Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của hạt vải (semen litchi chinnensis)

2 tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của hạt Vải Semen Litchi chinensis’’ với 3 mục tiêu sau: 1.. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả tấm lòng, em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy

PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và

truyền đạt những những kinh nghiệm quý báu cũng như đã động viên, hỗ trợ em về mọi mặt trong quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin bày tỏ lòng ngưỡng mộ và lời cảm ơn sâu sắc đến TS Phương

Thiện Thương, người đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ cho em rất nhiều cũng

như truyền đạt cho em những kinh nghiệm, động viên em những lúc khó khăn nhất trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn quí Thầy Cô và các anh chị em kỹ thuật viên

bộ môn Dược học cổ truyền, trường đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều

kiện cho em thực hiện luận văn này

Xin cám ơn chân thành tới các anh chị em khoa Hóa phân tích và khoa

Dược lý- Viện Dược liệu, các bạn trong tập thể chuyên ngành Dược học cổ truyền lớp CH16 đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian qua

Xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện cho tôi học tập, là động lực lớn giúp tôi vượt qua mọi khó khăn

Một lần nữa xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến quý thầy cô, các bạn sinh viên và gia đình đã quan tâm, động viên và giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Hà nội, ngày 20 tháng 8 năm 2013 Học viên

Phạm Thị Anh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố của chi Litchi Sonn 3

1.1.1 Vị trí phân loại chi Litchi Sonn 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Litchi Sonn 3

1.2 Cây Vải (Litchi chinensis Sonn.) 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây Vải Litchi chinensis Sonn 4

1.2.2 Thành phần hóa học của cây Litchi chinensis Sonn 5

1.2.3 Tác dụng sinh học 11

Chương 2: NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu 16

2.2 Phương tiện 17

2.2.1 Động vật thí nghiệm 17

2.2.2 Thiết bị 17

2.2.3 Hóa chất 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Xác định mẫu nghiên cứu 18

2.3.2 Phương pháp chiết xuất 19

2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 20

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học 21

2.3.5 Phương pháp phân lập các chất 26

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu 28

3.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học 29

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu hạt vải bằng phản ứng

hóa học 29

3.2.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải 37

3.4 Kết quả khảo sát tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan 45

3.4.1.Chiết xuất để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa 45

3.4.2.Thử nghiệm dọn gốc DPPH ……… 47

3.4.3 Kết quả khảo sát tác dụng bảo vệ gan 48

3.5 Phân lập các chất 52

3.5.1 Phân lập bằng phương pháp sắc ký cột 52

3.5.2 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định sự có mặt của chất phân lập trong dược liệu 55

3.5.3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được 58

Chương 4 BÀN LUẬN 65

4.1 Xác định mẫu nghiên cứu 65

4.2 Về thành phần hóa học 65

4.3 Về tác dụng sinh học 66

4.4 Các chất phân lập được 70

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

resonance

Phổ cộng hưởng proton

MeOH Methanol Dung môi metanol

resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1: Tóm tắt thành phần hóa học của quả Vải 8

2

Bảng 1.2: Thành phần dinh dƣỡng trong củi Vải

6 Hình 3.6 Sắc ký đồ của phân đoạn n-hexan với hệ 2 42

7 Hình 3.7 Sắc ký đồ của phân đoạn ethyl acetat với hệ 1 43

8 Hình 3.8 Sắc ký đồ của phân đoạn n- butanol với hệ 1 44

9 Hình 3.9 Sơ đồ chiết các phân đoạn từ hạt Vải 46

10 Hình 3.10 Đồ thị kết quả hoạt tính dọn gốc tự do DPPH

11 Hình 3.11 Sơ đồ phân lập chất tinh khiết 55

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bắt đầu vào khoảng năm 1950, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu nguyên nhân gây ra hàng loạt những bệnh nguy hiểm, nổi cộm như suy tim, đột quỵ, viêm khớp, viêm gan, tiểu đường, rối loạn thần kinh…, trầm trọng nhất là bệnh ung thư với mức độ ngày càng gia tăng và phổ biến, mặc

dù điều kiện sống ngày càng được nâng cao Kẻ thù đáng nghi ngờ đầu tiên chính là các tác nhân hóa học có sức phá hủy mạnh được gọi là các gốc tự do [29], [30]

Mãi đến những năm 80 của thế kỷ XX, con người mới chú ý đến vũ khí tiềm năng có khả năng loại bỏ các gốc tự do, đó là các hoạt chất chống oxy hóa trong thực vật Hiện nay đã tìm ra rất nhiều bệnh liên quan đến gốc tự do [35], [64] Vì vậy xu hướng đi tìm kiếm nguồn tài nguyên có tác dụng chống oxy hóa đang trở nên cần thiết

