Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 166 28

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ HẰNG NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 166.28 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ HẰNG

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ

STREPTOMYCES 166.28

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Cao Văn Thu,

người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tiếp đó, tôi c ng xin chân thành cảm ơn c c thầy cô gi o, c c c n , k thuật viên công t c t i B môn Vi sinh - Sinh học, khoa Hóa trường Đ i học Khoa học tự nhiên Hà N i và Viện hóa học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã gi p đ tôi trong thời gian làm luận văn

Nhân dịp này, tôi c ng xin g i lời cảm ơn đến Ban gi m hiệu c ng toàn th

c c thầy cô gi o trường Đ i học Dư c Hà N i đã d y d và t o mọi điều kiện thuận

l i cho tôi trong thời gian tôi học tập t i trường

Cuối c ng, tôi g i lời cảm ơn tới gia đình và n đã đ ng viên, gi p đ tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Với điều kiện h n h p về thời gian, phương tiện nghiên cứu và trình đ của

ản thân, luận văn chắc chắn còn nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận đư c sự góp của c c thầy cô đ luận văn đư c hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 5 tháng 8 năm 2014

Học viên

Đặng Thị Hằng

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đ i cương về kh ng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Cơ chế t c dụng 2

1.1.3 Ứng dụng 2

1.2 Đ i cương về Streptomyces 3

1.2.1 Đặc đi m cấu t o 3

1.2.2 Đặc đi m hình th i 3

1.2.3 Đặc đi m sinh l 4

1.2.4 Ứng dụng của Streptomyces trong sinh tổng h p kh ng sinh 4

1.3 Cải t o giống x khuẩn 5

1.3.1 Mục đích 5

1.3.2 C c phương ph p cải t o giống 5

1.4 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 6

1.4.1 Mục đích 6

1.4.2 Phương ph p 6

1.5 X c định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh 6

1.5.1 Phổ t ngo i – khả kiến 6

1.5.2 Phổ hồng ngo i (IR) 6

1.5.3 Phổ khối (MS) 7

1.5.4 Phổ c ng hưởng từ h t nhân (NMR) 8

1.6 Những kết quả đã có về Streptomyces 166.28 9

1.6.1 Môi trường lên men ề mặt thích h p 9

1.6.2 Môi trường lên men chìm 9

1.7 Những vấn đề cần nghiên cứu tiếp về Streptomyces 166.28 9

1.7.1 Cải t o giống 9

1.7.2 Chiết t ch kh ng sinh 9

1.7.3 Cấu tr c kh ng sinh 9

1.8 M t số nghiên cứu mới trong sinh tổng h p kh ng sinh từ Streptomyces 10

1.8.1 Quy tắc sinh tổng h p valanimycin từ Streptomyces viridifaciens: đặc tính của VlmI 10

1.8.2 Nghiên cứu đặc tính của kh ng sinh số 70 đư c sản xuất ởi Streptomyces sp IMV-70 11

1.8.3 C c kh ng sinh mới thu c nhóm capoamycin và c c acid polyene đư c sản xuất từ Streptomyces fradiae PTZ0025 12

1.8.4 Các pyramidacin A – D, 3-Hydroxyquinoline-2-carboxamide và các enzamide gây đ c tế ào đư c sản xuất từ Streptomyces sp DGC1 13

1.8.5 Nghiên cứu sản xuất kh ng sinh vancomycin từ x khuẩn Streptomyces orientalis 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu và thiết ị 18

2.1.1 Nguyên vật liệu 18

2.1.2 M y móc thiết ị 20

2.2 Phương ph p thực nghiệm 20

2.2.1 Phương ph p nuôi cấy và giữ giống x khuẩn 20

2.2.2 Đ nh gi ho t tính kh ng sinh ằng phương ph p khuếch t n 21

2.2.3 Phương ph p sàng lọc ngẫu nhiên (SLNN) 22

2.2.4 Phương ph p đ t iến (ĐB) ằng nh s ng UV 22

2.2.5 Phương ph p lên men chìm tổng h p kh ng sinh 23

2.2.6 Phương ph p chiết kh ng sinh từ dịch lên men ằng dung môi hữu cơ 24

2.2.7 Phương ph p t ch c c thành phần trong kh ng sinh ằng sắc k lớp mỏng 24

2.2.8 Phương ph p thu kh ng sinh thô ằng phương ph p cất quay 25

2.2.9 Phương ph p tinh chế kh ng sinh thô ằng sắc k c t 26

2.2.10 Phương ph p x c định c c phổ nghiên cứu cấu tr c kh ng sinh chính 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Kết quả chọn lọc và cải t o giống 28

3.1.1 Sàng lọc ngẫu nhiên 28

3.1.2 Đ t iến ằng nh s ng UV lần 1 29

3.1.3 Đ t iến ằng nh s ng UV lần 2 31

3.2 Kết quả lên men chìm 33

3.3 Chiết xuất kh ng sinh 34

3.4 Tinh chế kh ng sinh 37

3.4.1 Khảo s t hệ dung môi tinh chế kh ng sinh lần 1 37

3.4.2 Tinh chế kh ng sinh lần 1 38

3.4.3 Khảo s t hệ dung môi tinh chế kh ng sinh lần 2 40

3.4.4 Tinh chế kh ng sinh lần 2 41

3.4.5 Tinh chế kh ng sinh lần 3 44

3.5 Kết quả đo đi m nóng chảy và phổ 46

3.5.1 Kết quả đo nhiệt đ nóng chảy 46

3.5.2 Kết quả đo phổ t ngo i 46

3.5.3 Kết quả đo phổ hồng ngo i (IR) 46

3.5.4 Kết quả đo phổ khối 47

3.5.5 Kết quả đo phổ c ng hưởng từ h t nhân 47

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 51

4.1 Nâng cao HTKS ằng chọn lọc, cải t o giống 51

4.2 Nâng cao hiệu suất chiết t ch kh ng sinh 52

4.3 Nghiên cứu cấu tr c chất kh ng sinh chính 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 56

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid DeoxyrubiNucleic

B cereus Bacillus cereus

CW Cell wall

ESI MS Electrospray ionization mass

S flexneri Shighella flexneri

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

1 Bảng 1.1: M t số kh ng sinh do Streptomyces tổng h p 5

2 Bảng 1.2: C c đặc tính hóa l của kh ng sinh 70 - A 8

3 Bảng 1.3: C c đặc tính hóa l của c c pyramidamycin A – C (2

12 Bảng 3.4: Kết quả chọn d ng chủng ( iến chủng) lên men chìm 26

13 Bảng 3.5: Kết quả th HTKS của dịch lọc của dịch lên men

16 Bảng 3.8: Kết quả lên men chìm iến chủng 11.11 36

17 Bảng 3.9: Thành phần ốn hệ dung môi đƣ c khảo s t 37

18 Bảng 3.10: Kết quả sắc k lớp mỏng chọn hệ dung môi (vi sinh

Do đó, yêu cầu cấp thiết đặt ra với ngành y tế là cần phải đẩy m nh nghiên cứu đ sản xuất c c kh ng sinh mới có hiệu quả điều trị cao, đ c tính thấp và ít ị kháng thuốc

