Xây dựng phương pháp xác định dư lượng cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất dược bằng HPLC

Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện được một nguyên nhân cũng không kém phần quan trọng khác: đó là sự tồn dư của kháng sinh và các chất chuyển hóa của chúng trong môi trường vì chỉ

 TRẦN THỊ THANH HUẾ

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI

TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC  

HÀ NỘI – 2013 

 TRẦN THỊ THANH HUẾ

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI

TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC  

HÀ NỘI – 2013 

TRẦN THỊ THANH HUẾ

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI

TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60 72 0410

Người hướng dẫn: 1 PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

2 TS Đoàn Cao Sơn

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh và TS Đoàn Cao Sơn, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này Đặc biệt, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và TS Nguyễn Thị Kim Hương – Trưởng khoa Dược lý, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cùng tập thể cán bộ trong khoa đã tạo điều kiện và giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường và thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2013

Học viên

Trần Thị Thanh Huế

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 3

1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc 3

1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3

1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM 6

1.2.1 Công thức cấu tạo 6

1.2.2 Tính chất lý hóa 6

1.2.3 Dược lý 6

1.2.4 Chỉ định 7

1.2.5 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim 7

1.4 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 11

1.4.1 Khái niệm 11

1.4.2 Nguyên tắc 11

1.4.3 Phân loại 11

1.4.4 Các thông số đặc trưng 12

1.4.5 Ứng dụng của HPLC 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 19

2.2.1 Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn 19

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 21

2.3.2 Xây dựng điều kiện sắc ký 21

2.3.3 Đánh giá phương pháp 21

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 24

3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 24

3.1.2 Khảo sát quy trình phân tích 33

3.1.3 Quy trình phân tích 37

3.2 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 38

3.2.1 Độ thích hợp của hệ thống 38

3.2.2 Tính chọn lọc của phương pháp 39

3.2.3 Độ tuyến tính 43

3.2.4 Độ đúng và độ chính xác của phương pháp 45

3.2.6 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 49

3.2.6 Khảo sát độ ổn định 50

3.3 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC 51

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 54

4.1 LỰA CHỌN QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU 54

4.2 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH 54

4.3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

KẾT LUẬN 58

KIẾN NGHỊ 59

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

BP 2010 Dược điển Anh 2010 (The Bristist Pharmacopoeia)

C18 Octadecyl carbon chain

DAD Detector chuỗi diod (Diode array detector)

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High perform liquid chromatography)

HPLC-MS Sắc kí lỏng khối phổ (High perform liquid chromatography –Mas

LLOQ Giới hạn định lượng dưới

ULOQ Giới hạn định lượng trên

USP 32 Dược điển Mỹ 32 (The United States Pharmacopoeia)

UV - VIS Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible

absorption Spectrophotometry)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phổ tác dụng của các cephalosporin 4

Bảng 1.2 Đặc tính của các cephalosporin liên quan nghiên cứu 5

Bảng 3.1 Khảo sát lựa chọn dung môi xử lý mẫu 25

Bảng 3.2 Khảo sát xử lý mẫu với dung môi diethyl ether 29

Bảng 3.3 Khảo sát xử lý mẫu với dung môi cloroform 30

Bảng 3.4 Khảo sát xử lý mẫu với dung môi cyclohexan 31

Bảng 3.5 Khảo sát độ ổn định của quá trình xử lý mẫu 32

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 35

Bảng 3.7 Kết quả độ thích hợp của hệ thống 39

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 44

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 46

Bảng 3.10.a Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian ở nồng độ LQC 47

Bảng 3.10.b Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian ở nồng độ MQC 47 Bảng 3.10.c Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian ở nồng độ HQC 48 Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ ổn định trong quá trình bảo quản mẫu 50

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ ổn định trong giai đoạn chờ tiêm mẫu 51 Bảng 3.13 Kết quả phân tích mẫu nước thải công ty CP dược Mediplantex 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức chung của cephalosporin 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cefixim 6

Hình 2.1 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ 20

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lý mẫu 25

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn lượng dung môi xử lý mẫu 27

Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với diethyl ether 28

Hình 3.4 Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với cloroform 29

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với cyclohexan 30

Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát xử lý mẫu bằng cloroform tỷ lệ 6:2 acid hóa 32

Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng 34

Hình 3.8 Phổ hấp thụ tử ngoại của cefixim 36

Hình 3.9 Phổ hấp thụ tử ngoại của cefdinir 37

Hình 3.10 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu: mẫu chuẩn cefdinir (a), mẫu chuẩn cefixim (b), mẫu trắng (c), mẫu tự tạo (d) 41

Hình 3.11 So sánh phổ cefixim trong dung dịch mẫu tự tạo và dung dịch chuẩn 41

Hình 3.12 So sánh phổ cefdinir trong dung dịch mẫu tự tạo và dung dịch chuẩn 42

Hình 3.13 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu khi phân tích cefixim và 4 cephalosporin khác 42

Hình 3.14.a Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ cefixim (ng/ml) và tỷ lệ diện tích pic của cefixim/diện tích pic chuẩn nội 44

