Xây dựng một số phương pháp kiểm nghiệm và nghiên cứu tác dụng trên sỏi tiết niệu của thân cây ý dĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẢO XÂY DỰNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG TRÊN SỎI TIẾT NIỆU CỦA THÂN CÂY Ý DĨ LUẬN VĂN T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THẢO

XÂY DỰNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG TRÊN SỎI TIẾT NIỆU CỦA THÂN CÂY Ý DĨ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THẢO

XÂY DỰNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VÀ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG TRÊN

SỎI TIẾT NIỆU CỦA THÂN CÂY Ý DĨ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60720406

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Quỳnh Chi

TS Nguyễn Thùy Dương

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Quỳnh Chi, TS Nguyễn Thùy Dương, TS Nguyễn Hoàng Anh và TS Phương Thiện Thương là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tận tình giúp tôi hoàn thành luận

văn này

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Dược

Hà Nội, Trường Cao đẳng Dược TW Hải Dương đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Dược liệu – Trường Cao đẳng Dược TW Hải Dương và phòng hóa phân tích - Viện Dược Liệu đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và làm luận văn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Dược Hà Nội;

Bộ môn Dược liệu – Trường Cao đẳng Dược TW Hải Dương đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp và những người thân trong gia đình đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

Đặt vấn đề 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh lý sỏi tiết niệu 3

1.1.1 Định nghĩa bệnh lý sỏi tiết niệu 3

1.1.2 Đặc điểm dịch tễ 3

1.1.3 Phân loại và thành phần cấu tạo sỏi tiết niệu 3

1.1.4 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh sỏi tiết niệu 4

1.1.5 Điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu 5

1.1.5.1 Điều trị ngoại khoa 5

1.1.5.2 Điều trị nội khoa 6

1.1.5.3 Phòng chống tái phát 6

1.2 Vai trò của dược liệu trong điều trị sỏi tiết niệu 7

1.3 Cây Ý dĩ 11

1.3.1 Vị trí phân loại 11

1.3.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 11

1.3.3 Công dụng theo Y học cổ truyền 12

1.3.4 Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Ý dĩ 12

1.3.4.1 Thành phần hóa học 13

1.3.4.2 Tác dụng dược lý 18

1.3.5 Các nghiên cứu trong nước về thân Ý dĩ 18

1.3.5.1 Thành phần hóa học 18

1.3.5.2 Tác dụng dược lý 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 22

2.1.1 Nguyên vật liệu 22

2.1.2 Thiết bị 23

2.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Xây dựng một số phương pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ 24

2.3.1.1 Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm về vi học 24

2.3.1.2 Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm về hóa học 25

2.3.2 Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ 29

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Xây dựng một số phương pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ 34

3.1.1 Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm về vi học 34

3.1.1.1 Đặc điểm vi phẫu 34

3.1.1.2 Đặc điểm bột dược liệu 35

3.1.2 Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm về hóa học 38

3.1.2.1 Định tính các nhóm chất chính bằng các phản ứng hóa học 38

3.1.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 39

3.1.2.3 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC 40

3.2 Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ 55

3.2.1 Ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ đến thể tích nước tiểu 55

3.2.2 Ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ đến pH nước tiểu 55

3.2.3 Ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ đến số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu 56

3.2.4 Tác dụng ức chế sự lắng đọng tinh thể calci oxalat trong thận của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ trên mô hình gây sỏi tiết niệu bằng ethylen glycol 0,75% 59

Chương 4 BÀN LUẬN 61

4.1 Về xây dựng phương pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ 61

4.2 Về đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

I Kết luận 65

II Kiến nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AS: Hệ số đối xứng pic

CaOx: Calci oxalat

CE-MS: Capillary Electrophoresis with Mass Spectrometry

COD: Calci oxalat dihydrat

COM: Calci oxalat monohydrat

DAD: Detector mảng Diod (Diode-Array Detector)

EG: Ethylen glyol

ESI-MS: Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry

EtOAc: Ethyl acetat

HPLC: Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

IC50: nồng độ ức chế 50%

LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về tác dụng của dược liệu trong điều trị

sỏi tiết niệu 8

Bảng 1.2 Một số bài thuốc / dược liệu trong nước đã được nghiên cứu tác dụng trên sỏi tiết niệu 9

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của hạt Ý dĩ 14

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của rễ cây Ý dĩ 18

Bảng 2.1 Các phản ứng định tính các nhóm chất chính trong thân Ý dĩ 26

Bảng 2.2 Thang điểm phản ánh số lượng tinh thể niệu trung bình 32

Bảng 3.1 Kết quả định tính một số nhóm chất trong các mẫu thân Ý dĩ 38

Bảng 3.2 Các thông số HPLC của hệ dung môi 1 và hệ dung môi 2 41

Bảng 3.3 Chương trình dung môi 1 cho chế độ rửa giải gradient 43

Bảng 3.4 Chương trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient 43

Bảng 3.5 Các thông số HPLC của chương trình dung môi 1 và 2 44

Bảng 3.6 Các thông số HPLC của hệ acid 1 và hệ acid 2 45

Bảng 3.7 Chương trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient 46

Bảng 3.8 Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD 47

Bảng 3.9 Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính 48

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát đường chuẩn 49

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 50

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu 1 51

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi 52

Bảng 3.14 Kết quả định lượng acid p-coumaric trong một số mẫu Ý dĩ 53

Bảng 3.15 Hàm lượng trung bình (kl/kl) của acid p-coumaric trong các mẫu Ý dĩ 54 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần thân cây Ý dĩ đến thể tích nước tiểu (ml) 55

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ số lượng tinh thể calci oxalat trong nước tiểu 57

Bảng 3.18 Điểm đánh giá về số lượng ống thận có kết tập sỏi 59

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Thành phần hóa học của thân cây Ý dĩ 19

Hình 2.1 Cây Ý dĩ 22

Hình 2.2 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ

trên mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo 31

Hình 3.1 Hình ảnh vi phẫu thân của Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi L 34

Hình 3.2 Hình ảnh vi phẫu thân của Coix lachryma-jobi L var ma-yuen Stapf 35

Hình 3.3 Đặc điểm bột thân của Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi L 36

Hình 3.4 Đặc điểm bột thân Coix lachryma-jobi L var ma-yuen Stapf 37

Hình 3.5 Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết thân Ý dĩ với hệ dung môi Toluen : ethylacetat: acid formic (7:3:1) quan sát ở UV 254 nm (A), 366 nm (B) và

sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin - acid sulfuric (C) 39

Hình 3.6 Sắc kí đồ hệ dung môi 1 Hình 3.7 Sắc kí đồ hệ dung môi 2 41

Hình 3.8 Sắc kí đồ chương trình dung môi 1 Hình 3.9 Sắc kí đồ chương trình

dung môi 2 43

Hình 3.10 Sắc kí đồ của hệ acid 1 Hình 3.11 Sắc kí đồ của hệ acid 2 45

Hình 3.12 Sắc kí đồ HPLC của mẫu dược liệu 1 và mẫu acid p-coumaric đối chiếu

46

Hình 3.13 Đường chuẩn và phương trình hồi quy của acid p-coumaric 48

Hình 3.14 Sắc kí đồ HPLC của các mẫu dược liệu và mẫu acid p-coumaric đối

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sỏi tiết niệu là tình trạng bệnh lý đã được đề cập đến từ rất lâu trong y văn và

là một bệnh mạn tính, hay gặp, hay tái phát với tỷ lệ mắc bệnh lớn khoảng 2 - 12% trong cộng đồng dân cư [19] Sỏi gây tắc nghẽn đường tiết niệu mà hậu quả có thể dẫn đến ứ nước thận và hoại tử tổ chức thận, gây nhiễm khuẩn và gây đau, ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng của người bệnh [9] Trên thế giới có những vùng

có tỷ lệ sỏi tiết niệu cao gọi là vành đai sỏi Việt Nam cũng nằm trong vùng vành đai sỏi của thế giới [19]

Các phương pháp ngoại khoa điều trị sỏi tiết niệu đã tạo những bước tiến đáng kể tuy nhiên lại gây ra nhiều biến chứng, đặc biệt chưa cải thiện được tình trạng tái phát sỏi Trong khi đó, vai trò của điều trị nội khoa trong bệnh lý sỏi tiết niệu vẫn còn rất hạn chế Việt Nam có nguồn dược liệu rất phong phú và đã có nhiều dược liệu được nhân dân ta sử dụng với kinh nghiệm dân gian để điều trị sỏi tiết niệu Tuy nhiên, mới có rất ít dược liệu được nghiên cứu đầy đủ trên mô hình dược lý thực nghiệm cũng như trên lâm sàng

Ý dĩ là loài cây bản địa ở Việt Nam được trồng từ thời cổ xưa như một cây thuốc quý Trong khi hạt Ý dĩ đã được nhân dân ta sử dụng từ lâu vừa như một loại thực phẩm vừa như một vị thuốc có tác dụng bồi bổ cơ thể thì phần thân Ý dĩ thường không được sử dụng Tuy nhiên, một số nghiên cứu gần đây của chúng tôi cho thấy thân Ý dĩ cũng là một nguồn dược liệu rất đáng được quan tâm Chúng tôi

đã sưu tầm được một bài thuốc sử dụng trong dân gian để điều trị sỏi tiết niệu gồm

ba vị: thân cây Ý dĩ, lá cây Bồ đề, phần trên mặt đất của cây Xấu hổ Những nghiên cứu sơ bộ ban đầu cho thấy dịch chiết nước thân Ý dĩ có tác dụng ức chế sự hình

thành tinh thể calci oxalat in vitro Để có thể đưa thân Ý dĩ vào sử dụng trong điều

trị sỏi tiết niệu, cần có những nghiên cứu sâu hơn về tác dụng sinh học cũng như cần có các tiêu chuẩn để kiểm nghiệm dược liệu này

3

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh lý sỏi tiết niệu

1.1.1 Định nghĩa bệnh lý sỏi tiết niệu

Sỏi tiết niệu là sự hình thành và hiện diện sỏi trong đường tiết niệu Khi sỏi ở

vị trí nào thì có tên gọi theo vị trí giải phẫu (sỏi thận, sỏi niệu quản, sỏi bàng quang) [10]

1.1.3 Phân loại và thành phần cấu tạo sỏi tiết niệu

Trong sỏi có 90% trọng lượng là tinh thể, 5% là nước, 3% là protein và các

vi lượng khác Dựa vào cấu tạo hóa học người ta chia thành các loại sỏi: sỏi calci, sỏi urat, sỏi cystin và sỏi struvit [1], [32]

 Sỏi chứa calci là dạng phổ biến nhất chiếm khoảng 75% các loại sỏi thận, trong đó sỏi calci oxalat đơn độc chiếm 50%, sỏi calci phosphat 5% và sỏi hỗn hợp chiếm 45% [22] Sỏi này có tính cản quang, thường có màu đen hay trắng xám Sỏi calci oxalat gồm 2 dạng là calci oxalat monohydrat (COM) và calci oxalat dihydrat (COD)

- COM (Whewellite): hình que dài 6 cạnh hoặc hình bầu dục có nhân, có khả năng kết tụ cao, khả năng gắn chặt vào tế bào biểu mô ống thận, giữ lại tạo điều kiện hình thành sỏi [47]

4

- COD (Weddellite): hình vuông, góc kết nối bằng đường giao nhau, không kết tụ thành các khối bền vững, không gắn vào tế bào biểu mô ống thận, dễ dàng bị cuốn theo nước tiểu, khó tạo thành sỏi tiết niệu [47]

 Sỏi urat: thành phần gồm acid uric và urat, sỏi này thường tròn, nhẵn,màu vàng cam, gần như không cản quang, trừ khi hỗn hợp với sỏi calci hay sỏi struvit [1], [32]

 Sỏi struvit: đây là chất kết tinh tạo ra từ magnesi amoni phosphat Sỏi thường

có kích thước to, hình san hô, màu trắng ngà, có tính cản quang [1], [32]

 Sỏi cystin: thành phần chính là cystin, thường tròn, có màu vàng lục, tính cản quang trung bình [1], [32]

1.1.4 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh sỏi tiết niệu

Sỏi tiết niệu là tình trạng bệnh lý thường gặp trong các bệnh lý đường tiết niệu Mặc dù đã được đề cập đến từ rất lâu trong các y văn, nhưng quá trình hình thành sỏi tiết niệu hiện chưa được hiểu biết đầy đủ Sỏi tiết niệu do nhiều nguyên nhân và nhiều quá trình phức tạp gây nên [11]

Về nguyên nhân: sự hình thành sỏi không phải do một bệnh đặc biệt nào mà

là biến chứng của nhiều bệnh Vì vậy, sự phát sinh sỏi có nhiều nguồn gốc khác nhau tùy từng loại sỏi [9], [11], [32]:

- Yếu tố di truyền: Đối với sỏi cystin và sỏi urat, yếu tố di truyền đóng vai trò

quan trọng Sỏi cystin xuất hiện ở những bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử Vai trò di truyền trong sỏi urat, sỏi oxalat đã rõ ràng Đối với các loại khác yếu tố di truyền khó xác định hơn

- Các dị dạng bẩm sinh: Trên thực tế, những dị dạng bẩm sinh và mắc phải chỉ

là những yếu tố thuận lợi để tạo sỏi do ứ đọng và nhiễm khuẩn Nguyên nhân chủ yếu do rối loạn chuyển hóa các thành phần trong nước tiểu được bài tiết qua thận

- Yếu tố địa dư và khí hậu: Yếu tố này thường được các nhà dịch tễ học đưa

ra Khí hậu nóng và khô ở vùng sa mạc và vùng nhiệt đới là yếu tố môi trường tác động rất nhiều đến sự phát sinh bệnh sỏi đường tiết niệu

5

- Chế độ ăn uống: là một trong những nguyên nhân gây tác động trực tiếp đến bệnh sỏi Ví dụ thức ăn chứa nhiều purin, oxalat, calci, phosphat…có khả năng sinh sỏi cao hơn

- Rối loạn chuyển hóa: Nồng độ calci, acid uric máu quá cao, có cystin trong nước tiểu

- Các nguyên nhân khác: Nước tiểu bài tiết ra quá ít, nồng độ magnesi và acid citric trong nước tiểu quá thấp, pH quá kiềm hay quá acid Sỏi do nhiễm khuẩn như loại sỏi struvit Các trường hợp gãy xương, nằm bất động lâu cũng là những điều kiện hình thành sỏi

Về quá trình hình thành sỏi: hiện nay có hai thuyết chính được đưa ra để

giải thích quá trình hình thành sỏi là: thuyết “hạt tự do” (free partical) và thuyết “hạt

cố định” (fixed partical) [24]

- Thuyết “hạt tự do” cho rằng: hạt khởi đầu được hình thành ở ngoài tế bào (trong lòng ống thận) do hiện tượng tăng bài tiết các chất hòa tan vào nước tiểu tới mức quá bão hòa, gây kết tinh thành các tinh thể Các tinh thể trong nước tiểu sẽ dính vào nhau để tạo thành nhân, các nhân mới tiếp tục kết tập

để tạo thành hạt lớn hơn Các hạt sỏi này trôi theo dòng nước tiểu và bị “bẫy” lại ở các vị trí hẹp của đường tiết niệu Tại các vị trí này, chúng tiếp tục kết tập thêm các tinh thể và lớn dần lên để tạo thành sỏi

- Thuyết “hạt cố định” cho rằng: quá trình hình thành sỏi khởi đầu bằng sự lắng đọng các muối trong các mô kẽ thận hoặc trong các tế bào ống thận Các

mô và các tế bào này bị phá hủy và làm bộc lộ ra các tinh thể Các tinh thể này trở thành nhân gắn với một vị trí ở ống thận hoặc mô thận Các nhân này lớn dần lên do sự kết tập liên tục các tinh thể, rồi sau đó bong ra theo dòng nước tiểu Các hạt sỏi này bị “bẫy” lại ở các vị trí hẹp ở đường tiết niệu và tiếp tục lớn lên để trở thành sỏi

1.1.5 Điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu

1.1.5.1 Điều trị ngoại khoa

Điều trị ngoại khoa thường áp dụng với những sỏi có đường kính từ 5mm trở lên, khó có thể lọt qua được đường tiết niệu để đào thải ra ngoài Các phương pháp

6

điều trị ngoại khoa bao gồm: dẫn lưu bể thận qua da, dẫn lưu bể thận qua niệu quản, lấy sỏi qua nội soi bàng quang niệu quản, tán sỏi ngoài cơ thể, tán sỏi qua da, phẫu thuật nội soi lấy sỏi, mổ mở, cắt thận bán phần, cắt toàn bộ thận Tuy nhiên, các phương pháp này có nhược điểm là chi phí điều trị cao, nhiều tác dụng phụ và hầu như không có tác dụng trong việc phòng ngừa sỏi tái phát [11]

1.1.5.2 Điều trị nội khoa

- Điều trị nội khoa tống sỏi: nâng cao thể trạng và vận động, dùng kháng sinh chống nhiễm khuẩn, thuốc giãn cơ trơn, thuốc kháng cholinergic, thuốc chống viêm giảm phù nề, thuốc lợi tiểu nhẹ…[19]

- Điều trị nội khoa tan sỏi: sử dụng thuốc và hóa chất làm tan sỏi tùy loại sỏi, ví dụ: sỏi oxalat dùng magie citrat, natri citrat; sỏi phosphat dùng methionin hoặc amoni clorua ; sỏi cystin dùng natri bicarbonat, natri citrat hoặc D-penicillumin; sỏi uric dùng natri bicarbonat hoặc natri citrat…[19]

- Điều trị các triệu chứng và biến chứng: sử dụng kháng sinh chống nhiễm khuẩn, thuốc giãn cơ trơn, thuốc kháng cholinergic chống ứ nước tiểu, thuốc lợi tiểu nhẹ, thuốc giảm đau không opioid đối với bệnh nhân có cơn đau quặn thận [19]

- Điều trị nội khoa theo y học cổ truyền: nguyên nhân của chứng “thạch lâm” là

do thấp nhiệt ở hạ tiêu làm cặn nước tiểu đọng lại gây cản trở nước tiểu Thấp nhiệt gây ứ trệ và chảy máu Có 2 thể lâm sàng chính với phương thức điều trị khác nhau:

+ Thể thấp nhiệt (sỏi tiết niệu có nhiễm khuẩn): điều trị bằng thanh nhiệt, trừ thấp, bài thạch, lợi tiểu

+ Thể ứ trệ (sỏi gây xung huyết chảy máu): điều trị bằng lý khí hành trệ, thông lâm bài thạch [9]

1.1.5.3 Phòng chống tái phát

- Chế độ ăn uống: uống đủ nước, hạn chế ăn uống các chất góp phần tạo sỏi

- Chế độ lao động và luyện tập: hạn chế ngồi lâu một tư thế hoặc làm việc nhiều giờ trong điều kiện nóng bức, nên vận động nhiều

- Chế độ dùng thuốc và điều trị: điều trị triệt để các bệnh gây sỏi hoặc tạo điều kiện gây sỏi như phẫu thuật dị dạng đường tiết niệu, điều trị rối loạn chuyển hóa…

7

Dùng thuốc lợi tiểu nhẹ nhóm thiazid, vitamin nhóm B để hạn chế bong tróc biểu

mô [19]

1.2 Vai trò của dược liệu trong điều trị sỏi tiết niệu

Hiện nay mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong các phương pháp ngoại khoa điều trị sỏi tiết niệu với công nghệ hiện đại như tán sỏi ngoài cơ thể, tán sỏi qua nội soi niệu quản ngược dòng và phẫu thuật lấy sỏi qua da đã tạo nhiều bước tiến đáng kể trong điều trị sỏi tiết niệu nhưng vẫn chưa cải thiện được tình trạng tái phát sỏi Phương pháp tán sỏi ngoài cơ thể có hiệu quả trên dạng sỏi COD và sỏi urat, ít có tác dụng trên sỏi COM và sỏi cystin Hơn nữa, các phương pháp này còn gây nhiều tác dụng không mong muốn như tăng huyết áp, xuất huyết, hoại tử ống thận, tắc nghẽn niệu quản, nhiễm trùng, xơ hóa thận dẫn đến tổn thương tế bào và những mảnh sỏi sót lại là điều kiện thuận lợi tái phát sỏi [60] Hiện có rất ít tác nhân dược

lý có thể lựa chọn để điều trị sỏi tiết niệu Muối citrat và thuốc lợi tiểu thiazid đều cho hiệu quả hạn chế và khả năng dung nạp kém Vì vậy, việc tìm kiếm các phương pháp điều trị thay thế khác đặc biệt là sử dụng dược liệu đang là vấn đề được quan tâm hiện nay [38], [64]

Những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học

về tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của các dược liệu Một số nghiên cứu về tác dụng trong điều trị sỏi tiết niệu của một số dược liệu trên thế giới và Việt Nam được trình bày ở bảng 1.1 và bảng 1.2

8

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu trên thế giới về tác dụng của dược liệu trong điều

trị sỏi tiết niệu

dùng

Thử nghiệm

L

Toàn cây In vitro Tăng số lượng nhưng giảm kích

thước của các tinh thể calci

Toàn cây In vitro Làm giảm sự lớn lên và tập hợp

của các tinh thể calci oxalat

Thân rễ In vitro ức chế sự hình thành tinh thể

calci oxalat và sự kết tủa calci phosphat

[43], [50]

ngừa sự lắng đọng các tinh thể calci oxalat trong ống thận

Linn

Bộ phận trên mặt đất

thể trong thận bằng cách làm giảm sự bài tiết các thành phần của sỏi và làm tăng nồng độ của các chất ức chế sự hình thành sỏi trong thận

[70]

In vivo Làm giảm nồng độ của calci

oxalat trong thận, làm giảm sự lắng đọng calci oxalat ở trên

mô và trong lòng ống thận

L

thể calci oxalat ở thận, tăng nồng độ citrat và giảm nồng

độ oxalat trong nước tiểu

Bảng 1.2 Một số bài thuốc / dược liệu trong nước đã được nghiên cứu tác dụng

trên sỏi tiết niệu

STT Bài thuốc / dược liệu Thử nghiệm Kết quả nghiên

cứu

Tài liệu

1 Ngũ linh tán (Kim tiền thảo,

cối xay, bạch linh, trạch tả,

bạch truật, trư linh, kê nội

kim, quế)

In vivo, lâm

sàng

Bào mòn sỏi và tống sỏi kích thước nhỏ ra ngoài

[33]

2 Bài thuốc “bài sỏi” (Kim tiền

thảo, kê nội kim, uất kim, hải

kim sa, sa tiền tử)

Lâm sàng Tác dụng rất tốt

với tỷ lệ khỏi và

đỡ là 88,9%

[31]

[25], [26]

5 Kim tiền thảo (Desmodium

styracifolium (Osb.) Merr.)

In vitro

In vivo

Làm mòn sỏi và lợi tiểu

[25]

6 Rau om (Limnophila

aromatica (Lamk.) Merr.)

giảm đau

[25]

Cơ chế tác dụng trên sỏi tiết niệu của các dƣợc liệu cũng đã đƣợc nghiên cứu:

Một số dƣợc liệu có tác dụng điều trị bệnh lý sỏi tiết niệu là do có vai trò

“hòa tan” (bào mòn) sỏi nhƣ Bergenia ciliata (Haw.) Sternb [44], bài thuốc Ngũ

linh tán [33] hoặc tác dụng hỗ trợ lợi tiểu, làm tăng lƣợng chất lỏng qua thận, từ đó

tăng đào thải các chất lắng cặn nhƣ Bergenia ligulata Wall.[50], Herniaria hirsute

L.[41], Kim tiền thảo, Chuối hột[25] …

Một số dƣợc liệu có tác dụng ngăn cản sự kết tụ của tinh thể calci oxalat,

ngăn cản sự tạo mầm calci oxalat, ngăn cản sự lớn lên của tinh thể calci oxalat nhƣ

Phyllanthus niruri Linn.[66], Bergenia ligulata Wall [50]…; Làm giảm sự lắng

đọng các tinh thể ở trên mô và trong lòng ống thận nhƣ Herniaria hirsuta L.[40],

Bergenia ligulata Wall.[50], Ammi visnaga L.[74], Alisma orientalis (Sam.) Juzep

[64], Aerva lanata Linn.[70] ; Làm tăng nồng độ của các chất ức chế sự hình thành sỏi trong thận nhƣ Aerva lanata Linn.[70], Ammi visnaga L [74]…; làm giảm nồng

11

độ calci trong mô ở thận, cải thiệnn tình trạng quá bão hòa calci oxalat như Alisma

orientalis (Sam.) Juzep.[64]

Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng phân rã hệ thống treo mucoprotein-là tác nhân thúc đẩy sự kết tinh Một số dược liệu có đặc tính kháng khuẩn, bảo vệ lớp chất dính của niêm mạc, do đó có vai trò như một hàng rào bảo

vệ sỏi tiết niệu [53]

Một số dược liệu có tác dụng thăng bằng các chất điện giải, chất khoáng giống như tác dụng của hệ thống nội tiết bao gồm prostaglandin và các chất trung gian hóa học dẫn truyền thần kinh [52]

