Nghiên cứu phân lập một số alcaloid và tinh chế một alcaloid từ cây củ dòm (stephania dielsiana y c wu ) làm chất chuẩn

Xác định độ tinh khiết của chất bằng phương pháp quét nhiệt vi sai Trong những trường hợp không có chất chuẩn để tiến hành định lượng các mẫu nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký hoặc đo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VŨ MINH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ

ALCALOID VÀ TINH CHẾ MỘT ALCALOID

TỪ CÂY CỦ DÒM (Stephania dielsiana Y.C.WuJ

LÀM CHẤT CHUẨN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC• • • •

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VŨ MINH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ

ALCALOID VÀ TINH CHẾ MỘT ALCALOID

TỪ CÂY CỦ DÒM (Stephania dielsiana Y.C.Wu.)

LÀM CHẤT CHUẨN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC• • • •

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU-DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MA SỐ: 60720406

Người hướng dẫn khoa học : TS Nguyễn Quốc Huy

GS TS Phạm Thanh Kỳ

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠNTrước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với GS TS Phạm Thanh

Kỳ và TS Nguyễn Quốc Huy, các Thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Viết Thân, người thầy đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian học tập và nghiên cứu tại trường.Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Sau đại học, Bộ môn Thực vật và các Bộ môn, phòng ban của Trường Đại Học Dược Hà Nội

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban chỉ huy Viện Kiểm nghiệm Nghiên cứu Dược và Trang thiết bị y tế Quân đội và các đồng chí, đồng nghiệp Khoa kiểm nghiệm Hóa học, Khoa kiểm nghiệm Vật lý, Khoa nghiên cứu kiểm nghiệm Dược liệu, đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, 1703 tháng 109 năm 2014

DS Nguyễn Vũ Minh

MỤC LỤC

r r i Ạ _ _ _ r p _

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chươngl TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về loài Củ dòm (Stephania dielsiana Y C Wu.) 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 3

1.1.2 Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học loài Củ dòm (Stephania Dielsiana Y.C.Wu.) 4

1.1.3 Tác dụng, công dụng 5

1.2.Tổng quan về chiết xuất, phân lập, tinh chế alcaloid 5

1.2.1 Chiết xuất 5

1.2.2 Tinh chế và phân lập 6

1.2.3 Sắc ký điều chế ứng dụng trong phân lập, tinh chế alcaloid 8

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, phân lập alcaloid 9

1.3 Tổng quan về thiết lập chuẩn đối chiếu 11

1.3.1 Xác định độ tinh khiết của chất bằng phương pháp quét nhiệt vi sai 11

1.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 13

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 21

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 21

2.1.2 Dung môi hóa chất 23

2.1.3 Trang thiết b ị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Chiết xuất và phân lập alcaloid 24

2.2.2.Nhận dạng các chất phân lập được 24

2.2.3 Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất 24

2.2.4 Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn 24

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26

3.1 Chiết xuất, phân lập alcaloid trong loài Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu.) ' 26

3.1.1 Chiết xuất, phân lập alcaloid trong lá và thân 26

3.1.2 Chiết xuất, phân lập alcaloid từ củ 28

3.1.3 Nhận dạng các hợp chất phân lập được từ thân mang lá và từ c ủ 30

3.2 Tinh chế và thiết lập oxostephanin làm chất chuẩn đối chiếu 40

3.2.1 Tinh chế oxostephanin làm chuẩn đối chiếu 40

3.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết của oxostephanin đã tinh chế 40

3.2.3 Thiết lập oxostephanin đã tinh chế làm chất chuẩn đối chiếu 42

3.3 Xây dựng phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng HPLC .T 45

3.3.1 Xử lý mẫu dược liệu 45

3.3.2 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 46

3.4 Áp dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định để định lượng oxostephanin trong dược liệu Củ dòm (Phụ lục 6) 55

3.4.1 TCCS định lượng oxostephanin trong dược liệu Củ dòm (Phụ lục 6) 55 3.4.2 Áp dụng TCCS định lượng oxostephanin trong mẫu dược liệu 55

Chương 4 BÀN LUẬN 56

4.1 Về chiết xuất và phân lập alcaloid trong củ dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) ' 56

4.2 Về việc chiết xuất và tinh chế oxostephanin đạt yêu cầu làm chất chuẩn đối chiếu 56

4.3 Về việc xây dựng phương pháp định lượng oxostephanin trong dược liệu bằng HPLC 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

Bài báo đã công bố liên quan đến đề tà i 60

Tài liệu tham khảo 61

Phụ lục 65

DoubletDiod Array Detector Doublet of doublet

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

Dimethyl sulfoxide

Differential scanning calorimetry Electron Spray Ionization Mass Spectra

High-Performance Liquid

Chromatographic

High-Performance Liquid Chromatographic - Mass Spectrometry

Proton-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Diễn giảiDược Điển Anh Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

Phổ COSY

Độ dịch chuyển hóa học đen-ta

Cụm tín hiệu Đúp-lét Detector mảng diod Cụm tín hiệu Đúp-lét của Đúp-lét

Phổ DEPT

Dịch chiết Nhiệt vi saiPhổ khối lượng ion hóaphun mù điện tử

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

HMBC Heteronuclear mutiple Bond Phổ tương tác dị nhân qua

HSQC Heteronuclear Single -Quantum Phổ tương tác dị nhân qua 1

tượng thử nghiệmICH International Conference on

Harmonisation

IR Infrared spectroscopy Quang phổ hồng ngoại

LOQ Limit of Qualification Giới hạn định lượng

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt

nhân

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

TGA Thermogravimetric analysis Phân tích nhiệt trọng lượngTFA Acid trifluoracetic

TTBYT Trang thiết bị y tế

UV - Vis Ultraviolet Visible Tử ngoại khả kiếnUSP United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Số liệu phổ 13C- NMR và !H - NMR của chất IPM (125/500MHz,

DMSO, Sppm) 30

Bảng 3.2 Tương tác proton-proton trong phổ COSY 31

Bảng 3.3 Mối tương quan trong phổ HMBC 32

Bảng 3.4 Số liệu phổ 13C- và 1H-NMR của BVE10.3 (125/500 MHz, CDCl3, Sppm) 37

Bảng 3.5 Số liệu phổ 1 3C-NMR và 1H-NMR của hợp chất LTM 5.10 39

Bảng 3.6 Kết quả phân tích chất đối chiếu oxostephanin 44

Bảng 3.7 Độ thích hợp hệ thống 51

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của oxostephanin 51

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng 53

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại 54

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian 54

Bảng 3.12 Kết quả định lượng oxostephanin trong dược liệu củ dòm 55

DANH MỤC HÌNH•

Hình 1.1 Cụm hoa đực và hoa đực S Dielsiana 4

Hình 1.2 Cụm hoa cái S dielsiana 4

Hình 1.3 Quả xanh và hạt S dielsiana 4

Hình 2.1 Vườn trồng cây Củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội 21