Hình 3.14.b Sắc ký đồ khảo sát độ tuyến tính 44

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu LOD 49

Hình 3.16 Sắc ký đồ phân tích mẫu nước thải Công ty CP dược Mediplantex .53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tình trạng kháng thuốc kháng sinh đang là một thảm họa mà con người phải đối mặt Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới, chỉ tính riêng năm 2010,

tình trạng vi khuẩn Klebsiella Pneumoniae kháng thuốc đã gây ra 25.000 ca tử

vong tại châu Âu Hiện nay, ngay cả những thuốc kháng sinh thế hệ mới nhất, chỉ dùng trong nhiễm khuẩn bệnh viện cũng đã có hiện tượng bị kháng, bằng chứng mới đây nhất là sự lây lan của chủng vi khuẩn kháng carbapenem (ndm-1)

ở hơn 16 quốc gia trên thế giới Tổng Giám đốc Tổ chức y tế thế giới, bà Magaret Chan đã đưa ra lời cảnh báo về khả năng con người quay trở lại thời kỳ trước khi thuốc kháng sinh được ra đời nếu không có một hành động toàn cầu giải quyết vấn đề kháng thuốc đang ngày càng trầm trọng này [32,33]

Để giải quyết vấn đề kháng thuốc kháng sinh, các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung chú ý đến nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không hợp lý Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện được một nguyên nhân cũng không kém phần quan trọng khác: đó là sự tồn dư của kháng sinh và các chất chuyển hóa của chúng trong môi trường vì chỉ cần một dư lượng nhỏ kháng sinh thải ra môi trường nhưng sẽ được tích lũy dần dần vào các vi khuẩn gây bệnh, giúp chúng phát triển những gen kháng thuốc Cũng vì lý do đó, từ những năm cuối thập kỉ

90 của thế kỷ 20, hướng nghiên cứu về dư lượng thuốc kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng như tác động của chúng trong môi trường được ra đời Hiện nay, hướng nghiên cứu này đang được quan tâm tại các nước phát triển như Mỹ, Đức, Thuỵ Sỹ, Australia… Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và chất chuyển hoá của chúng trong môi trường nước đã trở nên phổ biến [17,20,27]

Nhằm góp phần nâng cao nhiệm vụ chăm sóc và khám chữa bệnh cho nhân dân, ngành công nghiệp Dược Việt Nam đang ngày càng lớn mạnh Hiện cả nước có hơn 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc

với đủ chủng loại: kháng sinh, giảm đau, chống viêm, thuốc tim mạch, hormon, thuốc bổ và vitamin… Cefixim, một kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin thế

hệ 3 có phổ rộng trên trực khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang được chỉ định rộng rãi trong việc điều trị các bệnh đường hô hấp trên và dưới đặc biệt ở trẻ em Hiện cũng có nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản xuất loại kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau như: viên nén, viên nang, siro, bột pha hỗn dịch uống… Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dư Cefixim trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được quan tâm đúng mức Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam đã có một vài nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải bệnh viện [3], nhưng chưa có đề tài nào khảo sát đối tượng nước thải từ các cơ sở sản xuất dược phẩm

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng

phương pháp xác định dư lượng Cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng HPLC” với các mục tiêu chính như sau:

1 Xây dựng được phương pháp xác định dư lượng kháng sinh Cefixim trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng HPLC ở nồng độ ppb

2 Ứng dụng phương pháp xây dựng được để kiểm tra dư lượng Cefixim

có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược trong nước

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN

1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc

Năm 1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển tại Cagliari (Italia) đã

phân lập được chủng nấm Cephalosporium acremonium Dịch lọc môi trường

nuôi cấy nấm này có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng

Staphylococcus aureus và có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng

và bệnh thương hàn ở người Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham và Neuton

(Anh) từ môi trường nuôi cấy này (nay được gọi là Acremonium chrysogenum)

đã chiết được một hỗn hợp kháng sinh cephalosporin P1, cephalosporin C và penicillin N Năm 1971, từ chủng Norcardia, Nagarazan chiết xuất được cephamycin cũng có cấu trúc gần với cephalosporin C

Có nhiều cephalosporin tự nhiên được sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc khác nhau nhưng chúng hầu như không có ý nghĩa trong trị liệu Vì vậy người ta đã tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên cơ sở cấu trúc vòng β-lactam Ưu thế của các cephalosporin là có tác dụng kháng khuẩn đối với

cả các vi khuẩn có hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) và độc tính thấp Vì vậy chúng nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong trị liệu [9]

1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng

* Công thức chung của cephalosporin

S N

N H

R1O

R2 H

O

O O

H

H H

R3

Hình 1.1 Công thức chung của cephalosporin

Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic (A7AC), mang cấu trúc 3-cephem, 3 mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –lactam để hợp chất có tác dụng sinh học

Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7) đều có cấu hình R, và hầu như là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu tuyền khá mạnh [7]

* Phân loại và phổ tác dụng

Hiện nay, cephalosporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác dụng Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn, nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại Phổ chung của các thế

hệ cephalosporin được giới thiệu tại Bảng 1.1 [10]

Bảng 1.1 Phổ tác dụng của các cephalosporin

Thế hệ I Cephalexin - Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn Gram

(+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu kháng methicillin)