Vải (Litchi chinensis Sonn., Sapindaceae) là loài cây cận nhiệt đới và

nhiệt đới, được trồng khá phổ biến trên nhiều quốc gia Tại Việt Nam nói chung và khu vực Miền Bắc nói riêng diện tích các vùng trồng cây Vải rất lớn Thực tế cho thấy quả Vải giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc gia và nông dân địa phương Là một phần trong quả Vải thì hạt Vải (chiếm 10- 20% tổng trọng lượng quả) được xem là rác thải và loại bỏ, mặc

dù nó đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ… [22], [68] Một số công trình nghiên cứu mới đây đã chỉ ra rằng hạt Vải có nhiều tác dụng dược lý như hạ glucose huyết và hạ lipid máu, chống oxy hóa, chống virus, chống ung thư,… [41], [45], [51], [69]

Các tác dụng này có liên quan đến khả năng loại bỏ các gốc tự do của nhiều hợp chất polyphenol, saponin, flavonoid, chất béo… đã được công bố phân lập từ hạt Vải và nhiều dược liệu khác [29], [32], [52], [69] Để có thêm

cơ sở khoa học cho việc sử dụng hạt Vải trong y học và góp phần tìm kiếm nguồn Dược liệu có tác dụng chống oxy hóa, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

2

tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ

gan của hạt Vải (Semen Litchi chinensis)’’ với 3 mục tiêu sau:

1 Khảo sát thành phần hóa học của hạt Vải

2 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan

3 Phân lập đƣợc 2- 3 chất

Liên bộ cam (Rutanae)

Bộ bồ hòn (Sapindales)

Họ bồ hòn (Sapindaceae)

Chi Litchi Sonn

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Litchi Sonn

Cây gỗ, hoa đực và hoa cái trên cùng một cây Lá kép lông chim, mọc

so le Cụm hoa hình chùy, lông vàng Lá bắc nhỏ Hoa đơn tính, đối xứng tỏa tròn, đĩa tuyến mật ở bên ngoài vòng nhị Đài hoa 4-5 thùy, mở nắp Không

có cánh hoa Nhị 6-8 có lông, thò ra ngoài Bầu nhụy hình tim ngược, 2-3 ngăn, mỗi ngăn 1 noãn Quả hình trứng hoặc gần hình cầu, vỏ quả mỏng, có vết rạn đôi khi gần như trơn Hạt hình trứng, vỏ hạt màu nâu, phôi thẳng 2n =

28, 30 [11], [22], [25]

Chi Litchi Sonn chỉ có một loài trên thế giới là Litchi chinensis Sonn

và 3 phân loài [8], [22], [24], [25]

* Litchi chinensis ssp chinensis, syn: Dimocarpus litchi Lour (1790),

Litchi sinense J.Gme’lin (1791), Nephelium litchi Cambess (1892) Phân loài

này có nguồn gốc ở Bắc Việt Nam Hiện nay được trồng nhiều ở Việt Nam và Nam Trung Quốc Vải trồng ở Việt Nam có nhiều giống song đáng lưu ý nhất

là “Vải thiều” trồng ở vùng đồng bằng thuộc huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương, hiện đã phát triển ra các tỉnh khác

* Litchi chinensis ssp javensis Leenth: L.chinensis Sonn glomeriflora

Radlk (1932) Loài này mới chỉ thấy trồng ở phía tây đảo Java (Indonesia) và Nam Đông Dương (Campuchia và Nam Việt Nam)

1.2 Cây Vải (Litchi chinensis Sonn.) [24], [25]

Tên đồng nghĩa: Euphoria litchi Desf

Euphoria litchi Juss

Dimocarpus litchi Willd

Sapindus litchi Roxb

Tên địa phương:

Bengali (lichi)

Trung Quốc (lizi, jingli, huoshan, danli)

Tiếng Anh (lychee nut, litchi, lychee)

Pháp (quenèpe chinois, quenepier chinois, litchi dechine, litchi )

Đức (Chinesische Haselnuß, litchipflaume)

Indonesian: (klengkeng, litsi, kalengkeng)

Lào (Sino-Tibetan)

Malay (laici, kelengkang)

Việt Nam: Vải, Cây Vải, Tu hú

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây Vải Litchi chinensis Sonn

1.2.1.1 Đặc điểm thực vật [8], [11], [22], [24], [25]

Cây nhỡ hoặc cây to, cao khoảng 8-15 m, vỏ thân màu xám đen Cành tròn, tán lá rộng Lá kép lông chim, mọc so le, cuống lá dài 10-15 cm Lá chét dày 2, 3 hoặc 4 cặp, cuống lá chét dài 7-8 mm, phiến lá hình mũi mác hoặc

5

hình trứng mác, gốc tròn, đầu nhọn Hoa xếp thành hình chùy ở ngọn cành Đài hoa có lông vàng Hoa không có tràng Nhị 6-7 đôi khi là 8, dài 4mm Bầu nhụy có lông Quả màu đỏ nâu khi chín, hình cầu hoặc gần hình cầu Lớp

vỏ quả sần sùi, có vết rạn đôi khi trơn, bên trong là lớp áo hạt màu trắng đục,

là phần ăn được của hạt Vải và có giá trị dinh dưỡng cao Hạt cứng, bên ngoài màu nâu, bóng, bên trong màu trắng, có hình dạng và kích thước hạt rất khác nhau tùy thuộc vào điều kiện trồng và chăm sóc