Có a con đường cơ ản đ t o ra c c kh ng sinh mới: con đường sinh tổng

h p, con đường n tổng h p và con đường tổng h p ho học Trong đó, con đường sinh tổng h p kh ng sinh vẫn đư c s dụng chủ yếu Trong các kháng sinh có

nguồn gốc vi sinh vật thì có khoảng 75% thu c chi x khuẩn Streptomyces[13, 16]

Do đó, b môn Vi sinh – Sinh học trường Đ i học Dư c Hà N i đã tập trung vào

nghiên cứu chi x khuẩn này trong đó có chủng x khuẩn Streptomyces 166.28 Trước đây, môn đã thực hiện đề tài nghiên cứu về chủng x khuẩn Streptomyces

166.28 và thu đư c m t số kết quả như sau: phổ t c dụng r ng, nhưng hiệu suất sinh

tổng h p kh ng sinh còn thấp, hiệu suất tinh chế chưa cao, chưa x c định đư c cấu

tr c của chất kh ng sinh chính Do đó, ch ng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu nâng

cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 166.28” với ba mục tiêu

sau:

1 Nâng cao ho t tính kháng sinh ằng chọn lọc, cải t o giống

2 Nâng cao hiệu suất chiết t ch kháng sinh

3 Nghiên cứu cấu tr c hóa học của thành phần kh ng sinh chính

1.1.2 Cơ chế t c dụng

C c kh ng sinh t c dụng chủ yếu qua việc ức chế c c phản ứng tổng h p khác nhau của tế ào VSV gây ệnh ằng c ch gắn vào c c vị trí chính xác hay các phân t đích của tế ào VSV, làm iến đổi c c phản ứng đó M i nhóm kh ng sinh

t c dụng lên các đích kh c nhau [3, 5, 6, 7, 17] Có 6 ki u chủ yếu:

- T c dụng lên việc tổng h p thành tế ào

- T c dụng lên màng nguyên sinh chất

- T c dụng lên tổng h p AND

- T c dụng lên tổng h p protein

- T c dụng lên sự trao đổi hô hấp

- T c dụng lên sự trao đổi chất trung gian

1.1.3 Ứng dụng

Kh ng sinh ắt đầu đư c s dụng trong y học từ đầu những năm 40 của thế

kỷ 20 (penicilin) và sau đó là sự ra đời và ph t tri n của c c kh ng sinh kh c [8]

Ngoài y học, kh ng sinh còn đư c s dụng r ng rãi trong c c lĩnh vực kh c như:

- Trong chăn nuôi: + điều trị c c ệnh nhiễm tr ng của đ ng vật như viêm

phổi ở trâu ò (Griseoviridin), tụ huyết tr ng ở l n (ampiseptryl),…

+ ổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trưởng theo khuyến c o của FDA:aureomycin, amoxicillin,…[23, 25]

3

- Trong nông nghiệp: tiêu diệt c c nấm và vi khuẩn gây ệnh cho cây trồng

như ệnh khô vằn (validamycin), vàng lụi ở l a (kasugamycin),… từ đó làm tăng năng suất cây trồng [24]

- Trong ảo quản thực phẩm: kh ng sinh su tilin (do Bacillus subtilis t o ra), nisin (do Streptococcus lactis t o ra), iomicin (còn gọi là clortetracyclin hay CTC

do Actinomyces aureopaciens t o ra),… [12, 13]

1.2 Đ i cương về Streptomyces

1.2.1 Đặc đi m cấu t o

Cấu t o của Streptomyces chia làm 3 phần: thành tế ào, màng tế ào chất, tế

ào chất

- Thành tế ào: d ng kết cấu lưới đặc th vi khuẩn Gr (+), dày khoảng 10 – 20

nm, thành tế ào thu c nhóm CW I (có chứa L – DAP và glycin)

- Màng tế ào chất: dày khoảng 7,5 – 10 nm, không chứa cellulose và kitin, có chức năng điều hòa hấp thụ c c chất dinh dư ng vào tế ào và tham gia qu trình hình thành ào t

- Mezosom: nằm phía trong của tế ào chất, có hình phiến, hình ọng hay hình ống có chức năng làm tăng diện tích tiếp x c của mảng tế ào chất do đó tăng cường ho t tính enzym, tăng cường vận chuy n điện t [3, 5]

t trần (là cơ quan sinh sản chủ yếu của Streptomyces) Bề mặt ào t có c c d ng:

trơn nhẵn (sm), có gai (sp),… Hình d ng và kích thước ào t có vai trò quan trọng trong việc x c định tên x khuẩn [3, 5]

1.2.3 Đặc đi m sinh l

Streptomyces là sinh vật dị dư ng, có tính oxi hóa cao Ch ng phân giải c c

hydratcar on làm nguồn cung cấp vật chất và năng lư ng đ sinh trưởng và ph t tri n, đồng thời thủy phân c c h p chất như gelatin, casein, kh nitrat thành nitrit

Nhiệt đ tối thích của Streptomyces là 25 – 300C, pH tối thích thường là 6,8 – 7,5

[3, 5]

1.2.4 Ứng dụng của Streptomyces trong sinh tổng h p kh ng sinh

C c lo i x khuẩn phổ iến nhất thu c chi Streptomyces có khả năng t o ra

nhiều kh ng sinh có cấu tr c phức t p Trong tổng số c c kh ng sinh đã đư c tìm

thấy do x khuẩn tổng h p thì có tới 55% là từ Streptomyces [22, 27] Bảng 1.1 dưới đây giới thiệu m t số kh ng sinh do Streptomyces tổng h p [3]

