Xây dựng phương pháp định lượng pseudophedrin và loratadin trong viên phóng thích có kiểm soát bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Ứng dụng phương pháp phân tích trong xác định hàm lượng viên phóng thích có kiểm soát chứa Pseudoephedrin và Loratadin .... Phương pháp này cho phép vừa tách, định tính, định lượng đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỮU TIẾN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PSEUDOEPHEDRIN VÀ LORATADIN

TRONG VIÊN PHÓNG THÍCH CÓ KIỂM SOÁT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HỮU TIẾN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PSEUDOEPHEDRIN VÀ LORATADIN

TRONG VIÊN PHÓNG THÍCH CÓ KIỂM SOÁT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS TS

Nguyễn Thị Kiều Anh và ThS Đinh Thị Hải Bình, những người Thầy đã

trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết giúp tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô, anh chị Phòng kiểm nghiệm, phân tích và tương đương sinh học - Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận văn này

Xin gởi lời biết ơn tới Ban giám hiệu trường đại học dược Hà Nội, các Thầy Cô đã trực tiếp tham gia giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, những người luôn sát cánh động viên, ủng hộ giúp tôi hoàn thành khóa học và luận văn tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 21 tháng 08 năm 2013

Học viên Nguyễn Hữu Tiến

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

Danh mục các bảng, biểu

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương I: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ PSEUDOEPHEDRIN VÀ LORATADIN 3

1.1.1 Tổng quan về Pseudoephedrin (PSE) 3

1.1.2.Tổng quan về Loratadin (LOR) 8

1.1.3 Một số phương pháp định lượng đồng thời PSE và LOR 12

1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 15

1.2.1 Nguyên tắc và phân loại 15

1.2.2 Các thông số đặc trưng 15

1.2.3 Các phương pháp định lượng bằng HPLC 19

1.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘ HÒA TAN IN VITRO 20

1.3.1 Khái niệm 20

1.3.2 Phương pháp thử 20

1.3.3 Ý nghĩa của giải phóng dược chất in vitro 21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Dung môi, hóa chất 24

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 24

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 25

2.2.2 Thẩm định phương pháp 25

2.2.3 Ứng dụng phương pháp phân tích trong xác định hàm lượng viên phóng thích có kiểm soát chứa Pseudoephedrin và Loratadin 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời Pseudoephedrin và Loratadin bằng HPLC 26

2.3.2 Ứng dụng phương pháp định lượng Pseudoephedrin và Loratadin trong viên phóng thích có kiểm soát 28

2.3.3 Tính toán và xử lý số liệu 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 CHUẨN BỊ MẪU 35

3.1.1 Mẫu chuẩn 35

3.1.2 Mẫu thử 35

3.2 LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 37

3.2.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu 37

3.2.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 37

3.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 44

3.3.1 Độ thích hợp của hệ thống 44

3.3.2 Độ chọn lọc 45

3.3.3 Độ tuyến tính 48

3.3.4 Độ chính xác 49

3.3.5 Độ đúng 52

3.4 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TIÊU CHÍ CỦA VIÊN VN_CLARINASE 54

3.4.1 Độ đồng đều hàm lượng 54

3.4.2 Định lượng 55

3.4.3 Độ hòa tan 57

3.4.4 Đánh giá giải phóng hoạt chất in vitro viên phóng thích có kiểm soát chứa PSE và LOR 57