Cephalothin

Cephazolin

… - Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (-) như

E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis và Shigella

Thế hệ II Cephaclor

Cefuroxim

Cefotetan…

- Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1 Tuy nhiên tác dụng trên

vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn

- Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với

β-lactamase, tác dụng trên cả P aeruginosa

- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1

Thế hệ

IV

Cefdinir

Cefepim…

- Phổ tác dụng tương tự nhưng mạnh hơn thế hệ 3 Thuốc tác

dụng tốt với các vi khuẩn Enterobacteriaceae, Haemophilus,

Pseudomonas, Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu

- Bền vững với β-lactamase

1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu

Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi xin giới thiệu đặc tính của một số cephalosporin được liên quan nghiên cứu trong đề tài tại Bảng 1.2 [6,7,10,15,26,29,35]

Bảng 1.2 Đặc tính của các cephalosporin liên quan nghiên cứu

Tên chất Thế

hệ Công thức phân tử Tính chất vật lí

1 Cefadroxil

monohydrat

I C16H17N3O5S.H2O - Bột màu trắng hoặc gần như trắng

- Khó tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%

- Độ tan trong nước: 0,339 g/l

- pKa1 = 3,45; pKa2 = 7,43

2 Cefuroxim II C20H22N4O10S - Bột trắng hoặc hơi vàng

- Ít tan trong nước, tan trong aceton, ethyl acetat và methanol, ít tan trong ethanol

- Độ tan trong nước: 0,284 g/l

- pKa1 = 3,15; pKa2 = 1,1

3 Cefdinir III C14H13N5O5S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng

- Tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1M (pH = 7), ít tan trong nước, trong alcol và diethylether

- Độ tan trong nước: 8,87.10-2 g/l

- pKa1 = 1,74; pKa2 = 7,45

4 Cefoperazon III C25H26N9NaO8S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng

- Dễ tan trong nước, tan trong methanol, hơi tan trong ethanol 96%

- Độ tan trong nước: 0,286 g/l

- pKa1 = 3,38; pKa2 = - 1,7

+ Khối lượng phân tử: 507,5

+Tên khoa học: (6R, 7R)- 7- [[(Z)- 2- (2- aminothiazol- 4- yl)- 2- [(carboxy

methoxy) imino] acetyl] amino]- 3- ethenyl- 8- oxo- 5- thia- 1-azabicyclo [4.2.0] oct- 2- en- 2- carboxylic trihydrat [6,15,29]

1.2.2 Tính chất lý hóa

Bột trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm Ít tan trong nước, aceton, glycerin, tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong ether, ethyl acetat và hexan, hầu như không tan trong dung dịch sorbitol 70% và octanol Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim trong 1 ml nước có pH

CFM có độ bền vững cao với sự thủy phân của β- lactamase mã hóa bởi gen nằm trên plasmid và chromosom CFM có tác dụng cả in vitro và trên lâm sàng với hầu hết các chủng của các vi khuẩn sau đây:

- Vi khuẩn Gram (+): Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes

- Vi khuẩn Gram (-): Haemophilus influenzae (tiết hoặc không tiết β- lactamase), Moraxella catarrhalis (đa số tiết β- lactamase), Escherichia coli,

Proteus mirabilis, Neisseria gonorrhoeae (tiết hoặc không tiết penicillinase)

CFM không có hoạt tính đối với Enterococcus, Staphylococcus,

Pseudomonas aeruginosa và hầu hết các chủng Bacteroides và Clostridia

[5,10,13,14,26]

1.2.4 Chỉ định

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và dưới, viêm tai giữa cấp tính

- Nhiễm khuẩn đường niệu không biến chứng

- Viêm niệu đạo do lậu cầu

- Điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn đã kháng cephalosporin thế hệ I và thế hệ II: Viêm màng não cấp, áp xe não, nhiễm khuẩn đường huyết, viêm màng trong tim, nhiễm khuẩn đường hô hấp nặng, nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường mật, nhiễm khuẩn tiết niệu và sinh dục [5,26]

1.2.5 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim

Nghiên cứu định lượng CFM rất phong phú với nhiều loại nền mẫu khác nhau Chúng tôi xin giới thiệu một số nghiên cứu định lượng CFM

1.2.5.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang

- Định lượng CFM trong viên nén khi đánh giá độ hòa tan tại λ = 288 nm, mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 7,2 (6,8 g KH2PO4, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M) [6,29]

- Trong một nghiên cứu khác của Mahesh Attimarad và Anroop B Nair năm 2011, CFM và Ofloxacin được định lượng đồng thời bằng phương pháp đạo hàm và đạo hàm tỷ đối bậc nhất Với phương pháp phổ đạo hàm bậc nhất, nhóm nghiên cứu đã tìm ra bước sóng thích hợp cho định lượng CFM là 318,6 nm và nồng độ định lượng trong khoảng từ 2-20 µg/ml [25]

1.2.5.2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC

 Mẫu: nguyên liệu, viên nén, hỗn dịch

Cũng theo một nghiên cứu khác của K Azhagesh Raj và cộng sự năm

2010, CFM và Cefuroxim axetil trong dạng thuốc bán thành phẩm và thành phẩm được định lượng đồng thời bằng phương pháp HPLC pha đảo với cột C-18 của Merck (100 x 4,6 mm, 5 µm) Pha động sử dụng methanol: nước (90:10) Bước sóng phát hiện cũng ở 254 nm [24]