Bảng 1.1: M t số kh ng sinh do Streptomyces tổng h p

Chất kháng sinh Chủng sinh tổng h p Phổ t c dụng

1.3.2.2 Đ t biến nhân t o

Có 3 nhóm t c nhân gây đ t biến nhân t o:

- Tác nhân hóa học: acid nitro, dimethylsulphat, nitrosoguanidin,…

- Tác nhân vật l : nh s ng UV, tia X, tia neutron hay electron Trong đó nh

s ng UV hay đư c s dụng nhất

- Tác nhân sinh học: tác nhân sinh học gen nhảy

Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lư ng và thời gian thích h p sẽ giết chết hầu hết các vi sinh vật Các cá th sống sót sẽ có sự biến đổi ở nhiễm sắc th , làm thay đổi các tính tr ng dẫn đến hoặc là mất (hay giảm) khả năng tổng h p kháng sinh (gọi là đ t biến âm tính), hoặc là tăng khả năng tổng h p kháng sinh (gọi là đ t biến dương tính)

Nhằm t o ra các chủng có khả năng sinh tổng h p kháng sinh cao, cần phải tiến hành cải t o giống bậc thang, kết h p c c phương ph p di truyền phân t (ví dụ:

k thuật t o và dung h p tế bào trần) C c phương ph p này đã và đang đư c ứng dụng r ng rãi [3, 5, 6, 14]

6

1.4 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

1.4.1 Mục đích

Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, kết thúc quá trình lên men kháng sinh

có th nằm trong sinh khối hay nằm trong dịch lọc t y theo đặc đi m của loài Do

đó, cần phải tách và tinh chế kháng sinh bằng c c phương ph p thích h p đ thu

đư c kháng sinh tinh khiết

1.5 X c định cấu trúc hóa học của chất kháng sinh

Trong nghiên cứu cấu tr c kh ng sinh, thường s dụng c c phương ph p đo phổ, quan trọng nhất là phổ hồng ngo i, phổ khối và phổ c ng hưởng từ h t nhân 1.5.1 Phổ t ngo i – khả kiến

Dựa trên sự hấp thụ năng lư ng các bức x ánh sáng vùng UV-VIS bởi các phân t của chất nghiên cứu làm thay đổi mức năng lư ng điện t (E0− E1, E2) Giữa cấu trúc hóa học và quang phổ hấp thụ có mối quan hệ chặt chẽ, chỉ có những phân t nào có điện t dễ bị kích thích mới hấp thụ năng lư ng nh s ng đ chuy n

từ tr ng th i cơ ản lên tr ng thái bị kích thích Đó là: nối đôi liên h p, nhân thơm,

dị tố N, S, O [1, 18, 26]

1.5.2 Phổ hồng ngo i (IR)

Quang phổ hồng ngo i là phương ph p đo quang phổ hấp thụ phân t Phân

t hấp thụ năng lư ng của bức x hồng ngo i bị thay đổi dao đ ng Do đó, phổ hồng ngo i còn gọi là phổ dao đ ng Năng lư ng bức x hồng ngo i không đủ lớn

c c ion có điện tích +1 (chiếm tỉ lệ lớn) và +2 Đây gọi là ion gốc hay ion phân t

Nếu các ion gốc tiếp tục va ch m với c c dòng điện t có năng lư ng lớn hơn thì ch ng sẽ bị phá v thành nhiều mảnh ion, các gốc hay các phân t trung hòa

kh c nhau Như vậy, đã diễn ra sự ion hóa và sự phân mảnh Các ion có khối lư ng

m và điện tích e Tỷ lệ m/e đư c gọi là số khối

Khi tách ion có số khối kh c nhau và x c định đư c xác suất có mặt, vẽ đồ thị bi u diễn mối liên quan xác suất có mặt (hay cường đ I) và số khối z, ta thu

đư c phổ khối lư ng Giá trị R (gọi là đ phân giải) đặc trưng cho chất lư ng của phổ khối kế Máy có R = 10.000 trở lên là m y có đ phân giải cao Máy hiện đ i có

R = 100.000 [1, 18, 26]

8

1.5.4 Phổ c ng hưởng từ h t nhân (NMR)

Đây là phương ph p quan trọng trong hóa học hữu cơ Khi đặt trong từ trường những nhân từ tính thì xảy ra sự hấp thụ chọn lọc sóng điện từ, phát sinh hiện tư ng c ng hưởng từ h t nhân Các phân t h p chất hữu cơ đư c đặt trong từ trường không đổi thì các mức năng lư ng đư c phân chia, chúng ở tr ng thái cân bằng đ ng Sự khác nhau ở các mức năng lư ng gần nhau phụ thu c vào tính chất của nhân và cường đ từ trường H Khi cung cấp m t năng lư ng từ ngoài vào thì

tr ng thái cân bằng đ ng bị phá v , các h t nhân nằm ở mức năng lư ng thấp sẽ hấp thụ năng lư ng chuy n lên mức năng lư ng cao hơn trong khoảng thời gian ngắn,

m t số h t nhân ở mức năng lư ng cao l i bức x năng lư ng xuống mức năng

lư ng thấp t o ra m t cân bằng đ ng mới Khoảng cách thời gian trên gọi là thời gian phục hồi spin – spin

Sự phát sinh các tín hiệu NMR xảy ra do sự phụ thu c cường đ tín hiệu theo

từ trường H hay tần số μ của từ trường iến thiên gọi là phổ c ng hưởng từ h t nhân Những h t nhân nguyên t có khối lư ng là số lẻ và những h t nhân có khối

lư ng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên t là số lẻ thì có moment từ và có tín hiệu NMR Phổ đư c đặc trưng ởi chiều cao tín hiệu và đ r ng tín hiệu C c nhà nghiên cứu nhận thấy rằng sự che chắn của c c đ m mây điện t quanh h t nhân và ảnh hưởng của c c h t nhân có từ tính kh c trong phân t có t c đ ng lên t c dụng của từ trường ngoài lên h t nhân Sự che chắn của đ m mây điện t gây nên sự dịch chuy n hóa học Ảnh hưởng của từ tính h t nhân gây nên sự t ch tín hiệu do tương tác spin – spin

Đ dịch chuy n hóa học  cho biết vị trí của tín hiệu c ng hưởng, đ dịch chuy n hóa học của phổ c ng hưởng h t nhân (1HNMR) từ 0 đến 12ppm