Chương 4 BÀN LUẬN 66

4.1 Về phương pháp HPLC 66

4.2 Về thẩm định phương pháp phân tích 68

4.3 Về ứng dụng của phương pháp phân tích 70

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

Kết luận 72

Kiến nghị 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

AHP Amoni dihydrophosphat

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography) LOR Loratadin

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

1.1 Một số nghiên cứu định lượng PSE bằng HPLC 6

1.2 Một số nghiên cứu định lượng LOR bằng HPLC 10

1.3 Một số nghiên cứu định lượng đồng thời PSE và LOR

3.4 Kết quả độ thích hợp hệ thống sắc ký của PSE và LOR 45

3.5 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của PSE và LOR 48

3.6 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 50

3.7 Kết quả đánh giá độ chính xác khác ngày của phương

pháp

51

3.8 Kết quả thẩm định độ đúng của PSE và LOR 53

3.9 Kết quả đánh giá độ đồng đều hàm lượng về LOR của

viên Clatadin B

55

3.10 Kết quả định lượng PSE và LOR trong viên Clatadin B 56

3.11 Kết quả thử độ hòa tan của chế phẩm Clatadin B 57

3.12 Kết quả đánh giá độ hòa tan in vitro của chế phẩm thử

3.14 Kết quả đánh giá độ hòa tan in vitro của chế phẩm thử

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

3.1 Sắc ký đồ khảo sát loại cột sắc ký 38

3.2 Đồ thị biễu diễn sự thay đổi thời gian lưu của píc PSE và

LOR khi thay đổi tỷ lệ pha động

40

3.3 SKĐ mẫu chuẩn với chương trình dung môi 41

3.4 SKĐ chạy đẳng dòng có chất tạo cặp ion 42

3.5 Phổ hấp thụ UV của PSE (a) và LOR (b) 43

3.6 Sắc ký đồ các mẫu thẩm định tính chọn lọc của phương

pháp

47

3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện

tích píc và nồng độ của PSE và LOR

49

3.9 Đường biểu diễn tốc độ giải phóng hoạt chất trung bình

của viên thử (T) và viên đối chiếu (R) ở pH 1,2

64

3.10 Đường biểu diễn tốc độ giải phóng hoạt chất trung bình

của viên thử (T) và viên đối chiếu (R) ở pH 4,5

64

3.11 Đường biểu diễn tốc độ giải phóng hoạt chất trung bình

của viên thử (T) và viên đối chiếu (R) ở pH 6,8

65

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm mũi dị ứng là bệnh lý khá phổ biến ở các nước nhiệt đới gió mùa hay nước có nền công nghiệp đang phát triển do môi trường ô nhiễm có nhiều kháng nguyên lạ như ở Việt Nam Việc phối hợp nhiều hoạt chất trong điều trị cho thấy hiệu quả rõ rệt và cải thiện đáng kể các triệu chứng của viêm mũi

dị ứng Loratadin là một thuốc kháng histamin thế hệ II có tác dụng làm giảm triệu chứng của viêm mũi dị ứng do giải phóng histamin, pseudoephedrin là một chất có tác dụng co mạch làm giảm xung huyết hữu hiệu Việc kết hợp 2 chất này trong một dạng bào chế đem lại tác dụng chữa viêm mũi dị ứng hiệu quả Tuy nhiên, sự khác biệt về độ tan và thời gian bán thải của hai dược chất này khác nhau đáng kể nên bào chế dạng quy ước có hiệu quả không cao Trên thị trường hiện có một số chế phẩm Claritin-D, Clarinase là sản phẩm của nước ngoài (Schering-Plough) được bào chế ở dạng viên giải phóng có

kiểm soát Đề tài nghiên cứu Khoa học và Công nghệ cấp bộ “ Nghiên cứu

bào chế và đánh giá sinh khả dụng viên phóng thích có kiểm soát chứa Pseudoephedrin và Loratadin ” đã nghiên cứu sản xuất thành công dạng bào chế nói trên với tên gọi Clatadin B Do đó việc nghiên cứu xây dựng một tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm bào chế mới này là rất cần thiết

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một trong những phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm dược phẩm Phương pháp này cho phép vừa tách, định tính, định lượng đồng thời chất phân tích trong cùng một phép thử với độ chọn lọc và chính xác cao nên thường được xem là phương pháp “trọng tài” khi cần đánh giá các phương pháp khác

Để góp phần tiêu chuẩn hóa chế phẩm viên bao Clatadin B, đặc biệt là có một phương pháp định lượng đồng thời pseudoephedrin và loratadin với thời

gian ngắn, độ chính xác cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng

phương pháp định lượng Pseudoephedrin và Loratadin trong viên phóng thích có kiểm soát bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp định lượng Pseudoephedrin và Loratadin trong viên phóng thích có kiểm soát bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

2 Ứng dụng đánh giá chất lượng độ đồng đều hàm lượng đối với

Loratadin, định lượng, thử độ hòa tan, độ hòa tan in vitro viên phóng thích có

kiểm soát chứa Pseudoephedrin và Loratadin

Chương I TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ PSEUDOEPHEDRIN VÀ LORATADIN

1.1.1 Tổng quan về Pseudoephedrin

1.1.1.1 Cấu tạo hóa học

- Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C10H15NO

- Khối lượng phân tử: 165,23

- Tên khoa học: (S,S)-2-methylamino-1-phenylpropan-1-ol

- Pseudoephedrin (PSE) dược dụng thường ở dạng muối Pseudoephedrin hydrochlorid ( công thức phân tử: C10H15NO.HCl, khối lượng phân tử 201,7) và Pseudoephedrin sulfat (công thức phân tử: (C10H15NO)2.H2SO4, khối lượng phân tử 428,54) [15], [16], [38]