 Mẫu dịch sinh học

 Phạm Thu Trang [11]: mẫu huyết tương

- Tủa protein bằng dung dịch HClO4 20%

- Điều kiện phân tích:

o Cột Rp 18e (250 x 4,6 mm, 5 µm) có bảo vệ cột, nhiệt độ cột 40°C

o Pha động: MeOH : đệm phosphat pH = 2,1 (NaH2PO4 12,5 mM, KH2PO4

5 mM; TBAH 0,06 mM) = 35 : 65, tốc độ dòng 1,5 ml/phút

o Detector: DAD λ =285 nm

 Abbas Khan và cộng sự [12]: mẫu huyết tương

- Tủa protein bằng acid tricloroacetic

- Điều kiện phân tích:

o Cột Supelco Discovery HS C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 50°C

o Pha động: ACN : methanol (50:50): dung dịch trifloroacetic (19:81), tốc

độ dòng 2 ml/phút

o Detector: UV λ = 285 nm

 Emirhan Nemutlu và cộng sự [18]: mẫu huyết tương và nước ối

- Chiết pha rắn cột polymeric sorbent (Strata X)

 Joy A McAteer và cộng sự [23]: mẫu huyết tương, định lượng đồng thời 5

cephalosporin dùng đường uống là cefixim, cephalexin, cefaclor, cephradin, cefadroxil

- Tủa protein bằng ACN

Nghiên cứu xác định cefixim trong mẫu nước bề mặt, nước ngầm, nước

uống đã được công bố [31]

- Chiết pha rắn cột SPE: Isolute EVN 100 mg

Các dược điển các nước đều có chuyên luận riêng về CFM [6,15,29]

Nghiên cứu định lượng CFM trong huyết tương cũng rất được quan tâm chú ý Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu định lượng riêng CFM hay định lượng CFM đồng thời với các chất khác [12,18,23] Tại Việt Nam, cũng đã có những nghiên cứu định lượng CFM trong huyết tương [11]

Tuy nhiên những nghiên cứu về CFM trong nước thải nhà máy còn khá ít Các quy trình định lượng CFM trong chế phẩm và huyết tương không thể áp dụng cho định lượng CFM trong nước thải nhà máy Trên thế giới, chúng tôi mới chỉ tìm thấy một nghiên cứu định lượng CFM trong nước thải bệnh viện [27] Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS, xử lý mẫu bằng chiết pha rắn Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp Tuy nhiên, hệ thống LC-MS/MS và chiết pha rắn giá thành cao, hiện nay chưa phổ biến tại Việt Nam Trong khi đó, hệ thống HPLC-DAD và chiết lỏng - lỏng khá thông dụng, dễ kiếm, dễ áp dụng tại Việt Nam Vì vậy chúng tôi xây

dựng quy trình phân tích CFM trong nước thải nhà máy với hệ thống HPLC với detector DAD

1.4 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.4.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của

sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [2]

1.4.2 Nguyên tắc

Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động Pha này là một chất lỏng được cho qua cột chứa các hạt pha tĩnh một cách liên tục Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng [1,2]

- Sắc ký lỏng - lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt chất mang rắn, đó là chất nhồi cột Quá trình lưu giữ chất phân tích liên quan đến sự phân bố giữa 2 pha lỏng

- Sắc ký pha liên kết: pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn ví dụ như silica, alumina [1,2]

1.4.4 Các thông số đặc trưng

* Hệ số phân bố K [2]

Trong đó: CS : nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh

CM: nồng độ mol của chất tan trong pha động

K càng lớn, sự di chuyển của các chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

* Thời gian lưu t R [2]

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân tích đến detector Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản chất của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH pha động

* Hệ số dung lượng k’ [2]

k’ = = K

Trong đó: K: hệ số phân bố

VS: thể tích pha tĩnh

VM: thể tích pha động Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8

* Hệ số đối xứng của pic AF [2]

a

W

2

20 / 1

AF = Trong đó: W1/20: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic,

a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Trong phép định lượng yêu cầu 0,8 ≤ AF ≤ 2

* Số đĩa lí thuyết và hiệu lực cột N [2]

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột

2 2 / 1

2

54 , 5

RA RB A

B

RA RB S

W W

t t W

W

t t R

2 / 1 2

/ 1

)(

18,1)(

WA, WB: Độ rộng của pic đo ở các đáy pic của chất A và chất B

W1/2A, W1/2B: Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic của chất

A và chất B

Các giá trị tRA, tRB ,WA, WB , W1/2A, W1/2B phải tính theo cùng đơn vị

- Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5

1.4.5 Ứng dụng của HPLC

* Định tính:

- Sự giống nhau về thời gian lưu của pic chất phân tích trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và thử là cơ sở của phép định tính Trên các máy HPLC hiện đại với detector mảng diod ta có thể quét phổ UV-VIS của pic chất phân tích trên sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử rồi chồng phổ với nhau để xác định sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match (SI- similarity index)

- Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn

- Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao

- Hệ số Match > 0,990: hai phổ tương tự nhau

- Hệ số 0,900 ≤ Match ≤ 0,990: hai phổ có những điểm tương đồng

- Hệ số Match < 0,900: hai phổ khác nhau

* Định lượng:

Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ pic của chất phân tích trong dung dịch (diện tích pic hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc ký là cơ sở của phép định lượng

Các phương pháp định lượng có thể áp dụng là:

- Phương pháp dùng chuẩn ngoại

- Phương pháp dùng chuẩn nội

- Phương pháp thêm chất chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong đó phương pháp dùng chuẩn nội là phương pháp hay được sử dụng khi nền mẫu phức tạp, phải qua quá trình xử lý mẫu Phương pháp này có nhiều

ưu điểm làm giảm thiểu sai số qua các quá trình khác nhau Đây cũng là phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này Sau đây chúng tôi xin trình bày chi tiết

về phương pháp chuẩn nội dùng trong định lượng bằng HPLC

* Phương pháp dùng chuẩn nội [1,2]

Nguyên tắc: Người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích

và trong dung dịch chuẩn đối chiếu Tỷ số diện tích pic của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn

Hai yêu cầu đối với chuẩn nội là:

- Pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic các thành phần khác (RS > 1,25)

- Pic của chất chuẩn nội phải gần với pic của chất phân tích

Ưu điểm: Phương pháp này đáng tin cậy nhất (sai số cực tiểu khoảng 0,5 – 1,0%) Sai số do quá trình tiêm mẫu cũng được loại bỏ

1.5 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CÓ TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI

Nghiên cứu của Dương Hồng Anh và cộng sự (2006) đã xây dựng được phương pháp phân tích sự có mặt của các kháng sinh họ Floquinolon trong nước thải bệnh viện Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn dùng cột silicagel tự chế tạo và định lượng được các kháng sinh ciprofloxacin, norfloxacin, levofloxacin, ofloxacin và lomefloxacin có mặt trong nước thải bệnh viện bằng HPLC với detectơ huỳnh quang Điều kiện sắc ký: cột C16, nhiệt

độ cột 50ºC, tốc độ dòng 0,7 ml/phút, bước sóng kích thích 278 nm và bước sóng

phát xạ 445 nm Hiệu suất thu hồi trong nền nước thải đạt từ 80 đến 106% và giới hạn phát hiện trong khoảng 0,5 đến 1,0 µg/L [3]

Một nghiên cứu của Dennis McQuellan và cộng sự (2002) tại New Mexico đã phát hiện ra một số chất như: chống trầm cảm, chống dị ứng, viêm, kháng sinh và hoóc môn trong nước ở nồng độ nanogam/lít Các nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp HPLC-MS để phát hiện sự tồn tại các kháng sinh Tetracyclin và nhóm Macrolid có trong các nguồn nước tự nhiên [17]

Một nghiên cứu của Carolina Quesada- Molina và cộng sự (2012) đã xây dựng phương pháp xác định đồng thời dư lượng một số kháng sinh họ Cephalosporin (cephalexin, cefoperazon, ceftiofur, cephapirin, cephalozin) có trong các nguồn nước tự nhiên bằng kỹ thuật điện di mao quản với detector DAD Điều kiện phân tích sử dụng dung dịch đệm acetat 70 mM pH 7,0, đặt trong một điện thế 22,5V ở 25ºC và sử dụng cefadroxil làm chuẩn nội Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,1 µg/L đối với cephalexin; 0,2 µg/L đối với cefoperazon, ceftiofur, cephapirin và 0,3 µg/L đối với cephazolin [16].

Trong luận văn tiến sĩ của Haomin Xu ở Trường Đại học California, Irvine (2010), tác giả cũng đã xây dựng phương pháp và đánh giá hàm lượng kháng sinh Amoxicillin, thuốc chẹn Beta, trimetropim và cimetidin có trong nguồn nước tự nhiên tại châu Âu và Mỹ Trong đó, điều kiện phân tích Amoxicillin như sau: máy HPLC Agilent 1200 với 2 detector là UV-VIS và huỳnh quang, cột C18 Phenomenex, pha động dung dịch đệm phosphat 10 mM

pH 3,0: methanol (85:15), tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; bước sóng phát hiện 230

nm Các phương pháp này đã được ứng dụng để nghiên cứu quá trình quang chuyển hoá của các hợp chất trên [20]

Nghiên cứu của Vishal Diwan và cộng sự năm 2010 đã xây dựng và đánh giá dư lượng của 7 kháng sinh: amoxicillin, ceftriaxon, amikacin, ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn và phương pháp HPLC-MS/MS Kết quả đã xây dựng được phương pháp với LOD từ 0,01 đến

2,5 ng/ml tùy thuộc vào kháng sinh Phương pháp này đã được ứng dụng để phân tích sự có mặt các kháng sinh trên ở trong nước thải bệnh viện tại một số thời điểm khác nhau [30]

1.6 TÌNH TRẠNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN

1.6.1 Vấn đề toàn cầu về kháng thuốc kháng sinh

Trên thế giới, nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh đã trở nên ngày càng kháng thuốc kháng sinh Các kháng sinh “thế hệ một” gần như không được lựa chọn trong nhiều trường hợp Các kháng sinh thế hệ mới đắt tiền, thậm chí cả một số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” cũng đang mất dần hiệu lực Bằng chứng mới đây nhất là sự lây lan của chủng vi khuẩn kháng carbapenem (ndm-1)