Mùa hoa: tháng 3-4, mùa quả: tháng 5-6

1.2.1.2 Phân bố của cây Litchi chinensis Sonn

Bản địa: Trung Quốc, Malaysia, Việt Nam

Di thực: Úc, Brazil, Honduras, Hong Kong, Ấn Độ, Israel, Madagascar, Mauritius, Mexico, Myanmar, New Zealand, Reunion, Bắc Châu Phi, Đài Loan, Tỉnh thuộc Trung Quốc, Thái Lan, Zanzibar [56]

Hình 1.1 Bản đồ phân bố cây Vải (Litchi chinensis) trên thế giới

1.2.2 Thành phần hóa học của cây Litchi chinensis Sonn

Cho tới nay thành phần hóa học của cây Vải (Litchi chinensis Sonn.) đã

được nhiều nghiên cứu công bố Các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào nghiên cứu nhóm chất là các polyphenol, saponin, terpenoid Trong đó các

H

O OH OH O O

H OH

O

H

O OH OH O O

H OH

OH OH HO

Pinocembin-7-O-neohesperidosid

O

O OH

O

H

O OH OH

HO

OH

OH O

O

H

HO

OH OH OH

Taxifolin 4’-O-β-glucopyranosid

O

O OH

O

H

O OH

OH

O O

H OH

H

O OH OH OH

O

H

O OH

OH OH

O

OCH3

Tamarixetin 3-O-rutinosid

7

O HO

HO

OH

H O

2a, 3a-epoxy-5,7,3’

,4’-tetrahydroxylflavan-(4b-8-catechin)

O HO

HO

OH

H O

HO

OH

O

OH HO

OH

OH

2b, 3b-epoxy-5,7,3’,4’ tetrahydroxylflavan-(4a-8-epicatechin)

-O HO

OH

OH

OH OH

α- epicatechin

O HO

α- gallocatechin

OH

O O HO

HO

OH OH

Funingensin A

O

O OH

O O OH

HO

OH OH O

HO OH OH

Pumilasid A

8

O

O

O OH

HO

OH

OH

OH OH

epicatechin-3-gallate

O HO

OH

OH O

OH OH

OH

OH OH

phlorizin (2S)-pinocembrin-7-O-(6 –O-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranosid)

(2R) naringenin-7-O-(3-O-α-L- β-D-glucopyranosid)

rhassmnopyranosyl-2a,3a-epoxy-5,7,3’,4’ catechin)

-tetrahydroxyflavan-(4b-8-2b,3b-epoxy-5,7,3’,4’epicatechin)

-tetra-hydroxyflavan-(4a-8-Hạt

9

vỏ quả Procyanidin B2

Procyanidin B4 procyanidin A1 procyanidin A2 procyanidin A6 litchitanin A1 [epicatechin-(2β → O → 7,4 β → 6)-epicatechin-(2β → O → 7,4 β → 8)-catechin]

Hạt

litchitanin A2 [epicatechin-(2β → O → 7,4 β → epicatechin-(2β → O → 7,4 β → 6)-epicatechin]

6)-epicatechin-(2β → O → 7,4 β → (4α → 8)-epicatechin

vỏ quả, hạt

quả, hạt α-epicatechin-3-gallat

Acid protocatechuic daucosterol

stigmasterol (-)-epicatichin

quả, hạt α-gallocatechin

α-epicatechin-3-gallat

10

quả Malvidin-3-glucosid

acid linoleic acid palmitic acid stearic Sesquiterpene

glucosid [65],

[53]

litchiosid A litchiosid B Pumilasid A funingensin A

Cùi Vải là phần bao bên ngoài của hạt (áo hạt), đây là phần ăn được, có giá trị dinh dưỡng cao Cùi Vải chứa đường khử, acid citric, acid ascorbic, protein, chất béo, acid nicotic, riboflavin, caroten và các nguyên tố vi lượng như calci, sắt, phospho [25]

11

Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng trong củi Vải

(giá trị tương đương trong 100g)

Thân cây và rễ Vải có nhiều tanin, cyanidin diglycosid, và một chất

anthoxanthin dùng làm nguyên liệu trong các ngành công nghiệp

1.2.3 Tác dụng sinh học

1.2.3.1 Tác dụng theo y học cổ truyền

Theo y học cổ truyền, hạt Vải có tên là Lệ chi hạch, có vị ngọt, chát, tính

ôn, không độc, có tác dụng lý khí chỉ thống, tán hàn, thấp kết khí Chủ trị các chứng: hàn sán phúc thống, cao hoàn đau sưng, can khí uất trệ, vị quản cửu

Một số bài thuốc sử dụng hạt Vải :

Bài 1: Bài thuốc chữa tinh hoàn sƣng đau [13], [16]

13

Bài 4: Bài thuốc chữa răng sưng đau có sâu [8]