1.1.1.2 Tính chất vật lý – hóa lý

- Cảm quan: Tinh thể trắng, không màu hoặc gần như không màu

- Tính tan: tan tự do trong nước, alcohol; khó tan trong dicloromethan

- Hấp thụ UV: dung dịch PSE trong ethanol hấp thụ cực đại tại các bước sóng 208 nm, 251 nm, 237 nm và 264 nm

nhiều so với ephedrin về những tác dụng làm nhịp tim nhanh, tăng huyết áp tâm thu cũng như gây kích thích hệ thần kinh trung ương [3], [12]

b Dược động học

- Hấp thu: PSE hấp thu gần như hoàn toàn qua đường tiêu hóa và không

có bằng chứng của chuyển hóa lần một qua gan Khi uống với liều 60-120 mg thì đạt nồng độ tối đa trong huyết tương 180-300 ng/ml hoặc 397-422 ng/ml, tương ứng với thời gian khoảng 1,39-2 giờ hoặc 1,84-1,97 giờ Hấp thu từ dạng giải phóng kéo dài chậm hơn và đạt nồng độ cực đại sau 3,8-6,1 giờ Thức ăn làm chậm hấp thu thuốc khi uống dưới dạng dung dịch nhưng không ảnh hưởng khi uống dưới dạng giải phóng kéo dài

- Phân bố: Mặc dù thiếu những bằng chứng cụ thể, PSE được dự đoán qua được hàng rào nhau thai Khoảng 0,5% liều khi sử dụng bằng đường uống được phân bố trong sữa mẹ trong 24 giờ Thể tích phân bố VD = 2-3 l/kg

- Chuyển hóa: PSE bị chuyển hóa một phần qua gan (< 1%) bởi phản ứng khử methyl thành dạng không hoạt tính

- Thải trừ: PSE được bài tiết qua thận, 55-96% liều dùng được bài tiết ở dạng chưa chuyển hóa Thời gian bán thải của PSE trong nước tiểu pH 5 là 3-

6 giờ, trong nước tiểu pH 8 là 9-16 giờ [3], [12], [28]

c Chỉ định

PSE làm giảm các triệu chứng đi kèm với viêm mũi dị ứng và chứng cảm lạnh thông thường bao gồm nghẹt mũi, ngứa, chảy nước mũi, chảy nước

mắt, hắt hơi [3], [12]

d Chống chỉ định

Những người có rối loạn lưỡng cực nên sử dụng cẩn thận khi dùng pseudoephedrin, vì nó có thể gây ra chứng mất ngủ và do đó kích hoạt một giai đoạn hưng cảm

Bệnh nhân tăng huyết áp nặng hoặc bệnh mạch vành trầm trọng, bệnh nhân đã và đang dùng các thuốc chống trầm cảm ức chế monoamino oxydase trong vòng 2 tuần trước đó Dùng đồng thời pseudoephedrin với các loại thuốc này đôi khi có thể gây tăng huyết áp

Bệnh nhân có tiền sử dị ứng với pseudoephedrin [3], [12]

β-Giảm huyết áp khi dùng kèm các thuốc như: methyldopa, reserpin,

mecamylamin hydrochlorid, veratrum alcaloid [3], [12]

1.1.1.4 Một số phương pháp định lượng PSE

-Pha động : Chương trình dung môi với kênh

A : dd acid acetic 0,06%/nước; kênh B: dd acid acetic 0,06%/ACN Chương trình dung môi : thời gian (phút)/% kênh B: 0,01/1 ; 1,5/1; 3,5/40; 3,51/99; 3,59/99; 4,0/1; 5,0/1

- Nhiệt độ cột: 45 0C -Detector MS

-Tốc độ dòng : 1ml/phút Thể tích tiêm : 25 μl -LOQ : 1,25 ng/ml

Viên nén quy ước

-Detector UV-VIS : λ=240 nm

-Tốc độ dòng : 1ml/phút -Khoảng tuyến tính : 12-72 μg/ml

Viên nén quy ước

- Nhiệt độ cột: 40 0C -Detector UV-VIS : λ=242 nm

-Tốc độ dòng : 1ml/phút -Khoảng tuyến tính : 360 - 7200 μg/ml -LOQ : 1,4 μg/ml

Viên nén quy ước

b Các phương pháp khác

Pseudoephedrin còn được định lượng bằng các phương pháp:

- Chuẩn độ acid – base trong môi trường khan với dung dịch HClO4

0,1M (đối với nguyên liệu) [15], [38]

- Quang phổ đạo hàm (đối với dạng viên nén) [36]

- Quang phổ huỳnh quang thông qua dẫn xuất với nitrobenzofurazan (đối với các dạng viên nén, viên nang, siro) [13]