ở một số quốc gia Châu Âu và Châu Á Hiệu lực của kháng sinh nên được xem như một loại hàng hóa đặc biệt, cần được bảo vệ và quí trọng, không nên lãng phí vào các trường hợp không cần thiết Mục tiêu làm thế nào để kháng sinh chỉ được sử dụng cho các trường hợp nhiễm khuẩn là các trường hợp có thể điều trị bằng thuốc kháng sinh, không phải cho các trường hợp sẽ không có lợi từ việc sử dụng kháng sinh [32,33]

1.6.2 Tình trạng kháng thuốc kháng sinh ở Việt Nam

Theo báo cáo kết quả nghiên cứu ở 19 bệnh viện ở Hà Nội, TPHCM và Hải Phòng trong 2 năm (2009-2010) về tình trạng kháng thuốc kháng sinh, có 4

chủng vi khuẩn thường gặp kháng kháng sinh là Acinetobacter spp,

Pseudomonas spp, E.coli, Klebsiella Hầu hết các kháng sinh thông thường như:

penicillin, tetracyclin, streptomycin… hay như kháng sinh Cephalosporin thế hệ thứ 3 đều đã xuất hiện các khuẩn kháng thuốc

Sự kháng thuốc cao đặc biệt ở nhóm thuốc Cephalosporin thế hệ 3, 4 với

tỷ lệ kháng từ 66 - 83%, tiếp theo là nhóm kháng sinh Aminosid và Floquinolon

tỷ lệ kháng xấp xỉ trên 60% Tỷ lệ kháng imipenem năm 2009 là 35%, tăng gần

Trong điều tra về các bệnh tật cụ thể như lao, một khảo sát nghiên cứu cho

thấy khoảng 3% số ca sốt rét P.falciparum kháng các liệu pháp kết hợp

Artemisinin ở các tỉnh như Quảng Trị, Gia Lai và Đắc Nông Hậu quả là có khoảng 5.900 ca nhiễm lao đa kháng thuốc, gây 1.800 ca tử vong mỗi năm

Còn chương trình Giám sát sự lây lan của HIV kháng thuốc tại TPHCM

năm 2008 đã ghi nhận khoảng 5-15% số người đã kháng lại các loại thuốc kháng

vi rút, thậm chí trước khi bắt đầu phác đồ điều trị…

Đó là những nguyên nhân chính khiến Tổ chức Y tế thế giới (WHO) xếp Việt Nam vào danh sách các nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới [8,32,33]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Sử dụng nước thải nhà máy dược phẩm của công ty Mediplantex – một trong những công ty có dây chuyền sản xuất các cephalosporin trong đó có CFM làm nền mẫu trong nghiên cứu này Vị trí lấy mẫu là tại vòi nước thải đổ ra môi trường (nước thải sau khi xử lý)

Mẫu trắng (mẫu placebo): mẫu nước thải của công ty Mediplantex cách ngày sản xuất CFM ít nhất 7 ngày

Mẫu thử: mẫu nước thải của công ty dược vào ngày có sản xuất cefixim Mẫu tự tạo: Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc có chứa 50 µg CFM/ml vào bình định mức 100 ml, thêm mẫu nước thải trắng đến vừa đủ thể tích, lắc đều thu được dung dịch mẫu tự tạo có chứa 500 ng CFM/ml

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn

Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu :

Các chất chuẩn:

- Cefixim: Chuẩn quốc gia, SKS: 0105192, hàm lượng 98,88%, độ ẩm 10,57%, nơi sản xuất Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

- Cefdinir (chuẩn làm việc): hàm lượng 99,6%, độ ẩm 2,42%

- Cefuroxim natri, cefadroxil, cefoperazon: chuẩn làm việc

Thuốc thử, dung môi sử dụng trong nghiên cứu như sau:

- Acetonitril, methanol loại tinh khiết cho HPLC, nơi sản xuất Merck, Đức

- Dicloromethan, cloroform, diethyl ether, cyclohexan, acid phosphoric đậm đặc, natri dihydrophosphat, acid hydroclorid đậm đặc loại PA, nơi sản xuất Merck, Đức

- Giấy thử pH, nơi sản xuất Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

a Hệ thống HPLC Merck - Hitachi b Một số chất chuẩn – hóa chất

c Mẫu nước thải của nhà máy Mediplantex Hình 2.1 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ

- Cân phân tích Sartorius CP 224S (d = 0,01 mg, e = 0,1 mg) (Thụy Sĩ)

- Máy li tâm Hettich zentrifugen (Đức)

- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Merck – Hitachi với detector DAD, phần mềm Multi-system manager, Interface D7000, Nhật Bản

- Dụng cụ thủy tinh các loại

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

- Mục đích : tìm được loại dung môi, tỉ lệ dung môi xử lý mẫu có tỷ lệ thu hồi cao, loại được nhiều tạp chất

- Tiến hành xử lý mẫu thử chứa CFM bằng các cách khác nhau Định lượng hoạt chất theo quy trình đã lựa chọn Đánh giá và tìm ra cách xử lý phù hợp

2.3.2 Xây dựng điều kiện sắc ký

Nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát lựa chọn chuẩn nội và các điều kiện sắc ký về cột sắc ký, thành phần và tốc độ pha động, thể tích tiêm mẫu trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD nhằm lựa chọn được điều kiện sắc ký phù hợp nhất để xác định dư lượng kháng sinh CFM có trong nước thải (pic đẹp, tách được một số cephalosporin khác, LOD đạt yêu cầu)