Hạt Vải sấy khô, tán bột, xát vào răng bị đau nhiều lần trong ngày

1.2.3.2 Tác dụng theo y học hiện đại

Tác dụng sinh học của hạt Vải được đề cập đến nhiều nhất là các tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, hạ glucose huyết Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân lập các chất từ dược liệu, sau đó thử tác dụng sinh học của các chất phân lập được Một số tác dụng đáng chú ý như:

a Tác dụng chống oxy hóa [33], [46]

Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập được một số

anthocyanidin, sau đó thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử

nghiệm DPPH, TEAC Kết quả cho thấy 3 chất: 2a,3a-epoxy-5,7,3’,4’tetrahydroxyflavan-(4b-8-catechin);2a,3a-epoxy-5,7,3’,4’-etrahydroxyflavan-(4b-8)-epicatechin;2b,3b-epoxy-5,7,3’,4’-tetra-hydroxyflavanm-(4a-8-

-epicatechin) có tác dụng chống oxy hóa ở mức độ trung bình [51]

Một nghiên cứu khác thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử

nghiệm DPPH, lipid peroxydation, total antioxidant đối với các dịch chiết từ hạt Vải: ethanol, 50% ethanol, methanol, 50% methanol, nước Kết quả cho thấy dịch chiết 50% ethanol có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [45]

Ngoài ra, tác dụng chống oxy hóa còn được báo cáo ở phần cùi Vải ( lớp

áo hạt) và vỏ quả Vải [33], [50]

Nghiên cứu in vitro trên thử nghiệm DPPH, các polysaccaris trong thành

phần của cùi Vải có tác dụng phụ thuộc vào nồng độ Thành phần này còn có khả năng tạo phức và làm giảm điện năng Do đó có khả năng ức chế anion superoxide và gốc hydroxyl

Trong vỏ quả Vải (LFP) bao gồm số lượng đáng kể các chất flavonoid Các flavonoid chính trong vỏ quả Vải chín bao gồm flavonol và anthocyanins Các flavanol lớn trong LFP được báo cáo là procyanidin B4, procyanidin B2

và epicatechin, trong khi cyanindin-3-rutinsid, cyanidin-3-glucosid,

quercetin-14

3-rutinosde và quercetin-3-glucosid đã được xác định là những anthocyanins quan trọng Flavanol và anthocyanins của vỏ quả cho hoạt động chống oxy hóa rất tốt

b Tác dụng chống ung thư

Quả Vải chứa một lượng lớn các flavanoid và proanthocyanidin Vỏ quả của nó đã được chứng minh có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư vú và gan [39]

Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập được: Litchiosid D (1), taxifolin-4-O-β-glucopyranosid (2), kaemferol 7-neohesperidosid (3),

pulmilasid A (4) Sau đó thử tác dụng gây độc trên in vitro đối với các dòng tế

bào A549, LAC, Hep-G2, HeLa bằng thử nghiệm đo màu MTT ở bước sóng 570nm, chất đối chiếu admycin Kết quả cho thấy chất (1), (2), (3), (4), đều có tác dụng ức chế các dòng tế bào thử nghiệm [65], [66], [67]

c Tác dụng hạ đường huyết

Từ dịch chiết ethanol 50% của hạt Vải, chiết phân đoạn với CHCl3, butanol; phần n-butanol chia thành 2 phần: phần tan trong nước (WS), phần không tan trong nước (WI) Sau đó thử nghiệm tác dụng ức chế α-glucosidase

n-trên in vitro đối với dịch chiết ethanol 50%, các phân đoạn, phần WS, WI Kết

quả cho thấy: dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh, phân đoạn n-butanol

có tác dụng mạnh nhất so với các phân đoạn, WI tác dụng mạnh hơn WS [60]

Từ dịch chiết ethanol 70% của hạt Vải, đã phân lập được α- (methylenecyclopropyl) glycine, sau đó thử tác dụng trên chuột thấy có tác dụng hạ đường huyết, giảm nồng độ glycogen ở gan [28]

Từ cao chiết ethanol 50% của hạt Vải, thử tác dụng hạ đường huyết trên

mô hình gây tăng đường huyết bằng alloxan ở chuột nhắt trắng với liều uống 1,5g và 3g cao/ kg thể trọng/ ngày (tương đương với 10g và 20g dược liệu khô), trong 8 ngày liên tục Thấy tác dụng hạ đường huyết ở liều 1,5g cao/ kg thể trọng/ ngày có tác dụng mạnh hơn [10]

15

Nghiên cứu cơ chế dược lý của dịch chiết hạt Vải (SL) về tăng cường độ nhạy insulin loại trên chuột bị tiểu đường tuýp 2 (T2DR) với kháng insulin (IR) Kết quả cho thấy SL có thể làm giảm mức độ TNF-alpha, tăng insulin, đối kháng kháng insulin, tăng cường độ nhạy insulin, điều chỉnh loạn dưỡng lipid và tăng cường chống oxy hóa, cải thiện chức năng của gan và thận trong T2DR-IR [37]

d Tác dụng ức chế tyrosinase

Thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên in vitro đối với các dịch

chiết từ hạt Vải: ethanol, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh nhất [45]

e Một số tác dụng khác như tác dụng bảo vệ gan, chống viêm, kháng khuẩn

cũng đã được một số nghiên cứu báo cáo [20], [21], [23], [48]