Hình 2.2 Củ loài S dielsiana 22

Hình 2.3 Thân lá loài S dielsiana 22

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất, phân lập alcaloid trong thân và lá Củ dòm 27

Hình 3.2 Sơ đồ chiết xuất và phân lập alcaloid từ củ cây Củ dòm 29

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của chất IPM 33

Hình 3.4 Tương tác H ^ C trong phổ HMBC của IPM 34

Hình 3.5 Cấu trúc của BVE10.3 35

Hình 3.6 Tương tác H ^ C trong phổ HMBC của BVE10.3 36

Hình 3.7 Phổ DSC oxostephanin 41

Hình 3.8 Phổ TGA của oxostephanin 42

Hình 3.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất oxostephanin 43

Hình 3.10 Sắc ký đồ HPLC-PDA của hợp chất oxostephanin sau tinh chế 43

Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 47

Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu thử 47

Hình 3.13 Phổ UV của dung dịch đối chiếu oxostephanin 48

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu trắng 49

Hình 3.15 Sắc ký đồ dung m ôi 49

Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 50

Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu th ử 50

Hình 3.18 Đồ thị tương quan tuyến tính của oxostephanin 52

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên có nguồn tài nguyên thực vật rất phong phú và đa dạng Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo, trong đó có nhiều loài làm thuốc [16] Bên cạnh đó, dân tộc ta cũng có vốn tri thức bản địa phong phú trong việc sử dụng các loài động vật, thực vật và khoáng vật làm thuốc Hai lĩnh vực này được các nhà khoa học coi là một tiềm năng, để tìm kiếm nghiên cứu tạo ra những loại thuốc mới, có hiệu lực điều trị cao trong tương lai

Hiện nay xu thế tìm các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc được nhiều nhà khoa học quan tâm Các dược liệu làm thuốc trong nước rất đa dạng và phong phú, tuy nhiên do bị khai thác quá mức nên nhiều dược liệu đã cạn kiệt, phân bố ngày càng bị thu hẹp Do đó, chúng ta cần có những biện pháp tích cực nhằm bảo vệ và phát triển nguồn tài nguyên này

Chi Stephania Lour là một chi lớn trên thế giới có khoảng gần 100 loài,

riêng ở Việt Nam có khoảng 20 loài phân bố khắp cả nước Các cây trong chi này được nghiên cứu nhiều trong việc chiết xuất và phân lập lấy rotundin, làm thuốc an thần gây ngủ, một số loài chiết lấy cepharanthin làm thuốc chống nhiễm xạ, chống lao, Tuy nhiên, còn nhiều chất trong cây thuộc chi này cần được nghiên cứu để ứng dụng trong thực tiễn Cây Củ dòm còn có tên khác là

ngải tượng, củ gà ấp, bình vôi đỏ, có tên khoa học là Stephania dielsiana Y

C Wu Đây là cây thuốc được đưa vào Sách đỏ Việt Nam từ năm 2007 Cây

Củ dòm được một số dân tộc miền núi phía bắc thu hái làm thuốc chữa đau lưng, nhức mỏi chân tay đau bụng, đau dạ dày, sốt rét, Nguyễn Quốc Huy

đã phân lập được L-tetrahydropalmatin, oxostephanin, dehydrocrebanin từ Củ dòm và đã chứng minh oxostephanin có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), ung thư cơ vân (RD), ung thư phổi (LU), với IC50 lần lượt là 0,566, 0,755, 1,404 [10], [11]

Để tiếp tục tìm hiểu thành phần hóa học của cây Củ dòm và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng Củ dòm, tiến tới quy hoạch phát triển dược liệu Củ dòm theo hướng bền vững, đề tài "Nghiên cứu phân lập một số

alcaloid và tinh chế một alcaloid từ cây Củ dòm (Stephania dielsiana Y

C Wu.) làm chất chuẩn" được thực hiện với 2 mục tiêu:

- Chiết xuất, phân lập được một số alcaloid trong cây Củ dòm

- Tinh chế một alcaloid phân lập được đủ lượng và đạt độ tinh khiết làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm và nghiên cứu

Chương1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về loài Củ dòm (Stephania dielsiana Y C Wu.)

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Loài Stephania dielsiana Y.C.Wu thuộc chi Stephania Lour., họ Tiết dê

(Menisperaceae), bộ Hoàng Liên (Ranunculaceae), phân lớp Hoàng Liên (Ranunculidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [10]

Võ Văn Chi [3], Nguyễn Chiều [4], [5], mô tả Củ dòm Stephania dielsiana

Y.C.Wu.) với các đặc điểm sau: Cây thảo, sống nhiều năm, rễ củ to, hình cầu Thân nhỏ mọc leo, dài khoảng 3 m Thân già màu nâu bạc, thân non màu tím nhạt Thân lá, cụm hoa đều không có lông, lá đơn, nguyên, mọc so le, cuống

lá 4,5- 8,5 cm, cuống đính lá hình khiên; phiến lá hình tam giác tròn, dài 9­13,2 cm, rộng 5- 13,5 cm, mép lá có thể hơi gợn sóng hoặc có răng tù, rất thưa ở ngọn lá, đầu lá nhọn, góc lá bằng hoặc hơi lõm, gân lá dạng chân vịt Ngọn non, cuống lá non và cụm hoa chứa dịch màu tím hồng

Hoa đơn tính, khác gốc Cụm hoa đực do 3-5 xim tán hợp thành xim tán kép; hoa nhỏ cuống ngắn; có 6 lá đài xếp 2 vòng, màu tím; 3 cánh hoa hình quạt tròn, màu hồng cam, cong vào phía trong, cột nhị ngắn, bao phấn dính thành đĩa 6 ô Cụm hoa cái gồm 7-8 đầu nhỏ, cuống cực ngắn xếp thành dạng đầu; hoa nhỏ, cuống rất ngắn; hoa có 1 lá đài màu tím 2 cánh hoa màu hồng cam, hình quạt tròn, cong, có các chấm và vân tím; đầu nhụy 4-5 thùy dạng đùi Quả hình trứng ngược, dẹt 2 bên, dài 0,8- 0,9 cm rộng 0,7- 0,75 cm Hạt hình trứng ngược, cụt đầu, có lỗ thủng ở giữa, trên lưng có 4 hàng gai cong, nhọn

Loài Stephania dielsiana Y.C.Wu phân bố nhiều ở Việt Nam và Trung

Quốc Tại Việt Nam, loài này phân bố chủ yếu ở Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang (Na Hang, Chiêm Hóa), Bắc Kạn, Thái Nguyên (Đại Từ, Tam Đảo), Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hà Nội (Ba Vì), Quảng Nam (Trà My, Trà Mai, Trà Giác) [10], [14], [15], [20]

Hình 1.1 Cụm hoa đực và hoa đực S Dielsiana

Hình 1.2 Cụm hoa cái S dielsiana

Hình 1.3 Quả xanh và hạt S dielsiana

1.1.2 Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học loài Củ dòm (Stephania Dielsiana Y.C.Wu.)