2.3.3 Đánh giá phương pháp

Xử lý các mẫu nghiên cứu theo phương pháp đã xây dựng, tiến hành sắc ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu: tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, độ tuyến tính, độ đúng và độ chính xác, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [21]

 Tính thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời

gian lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 1 mẫu chuẩn 6 lần liên tiếp

Yêu cầu: RSD về thời gian lưu và diện tích pic < 2%; độ phân giải của pic CFM

và chuẩn nội > 1,5 Số đĩa lý thuyết của CFM > 5000

 Độ đặc hiệu: Trên sắc ký đồ, mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời

gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu chuẩn nội; nếu có đáp ứng pic phải < 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tính

 Độ tuyến tính: Đáp ứng phân tích thu được tỷ lệ với nồng độ (trong

khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử

Xây dựng đường chuẩn ít nhất 6 điểm (X1 đến Xn) của dung dịch có chứa chất chuẩn CFM ở trong khoảng nồng độ phù hợp và chất chuẩn nội ở một nồng

Độ đúng và độ chính xác: Độ đúng là sự đồng nhất giữa giá trị tìm thấy

với giá trị thực hoặc giá trị đối chiếu được chấp nhận Độ chính xác là sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả Độ chính xác có thể chia làm 3 cấp độ: Độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ tái lặp Chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian

Độ đúng của phương pháp được tiến hành theo quy trình phân tích trên mẫu

tự tạo chứa lượng hoạt chất đã biết trước hàm lượng Tiến hành trên 3 điểm nồng độ: LQC (bằng khoảng 2 - 3 lần LLOQ), MQC (khoảng 40 - 60% ULOQ) và HQC (khoảng 80 - 90% ULOQ) Tại mỗi mức nồng độ phân tích 6 mẫu độc lập Tính RSD để xác định độ lặp lại của phương pháp Tính tỉ lệ chuẩn thu hồi lại

được và lượng chuẩn thờm vào để cú được độ đỳng của phương phỏp Tiến hành lặp lại quy trỡnh trờn vào một ngày khỏc Tại mỗi nồng độ, xỏc định giỏ trị RSD của 12 mẫu độc lập để xỏc định độ chớnh xỏc trung gian của phương phỏp

Yờu cầu: Theo AOAC [28]:

- Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: độ thu hồi từ 80 – 110 %, RSD ≤ 15%

- Nồng độ từ 10 – 100 ng/ml: độ thu hồi từ 60 – 115 %, RSD ≤ 21%

 Khảo sỏt giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng

- Giới hạn phỏt hiện (LOD) của CFM được xỏc định dựa vào hệ số gúc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của đỏp ứng

Dựa vào độ lệch chuẩn của đỏp ứng và độ dốc: giới hạn phỏt hiện được tớnh theo cụng thức sau:

3,3 Sc LOD  -

Trong đó: SC là độ lệch chuẩn của đáp ứng intercept

a là độ dốc của đ-ờng chuẩn: Y = aX + b

- Giới hạn định lượng (LOQ) được tớnh bằng 3,3 lần giới hạn phỏt hiện

2.3.4 Phương phỏp xử lý số liệu

Cỏc kết quả thống kờ được tớnh dựa vào cỏc hàm trong Microsoft Excel

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

Qua tham khảo tài liệu, cefixim có giá trị log Poctanol/nước = -0,64 nên việc chuyển CFM từ pha nước (nước thải) sang pha dung môi là khá khó khăn Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu với mục đích loại tạp chất tan trong dung môi hữu

cơ, CFM vẫn ở trong pha nước Cụ thể, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát để lựa chọn dung môi xử lý mẫu, lượng dung môi và điều kiện xử lý phù hợp để tìm ra quy trình xử lý mẫu sạch nhất, tỷ lệ thu hồi cao, dễ thực hiện Kết quả khảo sát được đánh giá qua hiệu suất xử lý mẫu: lượng CFM tính được trong mẫu sau xử

lý so sánh với lượng CFM thêm vào mẫu nước thải

3.1.1.1 Khảo sát xử lý mẫu có sử dụng dung môi acetonitril

Giai đoạn đầu của nghiên cứu, chúng tôi khảo sát xử lý mẫu nước thải chứa CFM với 3 dung môi: dicloromethan, diethyl ether, cloroform với cùng tỷ lệ mẫu thử : acetonitril : dung môi = (5 : 1 : 3)

Chuẩn bị các mẫu chuẩn:

- Dung dịch chuẩn gốc (CFM 50 µg/ml trong nước cất): Cân chính xác khoảng 25 mg CFM hòa tan trong vừa đủ 500 ml nước cất

- Dung dịch chuẩn: pha loãng mẫu chuẩn gốc trong nước cất để được nồng

độ CFM 500 ng/ml

 Tiến hành:

- Lần lượt xử lý mẫu thử với từng dung môi trong 3 dung môi dicloromethan, cloroform, diethyl ether

