Nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng hạ đường huyết của rễ ngưu bàng

Nhằm khai thác nguồn nguyên liệu sẵn có ứng dụng vào phòng và điều trị bệnh song song với việc chứng minh kinh nghiệm sử dụng rễ Ngưu bàng trong dân gi n góp phần bổ sung vào kho tàng câ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ THỊ THU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và làm luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy ô gi o, nh hị kỹ thuật viên, các bạn đồng môn và gi đình Nhờ sự giúp đỡ quý b u đó mà tôi có thể học tập và hoàn thành tốt luận văn của mình

Nhân dịp này, tôi xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc tới :

PGS.TS Nguyễn Thái An

người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, luôn động viên, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn hân thành đến Ths Nguyễn Văn

An, TS Nguyễn Thị Vân Anh những người thầy đã tận tình góp ý, giúp

đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin được cảm ơn tất cả các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, bộ môn Hóa phân tích - Đại họ Dược Hà Nội, bộ môn Dược lý

- Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu

Xin trân trọng cảm ơn B n Gi m hiệu, Phòng Đào tạo, cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ Trường Đại họ Dược Hà Nội đã tạo điều kiện

để tôi có thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về ngành Dược trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắ đến gi đình, bạn bè đã luôn s t nh, động viên tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 27 tháng 08 năm 2013 Học viên

Ngô Thị Thu

MỤC LỤC

DANH MỤC HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC H NH ẢNH

Trang

Đ T VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT……… 3

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Arctium L……… 3

1.1.2 Đặ điểm thực vật của chi Arctium L……… 3

1.1.3 Đặ điểm thực vật của loài Arctium lappa L 3

1.1.4 Phân bố và sinh thái 5

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC……… 5

1.2.1 Quả………… 5

1.2.1 L ……… 6

1.2.3 Rễ………… 7

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ……… …10

1.3.1 Tác dụng trên gan và chống viêm……… 10

1.3.2 Tác dụng ức chế HIV và tế bào ung thư……… 11

1.3.3 Tác dụng hạ đường huyết… 11

1.3.4 Tác dụng kháng khuẩn… 12

1.3.5 Tác dụng chống oxy hó … 13

1.3.6 Tác dụng kh …… 14

1.4 TÍNH VỊ, CÔNG NĂNG, CÔNG DỤNG CỦA RỄ NGƯU BÀNG… 16

1.4.1 Tính vị, ông năng………… 16

1.4.2 Công dụng………… 16

1.5 MỘT SỐ BÀI THUỐC CÓ RỄ NGƯU BÀNG…… 17

1.6 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP GÂY TĂNG ĐƯỜNG HUYẾT TRÊN THỰC NGHIỆM… ….17

1.6.1 Phương ph p gây tăng glu ose huyết bằng alloxan 17

1.6.2 Phương ph p gây tăng glu ose huyết bằng Streptozocin 18

1.6.3 Phương ph p gây ĐTĐ typ 2 do hế độ ăn giàu hất béo kết hợp alloxan 18

1.6.4 Một số phương ph p kh .19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU……… 21

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU……… 21

2.2.1.Thuốc thử, dung môi, hoá chất……… 21

2.2.2 Động vật th nghiệm 22

2.2.3 Phương tiện và m y mó ……… …22

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 23

2.3.1 Nghiên cứu về hóa họ ……… …23

2.3.2 Nghiên cứu tác dụng trên đường huyết……… 23

2.3.3 Xử lý số liệu……… 26

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ…… 27

3.1 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC……… 27

3.1.1 X định độ ẩm dược liệu……… 27

3.1.2 Chiết xuất……… ………27

3.1.3 Định tính các nhóm chất trong rễ Ngưu bàng……… 28

3.1.4 Định tính cắn các phân đoạn……… …………30

3.1.4.1 Định tính cắn phân đoạn n-hex n……… 30

3.1.4.2 Định tính cắn phân đoạn hloroform………….……… 31

3.1.4.3 Định tính cắn phân đoạn ethyl et t……… …………33

3.1.5 Phân lập……… 35

3.1.5.1 Chuẩn bị cột…… 35

3.1.5.2 Tiến hành……… 35

3.1.5.3 Kiểm tr độ tinh khiết và nhận dạng các chất phân lập đượ …… 38

3.2 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA CAO LỎNG RỄ NGƯU BÀNG…… …………45

3.2.1 Kết quả nghiên cứu sau10 ngày uống thuố ……… ………45

3.2.2 Kết quả nghiên cứu sau 20 ngày uống thuố ……… ………… 49

3.2.3 Kết quả giải phẫu bệnh: Hình ảnh gan và tụy……… 53

3.2.3.1 Kết quả đại thể gan chuột nhắt trắng……… ……….53

3.2.3.2 Kết quả vi thể gan chuột nhắt trắng……… ………54

3.2.3.3 Kết quả đại thể tụy……… ………55

3.2.3.4 Kết quả vi thể tụy……… …………55

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN……… ……57

ẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… ………63 TÀI LIỆU THAM HẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance

HDL Lipoprotein tỷ trọng cao – High density

lipoprotein

HE x 400 Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 400

lần

HFD Chế độ ăn giàu hất béo - High fat diet

HFF Chế độ ăn giàu hất béo và fructose – High fat

diet plus fructose

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 1.1 Công thức hóa học của một số hợp chất phân lập từ các

13 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của chế độ ăn và o lỏng Ngưu bàng lên

cân nặng chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc 45

14 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ

glucose máu chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc 46

15 Bảng 3.12

Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ cholesterol toàn phần trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc

46

16 Bảng 3.13

Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ triglyceride trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc

47

17 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ LDL-

cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc

47

18 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ HDL -

cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc 48

19 Bảng 3.16

Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên hỉ số trọng lượng g n tương đối trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc

48

20 Bảng 3.17 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên hàm lượng

21 Bảng 3.18 Ảnh hưởng của chế độ ăn và o lỏng Ngưu bàng lên

cân nặng chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc

49

22 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ

glucose máu chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc

50

23 Bảng 3.20 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ

cholesterol toàn phần trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày

50

uống thuốc

24 Bảng 3.21

Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ triglyceride trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc

51

25 Bảng 3.22 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ LDL-

cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 51

26 Bảng 3.23 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ HDL -

cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 52

27 Bảng 3.24 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên trọng lượng gan

tương đối trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 52

28 Bảng 3.25

Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên hàm lượng MDA dị h đồng thể gan chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc

53

DANH MỤC H NH ẢNH

Sơ đồ phân lập các thành phần từ phân đoạn

16 Hình 3.15 Hình thái vi thể gan chuột lô 4 uống cao lỏng

17 Hình 3.16 Hình thái vi thể gan chuột lô 4 uống cao lỏng

18 Hinh 3.17 Hình thái vi thể gan chuột lô 5 uống cao lỏng

19 Hình 3.18 Hình thái vi thể gan chuột lô 5 uống cao lỏng

22 Hình 3.21 Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 56

23 Hình 3.22 Hình thái vi thể tụy chuột lô uống cao lỏng Ngưu

Đ T VẤN ĐỀ

Thế giới thực vật, một kho tàng bí ẩn và kỳ diệu của thiên nhiên

đ ng ngày àng được quan tâm, khám phá và khai thác phục vụ nhu cầu

củ on người Ngày nay, cùng với sự phát triển của tổng hợp hó dược, công tác nghiên cứu, phát triển thuốc và sản phẩm thiên nhiên mới có nguồn gốc cây cỏ đ ng là vấn đề thu hút sự quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới

Với vị tr đị lý và điều kiện tự nhiên ưu đãi, Việt Nam có một thảm thực vật phong phú và đ dạng với khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao [1], khoảng 4.000 loài được sử dụng làm thuốc [1] Tuy vậy chỉ có một số lượng ít loài cây và vị thuố được sử dụng ở mứ độ tương đối phổ biến theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo y học cổ truyền mà hư được nghiên cứu kỹ và đầy đủ

Rễ Ngưu bàng từ lâu đã được sử dụng phổ biến như một loại thứ ăn, phối hợp với củ cải trắng, cà rốt và nấm đông ô tạo thành một loại thứ ăn

bổ dưỡng dưới tên gọi “C nh dưỡng sinh”, và được coi là một phương thuốc chữa bách bệnh tại Nhật Bản [14] Ở nước khác trên thế giới như: Trung Quốc, Canada, Ấn Độ, Bắc Mỹ…rễ Ngưu bàng được xem là vị thuố đượ dùng điều trị đ i th o đường, đ u xương khớp, trị bệnh ngoài

da, bệnh Gout, có tác dụng làm ra mồ hôi, lọc máu, lợi tiểu, kích thích tiêu

ho …[24]

Ngưu bàng được nhập từ Trung Quốc vào Việt Nam từ năm 1959, đã được trồng thử ở Lào C i, L i Châu, Nghĩ Lộ [7] Trong y học cổ truyền, Ngưu bàng mới chủ yếu dùng hạt ngưu bàng tử) làm thuố điều trị cảm cúm, trị viêm phổi, viêm amidal, trị sốt, chữa họng hầu sưng đ u, ó t dụng cầm máu, giải độc, nhuận tràng…

Từ năm 2006, Nguyễn Thái An và cộng sự đã tiến hành khảo sát, nghiên cứu thành phần hóa học của rễ Ngưu bàng ó nguồn gốc khác nhau

và đã thu được các kết quả bướ đầu Nhằm khai thác nguồn nguyên liệu sẵn có ứng dụng vào phòng và điều trị bệnh song song với việc chứng minh kinh nghiệm sử dụng rễ Ngưu bàng trong dân gi n góp phần bổ sung vào

kho tàng cây thuốc Việt Nam một dược liệu mới.Vì vậy đề tài “Nghiên

cứu thành phần hóa học và thử tác dụng hạ đường huyết của rễ Ngưu bàng” được thực hiện với mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu thành phần hóa học của rễ Ngưu bàng

ký lớp mỏng Chiết xuất, phân lập và nhận dạng chất tinh khiết dựa trên các

dữ liệu phổ

2 Thử tác dụng hạ đường huyết: tiến hành thử tác dụng hạ đường huyết của cao toàn phần rễ Ngưu bàng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI Đ C ĐIỂM THỰC VẬT

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Arctium L [5], [9], [18]

Chi Arctium nằm trong phân họ Hoa ống (Tubuliflorae), họ Cúc (Asteraceae), bộ Cúc (Asterales), phân lớp Cúc (Asteridae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Vị trí của chi Arctium

L trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như s u:

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Arctium L

Cây thảo, lá ở gốc xếp hình hoa thị, lá ở thân mọc so le Cụm hoa đầu có bao chung, gồm nhiều lá bắ kéo dài thành mũi nhọn, có móc ở đỉnh, khi chín sẽ thành móc quặp giúp cho sự phát tán nhờ động vật Chi

Arctium gồm 10 loài ở vùng ôn đới cựu lụ địa Ở nước ta có nhập trồng 1

loài là Arctium lappa L [8]