16

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Hạt của cây Vải (Hình 2.2) được thu hái ở Thanh Hà - Hải Dương vào tháng 5 - 6 năm 2012 Mẫu cây được TS Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực

vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, giám định tên khoa học là: Litchi

chinensis Sonn., Họ Bồ hòn (Sapindaceae)

Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Mã tiêu bản: HNIP/17853/13 (Phụ lục 1)

Dược liệu sau khi làm sạch, được phơi khô, bảo quản trong túi nilon kín

để nơi khô ráo

Hình 2.2 Hình ảnh hạt Vải

17

2.2 Phương tiện

2.2.1 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 25,0

± 2,0 gam do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp

Động vật được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại phòng thí nghiệm từ 3 - 5 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu tại Khoa Dược lý - Viện Dược liệu

2.2.2 Thiết bị

2.2.2.1 Thiết bị để nghiên cứu thành phần hóa học và phân lập các chất

- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO)

- Cân phân tích (Sartorius, BP-221S)

- Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M)

- Tủ sấy (Memmert, ULM 500)

- Cân xác định độ ẩm (Sartorius, MA – 45)

- Máy cất quay chân không (Buchii, Rotavapor R – 220)

- Cột thuỷ tinh dùng cho sắc ký cổ điển

- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 365 nm (Vilber Lourmat, CN – 15 – LC)

- Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E

- Máy đo phổ hồng ngoại Impact 410 nicolet

- Máy AGILENT 1100LC-MSD Trap của Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên

- Brruke AM500FT-NMR Spectrometer của Viện hóa học thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm

2.2.2.2.Thiết bị nghiên cứu tác dụng sinh học

- Máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems (Đức)

- Máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout

2.2.3.1 Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu hóa học và chiết xuất

- Dichloromethan (DCM), ethyl acetat (EtOAc), chloroform, (CHCl3), methanol (MeOH), aceton, n-butanol (Trung Quốc, Merck) đạt tiêu chuẩn phân tích

- Bản sắc ký lớp mỏng Silica gel F254 tráng sẵn trên đế nhôm (Merck)

- Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063mm (Merck)

- Cồn 96% thực phẩm (Việt Nam)

- Các hóa chất dùng cho định tính sơ bộ thành phần hóa học được pha chế theo Dược Điển Việt Nam III (các chuyên luận thuốc thử)

2.2.3.2 Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học

- 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) của hãng Sigma (Mỹ)

- Quercetin của hãng Sigma (Mỹ)

- Carbon tetraclorid của hãng Placebo (CE) Dầu olive (Thailand) Silymarin (biệt dược Legalon) dạng viên nén, hàm lượng 70mg của hãng Madaus (Korea)

- Kít định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: AST, ALT, bilirubin toàn phần, của hãng DIALAB GmbH (Áo)

- Các hóa chất nghiên cứu dùng để xác định hàm lượng MDA trong gan: acid thiobarbituric, kaliclorid, acid tricloacetic của hãng Sigma (Mỹ)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định mẫu nghiên cứu [4], [15], [27]

- Thu mẫu cây khi mang hoa và dược liệu hạt Vải, làm tiêu bản mẫu cây, lưu giữ tiêu bản

- Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm

19

hình thái thực vật, so sánh với các khóa phân loại thực vật

- Dược liệu hạt Vải được xác định bởi đặc điểm vi học và các chỉ tiêu kiểm nghiệm theo các chuyên luận tương ứng của Dược điển Việt Nam IV [3], Dược điển Trung Quốc tiến hành cụ thể như sau:

+ Mẫu dược liệu dùng để nghiên cứu đặc điểm vi học được sấy khô ở nhiệt độ 60oC, nghiền thành bột mịn, bảo quản trong lọ có nút kín, ghi nhãn bảo quản nơi khô ráo

+ Quan sát trực tiếp, ngửi, nếm vị để xác định màu sắc, mùi, vị

+ Lên tiêu bản bằng dung dịch glycerin 5% trong nước, quan sát đặc điểm điển hình của bột dược liệu trên kính hiển vi, chụp ảnh, đối chiếu với

mô tả trong Dược điển Trung Quốc [26]

2.3.2 Phương pháp chiết xuất

2.3.2.1 Chiết xuất để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa

- Chiết dược liệu bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng 250- 350c với các loại dung môi chiết khác nhau:

+ Sử dụng Ethanol 50% để chiết xuất dược liệu, thu được dịch chiết toàn phần (HVT1)

+ Sử dụng Ethanol 80% để chiết được hầu hết các chất trong dược liệu (HVT2) Sau đó các chất chiết được trong dược liệu tiếp tục được phân tách thành các phân đoạn bằng các dung môi chiết có độ phân cực khác nhau

từ kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực lần lượt là: n- hexan, ethyl acetat, n- butanol Thu được 3 phân đoạn dịch chiết: phân đoạn n- hexan (HVH), phân đoạn ethyl acetat (HVE), phân đoạn n-butanol (HVB)

