Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 173 113

Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội đã đầu tư nghiên cứu và phát hiện nhiều chủng xạ khuẩn phân lập từ đất, bùn, … có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó có c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ

STREPTOMYCES 173.113

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ THUỐC

MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Cao Văn Thu

HÀ NỘI 2014

Lời cảm ơn

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo – PGS.TS Cao Văn

Thu người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi

hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm luận văn tại

bộ môn

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường

Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện nghiên cứu cũng như trình độ của bản thân còn hạn chế, luận văn này không tránh khỏi còn nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô

và bạn bè để luận văn này có thể được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên

Phan Thị Huyền

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ………

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN………

1.1 Đại cương về Streptomyces………

1.1.1 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ………

1.1.2 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces………

1.1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn………

1.1.4 Những điểm lưu ý khi nghiên cứu các chất kháng sinh từ xạ khuẩn……

1.2 Bước đầu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 173.113 1.3 Nghiên cứu tổng hợp Actinomycin X 2 từ Streptomyces 15.29 – Streptomyces microflavus………

1.4 Công nghệ lên men Daunorubicin và Adriamycin………

1.5 Tổng hợp cirramycin B từ Streptomyces cyaneus………

1.6 Kháng sinh chống nấm non-polyen từ Streptomyces albidoflavus………

1.7 Tổng hợp kháng sinh antimycin A9 từ Streptomyces Sp K01-0031 ………

1.8 Sparsomycin kháng sinh được tổng hợp từ Streptomyces Sp AZ-NIOFD1……

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị ………

2.1.1 Nguyên vật liệu………

2.1.2 Máy móc thiết bị………

2.2 Phương pháp thực nghiệm ………

2.2.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn………

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán…………

2.2.3 Sàng lọc ngẫu nhiên………

2.2.4 Đột biến bằng ánh sáng UV………

2.2.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ………

2.2.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ………

2.2.7 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng………

2.2.8 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay chân không…………

1

2

2

2

3

4

5

5

6

7

9

9

10

12

14

14

14

16

16

16

17

18

18

20

20

21

22

2.2.9 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột………

2.2.10 Xác định cấu trúc hóa học thành kháng sinh chính tinh khiết thu được……

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT………

3.1 Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn………

3.1.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ………

3.1.2 Kết quả đột biến lần thứ nhất ………

3.1.3 Kết quả đột biến lần thứ hai ………

3.2 Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất………

3.2.1 Kết quả chọn chủng lên men ………

3.2.2 Khảo sát chọn môi trường lên men chìm………

3.2.3 Kết quả lên men, chiết và cất quay thu kháng sinh thô………

3.2.4 Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ nhất………

3.2.5 Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ hai………

3.2.6 Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ hai………

3.2.7 Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ ba………

3.2.8 Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ ba………

3.3 Nghiên cứu tính chất, cấu trúc kháng sinh………

3.3.1 Kết quả đo độ nóng chảy………

3.3.2 Kết quả phổ tử ngoại ………

3.3.3 Kết quả phổ hồng ngoại ………

3.3.4 Kết quả đo phổ khối ………

3.3.5 Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ………

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN ………

4.1 Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn ………

4.2 Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tối thích ………

4.3 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ………

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

22

23

24

24

24

25

27

29

29

31

32

32

35

37

39

40

43

43

43

44

46

46

49

49

50

52

54

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Giá trị MIC và MFC của kháng sinh từ Streptomyces albidoflavus …………

Bảng 1.2: Giá trị MIC của các antimycin trên Caenorhabditis elegans và Artemia salina ……….

Bảng 2.1: Các vi sinh vật kiểm định ………

Bảng 2.2.: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định………

Bảng 2.3.: Các dung môi sử dụng………

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên ………

Bảng 3.2.: Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ nhất………

Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 ………

Bảng 3.4.: Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ hai………

Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 ………

Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men …… …………

Bảng 3.7.: Kết quả chọn môi trường lên men………

Bảng 3.8: Kết quả sắc ký cột lần thứ nhất ……… ………… ………

Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn chạy cột lần 1 ……….

Bảng 3.10: Kết quả SKLM các phân đoạn khảo sát dung môi tinh chế KS lần 2 … Bảng 3.11: Tỷ lệ các thành phần hệ dung môi Ethylacetat: methanol: n-hexan …………

Bảng 3.12: Kết quả SKLM với các hệ dung môi Ethylacetat: methanol: n-hexan ……

Bảng 3.13: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau tinh chế lần 2 ………

Bảng 3.14: Kết quả SKLM các phân đoạn sau tinh chế lần thứ hai ………

Bảng 3.15: Thành phần các hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần 3 ……….

Bảng 3.16.: Kết quả SKLM với các hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ 3………

Bảng 3.17.: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau tinh chế lần 3………

Bảng 3.18.: Kết quả SKLM các phân đoạn sau tinh chế lần thứ 3………

Bảng 3.19.: Biện giải các nhóm chức của KS1 từ phổ IR………

Bảng 3.20.: Biện giải các nhóm chức của KS2 từ phổ IR………

Bảng 3.21.: So sánh phổ NMR của KS2 với khung phenoxazone của actinomycin D

10

11

14

15

15

24

25

26

28

28

30

31

33

34

36

36

37

38

38

40

40

41

42

44

45

48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 : Một số kháng sinh được tổng hợp từ Streptomyces ………3

Hình 1.2 : Sơ đồ lên men tổng hợp kháng sinh ………4 Hình P1 : Phổ UV của chất kháng sinh KS1