Phạm Thị Duyên (2004) [6], [7] đã nghiên cứu định lượng L- tetrahydropalmatin bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Kết

quả định lượng cho thấy hàm lượng L-tetrahydropalmatin trong loài S

dielsiana (thu hái ở Ba Vì-Hà Tây) là: 0,40%.

Năm 2009, Nguyễn Quốc Huy [12] đã phân lập và nhận dạng được 3 alcaloid từ loài củ dòm là: L-tetrahydropalmatin, oxostephanin,dehydrocrebanin

Năm 2009, Zhang Yi và cs [29] đã phân lập và nhận dạng được 12

alcaloid từ loài Stephania dielsiana là sinoacutin, stephanin, ayuthianin,

dehydrostephanin, cephamorphinanin, aknadinin, liriodenin, sinomenin, l- tetrahydropalmatin, (-) corydalmin, oxocrebanin, nor-canelillin

Năm 2010, Yecheng Deng, Yanzhen Yu, Haiyu Luo, Ming Zhang, Xu

Qin, Lifeng Li [22] đã phân lập được hai alcaloid từ loài Stephania dielsiana

là stephanin và crebanin

1.1.3 Tác dụng, công dụng

Theo Võ Văn Chi, rễ dùng uống, chữa đau lưng, mỏi nhức chân, đau lưng, đau bụng, lại giúp ngủ rất say Còn dùng đắp chỗ sưng bắp chuối, nhọt cứng, apxe do viêm Người ta thường giã lẫn với muối và gừng Nhân dân ở Bắc Thái, Hà Tây thường dùng củ thái nhỏ nấu nước uống, chữa kiết lỵ ra máu, đau bụng kinh niên và đau dạ dày [3]

1.2.Tổng quan về chiết xuất, phân lập, tinh chế alcaloid

1.2.1 Chiết xuất

Alcaloid nói chung là những bazơ yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin, nên phải tán nhỏ dược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alcaloid khỏi muối của nó bằng các kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh

Hầu hết các alcaloid bazơ không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực (hydrocarbon thơm, cloroform, ether) trái lại các muối alcaloid thường tan trong các dung môi ít phân cực Mặt khác còn tuỳ theo tính chất của alcaloid như loại bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp [8]

Đối với những alcaloid bay hơi được như conein (trong cây conium malculatum) nicotin, spartein có thể cất kéo được bằng hơi nước Sau khi sấy khô dược liệu tán nhỏ, tẩm kiềm để đẩy alcaloid ra dạng bazơ rồi cất lấy alcaloid, người ta thường hứng dịch chiết được vào trong dung dịch acid và từ

đó thu được muối alcaloid [8], [13]

Đối với alcaloid không bay hơi được người ta sử dụng những phương pháp sau: [8]

Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm

Tán nhỏ dược liệu, tẩm với dung dịch kiềm

Chiết bằng dung môi hữu cơ kém phân cực Cất thu hồi dung môi

Chiết alcaloid bằng dung dịch acid 2 - 5%

Kiềm hoá dung dịch acid và chiết bằng dung môi hữu cơ, loại nước rồi cất thu hồi dung môi, thu được cắn alcaloid ^ kết tinh

Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước

Thấm ẩm dược liệu bằng dung môi chiết Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi đến cạn, dùng ether rửa dịch chiết đậm đặc

Kiềm hoá dịch acid, chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ thích hợp, bốc hơi dung môi hữu cơ thu được alcaloid thô

Chiết bằng cồn

Có một số alcaloid tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ở môi trường trung tính nên sau khi tán nhỏ dược liệu, thấm ẩm và chiết bằng ethanol Các quá trình tiếp theo được thực hiện như trên

Tuy nhiên có những trường hợp đặc biệt cần có những phương pháp đặcbiệt

1.2.2 Tinh chế và phân lập

Sau khi chiết xuất ít khi thu được một alcaloid tinh khiết mà thường là hỗn hợp nên cần loại tạp Nếu chỉ có một alcaloid thô thì có thể tinh chế bằng cách chuyển nó nhiều lần từ dung môi hữu cơ sang dung môi nước và ngược lại, cuối cùng làm bốc hơi dung môi ta được một alcaloid tinh khiết

Nếu là hỗn hợp những alcaloid để tinh chế và phân lập riêng từng alcaloid, thường chỉ dùng phương pháp kết tinh phân đoạn bằng các dung môi kiềm có độ pH thay đổi tăng dần Cụ thể thêm từ từ vừa đủ từng phần kiềm lúc đầu các base yếu nhất sẽ được giải phóng ra dưới dạng base tự do Tăng dần độ kiềm lên sẽ lần lượt giải phóng các base có tính kiềm mạnh dần Mỗi

lần thêm kiềm vào ta lắc hỗn hợp với dung môi hưu cơ ta sẽ thu được một loạt các phân doạn base [8], [17]

Ngày nay người ta sử dụng thêm một số phương pháp khác như: phương pháp trao đổi ion, phương pháp sắc ký cột, sắc ký chế hoá.[13], [17]

Phương pháp trao đổi ion

Dựa vào sự trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch muối alcaloid và các ion đã bị hấp phụ trên chất mang (nhựa trao đổi ion)

Các nhựa trao đổi ion (ionit) được dùng là các cationit (những cao phân

tử rắn mang nhóm acid có khả năng hấp phụ các cation) và các anionit (là những cao phân tử rắn mang nhóm bazơ có khả năng hấp phụ anion) các nhựa trao đổi này không tan trong nước và các dung môi hữu cơ

Muối alcaloid hoà tan trong nước tạo ra các cation lớn

Cl-Nhựa cationit hấp phụ alcaloid tạo ra dạng muối alcaloid Alcaloid này

sẽ được đẩy ra khi có dung dịch kiềm hoặc amoniac:

Cat[BH]+ + (NHO+OH- ^ Cat[NHị]+ + B + H2O

Alcaloid không tan trong nước và được giữ lại cột và được lấy ra bằng dung môi thích hợp

Nếu sử dụng anionit:

Ani OH- + [BH]+Cl- ^ Ani+ Cl- + B + H2O

Alcaloid được giải phóng dạng bazơ được chiết bằng dung môi hữu cơ

Phương pháp sắc kỷ cột

Dựa vào nguyên tắc các thành phần trong hỗn hợp alcaloid có độ hấp phụ khác nhau trên chất hấp phụ đã nạp trong cột, chất hấp phụ thường là silicagen G bột cellulose

Phương pháp sắc kỷ lớp chế hoá

Sau khi triển khai bằng hệ dung môi thích hợp, cạo lấy riêng các vết, chiết xuất thu được alcaloid tinh khiết.