- Xử lý mẫu: Mẫu tự tạo được acid hóa với HCl 1N đến pH khoảng bằng 3,

thử bằng giấy chỉ thị màu pH Lấy chính xác 5 ml dung dịch thử vào các ống

nghiệm, thêm 1 ml acetonitril (ACN), lắc xoáy trong 30 giây, đem ly tâm tốc độ

3000 vòng/phút trong 3 phút, lấy dịch trong nổi phía trên Thêm 3 ml dung môi

chiết lắc trong 5 phút, để cho tách lớp Lấy lớp nước (đối với dicloromethan,

cloroform lấy dịch phía trên, đối với diethyl ether lấy dịch phía dưới) ly tâm nếu

cần, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Dung dịch chuẩn: mẫu chuẩn được lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký đã chọn

Kết quả thu được như Hình 3.1 và Bảng 3.1

Bảng 3.1 Khảo sát lựa chọn dung môi xử lý mẫu Dung dịch

chuẩn

Xử lý bằng Dicloromethan

Xử lý bằng Cloroform

Xử lý bằng Diethyl ether

a Xử lý mẫu với dicloromethan: ACN c Xử lý mẫu với diethyl ether : ACN b Xử lý mẫu với cloroform:ACN

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lý mẫu

Nhận xét: Cả 3 dung môi đều dễ tách lớp, không bị nhũ hóa trong quá trình xử

lý mẫu Quá trình xử lý mẫu tương đối dễ dàng và tốn ít thời gian Mẫu xử lý với

dicloromethan và diethyl ether tương đối sạch Mẫu xử lý với dicloromethan cho

hiệu suất cao nhất, trong khi mẫu xử lý với cloroform và diethyl ether cho tỷ lệ thu hồi thấp

Qua khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy xử lý bằng dicloromethan cho tỷ lệ thu hồi cao nhất mà nền mẫu vẫn đạt yêu cầu Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ thể tích của mẫu thử, ACN, dicloromethan để có thể nâng cao được tỷ lệ thu hồi

Chuẩn bị các dung dịch tự tạo và chuẩn như phần 3.1.1.1

 Tiến hành :

- Xử lý mẫu thử với tỉ lệ dung môi dicloromethan khác nhau Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 tỉ lệ về thể tích của mẫu thử, ACN, dicloromethan như sau : + Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 : 2)

+ Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 : 3)

+ Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 : 4)

- Các bước tiến hành như mục 3.1.1.1

- Kết quả thu được như ở Hình 3.2

Nhận xét: Với cả 3 tỉ lệ dung môi xử lý mẫu khác nhau, các mẫu đều không bị

nhũ hóa, dễ dàng tách lớp Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:2), nền mẫu vẫn còn nhiều tạp chất, tỷ lệ thu hồi thấp Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:4), nền mẫu sạch tuy nhiên tỷ lệ thu hồi thấp Với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:3), nền mẫu sạch, tỷ lệ thu hồi đạt 80,76%

Tuy nhiên, chiết bằng dicloromethan và ACN với tỉ lệ mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5:1:3) đáp ứng phân tích vẫn chưa được cao Chúng tôi nhận thấy nguyên nhân đó là do ACN được cho vào với mục đích giúp loại protein, tuy nhiên chính dung môi này lại làm pha loãng mẫu (do ACN là dung môi đồng tan với nước), do đó làm giảm đáng kể đáp ứng phân tích của quá trình chiết (dù

đã thay đổi các dung môi và các tỷ lệ khác nhau)

a Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :2)

b Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :3)

c Mẫu thử : ACN : dicloromethan = (5 : 1 :4) Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn lượng dung môi xử lý mẫu

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu không sử dụng acetonitril

Qua phân tích nguyên nhân làm giảm hiệu suất của quá trình xử lý mẫu trên, chúng tôi tiếp tục khảo sát điều kiện xử lý mẫu bằng cách không sử dụng ACN và lựa chọn một dung môi hoàn toàn không đồng tan với nước để xử lý Trong giai đoạn khảo sát điều kiện xử lý mẫu này, chúng tôi đồng thời khảo sát hiệu suất thu hồi 4 cephalosporin khác (cefdinir, cefuroxim, cefadroxil và cefoperazon) để có thể lựa chọn một chuẩn nội phù hợp Các dung môi được lựa chọn cho khảo sát đó là cloroform (CRF), diethyl ether (DEE) và cyclohexan

(CHX); điều kiện xử lý mẫu hoặc giữ nguyên hoặc acid hóa về pH 3,0; tỷ lệ mẫu thử: dung môi để khảo sát là (4:4) và (5:3)

Quy trình xử lý mẫu như sau: Hút mẫu thử và dung môi với tỷ lệ phù hợp, lắc xoáy trong vòng 10 phút Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/giờ trong 5 phút Sau

đó lấy nước lớp bên trên (xử lý mẫu bằng CRF) hoặc lấy lớp nước ở dưới (xử lý mẫu bằng DEE hoặc CHX), lọc qua màng lọc 0,45µm và tiến hành sắc ký theo các điều kiện ở mục 3.1.3 (đối với cefixim, cefdinir, cefuroxim sử dụng bước sóng 285 nm để phát hiện, đối với cefadroxil và cefoperazon sử dụng bước sóng

260 nm để phát hiện)

Kết quả được trình bày theo các bảng và hình sau:

(a) Xử lý với DEE tỷ lệ 5:3 không acid