Hình P8a, b, c : Phổ 13C NMR giãn của kháng sinh KS2

Hình P9 : Phổ COSY của kháng sinh KS2

Hình P9a, b, c : Phổ COSY giãn của kháng sinh KS2

Hình P10 : Phổ DEPT của kháng sinh KS2

Hình P10a, b : Phổ DEPT giãn của kháng sinh KS2

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Với tính chất là một nước có khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, Việt Nam nằm trong

số các nước có nhu cầu sử dụng kháng sinh rất cao Tuy nhiên, trên thị trường dược phẩm nước ta hiện nay, hầu hết các thuốc kháng sinh đều được nhập khẩu ở dạng thành phẩm hoặc bán thành phẩm, ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa thực sự hình thành Vì vậy, đề án “Quy hoạch chi tiết phát triển công nghiệp Dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” đã xác định đẩy mạnh việc sản xuất nguyên liệu kháng sinh thế hệ mới đáp ứng nhu cầu về nguyên liệu để sản xuất kháng sinh trong nước [4]

Tổng hợp hoá học, bán tổng hợp và sinh tổng hợp là ba hướng phát hiện và tổng hợp kháng sinh Trong đó sinh tổng hợp kháng sinh với nhiều ưu điểm được sử dụng chủ yếu để tìm ra kháng sinh mới

Trong tất cả kháng sinh được biết đến hiện nay, có tới 55% kháng sinh được

phân lập từ xạ khuẩn, 75% trong số đó từ chi Streptomyces [8, 23] Bộ môn Vi sinh –

Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội đã đầu tư nghiên cứu và phát hiện nhiều chủng

xạ khuẩn phân lập từ đất, bùn, … có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó có

chủng xạ khuẩn Streptomyces 173.113 Bước đầu nghiên cứu cho thấy Streptomyces 173.113 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, tuy nhiên hiệu suất tổng hợp

cũng như hiệu suất tinh chế chưa cao, chưa biện giải được cấu trúc hóa học của kháng

sinh thu được [7] Bởi vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 173.113” làm luận văn thạc sĩ với các mục

tiêu cụ thể như sau:

1 Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất lên men sinh tổng hợp kháng sinh

2 Nâng cao khả năng lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh

3 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh chính thu được

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về Streptomyces

1.1.1 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces

Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh

có cấu trúc phức tạp Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn

+ Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ

+ Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân chia tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù

xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp)

- Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao

Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, khử nitrat

thành nitrit Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí Nhiệt độ tối thích của

chúng là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5

3

- Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4

loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc

tố melanoid [1, 3, 5, 27]

1.1.2 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces

Trong số các kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp được biết đến hiện nay thì

phần lớn được tổng hợp từ Streptomyces Các chất kháng sinh được tổng hợp từ

xạ khuẩn bao gồm các chất chống nâm, các chất kháng sinh, và hóa chất trị liệu hóa học trong ung thư Hình 1 dưới đây giới thiệu một số kháng sinh, trong đó

phần lớn là do Streptomyces tổng hợp [2, 8, 23]

Hình 1.1: Một số kháng sinh đƣợc tổng hợp từ Streptomyces

4

1.1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn

Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được thể hiện trong hình 1.2 dưới đây

Hình 1.2: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh

Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm

Bình nhân giống trong phòng thí nghiệm

Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống

Bình lên men tạo kháng sinh

Dịch lên men

Dịch lọc Sinh khối

Sinh khối thô

Dịch chiết sinh khối

5

1.1.4 Những điểm lưu ý khi nghiên cứu các chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Xạ khuẩn là vi khuẩn thật thuộc nhóm cơ thể nhân sơ, nhưng phát triển thành hệ sợi và thường sinh sản bằng bào tử Giống như nấm sợi, xạ khuẩn có khả năng phát triển tốt trên môi trường xốp Hiện nay, do điều kiện kỹ thuật đảm bảo môi trường nuôi vô trùng, người ta rất quan tâm đến việc nghiên cứu phát triển phương pháp lên men trên môi trường xốp để sinh tổng hợp enzyme, các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học khác

Xạ khuẩn có cấu tạo giống vi khuẩn, nhưng thời gian sinh trưởng phát triển chậm hơn vi khuẩn Do đó, thời gian sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp các chất kháng sinh thường kéo dài đến 96 -120 giờ lên men

Hầu hết các chủng xạ khuẩn phát triển tốt trong môi trường trung tính và nhiệt độ tối ưu là 28-300C Hơn nữa, sau giai đoạn sinh trưởng, phát triển, xạ khuẩn thường chuyển sang giai đoạn tự phân, do đó trong quá trình sản xuất phải lưu ý đến thời gian thu nhận sản phẩm [8]

1.2 Bước đầu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ

Streptomyces 173.113

Streptomyces 173.113 được bộ môn Vi sinh – Sinh học – trường ĐH Dược

Hà Nội phân lập từ đất Tây Nguyên Đây là môt chủng xạ khuẩn ổn định, có khả năng tổng hợp kháng sinh phổ rộng trên cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm,

có tiềm năng trong việc ứng dụng trong lĩnh vực phòng và chữa bệnh Tuy nhiên, hoạt tính kháng sinh chưa cao, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn thấp, do

đó cần phải tiến hành cải tạo giống lựa chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao và nghiên cứu phương pháp tinh chế kháng sinh thu được hiệu suất cao nhất

Qua sàng lọc ngẫu nhiên, và đột biến bằng UV và tác nhân hóa học thu được biến chủng ĐB3.04 là biến chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất Tỷ lệ

6

sống sót sau 3 lần đột biến của VSV là 0,15% Sau đó lên men chìm biến chủng ĐB3.04 để tạo kháng sinh Môi trường lên men thích hợp nhất là MT1dt Lượng kháng sinh thô thu được từ dịch lên men là 0,1033 g/l

Một số tính chất lý hóa kháng sinh chính thu được:

Phổ khối lượng phân tử: dự đoán phân tử lượng là 1268, 49 đvC [7]

Như vậy, nghiên cứu bước đầu đã tiến hành sàng lọc, đột biến để thu được biến chủng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn, và đã tách chiết được thành phần kháng sinh chính trong quá trình lên men Tuy nhiên, hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh chưa cao, quá trình tinh chế kháng sinh chưa xác định được kháng sinh đã tinh khiết hay chưa, do đó cần tiếp tục nghiên cứu để nâng cao khả năng sinh tổng hợp, hiệu suất quá trình tinh chế, và độ tinh khiết của kháng sinh chính thu được

1.3 Nghiên cứu tổng hợp Actinomycin X 2 từ Streptomyces 15.29 –

Streptomyces microflavus

Streptomyces 15.29 là chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ở Việt Nam,

tại phòng thí nghiệm vi sinh, bộ môn Vi sinh sinh học trường ĐH Dược Hà Nội

7

Tiến hành phân loại Streptomyces 15.29 theo ISP thì thấy 92,68% các đặc điểm trùng khớp với Streptomyces sinensis Tuy nhiên, khi giải trình tự gen 16s rADN bằng kỹ thuật khuếch đại gen PCR thấy hệ gen của Streptomyces 15.29 hoàn toàn trùng với gen của Streptomyces microflavus Do đó kết luận tên khoa học của Streptomyces 15.29 là Streptomyces microflavus

Tiến hành lên men Streptomyces microflavus thu dịch lên men sau đó chiết

bằng ethylacetat Dịch chiết ethylacetat được cất chân không thu được cắn (5g), sau đó tiến hành các phương pháp tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột silica gel thu được chất kháng sinh chính 1(1g)

Kháng sinh chính 1 được xác định các thông số về đặc tính lý hóa và công thức phân tử, công thức cấu tạo

Kháng sinh chính 1 : Chất rắn có màu hồng sẫm, Phổ khối lượng ESI-MS

m/z 1292 đvC [M+Na]+ C62H84N12O17

Nhiệt độ nóng chảy: 249 - 250o

C

Độ quay cực: []22D -360o (c, 0,5 trong MeOH)

Tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ, tác giả xác định được hợp chất 1 là actinomycin X2, một hợp chất cũng được phân lập từ

chủng Streptomyces spp và có hoạt tính chống ung thư cũng như hoạt tính kháng

sinh rất mạnh [16, 17, 20]

1.4 Công nghệ lên men Daunorubicin và Adriamycin

Daunorubicin và Adriamycin là các kháng sinh có hoạt tính chống ung thư

từ các xạ khuẩn chi Streptomyces Daunorubicin được sinh tổng hợp từ chủng S

peucetius và S.coeruleorubidus có độ độc cao nên ngày nay không được sử dụng điều trị ung thư, thay vào đó người ta nghiên cứu ra Adriamycin là chất kháng sinh tổng hợp từ biến chủng của S peucetius có hoạt tính cao hơn và phổ điều trị ung thư rộng hơn, ít độc tính hơn Ngoài ra, một nhóm nghiên cứu ở Liên Xô

8

cũng đã thu được một dẫn xuất tương tự khác là carmynomycin sinh tổng hợp từ

xạ khuẩn Actinomadura carminata

Quá trình lên men sản xuất Adriamycin như sau: Chủng S peucetius được đột biến bằng hóa chất thu biến chủng Biến chủng được nuôi cấy trong ống thạch nghiêng ở 26-270C, trong khoảng 10 ngày, sau đó loại bỏ hệ sợi nấm có màu đỏ đậm cấy chuyền sang môi trường bình tam giác 2 lít và nuôi trên máy lắc

ở tốc độ 120 v/phút, 280C trong 2 ngày Sau đó cấy sang thiết bị nhân giống thể tích 170 lít ( chứa 120 lít môi trường), nhân giống ở 26-270C trong 27 giờ, rồi cấy truyền tiếp sang thùng lên men 800 lít ( chứa 500 lít MT) Quá trình lên men kéo dài khoảng 145 giờ

Sản phẩm adriamycin tồn tại trong cả môi trường lẫn hệ sợi, vì vậy người

ta phải xử lý cả phẩn sinh khối và phần dịch trong để thu sản phẩm Đầu tiên, dịch lên men được lọc để tách riêng dịch trong và bã lọc Phần bã lọc được ngâm

xử lý trong hỗn hợp dung môi aceton: acid sulfuric 0,1N tỷ lệ 4:1, sau đó lọc tách bã Phần dịch được trung hòa về pH 7, và cô đặc chân không xuống nồng độ Adriamycin khoảng 250mg/l Dịch cô đặc được loại lipid bằng trích ly với dung môi chloroform ở pH 3 Pha nước được kiềm hóa bằng NaOH về pH 8,6 rồi trích

ly bằng hệ dung môi Chloroform – Methanol Dung môi trích ly loại nước được làm khô bằng natri sulfate khan, lọc, cô đặc, cuối cùng bổ sung ether vào để kết tủa thu adriamycin thô Phần dịch trong thu được sau khi lọc dịch lên men cũng được xử lý qua các công đoạn tương tự thu bột adriamycin thô Bột thô được hòa tan lại trong nước để tách qua cột cellulose, rửa cột bằng đệm phosphate pH 4,5

và n-butanol Dịch thu gom các phân đoạn sản phẩm được cô đặc chân không rồi trích ly sang chloroform ( tỷ lệ dung môi 4:1) Bước tiếp theo là phân tly thu pha dung môi, làm khô bằng Natri sulphat khan, cô đặc chân không rồi bổ sung dung dịch HCl trong methanol và làm lạnh để kết tinh thu kết tủa Cuối cùng, hòa tan

9

và kết tinh lại kết tủa trong ethanol để thu sản phẩm Adriamycin hydrochlorid tinh sạch.[2, 8]

1.5 Tổng hợp cirramycin B từ Streptomyces cyaneus

Atta và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu lên men sinh tổng hợp và tinh chế

cirramycin B từ S Cyaneus

Sau khi lên men, dịch lọc lên men được chiết xuất bằng Ethylacetat tỷ lệ 1:1 Loại dung môi bằng cất chân không dưới áp suất giảm thu được cắn, cắn được hòa tan trong lượng tối thiểu DMSO, sau đó được lọc Các thành phần kháng sinh được tách bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi chạy sắc ký là Chloroform: Methanol ( 24:1) Có ít nhất 3 thành phần trong hỗn hợp kháng sinh, trong đó thành phần có Rf = 0,4 là thành phần chính

Tinh chế kháng sinh chính bằng sắc ký cột silicagel với dung môi chạy cột

là Chloroform: methanol (9:1)

Kháng sinh chính thu được có nhiệt độ nóng chảy là 2280

C, hòa tan không giới hạn trong CHCl3, ethylacetat, n butanol, aceton, ethanol, methanol, iso-propanol, không tan trong dầu mỏ, hexan, benzene Đo phổ UV, bước sóng hấp thu cực đại là ở 240nm, phổ IR có 11 đỉnh hấp thụ Đo phổ khối xác định khối lượng phân tử là 679,4 đvC, công thức phân tử là C36H59NO12

Tiến hành phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ đã xác định được kháng sinh chính là cirramycin một kháng sinh thế hệ II nhóm macrolide, có khả năng ức chế cả vi khuẩn Gr + và Gr-[20]

1.6 Kháng sinh chống nấm non-polyen từ Streptomyces albidoflavus

Kháng sinh chống nấm chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ trong các nhóm thuốc hiện nay , tuy nhiên lại đóng vai trò rất quan trọng trong việc kiểm soát các bệnh

về nấm

10

S K Augustine và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp một kháng

sinh chống nấm non – polyen từ Streptomyces albidoflavus PU23

Lượng kháng sinh thu được từ Streptomyces albidoflavus PU23 cao nhất

là vào ngày thứ 8 của quá trình nuôi cấy Dịch lên men được chiết bằng n-hexan, sau đó bốc hơi thu hổi dung môi thu được kháng sinh thô Các thành phần trong kháng sinh thô này được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là ethanol: nước: chloroform (2:2:1) Dùng sắc ký cột với hệ dung môi là ethanol: nước ( 50:50) để tinh chế thu kháng sinh tinh khiết chính

Dựa vào phân tích phổ FTIR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân dự đoán công thức phân tử của kháng sinh chính là C16H32O19, có một nhóm hydroxymethyl, một nối đôi, còn lại là các liên kết –CHOH- Như vậy kháng sinh chính có công thức cấu tạo kiểu chuỗi polyhydroxy polyether mạch thẳng, có một liên kết đôi,

do đó thuộc nhóm chống nấm non-polyen [18]

Về hoạt tính sinh học của kháng sinh chính đổi với các chủng nấm được

thể hiện ở bảng dưới đây:

Bảng 1.1 : Giá trị MIC và MFC của kháng sinh từ S.albidoflavus

1.7 Tổng hợp kháng sinh antimycin A9 từ Streptomyces Sp K01-0031

Antimycin A9 là kháng sinh chính, nó tan được trong MeOH, aceton, acetonitril, ethyl acetat và chloroform, không tan trong nước và n-hexan Công thức của antimycin A9 được xác định là C29H34N2O9 Phổ IR của antimycin A9tương tự như phổ của một số antimycin đã biết Phân tích phổ 1

H, 13C NMR thấy công thức cấu tạo của (1) có một vòng dilactone, một nhóm bán 3-formamidosalicyl, một chuỗi n-butyl Những đặc điểm này giống với công thức cấu tạo của các antimycin khác Tuy nhiên, (1) là chất duy nhất có nhóm phenylacetyl gắn với C8 [25]

Về khả năng kháng khuẩn, nghiên cứu đánh giá trên hai chủng vi khuẩn

Caenorhabditis elegans, và Artemia salina Kết quả được thể hiện trên bảng sau:

Bảng 1.2: Giá trị MIC của các antimycin trên Caenorhabditis elegans, và

Atta và cộng sự đã tiến hành phân lập một chủng xạ khuẩn Streptomyces

sp AZ-NIOFD1 từ nước sông Nin-Ai Cập, sau đó tiến hành lên men, chiết xuất

và tinh chế để thu được một hợp chất có hoạt tính kháng sinh

Tiến hành giải trình tự gen 16s rADN ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gen

PCR nhận thấy Streptomyces sp AZ-NIOFD1 tương tự Streptomyces

violaceusniger , AZ-NIOFD1

Dịch lên men được chiết bằng n-butanol ở pH 7, cất chân không loại dung môi Sử dụng sắc ký lớp mỏng để tách các thành phần trong hỗn hợp kháng sinh thô, dung môi là chloroform : methanol (24:1), chỉ chất có Rf = 0.75 là có hoạt tính kháng sinh Tiến hành tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi chạy cột là chloroform : methanol (8:2), phân đoạn từ 23 đến 30 là có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất

Kháng sinh chính tinh khiết được xác định các thông số hóa lý và cấu trúc Kháng sinh chính tan được trong chloroform, n-buthanol, acetone,CCl4, methanol, ethanol, DMSO, không tan trong dầu hỏa, hexan, và benzen Nhiệt độ nóng chảy là 2050C Công thức phân tử là C13H21N3O6S2, phân tử lượng là 361.3 đvC, phổ IR có 23 đỉnh hấp thụ Phổ UV hấp thụ cực đại ở 270 và 302 nm Phân tích phổ cộng hưởng từ kết hợp với các thông số trên có thể kết luận kháng sinh

chính sinh tổng hợp từ Streptomyces Sp AZ-NIOFD1 là sparsomycin

13

Nghiên cứu hoạt tính sinh học của kháng sinh này thấy nó có khả năng ức chế Gram dương ( MIC dao động từ 11,7 đến 31,25 µg/ml), Gram âm ( MIC dao động từ 11,7 đến 15,6 µg/ml) [19]

14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 173.113 do Bộ môn Vi sinh – Sinh

học trường Đại học Dược Hà Nội phân lập từ mẫu đất tại Tây Nguyên

 Chủng vi sinh vật kiểm định: do Bộ môn Vi sinh – Sinh học cung cấp, được

trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định

Vi khuẩn Gram(+) Vi khuẩn Gram(-)

 Môi trường

 Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: Theo nghiên cứu trước [7], chúng tôi lựa chọn MT1 làm môi trường nuôi cấy xạ khuẩn với thành phần trong 100 ml môi trường như sau: Tinh bột 2g, KNO30,1 g, K2HPO40,05g, MgSO4.7H2O 0,5

15

Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần NaCl Cao thịt Pepton Thạch pH

- Dung môi chạy sắc ký: Các dung môi trong bảng 5 ở trên

- Bình chạy sắc ký, buret, Silicagel 60 F254 hạt có đường kính 0,04-0,063

mm

- Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL3030

- Cân kỹ thuật Sartorius TE 210

- Cân phân tích Sartorius BP 121 S

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt

- Máy cất quay Buchi Waterbath B480

- Thước kẹp Palmer độ chính xác 0,02mm

- Hộp Petri đường kính 9cm

- Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có mỏ các loại, nút thủy tinh, bông gạc, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,…

2.2 Phương pháp thực nghiệm

2.2.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn

- Cấy zigzac xạ khuẩn trên ống thạch nghiêng có chứa MT nuôi cấy thích hợp, ủ cho phát triển ở 28-29°C

- Sau 6-10 ngày, xạ khuẩn đã phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản ở 2-3°C, định kỳ 3-6 tháng cấy chuyền

17

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

- Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV

kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

- Tiến hành:

+ Tạo hỗn dịch VSV: Lấy một vòng que cấy VSV kiểm định cấy vào 2.5

ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) để tạo thành hỗn dịch VSV có nồng độ 106

+ Đưa mẫu thử vào môi trường kiểm định theo 1 trong 3 cách sau:

 Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (Φ=6,0mm) đã được tẩm 3 lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở nhiệt độ dưới

500C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định

 Phương pháp khối thạch: Đặt khối thạch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt MT đã cấy VSV kiểm định

 Phương pháp giếng thạch: Đục các giếng thạch (Φ=6,0mm) trên

MT đã cấy VSV kiểm định Nhỏ 0,05ml dịch thử vào mỗi giếng

+ Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37ºC trong 18-24h (đối với vi khuẩn) Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng 1 loại VSV kiểm định

+ Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Palmer

có độ chính xác 0,02mm Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:

D (mm): Đường kính vòng vô khuẩn thứ i

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: Số thực nghiệm tiến hành song song (Thông thường n=3)

2.2.3 Sàng lọc ngẫu nhiên

- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces

173.113, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân

tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1

(định ước) Sau đó, pha loãng tương tự đến nồng độ 10-6

- Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển đặc thù, mọc riêng rẽ sau 6 ngày rồi lấy ra cấy thử HTKS Các khuẩn lạc này, sau khi nuôi cấy 6 ngày được thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch

2.2.4 Đột biến bằng ánh sáng UV

- Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces

173.113, cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân

tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1

(định ước) Sau đó dung

19

1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6

làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa Petri vô trùng

- Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ

10-1 đựng trong đĩa Petri được chiếu ánh sáng UV (λ=254nm) với khoảng cách

và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian 5 phút), sau đó lấy ra, để chỗ tối 2h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

bằng nước vô trùng

- Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng 10-6

và 0,1ml hỗn dịch đã đột biến ở các nồng độ 10-4 và 10-5 vào các đĩa Petri có chứa MT1, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào

tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song Các đĩa Petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28°C trong 6 ngày đến khi xuất hiện khuẩn lạc Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:

% độ sống sót = m

o

N

N x 10-6+k x 100%

Trong đó: N m: Số khuẩn lạc sau đột biến ở nồng độ 10-k

N o: Số khuẩn lạc trong mẫu chứng ở nồng độ 10-6

- Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên Làm song song mẫu chứng Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:

% biến đổi hoạt tính = i 100%

20

- Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp

theo

2.2.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh

- Nguyên tắc: Sau khi có kết quả xác định được các môi trường nuôi cấy

bề mặt tốt nhất cho việc sản xuất kháng sinh, sử dụng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các môi trường lỏng tương ứng

- Tiến hành

+ Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 173.113 sau khi nuôi cấy

trên thạch nghiêng (MT1) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT1dt bằng 10ml nước vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h

+ Lên men: Sau 48h nhân giống, tiến hành lên men trên một số MT khác nhau để chọn MT lên men tốt nhất Giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa các MT dinh dưỡng với tỷ lệ Vgiống:Vmôi trường = 1:10 Các bình lên men được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h

Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT1dt được lên men trên môi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất

2.2.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ

- Mục đích: Xác định dung môi và pH chiết tối ưu cho dịch lọc

- Tiến hành: Dùng phương pháp chiết 1 lần

+ Dịch lọc được chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 1M

và HCl 1M

21

+ Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với nhiều dung môi khác nhau: Dịch lọc và dung môi cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi:Vdịch lọc = 1:5 Sau đó lắc kỹ trong

1 phút Để yên 1h cho phân lớp Tách riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc

+ Sau mỗi lần chiết, lấy lớp dung môi và lớp dịch lọc thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khoanh giấy

2.2.7 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng

- Mục đích: Xác định các thành phần kháng sinh trong dịch chiết, dịch lọc

hoặc xác định kháng sinh đã tinh khiết hay chưa

- Tiến hành:

+ Cắt bản mỏng có kích thước thích hợp, hoạt hóa ở 110°C/30 phút

+ Pha hỗn hợp dung môi theo đúng tỷ lệ, cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để yên bình khoảng 1h để bão hòa dung môi

+ Dùng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc ký lên bản mỏng Chấm nhiều lần, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 50°C

+ Đặt bản mỏng vào bình sắc ký Cho dung môi chạy lên khoảng ¾ chiều dài bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đường dung môi chạy

+ Xác định vết theo các phương pháp sau:

22

 Phương pháp hiện màu hóa học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 70°C trong 10’ để phát hiện vết Dùng thuốc thử ninhydrin 1% trong cồn để phát hiện các kháng sinh có chứa nhóm amin

+ Tính hệ số Rf (Retardation factor)

f

a R b



Trong đó: a: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết họat chất

b: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi

2.2.8 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay chân không

Pha dung môi hữu cơ thu được sau khi chiết được cất quay bằng máy cất chân không ở áp suất -0,09 atm Cắn thu được được hòa tan bằng một lượng nhỏ methanol hoặc aceton, đổ vào bình nón sạch, bốc hơi ở 50°C đến khô Cạo, thu lấy bột kháng sinh thô

2.2.9 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột

- Pha hệ dung môi chạy theo đúng tỷ lệ, để 30 phút cho bão hòa

- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột có đường kính 1cm, dài 50cm được rửa sạch, tráng cồn, sấy khô Cân khoảng 8g hạt Silicagel nhồi cột, hoạt hóa ở 110°C trong

30 phút, đem hòa thành hỗn dịch với dung môi chạy và đưa lên cột

- Đưa mẫu thử lên cột: Bột kháng sinh thô hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol rồi trộn với khoảng 2g Silicagel đã hoạt hóa Sấy ở 50°C cho bay hết methanol rồi cho lên cột, ổn định cột trong 30 phút

- Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch, khoảng 30 phân đoạn, mỗi phân đoạn 5ml

- Phát hiện và xác định các phân đoạn chứa kháng sinh cần tách: Thử HTKS của các phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy lọc Các phân đoạn có

23

HTKS được tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất Các phân đoạn chính là các phân đoạn từ khi xuất hiện vết đến khi không còn vết có Rftương đương và vẫn có hoạt tính kháng sinh mạnh

- Các phân đoạn chính sau khi chạy cột được thu vào bình cầu 250 ml, cất quay chân không loại dung môi thu được cắn Cạo thu bột tinh thể kháng sinh vào ống nghiệm sạch Sau đó, bột tinh thể kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi, lọc, sấy khô ở 50°C để thu kháng sinh tinh khiết

2.2.10 Xác định tính chất, cấu trúc hóa học thành kháng sinh chính tinh khiết thu đƣợc

- Đo nhiệt độ nóng chảy

24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

3.1 Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn

3.1.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên

Kế thừa kết quả của nghiên cứu trước [7] chúng tôi lựa chọn vi khuẩn

Staphylococcus aureus và Proteus mirabilis là 2 chủng VSV kiểm định đại diện

để thực hiện các nghiên cứu về sau Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên trên chủng

Streptomyces 173.113 ĐB3.04 là chủng tốt nhất từ nghiên cứu trước đang được

lưu giữ tại bộ môn Vi sinh – sinh học, trường ĐH Dược Hà Nội

* Mục đích:

Chọn dạng chủng có HTKS cao trong quần thể

* Tiến hành và kết quả:

Chủng Streptomyces 173.113.ĐB3.04 được SLNN, giữ lại 32 dạng chủng,

thử HTKS bằng phương pháp khối thạch Kết quả được thể hiện trên bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên

Dạng

chủng

Hoạt tính kháng sinh

Dạng chủng

SL.02 19,23 0,51 21,45 0,64 SL.18 17,42 0,41 19,50 0,37 SL.03 16,02 0,97 20,46 1,41 SL.19 16,87 1,98 20,65 1,15 SL.04 16,64 1,17 20,73 0,88 SL.20 16,07 1,16 19,31 0,90 SL.05 18,02 0,53 19,97 1,10 SL.21 16,20 0,59 18,99 0,80 SL.06 17,04 0,82 20,27 1,63 SL.22 14,45 0,97 19,47 0,37 SL.07 18,63 0,44 21,29 0,77 SL.23 16,61 1,02 19,55 1,10 SL.08 18,76 0,52 21,01 0,40 SL.24 15,27 0,94 19,23 0,50

SL.09 19,35 0,55 21,37 0,23 SL.26 17,95 0,36 19,05 0,37 SL.11 16,11 2,24 20,50 0,40 SL.27 18,29 0,64 19,69 1,46 SL.12 18,66 0,63 21,18 0,45 SL.28 18,95 0,99 20,93 0,93

SL.13 19,39 0,55 21,51 0,26 SL.29 18,65 0,47 20,89 0,25

25

SL.14 14,89 1,60 19,71 0,39 SL.30 17,27 0,49 19,49 0,73 SL.15 17,01 0,84 19,63 0,73 SL.31 18,47 0,54 20,58 0,35 SL.16 16,33 0,71 19,13 0,20 SL.32 18,29 1,51 20,45 0,49

Chọn dạng chủng có HTKS cao nhất sau SLNN là SL.13, mang đột biến

bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách chiếu 60 cm, thời gian 5 phút

Tỷ lệ sống sót là 0,73%, cách tính được thể hiện trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ nhất

Đĩa x i (Số khuẩn lạc trung

bình)

s

Sau đột biến – nồng độ 10-4

22,67 5,13 Sau đột biến – nồng độ 10-5

Chứng – nồng độ 10-6

116,33 5,51

Tỷ lệ sống sót 0,73%

Chọn và nuôi cấy 32 biến chủng, thử HTKS bằng phương pháp khối

thạch Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3

MC

D

(mm) s

% hoạt tính so với

MC

MC 21,02 0,09 100,00 23,08 2,31 100,00

ĐB1.01 20,87 1,11 99,30 22,79 0,96 103,20 ĐB1.02 22,45 0,77 106,82 23,28 0,87 105,43 ĐB1.03 21,21 0,66 100,92 23,21 1,11 105,13

ĐB1.04 23,09 0,05 109,86 24,01 0,93 108,76

ĐB1.05 22,27 0,93 105,96 22,86 0,71 103,53 ĐB1.06 22,25 1,17 105,87 19,52 2,17 88,41 ĐB1.07 19,46 0,75 92,58 22,36 2,13 101,27 ĐB1.08 20,51 1,89 97,56 22,13 0,55 100,24 ĐB1.09 22,10 1,21 105,14 23,12 0,87 104,71 ĐB1.10 19,71 1,67 93,78 20,61 0,68 93,33 ĐB1.11 21,45 0,88 102,06 23,01 0,37 104,23 ĐB1.12 22,39 2,92 106,50 23,75 0,99 107,55

ĐB1.13 23,81 0,37 113,26 24,15 0,26 109,39

ĐB1.14 21,41 0,28 101,84 23,11 0,80 104,68 ĐB1.15 21,87 0,88 104,03 23,75 0,10 107,58 ĐB1.16 22,59 0,12 107,48 21,98 0,64 99,55 ĐB1.17 20,25 0,41 96,35 21,32 0,57 96,56 ĐB1.18 21,87 0,29 104,06 22,88 0,53 103,62 ĐB1.19 22,46 0,61 106,85 20,89 0,85 94,63 ĐB1.20 22,56 1,00 107,33 23,89 0,18 108,18 ĐB1.21 20,45 3,86 97,30 23,29 0,44 105,50

27

ĐB1.22 19,60 1,28 93,24 22,31 1,50 101,03 ĐB1.23 21,16 1,53 100,67 22,61 1,06 102,42 ĐB1.24 18,44 0,96 87,73 20,71 0,73 93,78 ĐB1.25 18,69 0,55 88,90 21,39 0,59 96,86 ĐB1.26 18,93 0,53 90,07 21,21 0,40 96,04 ĐB1.27 20,11 0,85 95,65 20,86 1,07 94,47 ĐB1.28 21,17 0,69 100,73 20,57 1,44 93,18 ĐB1.29 22,10 0,78 105,14 22,87 0,81 103,56

ĐB1.30 23,57 0,29 112,15 24,28 0,18 109,98

ĐB1.31 19,29 0,87 91,79 22,29 0,50 100,94 ĐB1.32 21,89 0,97 104,12 23,91 1,00 108,30

* Nhận xét:

Sau khi đột biến bằng ánh sáng UV với tỷ lệ sống sót là 0,73% thì hoạt

tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn tăng lên đáng kể trên cả P mirabilis và S

aureus, nhất là các biến chủng ĐB1.04, ĐB1.13 và ĐB1.30 Do đó, tiến hành

nuôi cấy và giữ giống 3 biến chủng này Lựa chọn biến chủng ĐB1.13 để tiếp

Chọn dạng chủng có HTKS cao nhất sau đột biến lần thứ nhất là ĐB1.13,

mang đột biến bằng ánh sáng UV (λ=254nm), khoảng cách chiếu 60 cm, thời gian 4 phút

Tỷ lệ sống sót là 0,58%, cách tính được thể hiện trong bảng 3.4

28

Chọn và nuôi cấy 32 biến chủng, thử HTKS bằng phương pháp khối thạch Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ hai

Đĩa x i (Số khuẩn lạc trung bình) s Sau đột biến – nồng độ 10-4

MC

D

(mm) s

% hoạt tính so với

MC

MC 22,62 0,56 100,00 23,38 0,58 100,00 ĐB2.01 23,01 0,74 101,74 23,85 0,63 102,02

ĐB2.02 24,94 0,77 110,26 26,03 0,07 111,32

ĐB2.03 23,05 1,14 101,92 24,21 0,96 103,54 ĐB2.04 23,09 0,05 102,09 24,01 0,93 102,71 ĐB2.05 23,27 0,60 102,89 23,95 0,45 102,45 ĐB2.06 22,25 1,17 98,38 23,08 1,92 98,72 ĐB2.07 21,13 2,65 93,43 22,38 2,57 95,72 ĐB2.08 22,90 1,54 101,24 23,42 0,75 100,17 ĐB2.09 23,33 0,60 103,15 24,11 0,79 103,14

ĐB2.10 24,56 0,43 108,58 25,01 0,02 106,96

ĐB2.11 23,05 1,50 101,92 23,59 0,52 100,88 ĐB2.12 22,39 0,97 98,97 24,65 0,34 105,45 ĐB2.13 23,81 0,37 105,25 24,15 0,26 103,31 ĐB2.14 22,39 1,11 98,97 25,16 0,82 107,61

29

ĐB2.15 23,01 0,87 101,71 23,75 0,10 101,60 ĐB2.16 22,59 0,12 99,88 24,48 1,56 104,70 ĐB2.17 24,35 0,91 107,65 21,47 0,69 91,84 ĐB2.18 22,21 0,49 98,17 22,88 0,53 97,86 ĐB2.19 22,95 0,95 101,44 20,93 0,90 89,51 ĐB2.20 23,39 0,87 103,42 24,19 0,59 103,45 ĐB2.21 22,50 0,97 99,47 23,58 0,51 100,86 ĐB2.22 23,34 1,80 103,18 22,59 1,86 96,64 ĐB2.23 22,99 1,13 101,65 22,26 1,03 95,21 ĐB2.24 21,84 2,16 96,55 20,71 0,73 88,57

ĐB2.25 24,60 0,63 108,75 25,35 0,37 108,41

ĐB2.26 20,67 1,92 91,36 21,21 0,40 90,70 ĐB2.27 21,91 1,86 96,88 20,86 1,07 89,22 ĐB2.28 24,37 0,46 107,75 20,57 1,44 88,00 ĐB2.29 22,10 0,78 97,70 22,87 0,81 97,80 ĐB2.30 23,77 0,45 105,10 24,28 0,18 103,86 ĐB2.31 20,97 2,98 92,72 22,29 0,50 95,32 ĐB2.32 22,79 1,28 100,74 23,91 1,00 102,28

* Nhận xét:

Sau khi đột biến bằng ánh sáng UV với tỷ lệ sống sót là 0,58% thì hoạt

tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn tăng lên đáng kể trên cả P mirabilis và S

aureus, nhất là các biến chủng ĐB2.02, ĐB2.10 và ĐB2.25 Do đó, tiến hành

nuôi cấy và giữ giống 3 biến chủng này

3.2 Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất

3.2.1 Kết quả chọn chủng lên men

Kế thừa kết quả của nghiên cứu trước [7], chúng tôi đã biết MT1dt là môi

trường lên men chìm tốt hơn các môi trường còn lại đối với chủng Streptomyces

* Tiến hành và kết quả:

Thực hiện lên men chìm riêng rẽ các biến chủng này trong MT1dt Dịch lên men được lọc qua giấy lọc để loại sinh khối rồi thử HTKS dịch lọc bằng phương pháp giếng thạch Kết quả được trình bày ở bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả chọn chủng lên men

Dạng chủng, biến chủng

Hoạt tính kháng sinh

D(mm) s D(mm) s SL.02 19,06 0,70 20,83 0,93 SL.09 19,23 0,51 21,63 0,42 SL.13 20,07 0,08 21,31 0,56 ĐB1.04 23,06 0,65 24,49 0,58 ĐB1.13 23,85 0,79 24,81 0,38 ĐB1.30 23,52 0,46 23,53 0,53

ĐB2.02 25,06 0,20 26,36 0,48

ĐB2.10 24,71 0,38 24,37 0,61 ĐB2.25 24,50 0,62 25,61 0,52

* Nhận xét:

Trong 9 dạng chủng (biến chủng) đem lên men chìm thì dịch lọc của dịch

lên men chủng ĐB2.02 có HTKS cao nhất Do đó, chọn chủng ĐB2.02 để lên

men tạo kháng sinh

31

3.2.2 Khảo sát chọn môi trường lên men chìm

Từ kết quả của nghiên cứu trước [7], thấy MT1dt có khả năng lên men chìm tốt hơn so với các môi trường lên men khác Nay, chúng tôi tiến hành khảo sát để nâng cao khả năng lên men của MT1dt bằng cách cho thêm cao nấm men với các tỷ lệ 0,1%, 0,5%, 1%, 2% được ký hiệu lần lượt là MT1dt.1; MT1dt.2; MT1dt.3; MT1dt.4 từ đó tìm ra tỷ lệ tốt nhất để làm môi trường lên men chìm cho các nghiên cứu về sau

Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả chọn môi trường lên men

D

(mm) s

% hoạt tính so với MTdt1

MT1dt 25,50 0,45 100,00 26,65 0,43 100,00

MT1dt.1 25,53 0,57 100,13 26,84 0,85 100,71

MT1dt.2 27,33 0,42 107,16 28,43 0,64 106,69

MT1dt.3 26,95 0,17 105,67 27,77 0,89 104,22 MT1dt.4 25,31 1,71 99,27 26,32 0,52 98,76

Nhận xét: Khi thêm 0,1% cao nấm men vào MT1dt hoạt tính kháng sinh

không thay đổi, khi thêm 0.5% cao nấm men vào thì hoạt tính kháng sinh tăng rõ rệt Với tỷ lệ cao nấm men 1% hoạt tính kháng sinh cũng tăng nhưng không bằng môi trường 0,5%, còn môi trường 2% cao nấm men thì lại làm giảm hoạt tính

kháng sinh của chủng lên men Do đó, MT1dt.2 với tỷ lệ cao nấm men được

thêm vào là 0,5% được lựa chọn để làm môi trường lên men cho các mẻ lên men chìm sau

32

3.2.3 Kết quả lên men, chiết và cất quay thu kháng sinh thô

Tiến hành lên men chìm biến chủng ĐB2.02 trên MTdt1.2, lọc qua giấy lọc để loại sinh khối, thu được 7,5 lít dịch lọc

Chiết 7,5 lít dịch lọc này bằng 1,5 lít Ethylacetat thì thu được 1,1 lít dịch

chiết kháng sinh trong Ethylacetat

Tiến hành cất quay 1,3 lít dịch chiết này thu được 0,9134 g kháng sinh thô

có màu đỏ nâu

Hàm lượng kháng sinh thô trong dịch lên men chìm = 0,1218 g/l

Lượng kháng sinh thô này được giữ lại để nghiên cứu và tiến hành tinh chế

3.2.4 Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ nhất

* Mục đích:

Loại tạp, bước đầu tách các thành phần kháng sinh khác nhau từ bột kháng sinh thô

* Tiến hành và kết quả:

Theo kết quả của nghiên cứu trước [7], chọn hệ dung môi chạy cột sắc ký

là butylacetat: aceton: triethylamin (1:2:1) nhằm để loại tạp và bước đầu tách các thành phần kháng sinh từ bột kháng sinh thô

Bột kháng sinh thô chạy qua cột sắc ký silicagel, hệ dung môi khai triển

là hệ dung môi : Butylacetat: Aceton: Triethylamin (1:2:1)

Thu mỗi phân đoạn 5ml vào một ống nghiệm sạch Nhận thấy khi thu được 15 phân đoạn thì dịch chảy ra từ cột chỉ còn màu vàng rất nhạt nên kết thúc chạy cột, lúc này trên cột silicagel còn lưu lại một hợp chất màu nâu

Thử hoạt tính kháng sinh từng phân đoạn bằng phương pháp khoanh giấy

lọc với chủng vi sinh vật kiểm định là P mirabilis