1.2.3 Sắc ký điều chế ứng dụng trong phân lập, tinh chế alcaloid

1.2.3.1 Khái niệm về sắc ký điều chế

Sắc ký điều chế, khác với sắc ký phân tích, được sử dụng để tách một lượng chất nhất định ra khỏi hỗn hợp Sự khác nhau cơ bản giữa hai kỹ thuật

là hỗn hợp không được xác định hay phân tích hoàn toàn nhưng dung dịch chứa chất cần lấy được tách riêng và thu hồi lại sử dụng về sau Sắc ký điều chế không liên quan nhiều đến lượng mẫu lớn hay cột lớn (mặc dù các cột sắc

ký rất lớn thường được sử dụng trong sắc ký điều chế) Tuy nhiên, kỹ thuật này liên quan đến việc tách riêng và thu hồi các thành phần Tùy thuộc vào mục đích và yêu cầu sử dụng, đường kính cột sắc ký điều chế có thể từ vài

mm đến hơn lm với thể tích pha động từ vài mililít đến hàng trăm lít

Khi ứng dụng sắc ký điều chế, với thể tích mẫu không quá 2% thể tích cột điều chế thì cho kết quả tốt nhất [8]

1.2.3.2 Sắc ký phân loại theo kích cỡ và việc sử dụng Sephadex

Sắc ký phân loại theo kích cỡ (size exclusion chromatography- SEC) còn được biết đến với tên là sắc ký rây phân tử (molecular sieve chromatography), sắc ký thấm qua gel (gel permeation chromatography) hay sắc ký lọc qua gel (gel filtration chromatography) SEC dựa trên sự khác nhau về kích cỡ của các tiểu phân để tách riêng chúng ra bằng cách sử dụng các chất có kích thước

lỗ xốp xác định làm pha cố định Các phân tử có kích thước nhò hơn sẽ đi sâu vào trong khối xốp và bị giữ lại lâu hơn trước khi ra khỏi cột Trong khi đó, các phân tử có kích thước lớn hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn SEC thường có

độ phân giải thấp, vì thế trong quá trình tinh chế, sau khi chạy sắc ký lọc gel, sắc ký pha đảo được áp dụng cho giai đoạn cuối cùng của quá trình tinh chế, nếu cần [8], [17]

Sắc ký gel bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1950 nhưng gần 10 năm sau, chất lọc gel dùng làm pha cố định mới ra đời với tên là Sephadex Đây là pha

rắn đùng để lọc các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn tan trong nước, về sau một số chất gel polystyren có tính kỵ nước ra đời dùng để lọc các hợp chất phân tử lớn tan trong dung môi hữu cơ [1], [8]

Sephadex là tên thương mại của một loại gel có các dây nối dextran, dược sử dụng nhiều trong sắc ký lọc gel

Sephadex LH-20 là một chế phẩm được chế tạo đặc biệt dùng trong quá trình phân lập và tinh chế có sử dụng dung môi hữu cơ để điều chế các chất có sẵn trong tự nhiên như steroids, terpenoids, lipids các peptides có phân tử lượng thấp Trong một số dung môi nhất định, Sephadex LH-20 có thể có độ chọn lọc rất cao với các hợp chất có nhân thơm và có thể được sử dụng ở cả quy mô phân tích và quy mô công nghiệp

Sephadex LH-20 được tạo ra bằng cách hydroxypropyl hoá các hạt dextran để tạo các cầu liên kết hình thành nên một mạng lưới polysaccharide Mạng lưới này trương nở trong nước hoặc trong các dung môi hữu cơ Sephadex LH-20 được sử dụng cho việc tinh chế ở giai đoạn đầu, trước khi hoàn tất quá trình tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký pha đảo hoặc một kỹ thuật nào khác Tuỳ thuộc vào dung môi được sử dụng, Sephadex LH-

2 0 thể hiện cả tính ưa nước và kỵ nước và có thể đạt được độ chọn lọc sắc ký cần thiết cho những ứng dụng nhất định

Khi sử dụng Sephadex LH-20 trong quá trình phân lập và tinh chế, để thu được phân đoạn của một nhóm hoạt chất, thể tích mẫu đưa lên cột có thể lên đến 30% tổng thể tích cột Để thu dược phân đoạn có độ phân giải cao, yêu cầu thể tích mẫu đưa lên cột từ 0,5-4% tổng thể tích cột Đối với hầu hết các trường hợp, để có kết quả phân tách tốt nhất, yêu cầu thể tích mẫu đưa lên cột không quả 2% thể tích cột và tốc độ triển khai không quá 1 2cm/phút (đối với chiều cao cột nhồi là 14cm) [17]

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, phân lập alcaloid 1.2.4.1 Những yếu tố thuộc về dược liệu

- Màng tế bào dược liệu

- Chất nguyên sinh

- Các tạp chất có thể có trong dược liệu

1.2.4.2 Những yếu tố thuộc về dung môi

- Độ phân cực : dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực Và ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì dễ hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hòa tan các chất ít phân cực [17]

+ Dung môi không phân cực : ether dầu hỏa, xăng, hexan, heptan, benzen, toluen,

+ Dung môi phân cực yếu, phân cực vừa : chloroform, diclorethan, aceton, ethylacetat,

+ Dung môi phân cực mạnh : Nước, glycerin, các loại cồn có mạch carbon ngắn (methanol, ehtanol, isopropanol, )

- Ảnh hưởng của pH : vì alcaloid là một base yếu nên pH ảnh hưởng lớn đến hiệu xuất chiết xuất cũng như phân lập các alcaloid có trong dược liệu

- Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi : Độ nhớt càng thấp, sức căng

bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện cho quá trình chiết xuất,và ngược lại [8], [17]

Dưới đây là độ nhớt (^) và sức căng bề mặt (S) của một số dung môi thường gặp ở nhiệt độ phòng 200C (xếp theo thứ tự tăng dần)

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

- Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn

- Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất

- Ảnh hưởng của độ mịn dược liệu

- Ảnh hưởng của áp suất

9 > r _ ‘ỉ ĩ ĩ

1 ^ FT1 Ạ _ _ r s J ĩ _ * ^ J 1 •*> _ 1 _Ạ _J - A • _ 1 • Ạ _

.3 Tông quan vê thiêt lập chuân đôi chiêu

Theo Tổ chức y tế Thế giới (WHO), chuẩn đối chiếu (reference standard)

là bất kỳ nguyên liệu đã được xác định tính chất (định tính) và độ tinh khiết/ hoạt lực Một chuẩn đối chiếu chính thức phải có mặt trong danh mục chính thức của Dược điển Anh (BP) hoặc của Dược điển Mỹ (USP) hoặc của WHO

Có thể thiết lập một chuẩn đối chiếu cơ sở thông qua so sánh tính chất và độ tinh khiết/ hoạt lực với một chuẩn đối chiếu chính thức hoặc xác định độ tinh khiết tuyệt đối bằng các kỹ thuật khác Việc chấp nhận mức độ tinh khiết cao hơn hay thấp hơn đối với một chuẩn đối chiếu tuỳ theo mục đích sử dụng (dùng để định tính, dùng để định lượng) và bản chất phương pháp định lượng [19], [25], [26], [28]

1.3.1 Xác định độ tinh khiết của chất bằng phương pháp quét nhiệt vi sai

Trong những trường hợp không có chất chuẩn để tiến hành định lượng các mẫu nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký hoặc đo quang, hoặc không thể xác định hàm lượng hoạt chất bằng các phương pháp thông thường nào khác, người ta có thể xác định độ tinh khiết của chất bằng phương pháp quét nhiệt vi sai dựa trên cơ sở:

- Khi làm nóng một mẫu, sự thu nhiệt hay toả nhiệt có thể đo được Một thiết bị được thiết kế để ghi lại nhiệt độ mà tại đó có sự chuyển đổi pha, thay đổi trạng thái hoặc xuất hiện các phản ứng hoá học Khi có hiện tượng chảy,

cả hiện tượng trào dâng và pic nhiệt có thể được xác định một cách khách quan và lặp lại, thường kéo dài đến vài phần mười của độ Thuộc tính về nhiệt

độ này đặc trưng cho mỗi chất và sự khác nhau giữa hai giá trị nhiệt độ đo thể hiện độ tinh khiết, không thể phụ thuộc vào ý chủ quan Vật liệu tinh khiết có

đặc trưng điểm bộ ba bao gồm các thông số nhiệt độ, các giá trị khoảng chảy

và các hàng số khác Dựa vào đó, có thể định tính và xác định độ tinh khiết của chất

- Độ tinh khiết phân tử gam được xác định bằng đo quét nhiệt vi sai dựa trên công thức tính tích phân gần đúng của phương trình Van’t Hoff theo nồng độ trong hệ nhị nguyên [30]

T0: Điểm chảy của chất tinh khiết về mặt hoá học (độ K)

AHf: Nhiệt nóng chảy mol của chất (J)

R: Hằng số khí lý tưởng (J.K-1 mol1)

Do đó, xác định độ tinh khiết bẳng phương pháp DSC được giới hạn bởi sự phát hiện các tạp chất có hình thành hỗn hợp ơ tec ti với chất chính và

có tỉ lệ mol < 2 % trong mẫu chất được đo

Phương pháp này không áp dụng được với:

- Các chất vô định hình

- Các hợp chất đa hình hoặc solvat hoá (không ổn định trong khoảng nhiệt độ đo)

- Các tạp tạo dung dịch rắn với chất chính

- Các tạp không tan trong pha l ỏ ng ho ặc không tan trong chất chính nóng chảy

Trong suốt quá trình gia nhiệt đo mẫu chất, các tạp chất chảy hoàn toàn

ở nhiệt độ tạo thành hỗn hợp ơ tec ti (điểm ơ tec ti) Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt

độ này pha rắn còn lại chỉ có chất tinh khiết Khi nhiệt độ tăng dần từ nhiệt độ tạo hỗn hợp ơ tec ti đến nhiệt độ nóng chảy của chất tinh khiết, tỷ lệ mol của tạp trong pha lỏng giảm liên tục, vì lượng chất tinh khiết chảy lỏng tăng liên tục Với nhiệt độ cao hơn điểm ơ tec ti, có công thức tính sau:

* 2 = f (2)Trong đó:

F: Tỉ lệ mol của mẫu được đo

X*2: Tỉ lệ mol của tạp trong mẫu được đo

Khi mẫu đo chảy hoàn toàn, F=1 và X2 = X*2

Kết hợp (1) và (2), thu được công thức sau:

1.3.21 Tính đặc hiệu

Cần chú ý độ đặc hiệu thu được ở phần thẩm định này chỉ có ý nghĩa đôi với thành phần hoạt chất được định lượng chứ không có nghĩa là đảm bảo độ đặc hiệu cho phép định tính của dược liệu chứa hoạt chất đó Thông thường

để định tính dược liệu người ta phải bổ sung thêm các phép thử khác như: SKLM, Để thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp HPLC, cần tiến hành chuẩn bị một số mẫu sau theo quy trình phân tích:

- Mẫu trắng: dung môi pha mẫu

- Mẫu nền (giả dược - placebo): Mẫu giả dược bao gồm các thành phân tương tự như chế phẩm thuốc nhưng không chứa dược liệu cần phân tích được chuẩn bị giống như mẫu thử theo TCCS

- Mẫu chuẩn dược liệu hoặc cao dược liệu: Mẫu chiết từ dược liệu chuẩn hoặc cao dược liệu chuẩn có chứa thành phần hoạt chất cần phân tích với lượng bằng mẫu thử, được chuẩn bị giống mẫu thử theo tiêu chuẩn cơ sở

- Mẫu chuấn hóa học: Là mẫu chứa các chất chuẩn cần phân tích, các chất hóa học có trong dược liệu cần phân tích có nồng độ tương ứng (tính từ hàm lượng trong dược liệu) được chuẩn bị theo mẫu chuẩn trong TCCS cần chú ý với các phép thử định lượng được tính toán quy về 1 chuẩn ta vẫn cân chuẩn bị các dung dịch chuẩn của các chất đưa vào tính toán còn lại.

- Mẫu thử: Dung dịch mẫu thử được chuẩn bị theo TCCS

Tiến hành: Tiêm lần lượt các dung môi pha mẫu, dung dịch mẫu thử và dung dịch mẫu chuẩn đối chiếu, ở trê n vào hệ thống sắc ký

Phương pháp HPLC được coi là có tính đặc hiệu/ chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu:

+ Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn;

+ Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn;

+ Pic của chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử có các thông số đặc trưng như hệ số dung lượng (k’), thời gian lưu (tR), Số đĩa lý thuyết (N) và độ phân giải (R), Khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với pic tương ứng trong sắc ký mẫu chuẩn có nồng độ chất cần phân tích tương đương

Ngoài ra, nếu mẫu thử và mẫu chuẩn có nhiều thành phần, thông thường cần tính đến độ phân giải của các pic chất phân tích và pic bên cạnh, thông thường độ phân giải cần quy định không dưới 1,5 Mặt khác, tùy theo loại detector được sử dụng trong phương pháp HPLC, nhà sản xuất có thể sử dụng

các dữ liệu đặc trưng đối với mỗi loại detector như phổ UV-VIS (detector

diode array), phổ kích thích - phát xạ (detector huỳnh quang), phổ khối (detector khối phổ) hoặc mức độ tinh khiết/ không tinh khiết của pic (Purity/ Impurity peak) thu được trong sắc ký đồ các mẫu thử để chứng minh

tính đặc hiệu/ chọn lọc đối với hoạt chất cần phân tích của phương pháp Đối với detector diode array, nếu pic thu được trong sắc ký đồ mẫu thử có độ tinh khiết xấp xỉ 1 0 0% (không phát hiện thấy thành phần tạp chất trong pic) và phổ tử ngoại - khả kiến của pic thu được trong sắc ký đồ mẫu thử giống với

phổ tử ngoại - khả kiến của pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn (hệ số trùng phổ xấp xỉ 1,0) thì tính chọn lọc/ đặc hiệu đối với hoạt chất cần phân tích của phương pháp HPLC đang thẩm định càng được củng cố.