- Dịch chiết dược liệu được thu hồi dung môi, bảo quản trong tủ lạnh dùng cho việc xác định hoạt tính chống oxy hóa Kết quả thử nghiệm thu được sẽ định hướng cho các nghiên cứu hóa học và tác dụng sinh học kế tiếp

2.3.2.2 Chiết xuất cho nghiên cứu thành phần hóa học và phân lập các chất

Chiết xuất cho nghiên cứu thành phần hóa học: Sử dụng các quy trình

20

chiết chuyên biệt dựa vào độ tan của các chất trong dung môi khác nhau để loại bỏ các yếu tố cản trở phản ứng định tính, che lấp màu phản ứng, giúp nhận định kết quả có độ chính xác cao

Dựa vào kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa, kết hợp với kết quả nghiên cứu thành phần hóa học, lựa chọn phương pháp chiết xuất thích hợp để phân lập chất tinh khiết

2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.3.1 Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải

Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học theo phương pháp

nghiên cứu hóa thực vật và hóa học cây thuốc [4], [5], [6], [7], [9]

Rf tương ứng

Tiến hành theo Dược điển Việt Nam IV- phụ lục 5.4 [3]

Pha tĩnh: Bản mỏng tráng sẵn silica gel GF254 của hãng Merck được hoạt hóa ở nhiệt độ 1050C- 1100C trong 1 giờ

Pha động: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để tách tốt nhất Pha dung môi theo đúng tỷ lệ, đổ vào bình chạy sắc ký sao cho bề mặt dung môi cách vết chấm 0,8 cm Bão hòa dung môi trong bình chạy sắc ký, lót giấy lọc bên trong thành bình, đậy kín để yên trong 1 giờ

Chấm sắc ký: Hoà tan cắn trong methanol, chấm với 1 lượng dịch phù hợp Vết cách mép dưới bản mỏng 1,5 cm, cách bờ ít nhất 1cm

Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng trong bình sắc ký, đậy kín, để yên Khi vết dung môi cách mép trên bản mỏngkhoảng 2 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi, để bay hơi dung môi trong tủ hốt

Phát hiện vết: Quan sát ở 2 bước sóng λ=254 nm, λ=366nm, thuốc thử hiện màu

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học

2.3.4.1 Phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa in vitro

- Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH

Phương pháp được thực hiện theo Blois et al (1958) [57]

* Nguyên tắc của phương pháp

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của hầu hết dược

22

liệu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ= 517nm [17]

* Cơ chế dọn gốc tự do DPPH

Là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển gốc

tự do sang trạng thái ổn định Như vậy khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ khử gốc tự do DPPH làm cho dung dịch giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm [57]

Thí nghiệm được thực hiện như sau:

+ Mẫu nghiên cứu gồm: Cao ethanol 50% của hạt Vải, Cao ethanol 80% của hạt Vải, cao chiết hạt Vải các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat, n-

butanol Quy trình chiết xuất được trình bày theo mục 3.2.1

+ Pha dung dịch DPPH: Lấy 2mg DPPH pha trong 16,9 ml methanol

được dung dịch 1 Từ dung dịch 1 pha loãng gấp đôi được dung dịch có nồng

độ 150μM

+ Quercetin (chất đối chiếu)

+ Hỗn hợp phản ứng gồm:

90 μl DPPH 150 μM (pha trong methanol)

10 μl Mẫu thí nghiệm (pha trong methanol)

Hỗn hợp phản ứng được lấy như thể hiện ở bảng 2.3

Hoạt tính dọn gốc tự do DPPH tính theo công thức

HTDG (%) = [(OD mẫu chứng - OD mẫu thử)/OD mẫu chứng]×100

Để xác định giá trị IC50, là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế được 50% giải phóng các gốc tự do, mỗi mẫu thử có tác dụng được pha thành 5 thang nồng độ Giá trị IC50 của các mẫu được tính bởi phương pháp hồi qui tuyến tính của đồ thị biểu diễn phần trăm loại gốc tự do DPPH tương ứng với mỗi nồng độ của mẫu thử

24

2.3.4.2 Khảo sát tác dụng bảo vệ gan

- Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng carbon tetraclorid (CCl 4 )

Phương pháp được thực hiện theo Turner R.A (1965), có cải tiến phù

hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [17], [62]

- Nguyên tắc phương pháp khảo sát tác dụng bảo vệ gan:

+ CCl4 là một chất gây hủy hoại tế bào gan điển hình Bản thân CCl4không độc nhưng khi vào cơ thể, trong quá trình chuyến hóa, CCl4 tạo thành các gốc tự do, chính các gốc tự do này sẽ liên kết với lipid và các protein trên

hệ thống lưới nội mô của tế bào gan, gây phá hủy cấu trúc và chức năng của

hệ thống lưới, làm tổn thương gan [47], [55]

