Nghiên cứu định lượng gentiopicrin trong kem viemda AD bằng các phương pháp sắc ký

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG KEM VIEMDA AD BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG KEM VIEMDA AD BẰNG CÁC

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60720410

Cán bộ hướng dẫn: 1.PGS.TS NGUYỄN THỊ KIỀU ANH

2.TS.LÊ THỊ HẢI YẾN

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp

đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong nhiều lĩnh vực, các anh chị kĩ thuật viên, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng sau đại học, các thầy

cô giáo, kỹ thuật viên bộ môn Phân tích - Độc chất - Trường ĐH Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, TS Lê Thị Hải Yến người đã tận tình hướng dẫn, chỉ

bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ ở Viện công nghệ dược phẩm Quốc Gia, Viện an toàn vệ sinh thực phẩm đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi làm thực nghiệm tại cơ sở

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè - những người đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên, ủng hộ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập cũng như trong cuộc sống

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Thái Nguyên, ngày 27 tháng 8 năm 2014

Nguyễn Thị Quỳnh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Dược liệu long đởm 2

1.1.1 Tên khoa học 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.3 Thành phần hóa học 3

1.1.4 Tác dụng dược lý 4

1.2 Bệnh viêm da cơ địa (Atopic Dermatitis - AD) 5

1.2.1 Giới thiệu khái quát về bệnh viêm da cơ địa 5

1.2.2 Thuật ngữ 6

1.2.3 Một số phương pháp điều trị AD 7

1.3 Chế phẩm kem Viemda AD 8

1.4 Tổng quan về các phương pháp sắc ký 9

1.4.1 Phương pháp HPLC 9

1.4.2 Sắc ký lớp mỏng 13

1.5 Một số phương pháp định lượng và định tính getiopicrin bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Hóa chất và thiết bị 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 18

2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 19

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 20

2.4 Đánh giá kết quả 23

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC 24

3.1.1 Quy trình xử lý mẫu 24

3.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 26

3.1.3 Quy trình phân tích 29

3.2 Thẩm định phương pháp định lượng bằng HPLC 30

3.2.1 Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống 30

3.2.2 Tính chọn lọc - đặc hiệu 30

3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 32

3.2.4 Độ chính xác 33

3.2.5 Độ đúng 34

3.3 Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC 35

3.4 Thẩm định phương pháp định lượng bằng HPTLC 38

3.4.1 Độ thích hợp của hệ thống 38

3.4.2 Độ đặc hiệu 38

3.4.3 Tính tuyến tính 40

3.4.4 Độ chính xác 41

3.4.5 Độ đúng 43

3.4.6 So sánh hai phương pháp 43

3.5 Đề xuất tiêu chuẩn kem Viemda AD 44

Chương 4 BÀN LUẬN 48

4.1 Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu ở Việt Nam 48

4.2 Vấn đề lựa chọn phương pháp phân tích 48

4.3 Về xây dựng phương pháp định lượng 49

4.4 Về thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng 50

4.5 Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng kem Viemda AD 52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TLC : Thin Layer Chromatograph (Sắc ký lớp mỏng)

HPLC : Hight Performance Liquit Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HPTLC: Hight Performance Thin Layer Chromatograph (Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao)

Danh mục bảng:

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu 24

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thời gian đun cách thủy 25

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thành phần pha động 26

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động 27

Bảng 3.5: Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống (bằng HPLC) 30

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính (bằng HPLC) 32

Bảng 3.7: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC 33

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC 35

Bảng 3.9: Giá trị Rf và diện tích vùng đáp ứng của các vết 38

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp HPTLC 40

Bảng 3.11: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPTLC 42

Bảng 3.12: So sánh hàm lượng gentiopicrin(%) của 2 phương pháp 43

Danh mục hình:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo gentiopicrin 4

Hình 1.2: Chế phẩm kem Viemda AD 9

Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tỷ số diện tích pic và khối lượng mẫu (A/m) với thời gian chiết 25

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn mối liên hệ giữa tỷ số diện tích pic, khối lượng mẫu và thời gian đun cách thủy 25

Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần pha động tới áp suất cột sắc ký 27

Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần pha động tới thời gian lưu của pic gentiopicrin 27

Hình 3.5: Sắc ký đồ gentiopicrin chuẩn ở điều kiện sắc ký đã lựa chọn 28

Hình 3.6: Phổ hấp thụ của gentiopicrin 29

Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu placebo .31

Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn gentiopicrin 31

Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu thử (chế phẩm kem Viemda AD) 32

Hình 3.10: Sắc ký đồ dãy chuẩn gentiopicrin ………… 33

Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu thử đánh giá độ chính xác bằng HPLC 34

Hình 3.12: Hình ảnh sắc ký đồ gentiopicrin hệ dung môi khai triển 2 36

Hình 3.13: Giản đồ vết mẫu thử (chế phẩm kem Viemda AD) ở hệ dung môi khai triển thứ 2 37

Hình 3.14: Khảo sát thể tích chấm sắc ký 37

Hình 3.15: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu bằng HPTLC 38

Hình 3.16: Giản đồ vết mẫu gentiopicrin chuẩn bằng HPTLC 39

Hình 3.17: Giản đồ vết mẫu placebo bằng HPTLC 39

Hình 3.18: Sắc ký đồ mẫu thử (chế phẩm kem Viemda AD) bằng HPTLC 40

Hình 3.19: Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic 41

Hình 3.20: Sắc ký đồ mẫu thử đánh giá độ chính xác bằng HPTLC 42

1 YÊU CẦU KỸ THUẬT

1.1 Công thức điều chế : Công thức điều chế 100g kem Viemda AD

Tá dược: Dầu paraffin, Alcol cetylic, Acid stearic,

Glyceryl stearat, Butyl hydroxy toluene, Propyl

paraben, Methyl paraben, Tween 80, Na EDTA, Natri

laurylsulphat, Propylen glycol, Triethanolamin, Nước

cất

Vừa đủ một trăm gam

Vđ 100g

1.2 Tiêu chuẩn nguyên liệu, phụ liệu:

Cao khô long đởm Extractum Gentianae Đạt tiêu chuẩn cơ sở

Natri lauryl sulphat Sodium Lauryl sulfat Đạt Dược điển Mỹ 30 Butyl hydroxy toluen Butyl hydroxy toluen Đạt Dược điển Mỹ 30

