổ khối lượng, máy Bruker Avence - 500MHz

đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ cộng hưởng từ carbon

2.3 Nội dung nghiên cứu

O

O S

2.3.2 Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp

Kiểm tra độ tinh khiết

Khẳng định cấu trúc

2.3.3 Th tác dụng inh học của các chất tổng hợp được

 Tác dụng ức chế HDAC của tế bào ung thư đại trực tràng

 Tác dụng độc trên tế bào ung thư đại trực tràng

 Tác dụng ức chế PTP1B

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2 4 Phương pháp tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

 Tổng hợp 6 dẫn chất 4a-f bằng phương pháp hóa học

 Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được

 Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng

 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy

ẩm

 Phổ khối (MS): được ghi tại khoa Hóa, trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Hà nội trên máy LTQ Orbitrap XLTM

và viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam trên máy Agilent 6310 Ion Trap với chế độ ESI

 Phổ 1H-NMR và 13C-NMR: được ghi trên máy Bruker Avence – 500MHz tại viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam sử dụng DMSO làm dung môi, chất chuẩn nội là tetramethylsilan (TMS)

2 4 3 Phương pháp th tác dụng inh học

2.4.3.1 Thử tác dụng ức chế HDAC

Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thư đại tràng SW620 Phân tích dựa trên Western Blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng

Nguyên liệu và nuôi cấy tế bào:

Các tế bào ung thư đại tràng (SW620) được nuôi cấy trong môi trường RPMI (bổ sung L-glutamin, 10% huyết thanh bào thai bò FBS (fetal bovine serum)), gọi là môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh (complete medium) Tất cả các tế bào được ủ ở

37oC với 5% (w/v) CO2 và 95% (w/v) không khí

Trước khi sử dụng, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan trong DMSO

để tạo dung dịch gốc nồng độ 10 mg/mL Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh để tạo các dung dịch làm việc ở nồng độ 10μg/mL

Phân lập histon và Western Blot

Tế bào SW620 (khoảng 1 x 106) được ủ với mẫu thử trong 24 giờ, song song làm mẫu trắng (mẫu tế bào không ủ với mẫu thử) Sau đó, các tế bào được xử lý và rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý có đệm phosphat

Tiếp theo, tế bào được dung giải trong dung dịch dung giải đệm (20 mM Tris-HCl (pH 7,5); 150mM NaCl; 1mM Na2EDTA; 1mM EGTA; 1% triton; 2,5%

Na pyrophosphate; 1 mM β-glycerophosphat; 1mM Na3VO4; 1 μg/mL leupeptin), ủ trong đá 15 phút Hỗn dịch được ly tâm và phần dịch được thu hồi để tiến hành điện

di trên gel

Histon được điện di qua gel SDS-PAGE 10% và chuyển vào màng PVDF Các màng được ủ qua đêm cùng kháng thể 1 là kháng acetyl histon H3, kháng acetyl histon H4 (milipore), tiếp theo ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG thỏ liên hợp peroxidase của ngựa trong 2 giờ

Các dải có phản ứng dương tính được phát hiện nhờ sự phát quang đã được tăng cường Các thí nghiệm được làm lặp lại ít nhất 3 lần một cách độc lập

2.4.3.2 Thử độc tính tế bào

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (độc tính tế bào) in vitro được thực hiện

tại khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị IC50 được tính trên phần mềm GraphPad Prism

 Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng) Dòng tế bào ung thư được sử dụng từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco s minimum essential medium) hoặc môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò)

 Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp MTT theo các bước sau:

Bư c 1: Chu n bị

Các tế bào ở pha logarit được tripsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM hoặc RPMI bổ sung 10% FBS Điều chỉnh nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200µl, các đĩa sau đó được ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2

Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 µL môi trường DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/ mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 µL mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau Các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sau cho nồng

độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%

Bư c 2: Tiến hành thử

Sau 48 giờ ủ, thêm vào mỗi giếng 20 µL thuốc nhuộm MTT (nồng độ MTT 5 mg/ mL trong muối đệm phosphat – PBS) Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2 Tiếp theo mỗi giếng được cho 100 µL dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan được hòa tan Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm

Bư c 3: Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism

Trong phương pháp thử này, IC50 20 µg/ ml được coi là có hoạt tính

2.4.3.3 Thử tác dụng ức chế PTP1B

Tác dụng ức chế PTP1B được đánh giá trên mô hình in vitro Được thực hiện

tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Dược Hà nội

Nguyên vật liệu

 Mẫu thử: 6 chất tổng hợp 4a-f

 Bộ kít định lượng PTP1B do hãng Biomol International L.P (Mỹ) cung cấp Trong đó, bao gồm enzym PTP1B, cơ chất IR5, BIOMOL Red Reagent và các dung dịch đệm cần thiết khác