Tương t c spin – spin cho biết số lư ng H ở nguyên t C bên c nh và mối tương quan lập th của các nguyên t H với nhau Trong đó người ta quan tâm tới: đ b i của tín hiệu c ng hưởng, tỷ lệ cường đ của các v ch tín hiệu và hằng số tương t c spin-spin

1.6.1 Môi trường lên men ề mặt thích h p

Sau khi tiến hành thực nghiệm, đã chọn đư c MT2 là môi trường (MT) lên men ề mặt thích h p Với nghiên cứu sơ trước đó, môn c ng đã chọn đư c

S flexneri và B cereus là hai chủng VSV ki m định cho c c ước nghiên cứu tiếp

theo [11]

1.6.2 Môi trường lên men chìm

C c nghiên cứu sơ trước đó đã x c định đư c MT2dt là MT lên men chìm tốt nhất Tuy nhiên, ta cần x c định tiếp c c iện ph p cải thiện hiệu suất của qu trình lên men chìm nhằm đưa chủng vào sản xuất quy mô công nghiệp [11]

1.7 Những vấn đề cần nghiên cứu tiếp về Streptomyces 166.28

1.7.1 Cải t o giống

Đ t o ra chủng có khả năng siêu sinh tổng h p kh ng sinh, cần tiếp tục cải

t o giống ằng c c phương ph p kh c nhau như chọn lọc ngẫu nhiên, đ t iến ằng ánh s ng UV, đ t iến ằng hóa chất,…

1.7.2 Chiết t ch kh ng sinh

Đ tinh chế kh ng sinh, ta cần chọn đư c dung môi và điều kiện chiết xuất tối ưu Ngoài ra, cần tiếp tục nghiên cứu c c điều kiện t ch đ thu đư c kh ng sinh tinh khiết có hiệu suất cao

1.7.3 Cấu tr c kh ng sinh

Đ x c định đư c cấu tr c hóa học của thành phần kh ng sinh chính thu

đư c, cần đo nhiệt đ nóng chảy; iện giải phổ UV, IR, phổ khối ESI MS, phổ c ng hưởng từ h t nhân (1

H-NMR, 13C NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC)

10

1.8 M t số nghiên cứu mới trong sinh tổng h p kh ng sinh từ Streptomyces

1.8.1 Quy tắc sinh tổng h p valanimycin từ Streptomyces viridifaciens: đặc tính

của VlmI

Nghiên cứu đư c thực hiện ởi c c t c giả khoa Hóa trường Đ i Học Rice (Hoa Kỳ) nhằm làm rõ đặc tính và cơ chế của VlmI - m t protein điều hòa sản xuất

kháng sinh – trong sinh tổng h p valanimycin từ Streptomyces viridifaciens

Phương ph p nghiên cứu đư c s dụng là phương ph p Western

Kết quả cho thấy: c c protein điều hòa sản xuất kh ng sinh từ Streptomyces

đư c chứng minh là có vai trò kích ho t sự phiên mã ằng c ch gắn với m t sắp xếp c i trước c i sau của sự lặp l i trực tiếp c c heptamer ở xung quanh 35 vị trí của

c c chất ho t hóa c ng nguồn gốc của ch ng Bằng chứng thực nghiệm đư c trình

bày trong nghiên cứu cho thấy VlmI là m t gen quy định trong cụm gen sinh tổng

h p valanimycin từ Streptomyces viridifaciens và mã hóa m t protein thu c họ

SARP Sự tổ chức của cụm gen sinh tổng h p valanimycin cho thấy các gen sinh tổng h p valanimycin đư c định vị trên a ản sao tiềm tàng: vlmHORBCD,

vlmJKL và vlmA Sự gi n đo n của VlmI ph hủy qu trình sinh tổng h p mycin, qua đó th hiện sự cần thiết của VlmI trong sinh tổng h p valanimycin Phân tích Western lot cho thấy VlmR và VlmA vắng mặt trong đ t iến VlmI và sự sản

valani-xuất VlmK ị giảm m t c ch nghiêm trọng C c kết quả này th hiện rằng sự i u

hiện của c c gen này từ a ản sao tiềm tàng đư c ki m so t chặt chẽ ởi vlmI Các vùng gồm hai gen VlmA-VlmH và VlmI-VlmJ đều th hiện m t ki u lặp đi lặp l i

trực tiếp c c heptamer C c thí nghiệm chuy n gen với VlmI đư c sản xuất qu đ ở

loài Escherichia coli như m t protein gắn FLAG c-terminal đã cho thấy rõ ràng

rằng VlmI liên kết với c c mảnh ADN từ cả hai vùng có chứa c c đo n lặp đi lặp l i của heptamer [28]

thành phần kh ng sinh số 70 đư c sản xuất ởi Streptomyces sp IMV-70

Đây là m t chủng đư c phân lập từ đất của Kazakhstan, nó có khả năng sản xuất kh ng sinh với ho t lực m nh Thành phần kh ng sinh số 70 đư c sản xuất ởi

Streptomyces sp IMV-70 trong qu trình lên men là m t kh ng sinh ngo i ào Ho t

lực kh ng sinh cao nhất của h p chất số 70 đư c ghi nhận đối với c c chủng cầu khuẩn lâm sàng: MRSA và MRCNS k cả với c c lo i kh ng thuốc khác nhau Nồng đ ức chế tối thi u (MIC) của nhóm c c t c nhân gây ệnh trên lâm sàng thu thập đư c trong ph m vi 0,1–0,025 μg/mL

H p chất kh ng sinh số 70 đã đư c tinh chế và t ch ra thành c c thành phần riêng lẻ ằng phương ph p HPLC, TLC, và phương ph p sắc k c t Thành phần chính của h p chất kh ng sinh số 70 đư c đặt tên là kháng sinh 70-A, đư c tìm thấy

là giống với peptolide etamycin A

Bảng 1.2: C c đặc tính hóa l của kh ng sinh 70 - A

UV (H2O), λmax, nm (E1%1 cm) 340 (80)

HPLC trên “Knauer” (Đức), c t 4 × 150 mm đư c nhồi

h t “Chromasil A-100 C-18, 5 mcm” (BioChimMac,

Moscow), thời gian lưu (ph t)

17,85

Đ tinh khiết về mặt cảm quan theo dữ liệu HPLC 95%

Khối lư ng phân t , phương ph p MS MALDI-TOF m/z 879 (M+H)+

,

901 (M+Na)+,

917 (M+K)+TLC, ản mỏng Kieselgel 60 (Merck) 0,64

12

Hệ: chloroform-benzene-methanol (30 : 20 : 7)