- 2 -

1.3 Chất lượng thành phẩm

1.3.1 Tính chất: Thuốc mềm Viemda AD phải mịn, đồng nhất, không được có mùi lạ,

không biến màu, không cứng lại hoặc tách lớp ở điều kiện thường, không được chảy lỏng ở nhiệt độ 370

C và phải bắt dính được trên da hoặc vết thương

1.3.2 Độ đồng nhất: Chế phẩm phải đạt yêu cầu Phép thử độ đồng nhất (phụ lục 1.12

DĐVN IV)

1.3.3 Độ đồng đều khối lượng: Chế phẩm phải đạt yêu cầu Phép thử độ đồng đều khối

lượng (phụ lục 11.3 DĐVN IV)

1.3.4 Định tính: Chế phẩm phải có phản ứng định tính với gentiopicrin

1.3.5 Độ nhiễm khuẩn: đạt mức 1 Dược điển Việt Nam IV

1.3.6 Định lượng: Hàm lượng gentiopicrin không dưới 0,1%

1.3.6 Bảo quản: Đóng tupe polyme 20g, để nơi khô ráo, tránh ánh sáng, nhiệt độ

2.3 Độ đồng đều khối lượng: phụ lục 11.3 DĐVN IV

Cân chính xác cả vỏ khối lượng của 1 tupe Mở đồ chứa ra, lấy hết thuốc ra, cắt

mở toàn bộ tupe thuốc để dễ dàng dùng bông lau sạch thuốc bám ở mặt trong, cân khối lượng vỏ Hiệu số giữa 2 lần cân là khối lượng của thuốc

- 3 -

Tiến hành tương tự với 4 tupe thuốc khác lấy ngẫu nhiên Tất cả các tupe thuốc phải có khối lượng trong giới hạn chênh lệch so với khối lượng ghi trên nhãn quy định không quá 10%

Nếu có một đơn vị có khối lượng nằm ngoài giới hạn đó, tiến hành thử lại với 5 đơn vị khác lấy ngẫu nhiên Không được có quá một đơn vị trong tổng số 10 đơn vị đem thử có khối lượng nằm ngoài giới hạn quy định

2.4 Định tính: sử dụng một trong hai phương pháp sau:

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

- Bản mỏng: Silicagel GF254, hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ

- Dung môi khai triển: Ethyl acetat – ethanol – nướ c (8 : 2 : 1)

- Dung dịch thử: Lấy 1,0 g chế phẩm, thêm 10 ml methanol (TT), đun trên cách thủy trong khoảng 15 phút, lọc, cô di ̣ch lo ̣c trên cách thủy còn khoảng 2 ml thu được dung dịch thử

- Dung dịch đối chiếu : Cân và hòa tan Gentiopicrin trong methanol để được dung dịch có chứa chính xác khoảng 0,2 mg Gentiopicrin trong 1 ml

- Cách tiến hành : Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 μl mỗi dung di ̣ch thử và dung dịch đối chiếu Sau khi triển khai xong , lấy bản mỏng ra để khô ở nhiê ̣t đô ̣ phòng rồi quan sát dưới ánh sáng tử ngoa ̣i ở bước sóng 254 nm Các vết trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có cùng màu sắc và cùng giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong phần định lượng, trên sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn gentiopicrin

2.5 Độ nhiễm khuẩn:

Thử theo Dược điển Việt Nam IV – phụ lục 13.6 phần thử giới hạn nhiễm khuẩn

2.6 Định lượng:

* Điều kiện sắc ký:

Cột: Cột phân tích pha đảo Inertsil C18 (5 m, 250 mm x 4,6 mm)

* Cân một lượng chính xác khoảng 0,5 g mẫu thử cho vào ống nghiệm 10 ml Thêm khoảng 6 ml MeOH, lắc xoáy, siêu âm trong 20 phút, đậy giấy bạc, đun cách thủy ở 600C trong 15 phút Để nguội Chuyển toàn bộ vào bình định mức 10 ml, tráng ống nghiệm 3 lần mỗi lần với khoảng 1 ml methanol Tập trung dịch rửa vào bình định mức trên Thêm methanol đến vừa đủ thể tích Lắc đều, ly tâm, lấy phần dịch trong phía trên lọc qua màng lọc đường kính lỗ 0,45 µm, dịch lọc thu được đem tiến hành sắc ký

Tiến hành:

- Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn gentiopicrin Xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích pic Phép thử chỉ có giá trị khi RSD của thời gian lưu và diện tích pic gentiopicrin không quá 2,0%

- Sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn gentiopicrin và dung dịch thử Ghi các sắc ký đồ với các thông số thời gian lưu và diện tích pic của gentiopicrin tương ứng

Hàm lượng gentiopicrin (X) trong kem Viemda AD được tính theo công thức:

Trong đó :

At và Ac :Diện tích pic của gentiopicrin tương ứng trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

mt và mc : Khối lượng (g) mẫu thử và mẫu chuẩn

Cc và H: Hàm lượng (%) gentiopicrin và độ ẩm (%) của chất đối chiếu

- 5 -

3 ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN VÀ BẢO QUẢN

Đóng trong tupe 20g, đậy nắp kín