+ Mức độ tổn thương phụ thuộc vào liều lượng CCl4, dạng tổn thương thường tập trung chủ yếu ở vùng trung tâm tiểu thùy

+ Để thăm dò sự huỷ hoại tế bào gan thường xác định hoạt độ của các enzym transaminase trong huyết thanh Vì khi tế bào gan bị tổn thương các enzym này thường thay đổi sớm nhất và có tính chất đặc trưng Trong số đó

có hai loại enzym được chú ý nhất đó là: AST (Aspartat aminotransferase) và ALT (Alanin aminotransferase) [12], [14]

Ngoài hai enzym AST và ALT thì một số chỉ số sinh hoá khác trong huyết thanh như bilirubin, protein toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần, phosphatase kiềm cũng biến đổi khi gan bị tổn thương [18]

Để góp phần tìm hiểu cơ chế tác dụng của dược liệu có liên quan đến tác dụng chống oxy hoá hay không, thí nghiệm tiến hành định lượng đồng thời malondialdehyd (MDA), là sản phẩm sinh ra trong quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức trimethin (màu hồng) có độ hấp thụ cực đại ở = 532 nm

Nguyên tắc định lượng MDA: Định lượng MDA theo phương pháp

Wasowich và Balahoroglu [19], [63]

25

Mẫu nghiên cứu: Lựa chọn mẫu nghiên cứu dựa vào kết quả sàng lọc

tác dụng chống oxy hóa Tiến hành thí nghiệm với 2 mức liều tương đương với 5g dược liệu/ kg và 10 g dược liệu/ kg thể trọng chuột

Động vật: chuột nhắt trắng

Thực nghiệm:

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 12 con:

Lô 1 (chứng sinh học- Csh): Uống nước cất + tiêm dầu olive

Lô 2 (chứng bệnh lý- Cbl ) : Uống nước cất + tiêm CCl4

Lô 3 (chứng dương- Csi) : Uống silymarin 100mg/kg + tiêm CCl4

Lô 4 (thử thuốc HV5) Uống cao hạt Vải với liều tương đương 5g dược liệu/ kg thể trọng chuột nhắt trắng + tiêm CCl4

Lô 5 (thử thuốc HV10) Uống cao hạt Vải với liều tương đương 10g dược liệu/kg thể trọng chuột nhắt trắng + tiêm CCl4

Trình tự tiến hành thực nghiệm

Gây tổn thương gan chuột ở các lô 2, 3, 4, 5 bằng cách tiêm phúc mạc dung dịch CCl4 với liều 0,1 ml/ 10 g chuột pha trong dầu olive, tiêm cách ngày cụ thể tiêm vào ngày thứ 1, 3, 5 trong thời gian nghiên cứu

Tất cả 5 lô được cho uống thuốc hay nước cất theo quy định liên tục trong 8 ngày (trừ lô chứng sinh lý cho uống nước cất và tiêm dầu olive tương ứng với thể tích tiêm CCL4)

Đến ngày thứ 8, sau khi uống thuốc 1 giờ, giết chuột lấy huyết thanh định lượng AST, ALT, bilirubin bằng máy định lượng sinh hóa tự động sử dụng kit của hãng DIALAB GmbH (Áo) Đồng thời tách lấy gan để định lượng MDA

Quy trình định lượng MDA được tóm tắt như sau: cân 100 mg gan, nghiền đồng thể trong 1 ml dung dịch KCl 0,15 M Hút 300 l dịch đồng thể cho vào ống nghiệm có 1ml H20, thêm vào đó 1 ml dung dịch acid thiobarbituric 0,25 % pha trong acid acetic, đun cách thủy nhiệt độ 100o

C

26

trong 60 phút, để nguội, thêm 25 µl HCl 5N, lắc đều, thêm vào 3,5 ml butanol, ly tâm 3000v/phút x 10 phút, hút phần n-butanol đo quang ở bước sóng 532 nm Hàm lượng MDA được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA Lượng MDA trong mẫu thử giảm so với đối chứng gây bệnh sẽ biểu hiện khả năng ức chế quá trình POL của chất thử

n-Hình 2.3 Sơ đồ thời gian làm thực nghiệm NC tác dụng bảo vệ gan

2.3.5 Phương pháp phân lập các chất

- Lựa chọn cắn chiết có tác dụng chống oxy hóa in vitro mạnh kết hợp

với kết quả khảo sát định tính và định lượng để phân lập chất

- Phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường có

cỡ hạt là 0,040-0,063mm của Merck

Theo dõi các phân đoạn sắc ký bằng SKLM

- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật

Lấy máu và gan

Tiêm CCl4

27

 Phổ hồng ngoại được đo trên máy đo phổ hồng ngoại Impact 410 nicolet

 Phổ UV được đo trên máy quang phổ UV-Vis Cary 1E

 Phổ khối (ESI-MS) : Phổ khối lượng phun mù điện tử ( Eletron spray ionization mass spectra )đo trên máy AGILENT 1100LC-MSD Trap của Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (MNR) : 1H-NMR (500MHz),