4-cloro-7-1.1.2 Tổng quan về Loratadin

1.1.2.1 Cấu tạo hóa học

- Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử: C22H23ClN2O2

- Khối lượng phân tử: 328,88

- Tên khoa học: Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H

benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-yliden) -1-piperidinecarboxylat [38]

1.1.2.2 Tính chất vật lý – hóa lý

- Cảm quan: Tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng

- Tính tan: Tan tốt trong aceton, cloroform, methanol, toluen Gần như không tan trong nước

trên thần kinh trung ương LOR thuộc nhóm thuốc đối kháng thụ thể H1 thế

hệ thứ hai (không an thần)

LOR có tác dụng làm nhẹ bớt triệu chứng của viêm mũi và viêm kết mạc dị ứng do giải phóng histamin LOR còn có tác dụng chống ngứa và nổi mày đay liên quan đến histamin

LOR không phân bố vào não khi dùng thuốc với liều thông thường nên không có tác dụng an thần, ngược với tác dụng phụ an thần của các thuốc kháng histamin thế hệ thứ nhất

Ðể điều trị viêm mũi dị ứng và mày đay, LOR có tác dụng nhanh hơn astemizol và có tác dụng như azatadin, cetirizin, clopheniramin, clemastin, terfenadin và mequitazin… LOR có tần suất tác dụng phụ, đặc biệt đối với hệ thần kinh trung ương thấp hơn những thuốc kháng histamin thuộc thế hệ thứ hai khác

Vì vậy, LOR dùng ngày một lần, tác dụng nhanh, đặc biệt không có tác dụng an thần, là thuốc lựa chọn đầu tiên để điều trị viêm mũi dị ứng hoặc mày

đay dị ứng [3]

b Dược động học

- Hấp thu: LOR hấp thu nhanh sau khi uống Nồng độ đỉnh trong huyết tương trung bình của LOR và chất chuyển hóa có hoạt tính của nó (descarboethoxyloratadin) tương ứng là 1,5 và 3,7 giờ 97% LOR liên kết với protein huyết tương Sau khi uống LOR, tác dụng kháng histamin của thuốc xuất hiện trong vòng 1 - 4 giờ, đạt tối đa sau 8 - 12 giờ, và kéo dài hơn 24 giờ Nồng độ của LOR và descarboethoxyloratadin đạt trạng thái ổn định ở phần lớn người bệnh vào khoảng ngày thứ năm dùng thuốc

- Phân bố: Ở liều điều trị thuốc không qua hàng rào máu não nên không phân bố vào não.Thể tích phân bố của thuốc là 80 - 120 lít/kg

- Chuyển hóa: LOR chuyển hóa nhiều khi qua gan lần đầu bởi hệ enzym microsom cytochrom P450; LOR chủ yếu chuyển hóa thành descarboethoxyloratadin, là chất chuyển hóa có tác dụng dược lý

- Thải trừ: Khoảng 80% tổng liều của LOR bài tiết ra nước tiểu và phân ngang nhau, dưới dạng chất chuyển hóa, trong vòng 10 ngày Nửa đời của LOR là 17 giờ và của descarboethoxyloratadin là 19 giờ Nửa đời của thuốc biến đổi nhiều giữa các cá thể, không bị ảnh hưởng bởi urê máu, tăng lên ở

người cao tuổi và người xơ gan [2], [3], [12]

1.1.2.4 Một số phương pháp định lượng LOR

phosphat 0,05 M, Acetonitril,

Nguyên liệu

Methanol, Triethylamin (38:45:17:0.5) chỉnh về pH 3,6 Chương trình dung môi : thời gian (phút)/% kênh B:

0,01/0, 5/0, 9/20, 13/40, 17/70, 20/90, 25/100, 30/100, 35/70, 40/50, 45/20, 50/0 và 60/0

-Detector UV-VIS : λ=220 nm

-Tốc độ dòng : 1ml/phút -Thể tích tiêm : 50μl [25] Hypersil C8

[30] Cột C8 (150 x

4,6 mm, 5 μm)

-Pha động : Đệm phosphat 0,1M:

Methanol : Acetonitril (1:2:1) -Detector UV-VIS : λ=254 nm

-Tốc độ dòng : 1 ml/phút -Thể tích tiêm : 20 μl

Viên nén quy ước

-LOQ : 0,1%

Nguyên liệu, viên nén

-Tốc độ dòng : 0,3 ml/phút -Khoảng tuyến tính : 0,10–20,2 ng/ml -LOQ : 0,10 ng/ml

Huyết tương

b Các phương pháp khác

Loratadin còn được định lượng bằng các phương pháp :

- Chuẩn độ acid-base trong môi trường khan với dung dịch HClO4 0,1M (đối với dạng nguyên liệu) [15]

- Điện di mao quản ( đối với dạng viên nén) [29]

- Phương pháp cực phổ (đối với dạng viên nén) [35]

1.1.3 Một số phương pháp định lượng đồng thời PSE và LOR

a Phương pháp HPLC

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu định lƣợng đồng thời PSE và LOR bằng

Viên nén quy ƣớc

-Detector UV-VIS : λ = 250 nm

-Tốc độ dòng : 1,5 ml/phút

- Khoảng tuyến tính: 0,1-100 μg/ml (LOR) và 10-600 μg/ml (PSE)

Viên giải phóng kéo dài

b Các phương pháp khác

Bên cạnh phương pháp HPLC, M.M Mabrouk và cộng sự cũng tiến hành định lượng các chế phẩm chứa đồng thời LOR và PSE bằng phương pháp quang phổ đạo hàm Khoảng nồng độ tuyến tính là 5-25 μg/ml đối với LOR và 240-720 μg/ml đối với PSE.sulfat [27]

Tương tự, Singhvi I và Bhatia N đã nghiên cứu định lượng đồng thời PSE và LOR bằng phương pháp đo quang tại nhiều bước sóng (257 nm và

283 nm) và phương pháp pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất [34]

Feyyaz Onur và cộng sự đã tiến hành định lượng đồng thời PSE.sulfat, LOR và dexbrompheniramin maleat trong viên nén theo phương pháp quang phổ đạo hàm và quang phổ đạo hàm tỷ đối Khoảng nồng độ tuyến tính trong

cả hai phương pháp là 5 - 40 μg/ml đối với LOR và 192 - 1152 μg/ml đối với PSE [17]

Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Hải Bình, Lê Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thanh Hải đã nghiên cứu định lượng đồng thời LOR và PSE.sulfat bằng phương pháp quang phổ đạo hàm bậc nhất Khoảng tuyến tính khảo sát với LOR là 5-

50 μg/ml và của PSE.sulfat là 180-1000 μg/ml [10]

Lê Minh Trí và cộng sự đã xây dựng phương pháp quang phổ đạo hàm

để định lượng PSE.sulfat và LOR trong viên nén Khoảng tuyến tính khảo sát với LOR là 15 - 35 μg/ml và của PSE.sulfat là 36 - 84 μg/ml [11]

1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.2.1 Nguyên tắc và phân loại

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao

Pha tĩnh có thể là chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân, chất lỏng được bao trên bề mặt một chất rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ

Tùy thuộc vào bản chất các pha, kỹ thuật và phương tiện sắc ký mà người ta phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau : Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học Trong đó, sắc ký lỏng phân bố được sử dụng phổ biến nhất hiện

nay [4], [6], [7]

1.2.2 Các thông số đặc trưng

1.2.2.1 Thời gian lưu ( t R )

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại

Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là xác định Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố:

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp của hạt nhồi

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động, nồng độ chất tạo phức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá

Trong đó: CS: là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh

CM: là nồng độ mol của chất tan trong pha động

K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn

S t t V

K

k'

Trong đó: K : hệ số phân bố

VS, VM : thể tích pha tĩnh và pha động

tR, tM : thời gian lưu của chất cần phân tích và chất không lưu giữ Cần chọn điều kiện sắc ký sao cho k’ nằm trong khoảng 1≤ k’≤8 [4], [6], [7], [9], [32]

1.2.2.5 Số đĩa lý thuyết N

Là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký

2 2 / 1

2 2

2

54 , 5 16

W

t W

t

Trong đó: W: Chiều rộng đo ở đáy píc

W1/2: chiều rộng đo ở nửa chiều cao píc

Nếu N quá nhỏ thì không có sự tách của các chất, nếu N quá lớn thì các píc sắc ký tách quá xa nhau, rửa giải tốn nhiều dung môi Theo thực tế, trong hầu hết các hỗn hợp mẫu, N nằm trong khoảng 3500-7500 cho 1 mét cột là vừa đủ [4], [6], [7], [9], [32]

Nếu gọi L là chiều dài của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết được tính bằng công thức:

H=

N L

1.2.2.6 Độ phân giải R S

Để đánh giá độ tách của các chất được rửa giải liên tiếp nhau trong một

hệ pha, người ta dùng đại lượng độ phân giải RS

A B

RA RB A

B

RA RB S

W W

t t W

W

t t R

2 / 1 2

/ 1

)(

18,1)(

2

Trong đó:

tRA , tRB: thời gian lưu của 2 píc liền kề nhau (của chất A và B) (phút hoặc giây)

WA, WB: độ rộng píc đo ở các đáy píc (phút hoặc giây)

W1/2A, W1/2B: độ rộng píc đo ở nửa chiều cao píc (phút hoặc giây) Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5 [4], [6], [7], [9], [32]

1.2.3 Các phương pháp định lượng bằng HPLC

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó

Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dựng trong sắc ký là :

+ Phương pháp chuẩn ngoại : là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện Kết quả của chất chưa được biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết nồng độ và đáp ứng của chất phân tích ( diện tích hay chiều cao píc) của mẫu chuẩn và mẫu thử

+ Phương pháp chuẩn nội : thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất được thêm này gọi là chuẩn nội Từ những dữ kiện về diện tích (chiều cao) píc và nồng độ của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thể xác định được hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử

+ Phương pháp thêm chuẩn : chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC khi có vấn đề ảnh hưởng của các chất phụ (ví dụ : tá dược) Dung dịch mẫu thử được thêm vào một lượng xác định chất chuẩn Các píc thu được của hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn phải được đo trong cùng điều kiện sắc ký Kết quả được tính toán dựa trên sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích hoặc chiều cao píc

+ Phương pháp chuẩn hóa diện tích : nồng độ của mẫu thử được tính toán dựa trên diện tích píc tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích píc chất thử trên tổng diện tích toàn bộ píc có trong sắc ký đồ Trong HPLC, phương pháp này chỉ đúng khi có sự đáp ứng của detector trên các chất là như nhau, nếu không như nhau khi đó với mỗi chất cần có một hệ số hiệu chỉnh [4],[6]

1.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘ HÒA TAN IN VITRO

khuấy dùng cho viên nén, viên nang và một số dạng thuốc khác [38]

1.3.2 Phương pháp thử

- Thiết bị : máy thử độ hòa tan thích hợp

- Môi trường hòa tan : Tùy theo đặc điểm hòa tan của dược chất, khi cần có thể dùng đệm phosphat pH 4-8 hoặc acid hydrocloric loãng (0,001-0,1M) Dung tích thường dùng 500-1000ml (không nhỏ hơn 3 lần độ bão hòa của dược chất) Một số chất làm tăng độ tan có thể cho vào môi trường hòa tan (như chất diện hoạt)

- Thời gian thử : tùy từng chế phẩm đối với viên phóng thích có kiểm soát

- Tốc độ khuấy : từ 50-100 vòng/phút

- Phương pháp định lượng : tùy vào đặc tính của dược chất có thể dùng các phương pháp khác nhau, thường dùng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS, HPLC…

Xây dựng đồ thị giải phóng hoạt chất của chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu So sánh đồ thị giải phóng của chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu, mức độ tương đồng của hai mô hình giải phóng được đánh giá thông qua chỉ

số f2 và được tính như sau :

n

T R

f

t t

2 2

)(

1

100log

50

Trong đó : n là số điểm lấy mẫu

Rt và Tt là % dược chất giải phóng tại thời điểm t của mẫu đối chiếu và mẫu thử

Hai đồ thị được coi là tương tự nhau nếu f2 nằm trong khoảng 50 100 [38]

1.3.3 Ý nghĩa của giải phóng dược chất in vitro

- Sinh khả dụng (SKD) in vitro là công cụ kiểm soát chất lượng các

dạng thuốc rắn để uống (viên nén, viên nang, pellet,…), đặc biệt là đảm bảo

sự đồng nhất giữa các lô mẻ sản xuất, giữa các nhà sản xuất

- SKD in vitro dùng để sàng lọc, định hướng, đánh giá SKD in vivo Việc đánh giá SKD in vivo rất đắt tiền, tốn kém, không thể làm tràn lan do đó trước hết phải dùng SKD in vitro sàng lọc, định hướng cho việc thử in vivo để

giảm bớt chi phí, thời gian

- SKD in vitro dùng thay thế cho SKD in vivo trong trường hợp đã chứng minh được có sự tương quan đồng biến giữa SKD in vitro và SKD in

vivo với điều kiện công thức và quy trình sản xuất không thay đổi Thực ra do

tốn kém nên SKD in vivo chỉ đƣợc đánh giá một lần khi lập hồ sơ xin phép sản xuất, đảm bảo tính ổn định cho SKD in vivo

- Giải phóng dƣợc chất in vitro là công cụ cơ bản để xây dựng công

thức, thiết kế dạng thuốc trên cơ sở coi tỷ lệ hòa tan dƣợc chất là thông số chất lƣợng của đầu ra, từ đó lựa chọn dạng thuốc và công thức tối ƣu

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.1 Chất đối chiếu

Chất chuẩn pseudoephedrin hydrochlorid (hàm lượng: 99,9%, độ ẩm 0,1%) đạt tiêu chuẩn BP 2009 do công ty cổ phần dược phẩm Trung ương 1 cung cấp

Chất chuẩn loratadin (hàm lượng: 99,24%, độ ẩm: 0,02%, số kiểm soát: 0108242) của Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

2.1.1.2 Chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu

- Chế phẩm thử: Viên phóng thích có kiểm soát Clatadin B chứa PSE.HCl (hàm lượng ghi nhãn 120mg) và LOR (hàm lượng ghi nhãn 5 mg), chế phẩm này chứa ½ lượng PSE và toàn bộ lượng LOR giải phóng ngay, ½ lượng PSE giải phóng chậm

Công thức viên bao Clatadin B :

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Acetonitril (ACN), methanol (MeOH) tinh khiết HPLC (Merck – Đức)

- Amoni dihydrophosphat (PA), dung dịch H3PO4 (PA) (Merck – Đức)

- Acid hydrochloric, NaOH, kali dihydrophosphat, natri dihydrophosphat (AR) (Trung Quốc)

- Nước cất hai lần

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

- Hệ thống máy HPLC – detector UV – DAD Agilent Technologies

1260 Infinitive (Mỹ) với phần mềm Aligent Chemstation version B

- Máy siêu âm Ronorex RK 106 (Đức)

- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan)

- Máy ly tâm Hettich (Đức)

- Máy đo pH Eutech instrument pH150 (Anh)

- Thiết bị thử độ hoà tan Pharmatests, kết nối với bơm nhu động ISMATEC IPC và bộ phận lấy mẫu tự động Pharmatest PTFC II (Đức)

- Tủ sấy Shellab (Đức)

- Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm

- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) (d=0,01 mg)

- Pipet tự động 10-100 µl, 100-1000 µl (Đức)

- Các dụng cụ khác: Bình định mức 10 ml, 50 ml, 100 ml, pipet, ống đong, cốc có mỏ, lọ đựng mẫu sắc ký (vial).…

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích đồng thời PSE và LOR gồm:

- Pha tĩnh: Lựa chọn cột sắc ký có khả năng tách tốt và chọn lọc

- Pha động: Lựa chọn thành phần, tỷ lệ, pH và tốc độ dòng pha động cho thời gian lưu píc chất phân tích vừa phải, tách tốt, sắc ký đồ đẹp

- Detector và bước sóng phát hiện: chọn bước sóng tại đó đáp ứng phân tích của PSE và LOR là tối ưu

2.2.3 Ứng dụng phương pháp phân tích trong xác định hàm lượng viên

phóng thích có kiểm soát chứa Pseudoephedrin và Loratadin

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng ở trên để đánh giá các tiêu chí về định lượng trên viên Clatadin B gồm:

- Độ đồng đều hàm lượng (đối với LOR)

- Định lượng hàm lượng

- Đánh giá độ hòa tan

- So sánh độ hòa tan in vitro với chế phẩm đối chiếu là viên Clarinase

(Schering-Plough)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời

Pseudoephedrin và Loratadin bằng HPLC

2.3.1.1 Lựa chọn điều điện sắc ký

Nguyên tắc của việc lựa chọn điều kiện sắc ký là lựa chọn được loại cột sắc ký, loại pha động, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng và bước sóng phát hiện đảm bảo các chất tách nhau rõ rệt, píc gọn, thời gian phân tích không quá dài, đáp ứng phân tích là tối ưu cho 2 hoạt chất

- Lựa chọn cột sắc ký: khảo sát trên 3 loại cột sắc ký pha đảo C18 của các hãng, gồm : cột Inertsil C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm), cột Zorbax C18 SB (4,6 x 150 mm, 5 µm), cột Hypesil C18 BDS (4,6 x 250 mm, 5 µm)

- Lựa chọn pha động: Tham khảo các tài liệu, chúng tôi khảo sát trên dung môi pha động gồm MeOH, ACN và dung dịch đệm NH4H2PO4 30 mM

pH 3,5 với các tỷ lệ khác nhau, có hoặc không có chất tạo cặp; chế độ pha động đẳng dòng hoặc gradient; thay đổi hoặc giữ nguyên tốc độ dòng trong quá trình sắc ký

- Lựa chọn bước sóng: Tiến hành quét phổ hấp thụ UV của PSE và LOR để xác định bước sóng định lượng là tối ưu nhất

2.3.1.2 Thẩm định phương pháp

a Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

- Xác định tính thích hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích píc của các lần sắc ký

- Yêu cầu: chênh lệch diện tích píc, tR giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không lớn hơn 2%

b Tính chọn lọc của phương pháp

- Tạo mẫu trắng với các thành phần tá dược tương tự như trong chế phẩm nhưng không có hoạt chất PSE và LOR (mẫu placebo) Chuẩn bị mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu placebo Xử lý mẫu rồi tiến hành sắc ký với các điều kiện như mẫu thử

- Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu được, tại thời điểm tương ứng píc của PSE và LOR không được xuất hiện píc lạ

c Tính tuyến tính và khoảng xác định

- Tiến hành xác lập mối tương quan giữa diện tích píc với nồng độ PSE

và LOR Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn PSE và LOR có nồng độ tăng dần Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r

- Yêu cầu: đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị r 0,995

d Độ chính xác

Độ chính xác của một quy trình phân tích diễn tả sự thống nhất (mức độ phân tán) kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần lấy mẫu trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện mô tả

- Độ lặp lại (độ chính xác trong cùng điều kiện định lượng): xác định độ lặp lại của phương pháp bằng cách tiến hành 6 phép thử song song trên một mẫu chế phẩm Ghi sắc ký đồ, diện tích píc của hai hoạt chất Tính hàm lượng của PSE và LOR trong mẫu thử Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD phải không lớn hơn 2%

- Độ chính xác khác ngày: Diễn tả mức dao động của kết quả trong cùng một phòng thí nghiệm được thức hiện ở các ngày khác nhau Yêu cầu: chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD trong ngày phải không lớn hơn 2% và trong hai ngày phải không lớn hơn 3%

- Tính tỷ lệ thu hồi của PSE và LOR chuẩn thêm vào mẫu thử

- Yêu cầu: tỷ lệ thu hồi đạt 98,0 – 102,0 %

2.3.2 Ứng dụng phương pháp định lượng Pseudoephedrin và Loratadin

trong viên phóng thích có kiểm soát

2.3.2.1 Độ đồng đều hàm lượng

Tiến hành theo chuyên luận “Độ đồng đều hàm lượng” của DĐVN 4 Xác định hàm lượng LOR trong 10 viên (làm riêng rẻ) theo phương pháp định lượng đã xây dựng Tính hàm lượng trung bình của LOR trong 10 viên Kết quả đạt nếu không có viên nào có hàm lượng LOR nằm ngoài khoảng 85 % đến 115 % hàm lượng trung bình

Nếu có 1 viên có giá trị hàm lƣợng LOR nằm ngoài khoảng 85 %-115

% nhƣng nằm trong khoảng 75 %-125 % của hàm lƣợng trung bình thì tiến hành thử lại với 20 viên khác Kết quả là đạt nếu có không quá 1 viên trong số

30 viên thử có hàm lƣợng LOR nằm ngoài khoảng 85 %-115 % nhƣng nằm

trong khoảng 75 %-125 % của hàm lƣợng trung bình [1]

Tính hàm lƣợng mỗi hoạt chất trong chế phẩm dựa vào diện tích píc của PSE và LOR trong sắc ký đồ của mẫu thử, mẫu chuẩn và lƣợng PSE và LOR trong mẫu chuẩn

Yêu cầu : Hàm lƣợng trung bình của LOR nằm trong khoảng 90 % -

110 % và hàm lƣợng trung bình của PSE nằm trong khoảng 95 % - 105 % [1]

2.3.2.3 Độ hòa tan

a Phương pháp thử

- Thiết bị: máy thử độ hòa tan kiểu cánh khuấy

- Môi trường hòa tan: 2 môi trường : dung dịch HCl 0,1N (dịch dạ dày

pH 1,0) và dung dịch đệm hydrophosphat – dihydrophosphat pH 8,2 0,05, thêm enzym trypsin với nồng độ 0,05g/l (dịch ruột) Môi trường đệm pH 8,2 được pha bằng cách hòa tan 0,523 g kali dihydrophosphat và 16,73 g dikali hydrophosphat trong nước vừa đủ 1000 ml Chế phẩm được thử trong môi trường dịch dạ dày ở giờ thứ nhất, sau đó chuyển sang môi trường dịch ruột

Lượng dược chất giải phóng tại các thời điểm phải đạt yêu cầu ở bảng 2.1 [24]

Bảng 2.1: Yêu cầu về độ hòa tan của chế phẩm Clatadin B

Phần trăm LOR giải phóng

Phần trăm PSE giải phóng

Giai đoạn môi

2.3.2.4 Đánh giá giải phóng hoạt chất in vitro viên phóng thích có kiểm

soát chứa PSE và LOR

Viên thử và viên đối chiếu được đánh giá độ hòa tan trong 3 môi trường : đệm pH 1,2 ; đệm pH 4,5 và đệm pH 6,8 Mỗi môi trường thử 12 viên