Tiến hành

Dựa vào phản ứng dephosphoryl phân tử tyrosin đã được phosphoryl hóa (pTyr1158) trong tiểu đơn vị  của receptor của insulin (IR) khi có mặt protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) Phần phosphat tự do (Pi) tạo ra từ phản ứng này được định lượng dựa trên phản ứng giữa xanh malachit, ammonium molybdat và Pi trong môi trường acid (phương pháp định lượng xanh Malachit kinh điển: classic malachite green reagent) tạo xanh malachit phosphomolybdat Định lượng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 620

nm Lượng xanh malachit phosphomolybdat tạo thành tỷ lệ thuận với lượng phosphat tự do (Pi) có trong hỗn hợp phản ứng

Tính kết quả

Tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của PTP1B được tính theo công thức:

Trong đó: I là tỷ lệ phần trăm ức chế hoạt động của enzym

Achứng = mật độ quang của lô chứng - mật độ quang của lô chứng trắng

Athử = mật độ quang của lô mẫu thử

`CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

O +

O O

N H

O O

O

iii

N H

O O

O

4a-f

NH S O

Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất 4a-f

Ghi chú: i) HCl, H 2 O, hồi lưu, 2h; ii) 2-bromoethanamin, DMF, TEA, 25 o C, 24h; iii) p-hydroxybenzaldehyd, MeOH, K 2 CO 3 , hồi lưu, 24h; iv) thiazolidin-2,4-dion, EtOH, piperazin, 80 o C, 24h

Tiến hành phản ứng:

Cho 9.45g (0.1mol) acid monocloroacetic và 7.6g (0.1mol) thioure vào bình cầu dung tích 500ml Thêm 100ml nước cất, lắp sinh hàn, đun hồi lưu bằng bếp điện có áo bọc Sau khi dung dịch sôi khoảng 1h, rót tiếp 10ml HCl 10% qua sinh

hàn vào bình cầu Tiếp tục hồi lưu thêm 2h nữa Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM : MeOH : AcOH = 90 : 10: 1

Xử lý hỗn hợp phản ứng:

Rót hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ, để vào tủ lạnh, sẽ xuất hiện các tinh thể Để kết tinh lạnh trong 24h Lọc tủa qua phễu lọc Buchner, rửa 2 lần với 50ml nước cất lạnh

Tẩy màu: chất rắn sau khi thu được, được hòa tan trong 50ml nước nóng, thêm 50mg than hoạt, dùng đũa thủy tinh khấy nóng 10 phút Lọc qua phễu lọc Buchner, rửa 2 lần với 10ml nước nóng Dịch lọc thu được đổ vào cốc có mỏ, để vào tủ lạnh trong 24h Sản phẩm sẽ kết tinh, màu trắng ánh vàng Lọc dung dịch qua phễu lọc Buchner, rửa tủa 3 lần với 10ml nước lạnh Thu được TZD

O O

+ H 2 N

Br

S N

a Tổng hợp N-(2-bromoethyl)benzensulfonamid (2a)

- Tiến hành phản ứng:

Cho 0.3ml benzensulfoclorid (1a) (d=1.184g/ml) tương đương với 2mmol và

2ml DMF vào bình cầu dung tích 50ml, làm lạnh dung dịch bằng nước đá Thêm 450mg (2.2 mmol) 2-bromoethanamin vào bình cầu Tiếp tục thêm từ từ 0.6ml TEA, lắc đều trong hỗn hợp nước đá sao cho màu của dung dịch không được đậm lên Phản ứng được tiến hành trong nhiệt độ phòng, kết hợp khuấy từ 200

vòng/phút, thời gian 24h Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM : MeOH

= 40 : 1

- Xử lý phản ứng:

Thêm dần 10ml dung dịch nước lạnh, tiếp tục acid hóa với 10ml dung dịch HCl 5% (kiểm tra bằng giấy quỳ vạn năng) Chiết thu sản phẩm 3 lần bằng dung môi dicloromethan, mỗi lần 5-10ml dung môi Thu lớp dung môi, làm khan bằng

Na2SO4 Gộp dịch chiết của 3 lần Cất quay thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không ở 40oC đến khi thu được sản phẩm Sấy sản phẩm ở 60oC trong 4h Thu

và 450mg (2.2mmol) 2-bromoethanamin Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý

tương tự như tổng hợp dẫn chất 2a Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện tủa

màu trắng Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô Kết quả thu được như sau:

và 450mg (2.2mmol) 2-bromoethanamin Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý

tương tự như tổng hợp dẫn chất 2a Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện tủa

màu trắng Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô Kết quả thu được như sau:

 Khối lượng dẫn chất 2c: 0.43g

 Cảm quan: màu trắng đục

 Hiệu suất: 73%

 Nhiệt độ nóng chảy: 145-1470C

d Tổng hợp N-(2-bromoethyl)-4-clorobenzensulfonamid (2d)

Dẫn chất 2d được tổng hợp từ 0.42g (2mmol) 4-clorobenzensulfoclorid (1d)

và 450mg (2.2mmol) 2-bromoethanamin Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý

tương tự như tổng hợp dẫn chất 2a Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện tủa

màu trắng Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô Kết quả thu được như sau:

lý tương tự như tổng hợp dẫn chất 2a Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện

tủa màu trắng Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô Kết quả thu được như sau:

và 450mg (2.2mmol) 2-bromoethanamin Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý

tương tự như tổng hợp dẫn chất 2a Phần xử lý: sau khi cho HCl 5%, xuât hiện tủa

màu trắng Lọc tủa bằng phễu thủy tinh và sấy khô Kết quả thu được như sau:

Sản phẩm trung gian 2a-f được sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp tạo các dẫn chất 3a-f

3.1.1.3 Tổng hợp N-(2-(4-formylphenoxy)ethyl)benzensulfonamid và dẫn chất (3a-f)

Sơ đồ tổng hợp

S

N H

Br

O O

+ HO

CHO

S N H

a Tổng hợp N-(2-(4-formylphenoxy)ethyl)benzensulfonamid (3a)

- Tiến hành phản ứng:

Hoạt hóa hydroxybenzaldehyd: cân hỗn hợp phản ứng gồm 240mg (2 mmol) p-hydroxybenzaldehyd cùng 286mg K2CO3 vào trong bình cầu 50ml Thêm tiếp 10ml dung môi MeOH và gia nhiệt lên 80oC Quá trình hoạt hóa diễn ra trong vòng 30-60 phút

Hòa tan 0.42g (2mmol) tinh thể N-(2-bromoethyl)benzensulfonamid (2a)

trong 10ml dung môi MeOH, dùng pipet hút và đưa từ từ vào dung dịch đã được hoạt hóa Giữ nhiệt độ ở 80oC, tốc độ khấy từ 200 vòng/phút, hồi lưu trong khoảng 24h Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM : MeOH = 40 : 1

- Xử lý phản ứng:

Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 40oC Thêm từ từ 20ml dung dịch acid HCl 5% đã được làm lạnh vào hỗn hợp phản ứng, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, xuất hiện tủa màu vàng nhạt Lọc tủa qua phễu thủy tinh, rửa 4 lần với 15ml nước cất đến khi dịch lọc trung tính (thử với giấy quỳ vạn năng) Sấy khô tủa ở 60oC trong khoảng 48h Thu được chất 3a

Dẫn chất 3b được tổng hợp từ 0.60g (2mmol) clorobenzensulfonamid (2b) và 240mg (2 mmol) p-hydroxybenzaldehyd Quá trình tiến hành phản ứng và xử lý tương tự như tổng hợp dẫn chất 3a Kết quả thu được

trình tiến hành phản ứng và xử lý tương tự như tổng hợp dẫn chất 3a Kết quả thu

O

S N

a Tổng hợp N-(2-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)

ethyl)benzensulfonamid (4a)

Tiến hành phản ứng:

Cân 0.2g (xấp xỉ 0.7mmol) N-(2-(3-formylphenoxy)ethyl)benzensulfonamid

(3a) cùng với 120mg (1mmol) thiazolidin-2,4-dion vào bình cầu 50ml Thêm tiếp

5ml EtOH khan và 0.12ml piperazin vào bình cầu Gia nhiệt 80oC, tốc độ khuấy từ

300vòng/phút, lắp sinh hàn, hồi lưu trong 24h Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1

Xử lý phản ứng

Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 40oC Đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ đã có sẵn 10ml HCl 5% được làm lạnh Khuấy nhẹ hỗn hợp bằng đũa thủy tinh và thêm từ từ 10ml nước cất đã được làm lạnh Tráng rửa bình cầu bằng nước cất Tất cả dung dịch thu được làm lạnh trong 12h để sản phẩm tủa hoàn toàn Lọc tủa bằng phễu thủy tinh, rửa bằng nước lạnh tới khi dịch lọc trung tính

Sản phẩm được kết tinh lại trong dung môi EtOH Tinh thể 4a thu được đem

sấy khô ở 60oC trong 48 giờ

Sản phẩm được kết tinh lại trong dung môi EtOH Tinh thể 4b thu được đem

sấy khô ở 60oC trong 48 giờ Kết quả thu được như sau: