Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cây cỏ seo gà

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HẢI ĐƯỜNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÂY CỎ SEO GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2014...

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HẢI ĐƯỜNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC

TỪ CÂY CỎ SEO GÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu

NCS.ThS Nguyễn Duy Chí

Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm nghiên cứu

Dược và trang thiết bị y tế Quân đội

HÀ NỘI – 2014

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Thành phần hóa học 2

1.1.3 Tác dụng dược lý 4

1.1.4 Công dụng 6

1.2 MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ 6

1.2.1 Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid 6

1.2.2 Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid 7

1.2.3 Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosid] 9

1.2.4 3,4-dihydroxybenzandehyd 10

1.2.5 Kaempferitrin 11

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 12

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 12

1.3.2 Máy HPLC 13

1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 13

1.3.4 Ứng dụng của kỹ thuật HPLC 15

1.3.5 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 17

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Dung môi, hóa chất 19

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 19

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 21

2.3.2 Chuẩn bị các chất đối chiếu 22

2.3.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 22

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích 23

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 26

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 27

3.1 ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 27

3.1.1 Độ ẩm của dược liệu 27

3.1.2 Chiết xuất 27

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 28

3.2.1 Lựa chọn cột sắc ký 29

3.2.2 Lựa chọn pha động 30

3.2.3 Lựa chọn tốc độ dòng 30

3.2.4 Lựa chọn bước sóng phát hiện 30

3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ 34

3.4 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ SEO GÀ 37

3.4.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký 37

3.4.2 Độ lặp lại của phương pháp 39

3.4.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 41

3.4.4 Độ đúng 45

3.4.5 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 48

3.5 ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ SEO GÀ 49

3.5.1 Phân tích các phân đoạn thu được trong quá trình chiết xuất cây Cỏ Seo gà 49

3.5.2 Xác định hàm lượng các chất có trong cây Cỏ Seo gà 52

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 54

4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 54

4.2 VỀ VIỆC TẠM DÙNG CÁC CHẤT ĐỐI CHIẾU ĐỂ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP 54

4.3 VỀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 55

4.4 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 56

4.5 VỀ KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT VÀ SO SÁNH THÀNH PHẦN CÁC PHÂN ĐOẠN 57

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59

KẾT LUẬN 59

ĐỀ XUẤT 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AEPM: Dịch chiết Cỏ Seo gà (aqueous extracts of Pretis

multifida Poiret)

DAD: Detector mảng diod (Diod Array Detector)

DMSO: Dimethyl sulfoxid

HDL – cholesterol:Lipoprotein tỷ trọng cao mang Cholesterol (High Density

Lipoprotein Cholesterol)

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid

Chromatography)

HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

Spectrometry)

LDL – cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng thấp mang Cholesterol (Low Density

Lipoprotein Cholesterol)

LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)

NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu 27

Bảng 3.2 Hiệu suất chiết cắn các phân đoạn chiết xuất từ cây Cỏ Seo gà 28

Bảng 3.3 Một số thông số trên phổ UV-Vis của các chất nghiên cứu 32

Bảng 3.4 Sự phù hợp của hệ thống HPLC về thời gian lưu 37

Bảng 3.5 Sự phù hợp của hệ thống HPLC về diện tích pic 38

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM3 39

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM12 40

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM18 40

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM15 41

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM9 41

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM3 42

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM12 42

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM18 43

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM15 44

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM9 44

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ đúng với PM3 45

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát độ đúng với PM12 46

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát độ đúng với PM18 46

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát độ đúng với PM15 47

Bảng 3.20 Kết quả khảo sát độ đúng với PM9 47

Bảng 3.21 Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 5 hợp chất phân tích 48

Bảng 3.22 Kết quả khảo sát LOD và LOQ 48

Bảng 3.23 Kết quả xác định nồng độ các chất trong phân đoạn cloroform 50

Bảng 3.24 Hàm lƣợng trung bình các chất nghiên cứu trong cắn cloroform 51

Bảng 3.25.Kết quả xác định nồng độ các chất phân tích trong cắn ethyl acetat 52

Bảng 3.26 Hàm lƣợng trung bình các chất phân tích trong cắn ethyl acetat 52

Bảng 3.27 Kết quả xác định nồng độ chất phân tích trong các dung dịch thử 53

Bảng 3.28 Kết quả xác định hàm lƣợng các chất có trong cây Cỏ Seo gà 53

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC 13

Hình 1.2 Cấu tạo detector mảng diod (DAD) 17

Hình 3.1 SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm với các hệ dung môi khác nhau 29

Hình 3.2 Phổ UV – Vis với detector DAD của các chất nghiên cứu 31

Hình 3.3 Phổ UV – Vis của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ Seo gà 31

Hình 3.4 SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu 33

Hình 3.5 SKĐ của dịch chiết toàn phần cây Cỏ Seo gà 33

Hình 3.6 SKĐ của hợp chất PM3 phân lập được từ Cỏ Seo gà 34

Hình 3.7 SKĐ của hợp chất PM12 phân lập được từ Cỏ Seo gà 34

Hình 3.8 SKĐ của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ Seo gà 35

Hình 3.9 SKĐ của hợp chất PM15 phân lập được từ Cỏ Seo gà 35

Hình 3.10 SKĐ của hợp chất PM9 phân lập được từ Cỏ Seo gà 35

Hình 3.11 Phổ UV – Vis với detector DAD của pic tương ứng 36

Hình 3.12 Chồng phổ UV – Vis với detector DAD của pic tương ứng 36

Hình 3.13 SKĐ của mẫu trắng 38

Hình 3.14 SKĐ của dung dịch thử chuẩn bị từ cắn cloroform 50

Hình 3.15 SKĐ của dung dịch thử chuẩn bị từ cắn ethyl acetat 51

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp xác định

hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cây Cỏ Seo gà”, ngoài sự

làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự khích lệ từ phía thầy cô, gia đình, bạn bè và nhà trường Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu PGS TS Nguyễn Thái An

người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: NCS ThS Nguyễn

Duy Chí đã cho tôi những đóng góp quý giá về đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị kỹ thuật viên Khoa kiểm nghiệm Hóa học, Khoa kiểm nghiệm Vật lý, Khoa nghiên cứu kiểm nghiệm Dược liệu và ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dược và trang thiết bị y tế Quân đội Đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên về mọi mặt và giúp đỡ tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, tháng 8 năm 2014

Nguyễn Hải Đường

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Cỏ Seo gà (Pteris multifida Poiret), thuộc họ Cỏ luồng

(Pteridaceae) là loài cây thảo, mọc phổ biến ở miền Bắc và miền Trung nước

ta Theo y học cổ truyền, Cỏ Seo gà có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi thấp, giảm đau… thường được dùng để chữa bệnh lỵ, viêm tử cung, viêm dạ dày, ruột, viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở ngứa, bệnh ngoài da, ung thư…[3]

Ngày nay, trên thế giới với xu hướng tìm kiếm nguồn thuốc mới từ các chất thiên nhiên và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng Việt Nam có nền y học cổ truyền lâu đời, với lợi thế về địa hình và khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú Tuy nhiên nhiều loài cây được sử dụng rộng rãi theo kinh nghiệm dân gian mà chưa có hoặc còn rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học

Từ mẫu cây Cỏ Seo gà thu hái tại Ba Vì, Hà Nội, NCS Nguyễn Duy Chí đã nghiên cứu phân lập được một số hợp chất Các hợp chất phân lập được sau khi tinh chế đã được xác định và khẳng định cấu trúc bằng phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Để đánh giá tiềm năng và góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu, đề tài

“Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập

được từ cây Cỏ Seo gà” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1- Xây dựng được các quy trình cho phép định lượng đồng thời một số hợp chất đã được phân lâ ̣p từ cây Cỏ Seo gà bằng HPLC

2- Ứng dụng phương pha ́ p xây d ựng được để so sánh thành phần các phân đoạn thu được trong quá trình chiết xuất và sơ bộ xác định hàm lượng các hợp chất trên trong cây Cỏ Seo gà

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Pteris multifida Poir., họ Cỏ luồng (Pteridaceae)

Tên đồng nghĩa: Pteris serrulata L.f

Tên khác: Phượng vĩ thảo, cỏ luồng [3], theo gà, phượng vĩ [5]

Tên nước ngoài: Spider brake (Anh) [3]

Cây thảo, cao 20-40 cm, có thể hơn [3] Thân rễ nằm ngang dưới mặt đất, chừng 3-4 cm, hình cong queo, sần sùi, nhiều mấu, hơi cứng, vị hơi ngọt, đắng và tê, mùi thơm hắc [5] Lá mọc thẳng từ thân rễ, xẻ sâu hình lông chim hai lần, nhẵn, gân lá rõ, có hai loại: lá không sinh sản ngắn, màu lục nhạt hơi vàng, các thùy to nhỏ không đều mọc đối nhau, mép hơi khía răng, có đầu tròn, riêng thùy tận cùng thuôn dài thành mũi nhọn; lá sinh sản dài, màu đen sẫm gồm các thùy hình dải thuôn uốn éo, mọc đối, đầu nhọn hoắt, mép lá gập lại mang túi bào tử dày đặc ở trong; cuống lá rất dài, màu nâu nhạt ở gốc, hơi vàng ở phía trên [3]

Bào tử hình bốn cạnh, hơi tròn, màu vàng nhạt, có nhiều u sần nhỏ

Mùa sinh sản: tháng 5 – 10 [3]

Cỏ Seo gà mọc phổ biến ở miền Bắc và miền Trung nước ta, thường gặp nhất ở trên những vách đá, vách đất, xung quanh thành giếng, ven đường đi, những nơi thoáng ẩm và mát Còn thấy mọc cả ở Trung Quốc, Nhật Bản [5]

Bộ phận dùng làm thuốc của cây là thân rễ và lá [5]

1.1.2 Thành phần hóa học

Năm 1996, từ Pteris multifida Poir., Woerdenbag HJ và cộng sự đã phân

lập bằng sắc ký cột silica gel thu được 2 hợp chất diterpen là: ent-kauran-2β, 16α-diol và ent-kaur-16-en-2β, 15α-diol Cả 2 chất này đều có tác dụng gây độc với tế bào u báng Ehrlich [38]

Năm 2006, Hao-Bin Hu, Xu-Dong Zheng và Hong Cao đã phân lập đƣợc

2 hợp chất xanthon glycosid mới là butenyl)-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D glucopyranosyl xanthon và 1,3- dihydroxy-7-methoxy-8-(3-methyl-2-butenyl) -6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2) - [β-D-glucopyranosyl - (1→3)] -β-D-glucopyranosyl xanthon cùng với 6 hợp chất khác là quercetin, dehydro goniothalamin, vanillin, dihydro echioidinin, saucerneol D, licoagro chalcon D [14]

1-hydroxy-4,7-dimethoxy-8-(3-methyl-2-Năm 2008, Xu-dong Zheng, Hao-bin Hu, Huai-sheng Hu đã phân lập

đƣợc hợp chất neolignan glycosid mới là multifidosid A: dihydroxy-5'-methoxy-7,3'-dioxy-8,4'-neolignan- 4 - O- β – D - apiofuranosyl

rel(7S,8S)Δ7'2,9' (1→6) – β – D rel(7S,8S)Δ7'2,9' glucopyranosid và 4 chất khác là scaphopetalon, (−) rel(7S,8S)Δ7'2,9'

-isolariciresinol 3α – O – β - apiofuranosyl - (1→2) – O – β - glucopyranosid, 6,7 – dihydroxy - 3' – methoxy - 4',5 '- methylenedioxyisoflavon 6 – O – β –D

- xylopyranosyl - (1→6) – β – D - glucopyranosid, polyporusteron I [40]

Năm 2008, Liva Harinantenaina và cộng sự đã phân lập đƣợc 4-caffeoyl quinic acid 5-O-methyl ether, (2R,3R)-pterosin L 3-O-β-D-glucopyrannosid, β-sitosterol β - D - glucopyranosid, apigenin 7 – O – β – D - glucopyranosid, luteolin 7 – O – β – D - glucopyranosid, sucrose, caffeic acid, pterosin C 3 –

O – β – D -glucopyranosid, pterosid C, 4,5-dicaffeoyl quinic acid, pterosid A, wallichosid và (2S)-5,7,3',5'-tetrahydroxyflavanon [27]

Theo Wang WS, Wang ZQ, Zhou YW (2008), từ dịch chiết methanol

của P multifida Poir., sau khi phân lập, tinh chế bằng sắc ký cột pha thuận,

sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột nhồi sephadex, đã thu đƣợc một sesquiterpen glycosid là pterosin C-3-O-β-D-glucosid và 6 flavonoid là: apigenin, luteolin, apigenin-7-O-β-D-glucosid, apigenin-7-O-β-D-glucosyl-4'-O-α-L-rhanrnosid, apigenin-4'-O-α-L-rhanrnosid, luteolin-7-O-β-D-glucosid [37]

Năm 2008, Xin Ge và cộng sự đã phát hiện 6 hợp chất mới, trong đó có

3 hợp chất ent-kauran diterpenoid là pterokauran M1, pterokauran M2,

pterokauran M3 và 3 hợp chất C14 pterosin-sesquiterpenoid là multifidosid A,

multifidosid B, multifidosid C, đồng thời cũng phân lập được 18 diterpenoid

và sesquiterpenoid khác đã biết [39]

Jicheng Shu và cộng sự (2012) đã phân lập được 2S,3S-acetylpterosin C

và 2 hợp chất pterosin sesquiterpen mới là: 2R,3R-1hydroxy-pterosin L

3-O-β-D-glucopyranosid và 2R,3S-acetylpterosin C [20]

Năm 2013, Liu và cộng sự đã xác định đồng thời 5 flavonoid (vicenin-2,

lonicerin, rhoifolin, luteolin và apigenin) trong Pteris multifida Poir bằng

HPLC Phân tích được thực hiện trên một cột Diamonsil C18 (4,6 mm x

250 mm, 5 µm) Dung môi sử dụng là acetonitril-nước (chứa 0,1% acid

formic) với chế độ rửa giải gradient (0-10 phút: 15-85; 20-30 phút: 25-75;

phát hiện đã được xác định tại 350 nm Tỷ lệ thu hồi trung bình của các chất

tương ứng: vicenin-2, lonicerin, rhoifolin, luteolin và apigenin là 97,18-105,20% (RSD 1,72-3,20%), 95,02- 104,92% (RSD 1,96-2,93%),

98,45-103,70% (RSD 1,66-2,70%), 96,41-104,73% (RSD 1,03-3,46%), 95,82-99,34% (RSD 1,85-3,95 %) Các đường chuẩn xây dựng cho thấy tuyến

tính tốt (r ≥ 0,999, n = 5) Hàm lượng 5 flavonoid trên xác định trong khoảng

0,5-2,2 mg /g [26]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Theo T.C Wang, M.C Ti, S.C Lo, C.C Yang (2007) dịch chiết Pteris

multifida Poir có tác dụng thu dọn gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

(DPPH), hydroxyl và có khả năng khử [36]

Năm 2008, Xin Ge, Guan Ye, Ping Li, Wen-Jie Tang, Jin-Li Gao và

Wei-Min Zhao đã phát hiện ra 6 hợp chất mới ở loài P multifida Poir., trong

đó multifidosid A và multifidosid B được chứng minh có tác dụng ức chế

đáng kể đối với tế bào HepG2 (ung thư biểu mô tế bào gan) và K562 (ung thư

máu) Từ kết quả của nghiên cứu này, có thể sử dụng P multifida Poir để

điều trị ung thư [39]

Harinantenaina L, Matsunami K, Otsuka H (2009) nghiên cứu in vitro

đưa ra kết luận: dịch chiết P multifida Poir có tác dụng chống oxy hóa thể

hiện ở khả năng thu dọn các gốc tự do như: anion superoxid, 2,2'-azinobis (3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); tạo phức chelat với các ion kim loại chuyển tiếp (Fe2+, Cu2+ ); chống lại sự kích thích của FeCl2/H2O2 lên quá trình peroxyd hóa acid linoleic, phá vỡ phản ứng dây chuyền của sự peroxyd hóa lipid nên có tác dụng chống peroxyd hóa lipid [15]

Năm 2010, Wang TC và cộng sự đã phát hiện Cỏ Seo gà có tác dụng làm

hạ lipid máu trên chuột ăn chế độ giàu cholesterol: giảm triglycerid, LDL-cholesterol và tỷ lệ LDL-cholesterol/HDL-cholesterol huyết tương, giảm cholesterol, triglycerid gan; đồng thời có tác dụng tăng đào thải lipid và các sản phẩm chuyển hóa qua đường tiêu hóa [35]

Theo Kuang-Ping Lan và cộng sự (2011), dịch chiết P multifida Poir

(AEPM) có tác dụng thu dọn các gốc tự do α-diphenyl-β-picrylhydrazyl,

bao gồm acid ascorbic, β-caroten, tocopherol (dạng α-, β- và δ-) và phenol toàn phần, trong đó thành phần chống oxy hóa chính là phenol toàn phần Đây

là các chất chống oxy hóa hiệu quả, sự có mặt và lượng chất ảnh hưởng đến tác dụng chống oxy hóa Dựa trên những kết quả thu được từ nghiên cứu này, AEPM là chất bảo vệ có thể giúp cơ thể con người chống lại sự phá hủy của quá trình oxy hóa [22]

Năm 2013, Yu C, Chen J, Huang L đã công bố nghiên cứu về tác dụng

chống ung thư của flavonoid toàn phần trong P multifida Poir trên chuột

mang khối u H22, kết luận rằng các flavonoid toàn phần này có tác dụng ức chế rõ ràng trên khối u H22 được cấy; cơ chế hoạt động của nó có thể liên

quan với việc cải thiện chức năng miễn dịch và tăng cường khả năng chống

oxy hóa ở chuột [43]

1.1.4 Công dụng

Toàn cây Cỏ Seo gà có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính lạnh, có tác dụng thanh nhiệt, lương huyết, lợi thấp, chỉ lỵ Rễ có vị ngọt, đắng hơi tê, mùi thơm hắc [3]

Toàn cây Cỏ Seo gà được dùng chữa kiết lỵ mạn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở ngứa, bệnh ngoài da Nước sắc lá Cỏ Seo gà có tác dụng chữa bỏng [3]

Rễ, lá sao vàng, tán nhỏ đun với dầu vừng thành thuốc dầu bôi chữa một

số bệnh ngoài da của trẻ em [5]

Ở Trung Quốc, Pteris multifida Poir đã được sử dụng chủ yếu như một

loại thuốc dân gian truyền thống để điều trị bệnh eczema (chàm), nôn ra máu, viêm ruột, tiêu chảy, lỵ trực trùng và có tác dụng chống ung thư và kháng khuẩn [19]

Pteris multifida Poir có tác dụng hạ sốt, giải độc, chống viêm, kháng

sinh, giải nhiệt, tác dụng chống gây đột biến và chủ yếu được sử dụng như

loại thuốc dân gian để điều trị bệnh tả, lỵ và trĩ nội [24]

1.2 MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ

1.2.1 Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid

Tên khoa học: Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid

Công thức phân tử: C12H16O8 (M = 288,26 g/mol) [17]

1.2.1.1 Tính chất vật lý

Dạng dầu màu nâu sẫm [31], IR νmax

KBr: 3350, 1650, 1620, 1260, 890,

705 cm-1 [31], [α]D = -50,0o (c = 0,36, CH3OH–H2O (5 giọt, 5 ml) [30]

1.2.1.2 Nguồn gốc

Theo [31], từ 10 kg lá Abies koreana (Pinaceae) phân lập đƣợc 54,6 mg

Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid

Năm 2013, Djimtombaye BJ và cộng sự đã phân lập đƣợc

Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid từ toàn cây Astragalus halicacabus [9]

Từ 3,0 kg phần trên mặt đất khô của cây Elsholtzia rugulosa

(Lamicaeae) phân lập đƣợc 52,2 mg Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [12]

Từ 12 kg bột dƣợc liệu thô Drynaria fortunei phân lập đƣợc 11,5 mg

Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [25]

Từ 4 kg củ của cây Smilax bockii (Liliaceae) phân lập đƣợc 15 mg

Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [11]

Từ 980 g bột dƣợc liệu khô cây Scleranthus uncinatus Schur

(Illecebraceae) phân lập đƣợc 7,2 mg Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid [30]

1.2.2.1 Tính chất vật lý

Chất rắn vô định hình, màu vàng [α]D

25: -72o (c = 0,42, MeOH);

IR νmax : 3400, 1654 cm-1 [15]

1.2.2.2 Nguồn gốc

Năm 1997, Mohamed Sharaf và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được

Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid từ một số

loài thuộc chi Cleome: Cleome amplyocarpa Barr and Murb., C brachycarpa

Vahl., C chrysantha Decne., C droserifolia (Forssk.) Del [28]

Kaempferol – 3 - O-α-L-rhamnopyranosid -7-O-β-D-glucopyranosid còn

được tìm thấy ở trong cây Chenopodium murale [10]

Năm 2007, từ 8,1 kg toàn bộ cây tươi Pteris ensiformis Burm phân lập

Sử dụng phương pháp HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm x

250 mm); pha động: methanol và nước với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%,

tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ

dòng: 1 mL/phút; bước sóng 297 nm [44]

Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-D-glucopyranosid] có tác dụng thu dọn các gốc cation tự do DPPH và

ABTS.+ (ABTS là 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) [44]

1.2.3.4 Phương pháp định lượng

Sử dụng phương pháp HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm×

250 mm); pha động: methanol và nước với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%,

tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ

dòng: 1 mL/phút; bước sóng 297 nm [44]

1.2.4 3,4-dihydroxybenzandehyd

OHOH

1 2 3 4 5 6

Tên khoa học: 3,4-dihydroxybenzandehyd

Công thức phân tử: C7H6O3 (M = 138,12 g/mol)

1.2.4.1 Tính chất vật lý

Dạng bột màu trắng, Tonc: 152-154oC [7]

1.2.4.2 Nguồn gốc

Năm 2007, Buniyamin A Ayinde, Doris N Onwukaeme và Eric K

Omogbal phân lập được 3,4-dihydroxybenzandehyd từ vỏ thân cây Musanga

cecropioides R.Brown (Moraceae) [7]

Theo Nova Syafni và cộng sự, từ 6,0 kg lá; 4,3 kg thân cây; 1,5 kg rễ cây

Trichomanes chinense L tương ứng phân lập được 35 mg (chiếm 0,002%

khối lượng cắn), 33 mg (0,003% khối lượng cắn) và 8 mg (0,0007% khối

lượng cắn) 3,4-dihydroxybenzandehyd [29]

Ngoài ra 3,4-dihydroxybenzandehyd còn được phân lập từ nấm

Phellinus gilvus (Schwein) Pat (Hymenochaetaceae), cây Cremastra appendiculata (D Don) Makino (Orchidaceae) và lá Vitis vinifera L

(Vitaceae) [29]

1.2.4.3 Tác dụng dược lý

3,4-dihydroxybenzandehyd được tinh chế từ quả Xanthium strumarium

có tác dụng ức chế của phosphotransferase CKII (casein kinase II) với IC50khoảng 783 μM Nồng độ 300 μM 3,4-dihydroxybenzandehyd gây ra ức chế

50% sự tăng trưởng của tế bào ung thư U937 ở người Nó có thể có khả năng

ức chế bệnh ung thư thông qua sự ức chế hoạt động CKII [23]

3,4-dihydroxybenzandehyd được phân lập từ lúa mạch Hordeum vulgare

có tác dụng ức chế sự oxy hóa phá hủy DNA và quá trình hủy hoại tế bào bởi

(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), hydroxyl, ROS nội bào Nó cũng tạo phức chelat với Fe2+ [16]

1.2.5 Kaempferitrin

Tên khoa học: Kaempferol-3,7-di-O-α-L-rhamnopyranosid

Công thức phân tử: C27H30O14 (M = 578,53 g/mol) [18]

1.2.5.1 Tính chất vật lý:

Tinh thể hình kim sáng bóng màu vàng nhạt [13]

Tan trong ethanol hoặc DMSO, tonc: 201-203oC [18]

1.2.5.2 Nguồn gốc

Kaempferitrin được chiết xuất từ lá Hedyotis verticillata [6]

Năm 2006, Kaempferitrin được chiết xuất từ Celastrus orbiculatus,

C punctatus, C paniculatus, Trichosanthes cucumeroides [34]

Từ 1,5 kg bột dược liệu khô cây Lotus lalambensis phân lập được

180 mg Kaempferitrin [13]

Năm 2009, Yerra Koteswara Raoa và cộng sự đã chiết xuất được 156 mg

Kaempferitrin từ 500 g bột lá khô Cinnamomum osmophloeum [41]

1.2.5.3 Tác dụng dược lý

Kaempferitrin có tiềm năng chống viêm, có tác dụng ức chế một số chức năng của đại thực bào tham gia vào quá trình viêm Nó ức chế lipopolysaccharid, interferon (IFN) - γ – tạo ra nitric oxid (NO) và các cytokin [yếu tố hoại tử khối u TNF-α và interleukin (IL)-12] [32]

Kaempferitrin có tác dụng hạ đường huyết và có tiềm năng chống oxy hóa (phản ứng cao với DPPH (1,1- diphenyl -2- picryl hydrazyl), ức chế hoạt động myeloperoxidase và làm giảm quá trình peroxy hóa lipid – gây ra bởi gốc ascorbyl [8], [21]

Nghiên cứu này chứng minh tác dụng kép của Kaempferitrin là: vừa cải thiện đề kháng insulin bằng cách hoạt hóa đường dẫn truyền insulin kinh điển vừa tăng tiết adiponectin (kích thích tế bào mỡ tiết adipokin) [42]

Kaempferitrin có tác dụng chống rối loạn lipid máu: làm giảm cholesterol toàn phần, triglycerid và lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C) huyết tương ở chuột bị rối loạn lipid máu [33]

1.2.5.4 Phương pháp định lượng

Sử dụng phương pháp HPLC pha đảo với cột C18 Hypersil ODS (4,6mm x100 mm, 3 μm); pha động: acetonitril (A) và nước chứa 0,1% acid trifluroacetic (B) với tỷ lệ A:B là 10:90, chạy gradient tuyến tính tới 30:70 trong 0-20 phút, duy trì trong 10 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút; bước sóng phát hiện 265 nm; nhiệt độ cột: 25ºC; khoảng tuyến tính: 5 –100 μg/mL; độ tìm lại: 98% [41]

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực

tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất

ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố đó Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của chất phân tích

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1]

1.3.2 Máy HPLC

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC

1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

1.3.3.1 Thời gian lưu t R

Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất

Thời gian chết tM là thời gian lưu của chất không bị lưu giữ

Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R = tR – tM

Hệ thống cấp

Bộ phận tiêm mẫu

Cột sắc ký Detector

Hệ thu nhận xử lý dữ

liệu (máy ghi, máy tính)

Thải

k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất của hai pha và tỷ lệ VS/VMThường lựa chọn điều kiện sắc ký để k’ = 1 – 5

1.3.3.3 Hệ số chọn lọc 

Hệ số chọn lọc  đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B

trong đó: RS : độ phân giải

(tR)A, (tR)B: thời gian lưu chất A, B

WA, WB : lần lượt là độ rộng pic A, B ở các đáy pic

W1/2A, W1/2B : lần lượt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

RS  1,5 thì 2 pic coi như tách được hoàn toàn

1.3.3.5 Số đĩa lý thuyết

Mỗi cột sắc ký có thể được coi gồm nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý thuyết Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký

2 54

, 5

2 16

2 / 1

t

trong đó : W là chiều rộng pic ở đáy pic

W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

1.3.4 Ứng dụng của kỹ thuật HPLC

1.3.4.1 Định tính [1]

Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:

gian lưu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký

thêm chuẩn đối chiếu

bằng detector DAD thông qua hệ số match

chức (IR) hoặc số khối (MS)

1.3.4.2 Định lượng [2]

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:

 Phương pháp chuẩn ngoại

 Phương pháp chuẩn nội

 Phương pháp thêm chuẩn

 Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại

Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùng điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm

 Chuẩn hóa 1 điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử

Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

SX (HX): diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử

SS (HS): diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn

 Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn (C) Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính theo 2 cách:

sẽ suy ra được nồng độ của nó

chiều cao) pic với nồng độ chất cần xác định

S  a C b S: Diện tích pic

a: Độ dốc của đường chuẩn b: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung C: Nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử:

S b C

a



Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong

khoảng nồng độ tuyến tính của đường chuẩn

1.3.5 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector)

Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – Vis, được dùng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – Vis (trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau đó được tách ra thành các bước sóng đơn Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau cùng một lúc Thông thường, chỉ có một hoặc hai bước sóng được theo dõi trong quá trình chạy sắc ký Giám sát hai pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic

Hình 1.2 Cấu tạo detector mảng diod (DAD)

Quang phổ và sắc ký đồ có thể được biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh detector đo ở bước sóng cố định hoặc thay đổi Mặt khác,

hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian

Ứng dụng: Đầu dò DAD giúp lựa chọn bước sóng phù hợp cho phân tích, có khả năng vẽ phổ UV – Vis của pic chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để thấy sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match

Khi hệ số match xấp xỉ 1000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn

Hệ số match > 900 thì chỉ ra 2 phổ tương tự

Hệ số match càng gần 1000 thì sự tương tự của 2 phổ càng cao

Hệ số match < 900 chỉ ra 2 phổ khác nhau [1]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là cây Cỏ Seo gà (được làm khô tự nhiên) thu hái tại Ba

Vì, Hà Nội và đã được TS Đỗ Thị Xuyến (Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học

là: Pteris multifida Poir., họ Cỏ luồng (Pteridaceae)

2.1.2 Dung môi, hóa chất

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị

(Detector DAD) (Mỹ)

 Cột sắc ký Zobax Eclipse XBD – C18 (250 mm  4,6 mm, 5 µm)

 Micropipet 10-100L, 100-1000L

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích để kiểm tra khả năng sử dụng chúng như các chất đối chiếu

hợp chất trong hỗn hợp các chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong dịch chiết cây Cỏ Seo gà

 Định tính các chất dựa vào thời gian lưu trên sắc ký đồ, kết hợp với chồng phổ UV của chất đối chiếu và thử bằng HPLC detector DAD

chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích

phân đoạn thu được trong quá trình chiết xuất và mẫu cây Cỏ Seo gà đã thu hái được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử

2.3.1.1 Xác định độ ẩm của bột dược liệu

Toàn cây Cỏ Seo gà sau khi được làm khô tự nhiên, nghiền thành bột thô rồi xác định độ ẩm của dược liệu theo phương pháp mất khối lượng do làm

khô (Phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam IV)

Dùng chén thủy tinh có nắp mài làm bì đựng mẫu thử, làm khô bì trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC dưới áp suất thường trong 30 phút, để nguội tới nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm có silica gel rồi cân để xác định khối lượng bì Cân ngay mẫu thử vào bì này một lượng chính xác khoảng 2 g, dàn mỏng thành lớp

C đến khối lượng không đổi Từ đó xác định độ ẩm của bột mẫu nghiên cứu [4]

2.3.1.2 Chiết xuất

Tiến hành khảo sát các phương pháp chiết xuất như: ngâm ở nhiệt độ phòng, chiết soxhlet và chiết siêu âm với các dung môi khác nhau Phương pháp chiết siêu âm với dung môi là methanol được lựa chọn để chiết xuất thu được dịch chiết toàn phần

Tiến hành cân khoảng 50 g bột dược liệu toàn cây Cỏ Seo gà (đã xác định độ ẩm), chiết siêu âm với methanol nhiều lần, gộp dịch lọc, bay hơi dung

C

2.3.1.3 Tính hiệu suất chiết

Hàm lượng % của cắn toàn phần so với khối lượng bột dược liệu được tính theo công thức sau:

100

(100 )

a X

2.3.1.4 Pha dung dịch thử

Tiến hành cân chính xác khoảng 0,3 g cắn, hòa tan hoàn toàn bằng methanol trong bình định mức 50 mL, thêm methanol vừa đủ lắc đều, lọc qua

2.3.2 Chuẩn bị các chất đối chiếu

2.3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập được

Các chất nghiên cứu được cân chính xác, hòa tan và định mức thành các dung dịch trong methanol, lọc qua màng lọc và tiêm vào hệ thống sắc ký

Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có trong chúng sau khi được phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc Tổng tạp của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích

Nếu chất phân lập không bị lẫn các tạp chất khác, tạm bỏ qua hàm ẩm (vì khối lượng chất phân lập được rất ít) để coi hàm lượng của các chất phân lập

là 100% trong xây dựng phương pháp định lượng

2.3.2.2 Pha các dung dịch đối chiếu gốc

Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu đã phân lập và tinh chế được, hòa tan và định mức bằng methanol để thu được các dung dịch đối chiếu gốc có nồng độ chính xác lần lượt: PM3 khoảng 100 g/mL, PM12

PM9 khoảng 250 g/mL Các dung dịch này dùng để kiểm tra tổng tạp và được pha loãng thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn

2.3.3 Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký

2.3.3.1 Chọn cột sắc ký

Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng phổ biến với nhiều tính ưu việt Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập được từ cây Cỏ Seo gà, đồng thời qua tham khảo tài liệu nghiên cứu về phương pháp

tách chiết, định lượng một số thành phần trong cây Cỏ Seo gà, chúng tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này

Tiến hành khảo sát trên các cột C18 có kích thước hạt nhồi là 5 µm, với chiều dài cột là 10 cm, 15 cm và 25 cm

2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích

Phép định lượng các hợp chất phân lập được từ cây Cỏ Seo gà bằng

phương pháp HPLC được thẩm định thông qua các chỉ tiêu:

2.3.4.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký

Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý xong

Cách xác định: tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch đối chiếu đã chuẩn

bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

Ngoài ra, sự phù hợp của hệ thống còn thể hiện ở tính chọn lọc Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác (tạp chất hoặc các chất cản trở khác)

Trong HPLC, tính chọn lọc thể hiện: trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng và các mẫu tự tạo, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp

Tiến hành: tiêm lần lượt mẫu trắng, dung dịch thử, dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký; so sánh các sắc ký đồ thu được

Yêu cầu: tại thời gian lưu của chất đối chiếu không xuất hiện pic lạ trên mẫu trắng, mẫu nền

2.3.4.2 Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của một phương pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý mẫu ) đến công đoạn cuối cùng của quy trình phân tích

Tiến hành: pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại nhiều lần, lấy giá trị trung bình Độ lặp

lại được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích

2.3.4.3 Độ tuyến tính và khoảng xác định

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan r

Khoảng xác định: là khoảng nồng độ đã được khảo sát đảm bảo tuyến tính (gọi là khoảng tuyến tính) Khảo sát nồng độ từ 40% đến 140% nồng độ

dự kiến phân tích của mẫu

Cách xác định: chuẩn bị một dãy chất đối chiếu gồm 6 mẫu có nồng độ tăng dần trong khoảng thích hợp Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng

độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính

Yêu cầu: độ tìm lại: 95,0 – 105,0%

2.3.4.5 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

LOD là lượng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện được về mặt định tính