Trong một số trường hợp định lượng nhiều thành phần dựa trên một chất, đôi khi cần tính toán đến tỷ lệ các thành phần để đảm bảo tính đặc hiệu

do trong dược liệu có rất nhiều loại có cùng một hoạt chất hay cùng nhóm gốc (aglycon) (vd: định lượng flavonoid toàn phần trong cao bạch q u ả , )

1.33.2.2 Độ chính xác của phương pháp

Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị cv (%) Độ chính xác bao gồm độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp

- Độ lặp lại (độ chính xác trong ngày)

+ Độ lặp lại các lần tiêm mẫu (độ thích hợp của hệ thống)

Độ thích hợp của hệ thống được xác định bằng cách tiêm lặp lại nhiều lần một mẫu dung dịch đồng nhất chứa hoạt chất cần phân tích Độ thích hợp của hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thử nghiệm Mẫu đánh giá tính thích hợp của hệ thống thông thường là mẫu chuẩn có nồng độ 100% nồng độ định lượng Tuy vậy, vẫn có thể sử dụng các mức nồng độ khác, miễn là vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp Trên sắc ký đồ các mẫu đánh giá tính thích hợp của hệ thống, pic của hoạt chất cần phân tích phải đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp HPLC Giá trị RSD của diện tích (chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2,0%

+ Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của phương pháp (độ chính xác trong ngày, độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng) được biểu thị bằng giá trị RSD% kết quả phân tích các mẫu độc lập trong cùng một điều kiện phân tích Thông thường với mẫu thuộc đông dược độ lặp lại của phương pháp được đánh giá trên ít nhất 6 mẫu thử độc lập có nồng độ tương ứng với 1 0 0% giá trị ghi nhãn

Không có các giới hạn cụ thể mà độ lặp lại của một phương pháp phải đạt được, tuy nhiên đối với phương pháp HPLC dùng định lượng hoạt chất trong chế phẩm thuốc thuốc đông dược thì giá trị RSD của phương pháp cũng không nên vượt quá 3,0% Các trường hợp giá trị RSD > 3%, cần phải có sự giải thích phù hợp.

+ Độ chính xác trung gian (độ chính xác giữa các ngày)

Độ chính xác trung gian nhằm để đảm bảo rằng phương pháp sẽ cung cấp các kết qua tương tự như nhau khi phân tích cùng một mẫu thử trong các điều kiện thực nghiệm khác nhau Tùy thuộc vào thời gian, nguồn nhân lực và vật lực nghiên cứu độ chính xác trung gian của phương pháp HPLC có thể được thử nghiệm trên nhiều ngày với người phân tích và hệ thống HPLC khác nhau Độ chính xác trung gian của phương pháp HPLC phải thực hiện trên ít nhất 02 ngày và người phân tích khác nhau Bố trí đánh giá độ chính xác trung gian cho mỗi ngày thực nghiệm tương tự như bố thí thực hiện đánh giá

độ lặp lại của phương pháp Xác định độ chính xác trung gian của phương pháp bằng cách xác định giá trị RSD giữa các ngày phân tích Giá trị RSD giữa các ngày không nên vượt quá 3,0% Ngoài ra có thể so sánh kết quả định lượng trung bình của mỗi ngày phân tích hoặc sử dụng test-F, phân tích phương sai (ANOVA) để đánh giá Kết quả phân tích giữa các ngày, nói chung không nên khác nhau có ý nghĩa thống kê hoặc chênh lệch nhau không vượt quá giá trị sai số độ đúng của phương pháp

+ Độ tái lặp

Theo định nghĩa của ICH, độ tái lặp biểu hiện khả năng lặp lại kết quả phân tích trên cùng một mẫu giữa các phòng thí nghiệm Độ tái lặp của phương pháp được nghiên cứu tương tự độ chính xác trung gian nhưng thực hiện trên ít nhất 02 phòng thí nghiệm khác nhau Theo quy định chung, không bắt buộc phải xác định độ tái lặp của phương pháp HPLC giữa các phòng thí nghiệm đặc biệt khi đã thực hiện nghiên cứu độ chính xác trung gian đầy đủ (trừ các phương pháp HPLC dự định tiêu chuẩn hóa, áp dụng rộng rãi cho nhiều đơn vị)

1.3.2.3 Tính tuyến tính và khoảng xác định

- Tính tuyến tính: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử Xác định tính tuyến tính của phương pháp HPLC bằng cách tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn chất cần phân tích theo qui trình Xây dựng phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn

có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ (đường chuẩn) bằng phương pháp bình phương tối thiểu Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng

độ, nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng xác định của phương pháp Các mẫu chuẩn có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn ban đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau Một phương pháp HPLC thông thường phải có hệ số tương quan tuyến tính của đường chuẩn, r > 0,999, ngoài ra hệ số (b) của đường chuẩn không nên vượt quá 5% so với đáp ứng của mẫu tương ứng với mức nồng độ 1 0 0%

- Khoảng xác định: Khoảng xác định là khoảng nồng độ thuộc đường chuẩn

và đáp ứng các yêu cầu độ đúng, độ chính xác của phương pháp phân tích Khoảng xác định tùy thuộc vào mục đích sử dụng của phương pháp:

Đối với phương pháp HPLC dùng để định lượng hoạt chất của dược liệu trong chế phẩm thuốc đông dược: khoảng xác định tối thiểu nên tương ứng với từ 80% của nồng độ định lượng đến 150% nồng độ định lượng

Đối với phương pháp HPLC dùng để xác định độ đồng đều hàm lượng (đồng đều đơn vị phân liều): khoảng xác định tối thiểu phải tương ứng với từ 70% đến 150% nồng độ định lượng

Đối với phương pháp HPLC dùng để xác định lượng hoạt chất hòa tan trong môi trường thử nghiệm khoảng xác định tối thiểu phải đáp ứng yêu cầu

± 20% giá trị quy định trong tiêu chuẩn Ví dụ nếu tiêu chuẩn yêu cầu cho chế phẩm giải phóng hoạt chất có kiểm soát là từ 20% sau 1 giờ đến 90% sau 24 giờ thì khoảng xác định của phương pháp HPLC phải là từ 0% đến 110% hàm lượng ghi trên nhãn

Đối với phương pháp HPLC dùng để xác định tạp chất: khoảng xác định của phương pháp phải từ 1 0 0% đến 1 2 0% của giới hạn cho phép.

1.3.2.4 Độ đúng

Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết Không có các giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương pháp phải đạt được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ % và/hoặc khối lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử Nói chung, đối với phương pháp HPLC dùng để định lượng hàm lượng dược chất trong dược liệu của chế phẩm đông dược độ đúng của phương pháp có thể được chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chiết tách phức tạp, giới hạn có thể dao động từ ± 2 ,0% đến ± 1 0,0% hoặc hơn, tuy nhiên cần có biện giải về giới hạn này Độ đúng của phương pháp HPLC đối với định lượng hoạt chất trong dược liệu thường được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn như sau:

- Xác định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn:

Nghiên cứu độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn, tuy nhiên khác với phép định lượng các hoạt chất trong thuốc tân dược, với các thuốc đông dược cần sử dụng dược liệu hay cao dược liệu chuẩn đã biết hàm lượng hoạt chất

để thêm vào mẫu giả dược (trừ trường hợp phân tích các hoạt chất có sẵn ngay trong dược liệu thì cũng có thế chấp nhận dùng hoạt chất) Việc thêm chuẩn thường được thực hiện tại ít nhất 03 mức nồng độ (ví dụ ở mức 80, 100

và 1 2 0% so với mức hàm lượng lý thuyết) và nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập Phân tích mẫu theo qui trình phân tích Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp (giá trị trung bình và RSD) Có thể báo cáo độ đúng tại mỗi mức nồng độ hoặc báo cáo độ đúng của cả ba mức nồng độ

Trong một số trường hợp, không thể có được các mẫu giả dược phù hợp,

có thể chấp nhận thêm dược liệu hay cao chuẩn đã biết hàm lượng vào mẫu thử Lượng chất chuẩn thêm vào không nên quá 50% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng lượng hoạt chất có trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính

của phương pháp Tiến hành xác định độ đúng của phương pháp tương tự như trường hợp thêm chuẩn vào mẫu giả dược Tuy nhiên cũng cần chú ý trong trường hợp này cũng không nên thêm lượng thấp dưới 20% lượng hoạt chất

có sẵn để giảm bớt ảnh hưởng của sai số do chính phương pháp phân tích gây ra

1.3.2.5 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Các chỉ tiêu này theo ICH không cần đánh giá khi tiến hành định lượng, tuy nhiên khi tiến hành phát triển một phương pháp nên đánh giá các chỉ tiêu này để xem xét khả năng có thể định lượng một hoạt chất trong dược liệu, qua

đó mới xây dựng quy trình định lượng phù hợp, mặt khác khi định lượng giới hạn tạp chất thì chỉ tiêu này là bắt buộc

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của hoạt chất cần phân tích có trong mẫu mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được Giới hạn định lượng (LOQ) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp Không có các mức giới hạn bắt buộc phải đạt được đối với các giá trị LOD và LOQ của mồi phương pháp

- Xác định LOD

Giá trị LOD của phương pháp HPLC có thể xác định bằng một trong các cách sau:

+ Dựa vào tỷ lê đáp ứng so với nhiễu đường nền:

Tiến hành phân tích các mẫu giả dược Xác định đáp ứng trung bình của đường nền tại khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu của pic hoạt chất cần phân tích (SB) Kỹ thuật xác định đáp ứng của nhiễu đường nền tuân thủ theo nguyên lý chung của sắc ký

Tiến hành phân tích các mẫu giả dược có thêm dược liệu hay cao chuẩn

có chứa chất cần phân tích với nồng độ xác định — CT (kl/tt) Nồng độ Ct

càng nhỏ càng phù hợp Xác định đáp ứng pic trung bình của các mẫu giả dược có thêm chuẩn (ST)

Giá trị LOD của phương pháp được xác định theo công thức sau:

L 0 D = - - - - bCt ( k l / t t )

Từ giá trị LOD này cần tính toán LOD cho lượng dược liệu / cao tối thiểu trong chế phẩm

+ Dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng:

Tiến hành phân tích các mẫu giả dược và các mẫu giả dược có thêm dược liệu hay cao chuẩn có chất cần phân tích với các nồng độ xác định Cách tiến hành tương tự như phần a ở trên

Giá trị LOD của phương pháp được xác định theo công thức sau:

LOD = —

a

Trong đó:

+ S: Độ lệch chuẩn của đáp ứng pic của mẫu giả dược

+ a: Hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và đáp ứngpic của chất cần phân tích (xác định bằng phương pháp bình phương tối thiểu) trên mẫu giả dược có thêm chuẩn

Giá trị s nên được xác định từ tập họp các đáp ứng pic của mẫu giả dược Trong trường hợp không xác định được đáp ứng pic của các mẫu giả dược, có thể được xác định từ độ lệch chuẩn của tập hợp các giá trị b của đường chuẩn y = ax + b

độ chính xác của phương pháp tại giới hạn nồng độ định lượng của phương pháp

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Cây Củ dòm thu hái tại Ba Vì-Hà Nội tháng 3 năm 2013 và tháng 4

năm 2014 Mẫu nghiên cứu đã được giám định tên khoa học là Stephania

dielsiana Y.C Wu., họ Tiết dê (Menispermaceae) (tiêu bản được lưu giữ ở

phòng Tiêu bản - Trường Đại học Dược Hà Nội, mã số tiêu bản là HNIP/17701/10)

Hình 2.1 Vườn trồng cây Củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội

Hình 2.2 Củ loài S dielsiana

Dược liệu nghiên cứu là củ (trưởng thành), thân và lá (bánh tẻ):

- Củ được rửa sạch, gọt bỏ vỏ, thái lát, phơi sấy khô

- Thân và lá được rửa sạch, phơi sấy khô

Dược liệu được bảo quản nơi khô ráo, dược liệu trước khi chiết được làm thành bột thô [1], [2], [17]

2.1.2 Dung môi hóa chất

Các hóa chất, thuốc thử đạt yêu cầu tinh khiết phân tích, theo tiêu chuẩn DĐVN IV [1]:

- Bình thủy tinh 5 lít: để ngâm chiết dược liệu

- Máy cất thu hồi dung môi Rotavapor Buchi (Đức)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 (0,01 mg) (Đức)

- Cân phân tích XB 220A Precisa (0,1 mg) (Đức)

- Thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) AGILENT (Đức)

TECHNOLOGIES 1200 với detector UV - VIS (PDA); cột sắc kí RP 18 với các kích thước hạt và kích thước cột khác nhau

- Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo điểm nóng chảyBUCHI 535 (Đức) tại khoa KN Vật lý - Viện KN-NC Dược và TTBYT Quân đội

- Đo độ tinh khiết trên máy quét nhiệt vi sai shimadzu DSC (Nhật) (Differential Scanning Caloriemeter) - 60 tại Phòng Thuốc chuẩn - Viện Kiểm Nghiệm thuốc TW

- Đo quang phổ tử ngoại trên máy (UV - VIS) lambda 25 (Đức) tại Khoa

KN Vật lý - Viện KN-NC Dược và TTBYT Quân đội

- Đo phổ hồng ngoại trên máy FTIR Shimadzu (Nhật) tại Khoa KN Vật

lý - Viện KN-NC Dược và TTBYT Quân đội

- Đo phổ khối ESI-MS trên máy LC-MS AGILENT TECHNOLOGIES

1100 LC-MSD TRAP của Viện hóa học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đo trên máy cộng hưởng từ Bruker Avance AM500FT- NMR tại phòng cấu trúc, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất và phân lập alcaloid

- Chiết xuất alcaloid từ dược liệu theo phương pháp chiết với dung môi MeOH [8], [13]

- Phân lập alcaloid bằng phương pháp sắc ký cột dùng silicagel pha thường, sephadex LH20, [13], [17], [18], [30], [31], [32]

2.2.2.Nhận dạng các chất phân lập được

Dựa vào độ chảy và số liệu của phổ UV, IR, ESI- MS, NMR một chiều

và hai chiều, đối chiếu với các tài liệu đã công bố [21], [24]

- Sắc kí lớp mỏng: triển khai với 3 hệ dung môi khác nhau [8]

- Quét nhiệt vi sai: Sử dụng thiết bị để xác định thông số nhiệt lượng, qua đó đánh giá mức độ tinh khiết của chất [25], [26]

- Phân tích nhiệt trọng lượng: Sử dụng thiết bị TGA để xác định hàm lượng nước kết tinh và các tạp chất bay hơi [25], [26]

- Sắc kí lỏng hiệu năng cao: Sử dụng HPLC để xác định cụ thể số lượng tạp chất và tính gần đúng tỉ lệ tạp chất dựa trên tỉ lệ phần trăm diện tích pic [2], [25], [26]

2.2.4 Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn 2.2.41 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

- Xây dựng chỉ tiêu chất lượng: Căn cứ vào tính chất lí - hóa của nguyên

liệu thiết lập chuẩn và các chỉ tiêu chất lượng thông thường của chất chuẩn đối chiếu sơ cấp để xây dựng các chỉ tiêu chất lượng của chất chuẩn đối chiếu cần thiết lập [28]

- Xây dựng phương pháp đánh giá:

+ Tham khảo DĐVN [1] và các Dược điển quốc tế [30] để lựa chọn phương pháp phù hợp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng

+ Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng bằng HPLC

- Đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn: Nguyên liệu để thiết lập

chất chuẩn là các hợp chất đặc trưng chiết tách từ dược liệu, có độ tinh khiết trên 95,0% Áp dụng phương pháp phân tích đã thẩm định để đánh giá nguyên liệu có đáp ứng yêu cầu chất lượng không [25], [26], [28]

- Định tính: Tiến hành phương pháp đo phổ IR, NMR hoặc phối hợp thêm phương pháp HPLC

- Xác định độ tinh khiết: Sử dụng một trong các phương pháp HPLC, DSC, TGA, đo điểm chảy,

- Xác định hàm lượng: Sử dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định

- Đóng gói

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Chiết xuất, phân lập alcaloid trong loài Củ dòm (Stephania dielsiana

Y.C.Wu.)

3.1.1 Chiết xuất, phân lập alcaloid trong lá và thân

Bột lá và thân củ dòm đã sây khô (100,0 g) được chiết siêu âm với methanol 3 lần mỗi lần 400ml Sau khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, cô cạn đến cắn Cắn thêm 100ml nước, đem lắc với dicloromethan (3 lần) mỗi lần 100ml Gạn lấy dịch chiết dicloromethan Gộp dịch chiết dicloromethan đem cất thu hồi dung môi đến cắn, cắn đem phân lập trên sắc

ký cột silicagel (0,040-0,060mm), rửa giải bằng hệ dung môi cloroform 100%, ethyl acetat-ethanol (80%-20%;60%-40%), ethanol 100% (Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ pha động cloroform-methanol (9:1)) Được 17 phân đoạn Phân đoạn từ 12 đến 17 có một vết màu vàng cam trên sắc ký đồ, gộp các phân đoạn này, rồi cô đến cắn Cắn này được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel (0,04-0,06mm), rửa giải với hệ dung môi dicloromethan- methanol (9:1) thu được 4 phân đoạn tương ứng ký hiệu từ FI-FIV Kiểm tra bằng SKLM, lấy phân đoạn FIII cô đến cắn, hòa tan trong dicloromethan, để kết tinh trong tủ lạnh, được tinh thể hình kim màu vàng (12,7mg), ký hiệu LTM5.10

Phần dịch chiết nước, thêm 2ml acid trifluoracetic, lắc đều, để yên 30 phút Tiếp tục lắc với dicloromethan (3 lần) mỗi lần 100ml, gộp dịch chiết dicloromethan, cất thu hồi dung môi sau đó cô cách thủy đến cắn Cắn này được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel (0,04-0,06mm), rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2- MeOH từ 100:0 đến 0:100 thu được 3 phân đoạn ký hiệu F1, F2 và F3 Sau khi kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng phân đoạn F3 chỉ có 1 vết , bốc hơi dung môi rồi đem kết tinh lại nhiều lần thu được hợp chất ký hiệu IPM (14,2 mg) Sơ đồ chiết xuất, phân lập được trình bày ở Hình 3.1

V(^^S ắc ký cợ T ^^)

1

FI

VFII

3.1.2 Chiết xuất, phân lập alcaloid từ củ

Bột Củ dòm khô (1,0 kg) được ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với MeOH (chiết 3 lần) Cất thu hồi MeOH dưới áp suất giảm đến cắn Cắn được pha thêm khoảng 50ml nước và chiết phân đoạn (x 3 lần) với dung môi ethyl acetat mỗi lần 100ml Dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 12 gam cắn dịch chiết EtOAc

Cắn dịch EtOAc (12gam) được tách bằng sắc ký cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH (tỉ lệ CH2Cl2 - MeOH gradient từ 98:2 đến 50:50 đến 20:80 đến 100% MeOH, thu được 15 phân đoạn (ký hiệu BVE1- BVE15) Phân đoạn BVE10 (220 mg) được tách trên cột silicagel rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (98:2) thu được 5 phân đoạn (BVE10.1^ BVE10.5) Phân đoạn BVE 10.3 được tinh chế trên cột Sephadex LH20, dung môi rửa giải là MeOH thu được chất 2 sạch (22 mg,

ký hiệu BVE10.3)

Hình 3.2 Sơ đồ chiết xuất và phân lập alcaloid từ củ cây Củ dòm

3.1.3 Nhận dạng các hợp chất phân lập được từ thân mang lá và từ củ

3.1.3.1 Hợp chất IPM

Hợp chất IPM thu được dưới dạng hình kim màu đỏ

Phổ khối lượng ESI-MS m/z 321 [M+H]+, M=320 tương ứng với công thức phân tử C19H14NO4

Phổ 1H-NMR (phụ lục 2) có tín hiệu của 6 proton ở vùng thơm (SH7,39-

8 , 8 8 ppm) Cặp doublet ở s H 8,48 và 8 , 8 8 (mỗi tín hiệu 1H, H-4 và H-5) với hằng số tương tác J = 6,5 Hz và một tín hiệu singlet ở SH 6,69 (2H) đặc trưng cho sự có mặt của nhóm dioxymethylen(-0-CH2-0-) và singlet ở SH 7,80 (1H)

là tín hiệu đặc trưng của H-3 ở vòng A trong khung aporphin alcaloid Điều này được khẳng định thêm qua tín hiệu của carbon tương ứng ở SC 48,90 (N+- CH3), 105,29 (-CH2 ở vị trí 1') và tín hiệu xuất hiện với cường độ thấp của nhóm carbonyl ở s c 177,34 (C-7) trong phổ 13C-NMR

Bảng 3.1 Số liệu phổ 13C- NMR và 1H - NMR của chất IPM