13C-NMRR (125MHz) đo trên máy Bruker AM500FT-NMR Spectrometer của Viện hóa học thuộc Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Đặc điểm mẫu nghiên cứu

Dược liệu bột hạt Vải

Cảm quan: Bột màu nâu vàng, mùi hắc, vị hơi chát đắng

Quan sát đặc điểm bột hạt Vải bằng kính hiển vi (Hình 3.3): Mảnh vỏ hạt màu nâu vàng là các tế bào có kích thước không đều nhau, hình đa giác có đỉnh tù (6) Mảnh mô mềm đặc chứa tinh bột (2) Tế bào cứng thành dày, có ống trao đổi rõ (5), thể cứng hình sao (4) Có nhiều hạt tinh bột hình tròn hoặc hình thuôn dài kích thước khác nhau, rốn phân nhánh, vân không rõ, đứng riêng lẻ hoặc kép đôi hoặc tụ lại thành đám (1) Mảnh mạch xoắn, mảnh mạch vòng (3) Tế bào phôi hình đa giác có đỉnh tù, được làm đầy bằng các hạt tinh bột (8) Tế bào tiết chất béo có hình tròn, to (9) Sợi (7) nằm rải rác

Hình 3.4 Ảnh chụp các đặc điểm bột hạt Vải dưới kính hiển vi

9 Tế bào tiết chất béo

3.2 Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu hạt vải bằng phản ứng hóa học

* Định tính alcaloid

Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac đặc, đậy bình kín trong 30 phút Cho thêm 20 ml chloroform, lắc đều ngâm trong 24 giờ Lọc lấy dịch chiết cho bình gạn Lắc dịch chiết chloroform với dung dịch acid sulfuric 1N x 2 lần, mỗi lần 10 ml

Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid cho vào 3 ống nghiệm để làm phản ứng

- Ống 1: Cho 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu đến đỏ nâu

- Ống 2: Cho 2-3 giọt Dragendorff Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa từ vàng cam đến đỏ

- Ống 3: cho 2-3 giọt thuốc thử Mayer Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa trắng đến vàng,

Kết quả: Cả 3 ống không có tủa

Sơ bộ kết luận: Hạt Vải không có alcaloid

* Định tính glycosid tim

Cho 10g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 100ml ethanol 25%, lắc đều, ngâm 24h Lọc lấy dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat 30% đến dư Để lắng, lọc Loại tạp chì acetat bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa đến khi không còn tủa với Na2SO4 nữa Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn, lắc kỹ 2

30

lần với chloroform, mỗi lần 8 ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết chloroform Cho dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ, đem cô cách thủy đến khô để làm phản ứng

- Phản ứng Liebermann- Burchard

Hòa tan cắn với 0,5ml alhydrid acetic, đặt nghiêng ống nghiệm 1 góc

45o Thêm từ từ 1ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp Phản ứng dương tính khi mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ, lắc lên tạo thành dung dịch màu xanh lá

Kết quả: Không xuất hiện vòng tím đỏ giữa 2 lớp chất lỏng

- Phản ứng Keller- Kiliani

Hòa tan cắn trong 0,5ml ethanol 90% Thêm vài giọt sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic Lắc đều, nghiêng ống nghiệm 45o Cho từ từ theo thành ống 1ml acid sulfuric đặc, tránh làm xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm Phản ứng dương tính khi mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng tím

đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá

Kết quả: Không xuất hiện vòng tím đỏ giữa 2 lớp chất lỏng

- Phản ứng Baljet

Hòa tan cắn trong 0,5ml ethanol 90% Thêm thuốc thử mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) Lắc đều, so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim Phản ứng dương tính khi ống thử xuất hiện màu đỏ cam và đậm hơn màu ống chứng

Kết quả: Ống thử có màu giống ống chứng

- Phản ứng Legal

Hòa tan cắn trong 0,5ml ethanol 90% Thêm 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều, so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim Phản ứng dương tính khi ống thử xuất hiện màu đỏ cam và đậm màu hơn ống chứng

Kết quả: Ống thử có màu giống ống chứng

- Phản ứng Cyanidin

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm ít bột magnesi Nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc (2-3 giọt) vào ống nghiệm Sau đó để yên vài phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ

Kết quả: Dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ

- Phản ứng với kiềm

Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài

giọt dung dịch NaOH 10%, quan sát hiện tượng Sau đó thêm 1ml nước cất Phản ứng dương tính nếu có tủa vàng khi kiềm hóa, thêm nước thì tủa tan

Kết quả: Xuất hiện tủa vàng, thêm nước tủa tan

Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc Để

khô, quan sát dưới ánh sáng thường, sau đó hơ lên miệng amoniac đậm đặc Nhỏ 1 giọt khác làm chứng không hơ qua amoniac So sánh màu sắc với vết chứng Phản ứng dương tính nếu màu vết thử đậm hơn màu vết chứng

Kết quả: Màu vết thử đậm hơn màu vết chứng

- Phản ứng với thuốc thử diazo

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ

Kết quả: Xuất hiện tủa đỏ

Sơ bộ kết luận: Hạt Vải có flavonoid

* Định tính coumarin