LOQ là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp

Cách xác định: xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N) Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký Đo tín hiệu liên tục

từ mẫu trắng (B) và mẫu thử (S) Thiết lập tỷ số S/N

Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu

STT Khối lượng dược

liệu trước sấy (g)

Khối lượng dược liệu sau sấy (g) Độ ẩm (%)

 Khối lượng cắn toàn phần:

Cân 50,2785 g dược liệu toàn cây Cỏ Seo gà (độ ẩm 15,93%) đã được làm nhỏ, chiết siêu âm 5 lần, mỗi lần chiết siêu âm với 200 ml methanol trong thời gian 10 phút, thu dịch chiết, lọc, bốc hơi cách thủy dung môi trên tới cắn Cắn được sấy áp suất giảm ở 60oC đến khối lượng không đổi, thu được 2,1410 g cắn toàn phần, bảo quản ở 4oC

 Khối lượng cắn ở các phân đoạn chiết lỏng – lỏng:

Tiến hành song song như trên cân 50,2550 g dược liệu toàn cây Cỏ Seo

gà (độ ẩm 15,93%) đã được làm nhỏ, chiết siêu âm 5 lần, mỗi lần chiết siêu

âm với 200 ml methanol trong thời gian 10 phút Thu dịch chiết và bốc hơi được 2,140 g cắn toàn phần Cắn này được hòa tan vào một thể tích tối thiểu nước cất nóng 60°C Dịch chiết nước được tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, cloroform, ethyl

acetat Thu được 3 phân đoạn dịch chiết Các dịch chiết được cất thu hồi dung môi đến cắn có khối lượng không đổi

Nhận xét: Để định lượng các hợp chất trong Cỏ Seo gà đạt kết quả tốt,

trước hết cần phải chiết kiệt hoạt chất và làm sạch dịch chiết Chúng tôi chọn phương pháp chiết siêu âm với methanol, phương pháp chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, cloroform, ethyl acetat) Đây

là phương pháp dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, thời gian chuẩn bị mẫu ngắn đồng thời cho hiệu suất tương đối cao

 Hiệu suất chiết cắn toàn phần:

100

(100 )

a X

 Hiệu suất chiết cắn ở các phân đoạn:

Hiệu suất cắn của 3 phân đoạn so với cắn toàn phần của cây Cỏ Seo gà được trình bày trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Hiệu suất chiết cắn các phân đoạn chiết xuất từ cây Cỏ Seo gà

STT Phân đoạn Khối lượng

3.2.1 Lựa chọn cột sắc ký

Vì mẫu phân tích là dược liệu có nhiều thành phần nên cần có sự tách tốt

và thời gian phân tích phù hợp Chúng tôi tiến hành khảo sát trên loại cột C18 với kích thước hạt nhồi là 5µm và chiều dài cột là 10 cm, 15cm và 25 cm

hoặc cột Chromolith RP18e 130A (100 mm x 4,6 mm) có kích thước hạt 5µm

dung môi khác nhau thu được các sắc ký đồ trong đó các pic không tách riêng được (hình 3.1) Trong số các cột khảo sát, chỉ có cột Zobax Eclipse XBD –

hợp lý (hình 3.4, 3.5)

Hình 3.1 SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm với các

hệ dung môi khác nhau

3.2.2 Lựa chọn pha động

Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột Zobax Eclipse XBD – C18

C

Chúng tôi tiến hành khảo sát pha động với các hệ dung môi: methanol –

nước (có 0,1% acid formic), acetonitril – methanol (có 0,1% acid formic),

acetonitril – nước (có 0,1% acid formic) với tỷ lệ thành phần khác nhau

Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động acetonitril (kênh A) và

nước có 0,1% acid formic (kênh B) với chế độ gradient dung môi cho kết quả

tốt nhất Với chương trình dung môi tỷ lệ A:B sử dụng ban đầu là (5:95), thay

đổi tuyến tính đến (9:91) ở phút thứ 4, rồi thay đổi tuyến tính đạt tới (16:84) ở

phút thứ 5, duy trì đến phút thứ 12, sau đó tiếp tục thay đổi tuyến tính tới

(28:72) ở phút thứ 22, thay đổi tuyến tính trở về tỷ lệ ban đầu (5:95) ở phút

29, duy trì đến phút 30 là phù hợp nhất, có khả năng tách tốt cả 5 hợp chất cần

phân tích, cho pic nhọn, cân đối và thời gian lưu hợp lý, thời gian phân tích

không quá dài Vì vậy, hệ dung môi trên được chọn làm pha động trong

nghiên cứu này

3.2.3 Lựa chọn tốc độ dòng

Tiến hành khảo sát ở các tốc độ dòng khác nhau 0,8 mL/phút; 1,0 mL/phút; 1,1 mL/phút và 1,2 mL/phút Kết quả cho thấy tốc độ dòng 1,0 mL/phút là phù hợp vì kết quả tách tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý

3.2.4 Lựa chọn bước sóng phát hiện

Lấy phổ UV – Vis từ máy HPLC với detector DAD của các pic tương

ứng với chất nghiên cứu Hình ảnh phổ UV - Vis của các chất nghiên cứu

được thể hiện trong hình 3.2, độ hấp thụ quang tại một số bước sóng được ghi

trong bảng 3.3