Nghiên cứu cho thấy điều kiện lên men có ảnh hưởng rất quan trọng tới tỉ lệ kháng sinh 70-A thu đư c Cụ th là, trong môi trường lên men chứa nấm men thành phần 70 – A chiếm tỉ lệ cao nhất, tới 74% trong thành phần

Tóm l i, việc x c định c c điều kiện sinh trưởng tối thích và sự ph t tri n c c phương ph p đ phân lập, tinh chế và làm giàu thêm c c chế phẩm của kh ng sinh mới số 70 sẽ cho phép nghiên cứu sâu hơn về tiềm năng của lớp kh ng sinh mới này [29]

1.8.3 Các kháng sinh mới thu c nhóm capoamycin và c c acid polyene đư c sản

xuất từ Streptomyces fradiae PTZ0025

Trong nghiên cứu này, c c t c giả đã phân lập và x c định đư c 4 chất kh ng sinh thu c nhóm capoamycin: dioxamycin (2), MK844 – mF10 (5), 2 chất mới đư c đặt tên là fradimycins A (3) và B (4); và 2 acid polyene mới với tên gọi là acid fradic A (6) và B (7) Cấu tr c của c c chất này đư c x c định ằng phương ph p phổ c ng hưởng từ h t nhân (NMR), phương ph p quang phổ khối ion hóa phun điện t có đ phân giải cao (HRESIMS), và phương ph p suy tho i ằng hóa học

13

Hình 1.2: Cấu tr c c c thành phần từ 1 – 7

Nghiên cứu cho thấy c c thành phần 3 – 5 có t c dụng kh ng khuẩn trên in

vitro đối với Staphylococcus aureus với nồng đ ức chế tối thi u (MIC) là 2,0 – 6,0

μg/mL Hơn thế, ch ng còn ức chế m t c ch có nghĩa c c tế ào tăng trưởng trong ung thư ru t kết và u thần kinh đệm với nồng đ cần đ ức chế 50% tế ào ung thư (IC50) là 0,13 - 6.46 μM Fradimycin B (4), thành phần ho t đ ng nhất, đư c c c t c giả nghiên cứu sâu hơn về việc làm ngừng chu kỳ tế ào và gây ra qu trình chết định trình (apoptosis) của c c tế ào ung thư Kết quả nghiên cứu còn cho iết fradimycin B (4) làm ngừng chu kỳ tế ào ở pha G0/G1và gây ra sự chết theo chu trình và chết ho i ở ung thư ru t kết và c c tế ào u thần kinh đệm Tóm l i, c c kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng c c thành phần 3-5, đặc iệt là fradimycin B (4), có

ho t đ ng kh ng khuẩn và kh ng u m nh [31]

1.8.4 Các pyramidacin A – D, 3-Hydroxyquinoline-2-carboxamide và các

ben-zamide gây đ c tế ào đư c sản xuất từ Streptomyces sp DGC1

Nghiên cứu đư c thực hiện ởi c c t c giả thu c an khoa học dư c phẩm, trường cao đẳng dư c và trường đ i học Kentucky của Hoa Kỳ Họ đã phân lập

14

đư c 4 enzamid mới, c c pyramidamycin A-D (2–5) c ng với m t chất thiên nhiên

mới 3-hydroxyquinoline-2-car oxamide (6) ằng c ch chiết thô từ Streptomyces sp

DGC1 Ngoài ra, c c t c giả còn phân lập và x c định đư c năm h p chất kh c là

2-aminobenzamide (anthranilamide) (1); 4',7-dihydroxyisoflavanone (7); thymidine; 2'-deoxy-uridine và adenosine

2'-deoxy-Bằng việc s dụng phổ c ng hưởng từ h t nhân 1D và 2D c ng với phương

ph p phân tích khối phổ phân giải cao, cấu tr c của c c h p chất mới 2 – 6 đã đư c

x c định Kết quả cho thấy, c c h p chất đư c phân lập từ 1-6 chứa c ng m t chu i bên amide

Bảng 1.3: C c đặc tính hóa l của c c pyramidamycin A – C (2 – 4)

Chất rắn không màu, hấp thụ UV

B t màu trắng, hấp thụ UV

(CH2Cl2/5%MeOH)

0.22 (CH2Cl2/5%MeOH)

0.57 (CH2Cl2/2%MeOH), 0.30 (CH2Cl2)

184 [M+H]+, 206 [M+Na]+

183 [M+H]+, 205 [M+Na]+

(+)-HRESI MS (m/z)

15

X c định

đư c

168.0654 [M+H]+ và 190.0489 [M+Na]+

184.0609 [M+H]+, 206.0435 [M+Na]+

và 389.0963 [2M+Na]+

183.0774 [M+H]+, 205.0600 [M+Na]+

và 387.1292 [2M+Na]+

Tính toán

đư c

168.0655 cho C8H10NO3 và 190.0475 cho C8H9NO3Na

184.0604 cho C8H10NO4, 206.0424 cho C8H9NO4Na và 389.0955 cho C16H18N2O8Na

183.0770 cho C8H11N2O3, 205.0589 cho C8H10N2O3Na, 387.1275 cho C16H20N4O6Na UV/VIS

(MeOH):

λmax (log

ε)

212 (4.45), 255 (4.17), 295 (3.90) nm

214 (4.20), 260 (3.94), 295 (3.62) nm

235 (4.42), 271 (4.02), 314 (3.63) nm

Bảng 1.4: C c đặc tính hóa l của pyramidamycin D và 3 - carboxamide

hydroxyquinoline-2-C c đặc tính hóa l Pyramidamycin D (5)

3-Hydroxyquinoline-2-carboxamide (6)

UV

Chất rắn màu vàng nh t, hấp thụ UV, ph t huỳnh quang màu xanh lá cây dưới ước sóng UV dài (365 nm)

16

(+)-HRESI MS (m/z)

X c định đư c 225.0875 [M+H]+,

247.0704 [M+Na]+ và 263.0438 [M+K]+

189.0653 [M+H]+ và 211.0473 [M+Na]+

Tính to n đư c 225.0870 cho

C10H13N2O4, 247.0689 cho C10H12N2O4Na và 263.0429 cho

C10H12N2O4K

189.0658 cho C10H9N2O2 và 211.0478 cho C10H8N2O2Na

UV/VIS (MeOH): λmax

h p chất ho t đ ng nhất đối với cả hai dòng tế ào PC3 và H460 với liều gây ức chế 50% tăng trưởng (GI50) lần lư t là 2,473 mM và 7,339 mM Các benzamid (1 – 3)