1.1.3 Đặc điểm thực vật của loài Arctium lappa L

Tên khoa học: Arctium lappa L., họ Cúc (Asteraceae) [16]

Tên đồng nghĩ : Arctium majus Bernh [23]

Tên kh : đại đ o, thực, hắc phong tử, thử niêm tử [16]

a b c

Hình 1.1 Ảnh cây Ngưu bàng và một số bộ phận của cây Ngưu bàng

a) Cây Ngưu bàng lúc mới gieo b) Cây Ngưu bàng 2 năm tuổi c) Lá Ngưu bàng d) Cụm hoa Ngưu bàng

e) Quả Ngưu bàng f) Rễ Ngưu bàng

Ngưu bàng là ây thảo, sống hàng năm h y h i năm, thân thẳng, có khía, cao khoảng 1-1,5m, phía trên thân có nhiều cành Lá mọc thành hình hoa thị ở gốc và mọc so le ở trên thân Lá to, rộng 20-30cm, dài 30-40cm [16], [23] hình trái xoan, gố hình tim, đầu tù hay nhọn, mép ó răng ư

h y lượn sóng [7], [8], cuống lá dài, có nhiều lông trắng mịn ở mặt dưới lá [16]

Cụm ho hình đầu, mọc ở đầu ành, đường kính 2-4 cm Cánh hoa màu đỏ hay tím nhạt [7], [8], [16] Các lá bắc của bao chung kéo dài thành mũi nhọn, có móc ở chóp [7], [8]

Quả bế, thuôn, hoặc gần hình trứng, hơi ó ạnh tam giác [23], màu xám nâu [7], [8], [16], hơi ong [16], có nhiều móc quặp, phía trên có một

mào lông ngắn màu vàng [7], [8] Mỗi quả có 1 hạt Củ tròn và dài, có thể dài từ 1,2-2,7m nếu được trồng từ 2 năm trở lên [11]

Ngưu bàng r ho th ng 6-7; ra quả tháng 7-8 [10], [16], 8-9 [8]

1.1.4 Phân bố và sinh thái

Ngưu bàng ó nguồn gốc ở vùng ôn đới ấm thuộc Nam Âu hoặc Tây

Á Hiện nay cây mọc tự nhiên ở vùng cận Himalaya thuộc Ấn Độ, Nepal và Trung Quố Ngưu bàng òn được trồng nhiều nơi ở Trung Quốc và Nhật Bản [23]

Năm 1959, Ngưu bàng được nhập từ Trung Quốc vào trồng thử ở Sapa thấy sinh trưởng phát triển tốt, s u đó được mở rộng trồng ở Bắc Hà (Lào Cai) và Sìn Hồ (Lai Châu) [7], [8], [16] Ngưu bàng òn được phát hiện mọc hoang ở vùng cao huyện Bát Xát (Lào Cai) [16]

Ngưu bàng là ây ư ẩm, ư s ng và th h nghi với vùng có khí hậu á nhiệt đới núi cao, nhiệt độ trung bình năm từ 15-180C

Cây trồng từ hạt ở Sapa ra hoa quả nhiều ng y trong năm đầu tiên Sau khi quả già, cả cây bị tàn lụi [23]

Ngưu bàng rất dễ trồng Tuy nhiên, trong nhiều năm gần đây, ây không được chú ý phát triển nên chỉ còn một số ây đượ duy trì thường xuyên với mụ đ h giữ giống tại Trại thuốc Sapa - Viện Dược liệu [23]

Từ năm 2004, Ngưu bàng đã được trồng tại bãi giữa sông Hồng, hạt giống được nhập từ Úc

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

1.2.1 Quả

Một số tài liệu cho thấy, quả Ngưu bàng hứa nhiều chất thuộc nhiều nhóm chất hóa học:

-Nhóm lignan: arctiin, arctigenin, diarctigenin, các lappaol A, B, C,

D, E, F, H, các arctignan A - E, neoarctiin A, neoarctiin B [23]

-Nhóm polysaccharid: inulin [23]

-Nhóm dầu béo 15-30 % [23], 25-30% [16], [24] trong đó hủ yếu gồm các glycerid của acid palmitic, acid stearic và acid oleic)

Từ dịch chiết ethanol quả Ngưu bàng, năm 2007, MinYong, Gu Kun

và Min-Hu Qiu đã phân lập được 10 chất: neoarctiin A, mairesinol, arctiin, lappaol A, lappaol E, lappaol F, lappaol H và arctignan A, arctignan

t r x sterol Trong l tươi ó hứa onopordopicri, arctiopicrin [43]

- Triterpenes: các alcol terpen tự do, sterol tự do, triterpen ester [43]

- Acid béo: 94,7% acid béo no (C14- C26) và 5,3% acid béo không

Ngoài ra trong lá còn chứa arctiin và arctigenin [16], men oxydase [23]

1.2.3 Rễ

Bằng các phản ứng hóa họ thường quy, Hà Đăng Thành, Trần Thị Thu Trang, Trần Thị Thu Thủy đã sơ bộ x định trong rễ Ngưu bàng thu hái tại Sapa và Hà Nội có chứa flavonoid, coumarin, tanin, chất béo, phytosterol, đường khử, acid hữu ơ, id min, polys h rid; không ó anthraglycosid, carotenoid, glycosid tim, saponin [19], [21], [22]

Trong rễ Ngưu bàng Ngưu bàng ăn ó hứa:

- Nước: 70% [24], [43]

- Nhóm polysaccharide: inulin khoảng 50% [23], 56% [24], 57% (có khi tới 70%) [16], 45% [7], glucose 5-6% [16], fructofuranan có trọng lượng phân tử thấp (một dạng inulin)

+ Acid polyphenol: 3,65% [24] trong đó ó: id caffeic và acid chlorogenic [23], [42]

+ Acid alkyl của sulfur: acid aretic có cấu trú : 5‟- (1-propynyl) - 2,2‟- bithienyl- 5- carboxylic acid [24], acid gama - guanidine - n- butyric [23]

+ Acid béo: từ 0,4-0,8 % [43] bao gồm acid stearic, acid palmitic, acid oleic, acid linoleic [24]

- Các aldehyd: Fomaldehyd, acetaldehyd, propionic aldehyd, isopropyl aldehyd [24]

- Alkyl polyalkyl 0,001- 0,002%, trong đó: 1,11- tridecadien- 3,5,7,9-tetrayne chiếm 50%, 1,3,11- tridecatrie- 5,7,9- triyne chiếm 30% [24]

- Nhóm lignan: neoarctiin A và lignanolide arctiin [43]

- Rễ ngưu bàng òn hứa methylen chloride, alchohol [24], chất béo 0,4%, hàm lượng lớn các chất nhầy [16], [92], chất đắng, nhựa [16]; các nguyên tố vi lượng như l i, phospho, n tri, sắt, men peroxydase [23], chất sợi [43]

- Trong rễ tươi ó hứa tinh dầu, tannin, acid stearic, một carbua hydrogen và một phytosterol [7]

Từ rễ Ngưu bàng phân lập được baicalin và genistin [91]

Năm 2003, K rrdosov A và ộng sự đã phân lập được một fructofuranan trọng lượng phân tử thấp thuộc nhóm inulin từ dịch chiết nước [58]

Năm 2007, từ dịch chiết ethylacetat rễ Ngưu bàng, Trần Thị Thu

Tr ng đã phân lập được một flavonoid glycosid có công thức hóa học là

C21H20O11, với tên khoa học là kaempferol -7-O-glucosid [22]

Năm 2011, R kesh J isw l và Nikol i Kuhnert đã phân lập được acid chlorogenic trong rễ Ngưu bàng nhờ sử dụng sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ [51]

Bảng 1.1: Công thức hóa học một số hợp chất phân lập từ các bộ phận

khác nhau của cây Ngưu bàng

CH3HO

CH3O

Lá, quả,

rễ, hạt

[23], [68], [32], [46]

3 Arctiin

O H

OH3C OGlu

OCH3OCH3

[23], [32], [95]

8 Acid

H H COOH O H

H OH

H

H OCOCHCH

OH OH

Lá,

vỏ rễ

[23], [24], [32],

O MeO

CO

2-MeO

OMe

OMe

HO

H

OMe C

3

MeO

15 Beta-eudesmol

CH2

CH3

CH3OH

O H

OCH3

OCH3H

H

Quả,

rễ, hạt

[32], [50]

1.3 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

1.3.1 Tác dụng trên gan và chống viêm

Cao toàn phần rễ Ngưu bàng ó t dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương g n bằng acetaminophen (với liều 600mg/kg thể trọng chuột) [65] hoặc bằng tetrachlorocarbon (32µg/kg thể trọng chuột , theo ơ chế chống oxy hóa [65], [66]; có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng 0,05ml carragenin 1% [64]; baicain trong dịch chiết diclorua methal củ Ngưu bàng ó t dụng chống viêm và hạ nhiệt [59] Dịch chiết Ngưu bàng ó khả năng hống viêm thông qu ơ hế ức chế giải phóng cysteinyl leukotrienes (Cys-LTs) bởi các tế bào bạch cầu đơn nhân trong m u ngoại vi Ngoài ra, dịch chiết Ngưu bàng òn ó t dụng ức chế các phản ứng dị ứng cấp tính trên chuột được gây phù tai [59]

Lappaol F, diarctignin và arctigenin trong hạt và lá có khả năng ức chế tổng hợp NO bởi các inducible nitric oxide synthase (iNOS) trong các đại thự bào Do đó, ó thể điều trị một số bệnh như viêm khớp dạng thấp, viêm mạn tính, bệnh tự miễn [29]

Dịch chiết methanol củ ây Ngưu bàng ó t dụng chống viêm bằng cách ức chế tác dụng của COX-2 dẫn tới giảm giải phóng PGE2 [29]

1.3.2 Tác dụng ức chế HIV và tế bào ung thư

Rễ Ngưu bàng ó t dụng chống khối u [24] (tuy nhiên tác dụng này mới được thử nghiệm b n đầu trong ống nghiệm và trên động vật, hư được thử nghiệm trên người [92]), có khả năng ức chế sự phát triển của virus HIV [23]

Từ quả Ngưu bàng phân lập được arctigenin- là một phenyl propanoid- có tác dụng làm giảm qu trình tăng sản tế bào tại tế bào lai MH

60 (IC50 là 1,0µM), tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ngăn ản quá trình tổng hợp nitơ oxy [27]

Dịch chiết diclorua methal củ Ngưu bàng và r tigenin phân lập từ Ngưu bàng ó t dụng làm giảm nguồn dinh dưỡng của yếu tố gây độc tế bào ở nồng độ C=0,01µg/ml với hiệu quả 100% [27] Cơ hế là do sự bất hoạt Akt do thiếu glucose Baicalin và genistin ức chế chọn lọc trên ADN polymerase củ động vật ó vú Trong đó, genistin là dược chất kh ng đột biến, ức chế chọn lọc trên hoạt động của TdT (Terminal deoxyribonucleotidyl Transferase) [91]

ngày uống dịch chiết lignan toàn phần từ hạt với các mức liều 2,0; 1,0; 0,5

và 1,38; 0,69; 0,35 g/kg nồng độ glucose huyết, triglycerid, cholesterol giảm đ ng kể gần như về mứ bình thường Đồng thời khả năng dung nạp glucose, nồng độ insulin máu và HDL- holesterol tăng nhưng không ó nguy ơ hạ đường huyết quá mứ Do đó dịch chiết quả Ngưu bàng ó t dụng hạ đường huyết tương đối an toàn và có thể giúp ngăn ngừa các biến chứng của bệnh tiểu đường [93]

Dịch chiết ethanol rễ Ngưu bàng ó t dụng hạ đường huyết trên mô hình gây tăng đường huyết bằng streptozotocin Sau 14 ngày uống dịch chiết ethanol rễ Ngưu bàng ho thấy lượng insulin trong m u tăng và nồng

độ glucose huyết giảm đ ng kể Cơ hế có thể do dịch chiết kích thích tiết insulin và tái tạo các tế bào β tụy đã bị streptozotocin phá hủy [31]

1.3.4 Tác dụng kháng khuẩn

Ngưu bàng ó t nh kh ng khuẩn cao [23] Thuốc ngâm hạt Ngưu bàng trong ống nghiệm có tác dụng đối với nhiều loại nấm gây bệnh và có khả năng ức chế ở các mứ độ khác nhau Rễ ũng ó t dụng kháng khuẩn và kháng nấm [24]

Nước sắ ngưu bàng tử có tác dụng ức chế tụ cầu vàng và một số nấm ngoài da [2]

Dịch chiết ethyl acetat củ Ngưu bàng ó t dụng kháng khuẩn đối

với một số chủng vi khuẩn như: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia

coli, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus mutans và Candida albicans

[81]

Cao toàn phần củ l Ngưu bàng ó t dụng ức chế một số chủng vi

khuẩn: Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Bacilus subtilis, Candida albicans [44]

Acid chlorogenic phân lập từ l Ngưu bàng ó t dụng kiềm chế

một số vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus

Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết nước và dịch chiết nước nóng rễ Ngưu bàng không ó sự khác biệt đ ng kể Hai dịch chiết này khi được sử dụng ở liều 1,0mg đều có khả năng thu thập 60,4-65,0% superoxide và 80,5% hydrogen peroxyd [36]

Dịch chiết methanol rễ Ngưu bàng với thành phần chính là acid chlorogenic và acid caffeic có tác dụng làm giảm quá trình oxi hóa của LDL-cholesterol, deoxyribose và protein Với liều 200µg/ml không chỉ có tác dụng tăng nồng độ củ glut thion mà òn tăng hoạt tính của enzym glutathion reductase, glutathion peroxidase [29]

Trong nghiên cứu của Pin-Der Duh, tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết nước (WEB) và dịch chiết nước nóng (HWEB) rễ Ngưu bàng không có sự khác biệt đ ng kể Hai dịch chiết này khi được sử dụng ở liều 1,0mg đều có khả năng thu thập 60,4-65,0% superoxide và 80,5% hydrogen peroxyd [36]

Thông qu ơ hế kháng tiết acid và chống oxy hóa, dịch chiết

giảm diện tích tổn thương khoảng 29,2%; 41,4%; 59,3%; 38,4% tương ứng với mức liều 1, 3, 10 và 30mg/kg thể trọng chuột cống Với liều 10 mg/kg, không chỉ thú đẩy quá trình tái tạo niêm mạc dạ dày mà còn khôi phục lại hoạt động superoxid dismut se, ngăn hặn việc giảm mứ độ glutathione,

ức chế sự hoạt động myeloperoxidase và giảm tính thấm vi mạch Trong in

vitro, EET làm giảm gốc tự do và tăng thu dọn các gốc

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) [86]

1.3.6 Tác dụng khác

Nhiều công trình nghiên cứu đã tìm r t dụng dược lý khác của Ngưu bàng như: t dụng giảm ho [58], tác dụng trên loét dạ dày tá tràng [70], [94], trên thần kinh vận động [24], làm giảm triệu chứng của viêm cầu thận [55], tác dụng ức chế yếu tố hoạt hóa tiểu cầu [23]…

Bảng 1.2: Tác dụng dược lý của một số hợp chất phân lập từ cây Ngưu

rễ

Chống lại tế bào ung thư đ ng hoạt động, chống sự tăng sinh ủa các yếu tố chống tế bào B của tế bào hybridoma, MH60

[32], [47], [88]

++

Chống HIV

[32], [49],

rễ

Chống oxy hóa và các gốc tự do hoạt động

[28], [79], [80]

Acid chlorogenic Lá, vỏ rễ Chống oxy hóa, chống sốc phản

vệ, bảo vệ thần kinh, chống HIV

[30], [33], [62]

Tác dụng prebiotic, hạ huyết áp, chống đ i th o đường

[62], [82], [87]

1.4 TÍNH VỊ CÔNG NĂNG CÔNG DỤNG CỦA RỄ NGƯU BÀNG 1.4.1 Tính vị công năng

Rễ Ngưu bàng Ngưu bàng ăn ó vị đắng cay, tính hàn, có tác dụng lợi tiểu (loại được acid uric), khử độc, ra mồ hôi, lợi mật, nhuận tràng, trị giang mai, trị đ i đường, trị nọ độc [7]

Ở Ấn Độ, rễ Ngưu bàng được coi có tác dụng lợi tiểu, làm ra mồ hôi

và phục hồi sức khỏe [23]

Ở Nhật Bản và một số nơi kh , rễ Ngưu bàng được sử dụng như một loại thứ ăn và ngày àng trở nên thông dụng trong một loại hè để chữ ung thư [87]

Y học hiện đại dùng rễ Ngưu bàng làm thuốc lợi tiểu, ra mồ hôi, lọc máu; dùng trong bệnh thấp khớp, trị đ u và sưng khớp; bệnh ngoài da (hắc lào, trứng cá, mụn nhọn, lở loét) [16], [23] Cao rễ Ngưu bàng ó t dụng

hạ glu ose m u, đượ dùng điều trị bệnh đ i th o đường [16]

Ở Châu Âu, rễ Ngưu bàng được dùng làm thuốc chữa bệnh ngoài da

và bệnh gout [23]

1.5 MỘT SỐ BÀI THUỐC CÓ RỄ NGƯU BÀNG

-Trị nhiệt độ , đ u răng, răng lợi sưng đ u: Ngưu bàng ăn 1 đồng

ân, giã nước, cho chút muối, nấu thành cao, mỗi lần dùng bôi lên răng lợi Ngày bôi 2-3 lần [24]

-Trị trĩ lở: Ngưu bàng ăn, lệ lô ăn hầm cùng ruột già lợn, uống [24]

- Trị tai tự nhiên sưng: Rễ Ngưu bàng rửa sạch, cắt vụn, giã nhừ, lấy nướ 1 thăng, nấu thành o đắp lên trên chỗ sưng [24]

- Trị chân tay mềm yếu, mệt mỏi không có sức: Rễ Ngưu bàng hầm

gà, hầm thịt uống [24]

1.6 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP GÂY TĂNG ĐƯỜNG HUYẾT TRÊN THỰC NGHIỆM

Cơ hế gây tăng glu ose huyết của các mô hình:

 Đư glu ose từ bên ngoài vào ơ thể

 Tăng lượng glucose nội sinh bằng cách: Giảm sử dụng glucose ở tổ chức và ở ngoại vi hoặ tăng phân hủy glycogen thành glucose ở gan

 Gây tổn thương hoặc phá hủy ơ qu n bài tiết insulin

 Gây tăng đường huyết bằng chế độ ăn

 Kết hợp phương ph p

1.6.1 Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng alloxan

Cơ hế gây ĐTĐ: Allox n là một hợp chất pyrimidin triketon có cấu trú tương tự glu ose và id uri , t h lũy, gây độc trực tiếp và chọn lọc lên tế bào β ủa tiểu đảo tụy thông qua hệ thống vận chuyển glucose GLUT2 Bên trong tế bào xảy r qu trình tương t giữa alloxan và các nhóm SH nội bào, đặc biệt là glutathion, sinh ra sản phẩm là acid dialuric

có khả năng tự oxi hóa Quá trình tự oxi hóa của chất này đã sản sinh ra các gốc superoxid: hydrogen peroxide và gốc hydroxyl Các gốc hydroxyl là tác nhân cuối cùng gây tiêu diệt tế bào β, tế bào này có khả năng hống l ại

sự oxi hóa rất kém, vì vậy gây ra tình trạng ĐTĐ phụ thuộc insulin [37],

[38], [61]

1.6.2 Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng Streptozotocin

Streptozoto in gây độc trực tiếp và chọn lọc trên tế bào β củ đảo tụy thông qua hệ thống vận chuyển GLUT2, bẻ gãy sợi ADN, ức chế sự sao chép ADN ức chế sự nhân lên của tế bào, dần dần dẫn đến hủy hoại tế bào đảo tụy và gây ra tình trạng ĐTĐ phụ thuộ insulin trên động vật thực nghiệm [61]

1.6.3 Phương pháp gây ĐTĐ typ 2 do chế độ ăn giàu chất béo kết hợp alloxan

 Nguyên tắc: Chuột được nuôi béo phì trong khoảng thời gian nhất định, s u đó đượ tiêm llox n để gây ĐTĐ typ 2 Cho huột uống thuốc trong khoảng thời gian nhất định, s u đó định lượng các chỉ số sinh hóa và giải phẫu mô bệnh họ để đ nh gi ảnh hưởng của thuốc

Trong mô hình của Reed, Zang F và Srinivansan K, chuột được nuôi bằng chế độ ăn giàu hất béo có nồng độ glucose huyết tương tự như huột được nuôi bằng chế độ ăn bình thường nhưng nồng độ insulin, acid béo tự

do và trigly erid trong m u tăng o rõ rệt Các tác giả đều nhận định chế

độ ăn giàu hất béo gây ra tình trạng kháng insulin, khiến nhu cầu về bài tiết insulin tăng o hơn so với bình thường [57], [71] Theo một mô hình khác của Fabiola, chuột ũng được nuôi bằng chế độ ăn giàu lipid nhưng ó

bổ sung thêm fructose 60% vào thứ ăn ũng ho thấy đường huyết, nồng

độ cholesterol toàn phần, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, nồng độ triglycerid của chuột ăn hế độ ăn HFF o hơn nhiều so với chuột ăn hế

độ ăn bình thường [39] Chế độ ăn giàu lipid gây r tình trạng kháng insulin

và rối loạn chuyển hóa lipid, việc trộn thêm fru tose gây tăng rối loạn chuyển hóa ở gan vì khi nồng độ fructose trong gan quá cao sẽ dẫn đến tăng ường t h lũy trigly erid ở gan và làm suy giảm khả năng huyển hóa

glucose và lipid ở g n do đó làm tăng nguy ơ mắc các bệnh về tim mạch [76], [83], [84] Lúc này, chỉ cần tổn thương ở tụy là có thể gây giảm sản xuất insulin, sẽ làm xuất hiện những biến đổi rõ rệt về glucose huyết và các chỉ số sinh hóa khác

Trong mô hình gây ĐTĐ bằng alloxan của Elshater chuột sau khi tiêm alloxan, theo dõi nồng độ GH và các chỉ số sinh hóa khác, kết quả cho thấy 6 tuần sau khi tiêm alloxan với liều 150mg/kg nồng độ GH, cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL- holoesterol đều o hơn so với chuột bình thường [25] Do đó ó thể kết hợp hai mô hình trên để đ nh gi tác dụng của thuốc không chỉ trên GH và còn trên các chỉ số hóa sinh khác Chế độ ăn HFF gây r tình trạng stress oxi hóa tại gan gây tổn thương tế bào g n, do đó mô hình òn đ nh gi được ảnh hưởng của thuốc lên khả năng hống oxi hóa củ g n thông qu định lượng MDA dị h đồng thể gan

• Mô hình gây tăng đường huyết bằng glucose ngoại sinh: liều hợp lý nhất có thể gây tăng glu ose huyết trên chuột nhắt trắng là 3g/kg thể trọng [15]

Mô hình gây tăng GH do ph hủy tế bào β đảo tụy bằng các hóa chất

kh như: N-ethyl nitrosoure, vacor, dithizone, 8-hydroxyquinolon, monosodium glutamat [34], [45], [77]

 Mô hình gây tăng GH bằng virus: một số virus dễ gây ĐTĐ nhƣ virus gây viêm não, viêm ơ tim dạng D, virus gây sởi Đức, virus gây bệnh bại liệt và quai bị [45]

 Gây triệu chứng ĐTĐ tạm thời trên chuột lang bằng cách tiêm cho chuột huyết thanh của loài khác mà có chứa kháng thể kh ng insulin để gây

ra tình trạng thiếu hụt insulin ở chuột [45]

 Mô hình gây ĐTĐ bằng cắt bỏ tuyến tụy: mứ độ trầm trọng của bệnh tùy thuộc vào việc cắt bỏ một phần hay hoàn toàn tuyến tụy

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

- Mẫu nghiên cứu:

+ Cành m ng ho , l tươi để gi m định tên khoa học

+ Rễ Ngưu bàng tươi rửa sạch, thái mỏng, phơi se, rồi sấy khô ở 60ºC, nghiền thành bột thô, bảo quản trong túi nilon k n, để chỗ mát làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng hạ đường huyết

- Nơi thu h i: Bãi giữa Sông Hồng, tổ 19, phường Thượng Thanh, quận Long Biên, Hà Nội

- Thời gian thu hái: 2/2012

Mẫu nghiên ứu được PGS TS Nguyễn Khắc Khôi - Viện Sinh Thái và

Tài Nguyên sinh vật gi m định tên khoa học là: Arctium lappa L., họ Cúc (Asteraceae)

- Mẫu nghiên cứu tác dụng sinh học:

Nguyên liệu được làm nhỏ sấy khô đem hiết bằng nước 3 lần theo phương pháp sắc mỗi lần sắc khoảng 2 giờ, dịch lọ thu đượ đem ô h thủy ở 60-70oC đến cao lỏng 1:1

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1.Thuốc thử, dung môi, hoá chất

- Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đã ghi trong Dượ điển Việt Nam IV

+ Gliclazid (Diamicron MR viên 30 mg) do Công ty Servier (Pháp) sản xuất

+ Alloxan lọ 20g của Hãng Bio Basic INC, Canada

+ Kit định lượng glucose hãng Terumo, Nhật Bản

+ Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), LDL- cholesterol (LDL-C), HDL- cholesterol (HDL-C) của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và DIALAB GmbH (Áo)

+ Các hóa chất làm xét nghiệm mô bệnh họ đạt tiêu chuẩn

2.2.2 Động vật th nghiệm

- h tác dụng hạ glucose huyết : chuột nhắt trắng chủng Swiss,

khoẻ mạnh, giống đực trọng lượng trung bình 20 ± 2g, hăn nuôi trong điều kiện đạt tiêu huẩn thí nghiệm đượ đặt hàng tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

2.2.3 Phương tiện và máy móc

- Cột sắ ký

- Chất hấp phụ: sili gel k h thước hạt: 0,040 – 0,063 mm) (Merck)

- Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck)

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Cân phân tích Precisa

- Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200

- M y đo phổ khối lượng (ESI-MS): AGILENT 6310 LC-MSD Trap, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- M y đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- M y đo điểm nóng chảy: Kofler micro-hotstage, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu về hóa học

- Định tính thành phần hóa học: Định tính các nhóm chất trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng theo các tài liệu sau:

+ Bài giảng Dược liệu I [3]

+ Thực tập Dược liệu - Phần hóa học [4]

+ Phương ph p nghiên ứu hóa học cây thuốc [13]

- Chiết xuất và phân lập

+ Chiết xuất bằng phương ph p chiết nóng với dụng cụ chiết liên tục (Soxhlet) sử dụng dung môi: n-hexan, chloroform, ethyl acetat

+ Sử dụng phương ph p sắc ký cột (CC) với chất hấp phụ là silicagel + Kiểm tr độ tinh khiết của các chất phân lập bằng SKLM với một số

hệ dung môi khai triển

- Nhận dạng chất tinh khiết: Nhận dạng chất phân lập được dựa trên dữ liệu phổ MS, NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT)

2.3.2 Nghiên cứu tác dụng trên đường huyết

Tiến hành thử tác dụng hạ đường huyết của cao lỏng Ngưu bàng theo

mô hình của Fabiola (2011)[25] và Elshater (2009) [39] với 2 mức liều 20g/kg và 40g/kg tại 2 mốc thời gian sau 10 ngày và sau 20 ngày uống thuốc

Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội

Nguyên tắc: chuột được nuôi béo phì trong một khoảng thời gian

nhất định bằng chế độ ăn giàu hất béo và fru tose, s u đó tiêm llox n gây

đ i th o đường Sau khi tiêm alloxan cho chuột uống thuốc thử trong khoảng thời gian nhất định, định lượng đường huyết và các chỉ số sinh hóa

Cách tiến hành: Chuột nhắt trắng giống đực khỏe mạnh được chia làm

10 lô (mỗi lô 10 con):

- Lô 1A,1B: Lô chứng: chế độ NFD + uống nước cất

- Lô 2A,2B: Lô mô hình: chế độ HFF + tiêm alloxan + uống nước cất

- Lô 3A,3B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống gliclazid liều 30 mg/kg

- Lô 4A,4B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 1

- Lô 5A,5B: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 2 Trong đó hế độ HFF là chế độ ăn giàu hất béo và fructose (high fat diet plus fructose) và chế độ NFD là chế độ ăn bình thường (normal fat diet)

Và A: lô chuột thử nghiệm trong 10 ngày, B: lô chuột thử nghiệm trong 20 ngày

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của chế độ n N v của chuột nhắt tính trên 100g thức n

thường (NFD) (%)

Chế độ ăn giàu chất b o (HFD)* (%)

Tổng 100,00 100,00

*Sirô fructose 55% (Daesang Corporation) được trộn thêm trong thức ăn

của chuột nhắt c chế độ ăn D

Tất cả chuột ở 10 lô đượ định lượng glucose máu lần 1 khi bắt đầu tham gia nghiên cứu (nhịn đói qu đêm Chuột trong các lô từ 2-5 ăn hế

độ HFF, lô 1 ăn hế độ NFD trong 10 tuần liên tục, sau 10 tuần tất cả chuột đượ định lượng glucose máu lần 2 Tiêm alloxan liều 200mg/kg cho các lô chuột 2-5, lô 1 đượ tiêm nước muối sinh lý 72 giờ sau khi tiêm alloxan và nước muối sinh lý, định lượng glucose máu lần 3, chọn các chuột ở các lô tiêm alloxan bị đ i th o đường (có mứ glu ose khi đói trên 10mmol/l

được tham gia nghiên cứu Các lô chuột được uống nước cất hoặc thuốc cần thử tác dụng sau 1 thời gian nhất định sau khi gây mô hình Ngày cuối cùng 10 ngày đối với lô A, 20 ngày đối với lô B) sau khi uống thuốc 1 giờ trướ đó huột đã được nhịn đói qu đêm định lượng glucose máu lần 4

và các chỉ số lipid m u, đồng thời lấy g n định lượng MDA trong dịch đồng thể gan và làm giải phẫu vi thể và lấy tụy để làm giải phẫu vi thể

 Phương pháp xác định MDA dịch đồng thể gan:

Nguyên lý của phương pháp: MDA phản ứng với acid thiobarbituric

để tạo phức trimethine có màu hồng và ó đỉnh hấp thụ cự đại ở bước sóng 530-532nm

Mật độ quang OD (XE) của dung dị h đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm lượng MDA được tính theo hệ số chuyển đổi trên đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol Độ dố đường cong chuẩn là 28,2

Tiến hành: cân 0,25g gan chuột nhắt trắng nghiền với 6 ml KCl

Bước 1: 1ml dung dịch nghiền từ phủ tạng thêm vào 0,25 ml acid ascorbic và 0,25 ml muối Mohr

Bước 2: Ủ 370

C trong 30 phút lấy ra cho thêm vào 0,5 ml dung dịch acid tricloacetic vào các ống, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 3: Lấy 1ml dịch nổi thêm vào 0,5 ml acid thiobarbituric

Bướ 4: Đun sôi h thuỷ 20 phút s u đó để lạnh ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu hồng

Bướ 5: Đo qu ng ở bước sóng 532nm

 Mô bệnh học:

Sau 10, 20 ngày uống thuốc, chuột ở lô được mổ để qu n s t đại thể toàn bộ ơ qu n Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, tụy của 30% số chuột ở mỗi lô Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Trung tâm

nghiên cứu và phát hiện sớm Ung thƣ, do PGS.TS Lê Đình Ro nh đọc và nhận định kết quả

 Đánh giá ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu b ng lên gan v tụy chuột

sau khi uống thuốc:

Khi chuột đƣợc lấy máu xét nghiệm lần cuối, tiến hành mổ chuột lấy gan và tụy X định trọng lƣợng g n và hàm lƣợng MDA Quan sát mô bệnh học gan và tụy đại thể, vi thể) của 30% số chuột mỗi lô

2.3.3 Xử lý số liệu:

Số liệu đƣợc nhập và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel [12]

Biểu diễn số liệu: giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (M±SD)

Sử dụng phép thống kê so sánh hai giá trị trung bình test-t Sự khác biệt của các giá trị trung bình ó ý nghĩ thống kê khi p ≤ 0,05

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC

C, cắn E Cân và t nh hàm lượng cắn phân đoạn theo công thức:

M  (100- x) Trong đó: X: hàm lượng cắn (%) x: độ ẩm củ dược liệu (%)

a: khối lượng cắn (g) M: khối lượng dược liệu đem ân g

Bảng 3.1 m lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ rễ Ngưu b ng

STT Phân đoạn Khối lượng

dược liệu (g) Khối lượng cắn (g)

% so với nguyên liệu khô