đư c chứng minh là có t c dụng ức chế đối với Kocuria rosea B-1106 (đường kính

vòng ức chế là13±2 mm ở chất 1; 10±2 mm ở chất 2 và 3) H p chất 6 có t c dụng

yếu lên Escherichia coli DH5α và Micrococcus luteus NRRL B-2618 (đường kính

vòng ức chế lần lư t là 8±2 mm và 9±2 mm) Về phân lo i học, khi giải trình tự gen

16S rRNA, nghiên cứu đã cho thấy Streptomyces sp DGC1có 99% tr ng khớp với trình tự gen 16S rRNA của Streptomyces atrovirens chủng NRRL B-16357 [21] 1.8.5 Nghiên cứu sản xuất kh ng sinh vancomycin từ x khuẩn Streptomyces orien-

17

orientalis nhận đư c từ x lý N-methyl-N-nitro-N- nitrosoguanidin (MNNG) lên tế

bào trần của chủng gốc Vancomycin là chất kháng sinh thu c nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh, từng đư c coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đư c các bệnh nhiễm trùng nguy hi m do các chủng vi sinh vật kháng methicillin (chất kh ng sinh nhóm β- lactam) gây nên Vancomycin đã đư c đưa vào chữa bệnh từ hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn đư c coi là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng m t mình hoặc phối h p với các kháng sinh khác, chống l i các vi khuẩn đã nhờn với nhiều lo i kháng sinh thông dụng

Đầu tiên, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương ph p gây chủng đ t biến bằng tia UV nhằm nâng cao ho t tính kháng sinh của biến chủng

S orientalis 4912 Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào trần và bào t

chủng S orientalis 4912 sau khi x lý UV ở đ sống sót từ 1 - 10%, ki m tra ho t

tính kh ng sinh theo phương ph p cục th ch cho thấy, khả năng sinh tổng h p kháng sinh của chủng này tăng lên từ 8 - 30,3% đối với x lý bào t và 66,33% đối với x lý tế bào trần

Dựa trên môi trường lên men thích h p cho chủng S.orientalis 4912, các tác giả

đã tiến hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương ph p quy ho ch thực

nghiệm của Box-Wilson cho biến chủng S orientalis 4912-81-61 như sau:

saccha-rose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; b t đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO3 2 g/l; CaCl2 40 mg/l; CuSO4 10 mg/l

Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống là 4%, nhiệt đ lên men tối ưu là 280C, nồng đ pH thích h p là 7 Đ nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lư ng oxy hòa tan (dO2) trong môi trường tới sự sinh

trưởng và sinh tổng h p vancomycin, các thí nghiệm lên men biến chủng S

orien-talis 4912-81-61 đư c thực hiện trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lít với các

điều kiện pH, nhiệt đ và tỉ lệ giống đã x c định ở trên Kết quả x c định sinh khối khô và ho t tính kháng sinh sau 120 giờ lên men cho thấy, khi dO2 đư c duy trì ở mức 20 - 30% thì lư ngvancomycin và sinh khối đ t cao nhất, tương ứng bằng 2983 mcg/ml và 9,8 mg/ml Như vậy, kết quả của các thí nghiệm này cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan và bảo đảm đảo tr n tốt trong ình lên men là điều kiện thiết yếu của sản xuất vancomycin [11]

18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết ị

Bacillus cereus ATCC 9946 Escherichia coli ATCC 25922

Bacillus pumilus ATCC 6633 Proteus mirabilis BV 108

Bacillus subtilis ATCC 6633 Pseudomonas aeruginosa VM 201

Sarcina lutea ATCC 9341 Salmonela typhi DT 220

Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shighella flexneri DT 112

 Môi trường

 Các MT nuôi cấy x khuẩn: đư c trình ày ở ảng 2.2

 Các MT lên men (MTdt): có thành phần tương ứng MT nuôi cấy x khuẩn nhưng lo i ỏ th ch

 Các MT nuôi cấy VSV ki m định: đư c trình ày ở ảng 2.3

Bảng 3.2: C c MT nuôi cấy x khuẩn

20

2.1.2 M y móc thiết ị

- T c nhân gây đ t iến: nh s ng UV (λ=254nm), nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V

- M y lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf

- Tủ ấm Memmert IBN 400, Binder CE BD 53, tủ ấm Trung Quốc

- Tủ l nh Samsung, tủ l nh Sanyo

- Tủ cấy vô tr ng Aura VF 48, tủ cấy BASSAIR

- Tủ sấy Shalla model – 1350FX

- Lò vi sóng Whirlpool

- Nồi hấp vô tr ng Hirayama Model HL3030e, nồi hấp Hirayama HicliveTMHve - 25, nồi hấp ALPKT2346

- Cân k thuật Precisa BJ 210C

- Cân phân tích Sartorius BP 121J

- M y đo nhiệt đ nóng chảy E2-Melt

- M y cất quay Buchi Water ath B480

2.2.1 Phương ph p nuôi cấy và giữ giống x khuẩn

- Cấy zigzac x khuẩn trên ống th ch nghiêng có chứa môi trường nuôi cấy thích h p, ủ cho ph t tri n ở 28-29°C

- Sau 6 - 10 ngày, x khuẩn đã ph t tri n tốt, cho c c ống giống vào tủ l nh

ảo quản ở 2-4°C, định kỳ 3-6 th ng cấy truyền m t lần

21

2.2.2 Đ nh gi ho t tính kh ng sinh ằng phương ph p khuếch t n

- Nguyên tắc: Đưa mẫu th lên trên ề mặt lớp th ch dinh dư ng đã cấy

VSV ki m định Kh ng sinh từ mẫu th khuếch t n vào MT th ch sẽ ức chế sự ph t tri n của VSV ki m định và t o thành vòng vô khuẩn

- Tiến hành: gồm 5 ước chính

+ Bước 1: T o h n dịch VSV ki m định

Lấy m t vòng que cấy VSV ki m định cấy vào 2,5 ml MT canh thang, ủ ở 37°C trong 18-24h (đối với vi khuẩn) đ t o thành h n dịch VSV có nồng đ 106-108 tế bào/ml

+ Bước 2: Cấy h n dịch VSV ki m định vào môi trường th ch thường đã tiệt

tr ng đư c đ ngu i đến 45-50°C với tỷ lệ 5:200 (105 tế ào/1ml), lắc đều, đổ vào

c c đĩa Petri vô tr ng với th tích 20ml/đĩa

+ Bước 3: Đưa mẫu th vào h p Petri có chứa môi trường ki m định

 Phương ph p khối th ch: th ho t tính kh ng sinh của chủng x khuẩn khi đư c nuôi cấy trên môi trường đặc

C ch làm: Đặt khối th ch (Φ=6,0mm) có chứa VSV sinh kh ng sinh lên ề mặt MT

s: Đ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

n: Số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường: n=3)

2.2.3 Phương ph p sàng lọc ngẫu nhiên (SLNN)

- Pha h n dịch ào t : Lấy m t vòng que cấy ào t Streptomyces 166.28,

cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô tr ng, lắc cho ào t phân t n đều, thu

đư c h n dịch ào t ở đ pha loãng 10-1

(định ước) Sau đó, pha loãng tương tự đến nồng đ 10-6 ằng nước cất vô tr ng

- Cấy ào t : Cấy ào t Streptomyces 166.28 ở c c đ pha loãng 10-4 đến

10-6 lên môi trường MT2 trong đĩa Petri M i nồng đ pha loãng làm 3 thí nghiệm song song, rồi đem ủ ở 280C – 290C trong 6 ngày

- Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn tối thi u 32 khuẩn l c ph t tri n đặc

th , mọc riêng rẽ đem cấy zigzac lên ề mặt MT2 trong đĩa Petri, rồi ủ ở 280

C –

290C trong 6 ngày Sau đó lấy ra th ho t tính kh ng sinh (HTKS) ằng phương

ph p khối th ch

2.2.4 Phương ph p đ t iến (ĐB) ằng nh s ng UV

- Pha h n dịch ào t : Lấy m t vòng que cấy ào t Streptomyces 166.28,

cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô tr ng, lắc cho ào t phân t n đều, thu

23

đư c h n dịch ào t ở đ pha loãng 10-1 (định ước) Sau đó d ng 1ml h n dịch ào

t này pha loãng đến nồng đ 10-6

làm mẫu chứng, 9ml còn l i đư c đưa vào đĩa Petri vô tr ng đ tiến hành đ t iến ằng nh s ng UV

- Đ t iến ằng ánh sáng UV: với c c thông số là ước sóng: λ=254nm; khoảng c ch chiếu: 60cm; thời gian chiếu: 5 ph t Sau đó, lấy đĩa Petri ra, đ ch tối 2h, rồi pha loãng đến nồng đ 10-4, 10-5

- Cấy c c ào t sau đ t iến: Cấy c c ào t sau đ t iến ở hai nồng đ là

10-4, 10-5 lên môi trường MT2 trong đĩa Petri Mẫu chứng: cấy ào t ở nồng đ 10

-6 M i nồng đ pha loãng làm 3 đĩa song song C c đĩa Petri sau khi cấy đư c ủ ở nhiệt đ 280

C – 290C trong 6 – 10 ngày cho xuất hiện c c khuẩn l c

Đếm c c khuẩn l c, x c định % đ sống sót theo công thức:

% đ sống sót = (Nm/N0) × 10-6+k×100%

Trong đó: N m: Số khuẩn l c sau đ t iến có nồng đ 10-k

,

N o: Số khuẩn l c trong mẫu chứng

- Tiến hành sàng lọc với c c khuẩn l c sau khi đ t iến tương tự như phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên Chú ý: làm song song mẫu chứng

Phần trăm iến đổi ho t tính đư c x c định theo công thức:

% iến đổi ho t tính = i 100%

o

D

D Trong đó:

i

D : Đường kính trung ình vòng vô khuẩn của iến chủng thứ i sau đ t iến,

o

D : Đường kính trung ình vòng vô khuẩn của mẫu chứng

- Dựa vào kết quả thu đư c, lựa chọn ra c c iến chủng có % iến đổi ho t

tính (+) cao nhất d ng cho c c nghiên cứu tiếp theo

2.2.5 Phương ph p lên men chìm tổng h p kh ng sinh

- Nguyên tắc: Sau khi x c định đư c c c môi trường nuôi cấy ề mặt tối ưu

cho việc sản xuất kh ng sinh, ta s dụng giống cấp I đ lên men mẻ trên m y lắc trong c c môi trường lỏng tương ứng

- Tiến hành:

24

+ T o giống cấp I: Chủng giống Streptomyces 166.28 sau khi nuôi cấy trên

th ch nghiêng (MT2) đủ 6 - 10 ngày tuổi đư c cấy vô tr ng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2dt ằng 10ml nước vô tr ng, lắc trên m y lắc tròn ở nhiệt đ 28°C

± 0,1°C, tốc đ quay 140 vòng/ph t trong 48 giờ

+ Lên men: Cấy vô tr ng giống cấp I sang c c ình nón chứa môi trường dinh dư ng cần nghiên cứu với tỉ lệ Vgiống : Vmôi trường = 1 : 10 Đưa c c ình lên men trên vào m y lắc với c c thông số là nhiệt đ : 28°C ± 0,1°C; tốc đ quay: 140 vòng/ph t; thời gian: 120 giờ Sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất [4, 30]

2.2.6 Phương ph p chiết kh ng sinh từ dịch lên men ằng dung môi hữu cơ

- Mục đích: X c định dung môi và pH chiết tối ưu cho dịch lọc

- Tiến hành: D ng phương ph p chiết 1 lần

+ Chỉnh pH ằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M

+ Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với nhiều dung môi kh c nhau: Dịch lọc và dung môi cho vào ình g n theo tỷ lệ Vdung môi:Vdịch lọc = 1:5 Sau đó lắc k trong 1 -

2 ph t Đ yên 1h cho phân lớp Sau đó, t ch riêng lấy lớp dung môi và dịch lọc

+ Sau m i lần chiết, lấy lớp dung môi và lớp dịch lọc th ho t tính kh ng sinh theo phương ph p khoanh giấy lọc, từ đó chọn đư c dung môi và pH chiết tối

ưu

2.2.7 Phương ph p t ch c c thành phần trong kh ng sinh ằng sắc k lớp mỏng

- Mục đích: X c định c c thành phần kháng sinh trong dịch lọc hoặc ki m tra

đ tinh khiết của kh ng sinh

- Tiến hành:

+ Cắt ản mỏng có kích thước thích h p, ho t hóa ở 110°C/30 ph t

+ Pha h n h p dung môi theo đ ng tỷ lệ, cho vào ình sắc k , đ ổn định khoảng 30 ph t

25

+ D ng ống mao quản đường kính 0,5mm chấm dung dịch cần sắc k lên

ản mỏng đã ho t hóa sao cho c ch mép dưới 1,5 cm rồi đ khô tự nhiên hoặc sấy ở nhiệt đ dưới 50°C

+ Đặt ản mỏng vào ình sắc k , khi dung môi ch y đư c khoảng 3/4 chiều dài ản mỏng thì lấy ra, đ nh dấu vết dung môi ch y

+ X c định vết theo c c phương ph p sau:

 Soi đ n t ngo i: Đặt ản mỏng sắc k vào đ n t ngo i, nếu có vết chất th sẽ hiện màu

 Phương ph p hiện hình VSV: Đặt ản mỏng vào đĩa Petri đã tiệt trùng, đổ m t lớp vừa phải MT th ch thường đã cấy VSV ki m định sao cho ản mỏng chìm trong th ch Đ vào tủ 37°C, ủ trong 18-24h Nếu thấy xuất hiện vòng

vô khuẩn chứng tỏ có vết kh ng sinh

 Phương ph p hiện màu hóa học: Bản mỏng đư c phun thuốc th hiện màu, sấy ở 70°C trong 10 ph t đ ph t hiện vết D ng thuốc th ninhydrin 1% trong cồn đ ph t hiện c c kh ng sinh có chứa nhóm amin

Trong đó: a: Khoảng c ch từ v ch xuất ph t đến tâm của vết ho t chất,

: Khoảng c ch từ v ch xuất ph t đến v ch dung môi [2]

2.2.8 Phương ph p thu kh ng sinh thô ằng phương ph p cất quay

Pha dung môi hữu cơ thu đư c sau khi chiết đư c cất cô ằng m y cất quay chân không ở 460C – 700C và -0,85atm Cắn thu đư c đư c hòa tan ằng m t lư ng nhỏ methanol, đổ vào ình nón s ch, sấy ở 50°C đến khô C o, thu lấy t kh ng sinh thô

- Đưa mẫu th lên c t: B t kh ng sinh thô hòa tan trong m t lư ng tối thi u methanol rồi tr n với khoảng 2g silicagel đã ho t hóa Sau đó, sấy ở 50°C – 600C cho ay hết methanol rồi cho lên c t đã đư c ổn định

- Cho dung môi ch y qua c t với tốc đ 0,5ml/ph t Lấy c c phân đo n vào ống nghiệm s ch, khoảng 30 phân đo n, m i phân đo n 5ml

- Th HTKS của c c phân đo n ằng phương ph p khoanh giấy lọc C c phân đo n có HTKS đư c tiến hành sắc k lớp mỏng với hệ dung môi t ch tốt nhất Phân đo n chính là c c phân đo n có Rf tương đương nhau và có ho t tính kh ng sinh m nh

- Các phân đo n chính sau khi ch y c t đư c cất chân không C o thu t tinh th kh ng sinh cho vào ống nghiệm s ch, rồi đem kết tinh l i ằng h n h p dung môi, lọc, sấy khô ở 50°C đ thu kh ng sinh tinh khiết

2.2.10 Phương ph p x c định c c phổ nghiên cứu cấu tr c kháng sinh chính

C c phổ kh c nhau cho iết c c thông tin kh c nhau về kh ng sinh, từ đó ta có th iện giải đư c cấu tr c chất kh ng sinh chính Cụ th như sau:

- Phổ t ngo i: cho iết thông tin về lo i h p chất

- Phổ hồng ngo i: i u thị sự liên quan giữa nhóm chức và đỉnh hấp phụ

- Phổ khối ESI MS: nghĩa quan trọng nhất của nó là x c định đư c chính x c khối lư ng phân t

- Phổ c ng hưởng từ h t nhân 1H (1H NMR), phổ c ng hưởng từ 13C (13C NMR): x c định số lư ng hydro và car on

- Phổ c ng hưởng từ DEPT: x c định số nhóm CH3, CH và CH2

- Phổ c ng hưởng từ COSY: i u thị tương t c H H kề nhau

- Phổ c ng hưởng từ HSQC: i u thị liên kết H – C

27

- Phổ c ng hưởng từ HMBC: i u thị tương t c H – C trường lập th

Khi đã x c định đư c tất cả c c phổ cần thiết song việc iện giải cấu tr c hóa học của kh ng sinh là rất phức t p

28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả chọn lọc và cải t o giống

3.1.1 Sàng lọc ngẫu nhiên

* Mục đích: nhằm chọn ra chủng có HTKS cao trong quần th

* Tiến hành: Chủng Streptomyces 166.28 đư c SLNN, chọn lấy 32 d ng

chủng ph t tri n đặc th và mọc riêng rẽ đem th HTKS ằng phương ph p khối

29

* Nhận xét: Căn cứ vào ảng 3.1 ta thấy a d ng chủng 6, 15 và 29 có HTKS cao nhất Do đó, tiến hành giữ l i đ làm nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Đ t iến ằng nh s ng UV lần 1

* Mục đích: tăng HTKS của d ng chủng thu đư c sau SLNN

* C ch tiến hành: Chọn d ng chủng có HTKS cao nhất sau SLNN là d ng chủng 6, đ t iến ằng nh s ng UV (λ=254nm), khoảng c ch chiếu 60 cm, thời gian chiếu là 5 ph t

* Kết quả:

Tỉ lệ sống sót sau ĐB là 0,29% Tiến hành sàng lọc sau đ t iến và th ho t tính kh ng sinh của c c iến chủng đ chọn ra c c iến chủng có % iến đổi ho t tính dương cao nhất Kết quả th ho t tính kh ng sinh của m t số iến chủng đư c trình ày ở ảng 3.2 dưới đây:

- Dưới t c dụng của nh s ng UV, ên c nh c c iến chủng tăng HTKS, c ng

có c c iến chủng giảm HTKS m t c ch rõ rệt so với mẫu chứng

- Có iến chủng tăng m nh HTKS trên S flexneri và giảm HTKS trên B

cere-us và ngư c l i