1.3 Cây Ý dĩ

1.3.1 Vị trí phân loại

Cây Ý dĩ (Coix lachryma – jobi L.) thuộc chi Coix L., họ Lúa (Poaceae), bộ Lúa (Poales), phân lớp Loa kèn (Liliidae), lớp Hành (Liliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) [3]

1.3.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Ý dĩ là loại cây sống hàng năm, cao khoảng 1-3 m Thân mọc thẳng, ít phân cành Lá mọc từ thân, hình dải, dài 10-40cm, rộng 1,5-7cm, gốc hình bầu dục hoặc hình tim, mép lá sắc, đầu lá nhọn sắc, lá có bẹ và lưỡi nhỏ Hoa đơn tính, cùng gốc, chùm hoa nhiều mọc thẳng đứng ở kẽ lá Mỗi chùm được bao bởi mày cứng hoặc mềm Hoa đực ở trên, hoa cái ở dưới Hoa đực rụng lúc trưởng thành, bao gồm nhiều bông con xếp chồng lên nhau theo cặp Hoa cái gồm nhiều bông con, mày phía dưới rộng bao lấy bông Quả thóc, có mày nhẵn bóng bao bọc [46] [27]

 Thực vật chí Trung Quốc phân biệt 4 thứ Ý dĩ khác nhau chủ yếu dựa trên hình thái quả [46]:

* Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi L

Quả hình trứng, cứng và bóng, kích thước 7-11 x 6-10 mm

* Coix lachryma-jobi L var ma-yuen (Rom) Stapf

Quả mảnh, có rãnh, màu xanh xám hoặc nâu đen, hình elip đến gần hình cầu, kích thước 8-12 x 4-9mm, giòn, dễ vỡ

* Coix lachryma-jobi L var puellarum

12

Quả hình cầu, rất cứng rắn, màu trắng hoặc hơi xanh, đường kính 4-5mm

* Coix lachryma-jobi L var stenocarpa

Quả hình trụ, bóng, màu trắng, hơi xanh hoặc nâu, 7-15 × 2-3 mm

Ở Việt Nam, Ý dĩ mọc tự nhiên phân bố rải rác ở một số tỉnh vùng núi phía bắc như Lào Cai, Hà Giang, Lai Ckhâu…Cây thường mọc gần nguồn nước, dọc bờ khe suối ở cửa rừng hay trong thung lũng Ý dĩ trồng thường không cố định theo khu vực Vào đầu những năm 90, cây được trồng nhiều ở Kon Tum, Đồng Nai…Sau đó từ năm 1995-1997 được trồng ở Sơn La (Mộc Châu), Hòa Bình (Mai

Châu) và Hà Tây…Việt Nam là nước trồng nhiều Ý dĩ trong khu vực [34]

 Theo tác giả Võ Văn Chi [13], ở Việt Nam thường gặp 3 thứ, đó là:

* Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi L

* Coix lachryma-jobi L var ma-yuen (Rom) Stapf

* Coix lachryma-jobi L var puellarum

 Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ [20], Ý dĩ gồm có 2 thứ:

* Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi L

* Coix lachryma-jobi L var ma-yuen (Rom) Stapf

1.3.3 Công dụng theo Y học cổ truyền

Trong Y học cổ truyền Ý dĩ chủ yếu dùng hạt hoặc rễ [4], [12]; thân lá ít được

sử dụng

Hạt Ý dĩ có vị ngọt, nhạt, tính mát; quy kinh tỳ, phế, vị Hạt có tác dụng lợi tiểu, trừ thấp, tống thoát mủ, kiện tỳ, bổ phế Dùng để bồi dưỡng cơ thể, bổ phổi, chữa tê thấp, phù thũng, bí tiểu tiện, tiểu buốt, phế ung [4], [12], [27], [34] Ý dĩ sao vàng hoặc sao với nước gừng có tác dụng ôn bổ phế tỳ [4]

Rễ có vị ngọt, tính hơi hàn; có tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, tẩy giun sán Dùng

để trị ho, ung nhọt, sỏi niệu đạo, viêm gan, cam tích, động kinh [4], [12]

1.3.4 Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Ý dĩ

13

1.3.4.1 Thành phần hóa học

 Hạt Ý dĩ: Bên cạnh tinh bột, protein, các acid amin, các nhóm chất chính đã

đƣợc phân lập từ hạt Ý dĩ bao gồm: coixenolid 1, - monolinolein 2, các policosanol 3 - 6 , các phytosterol 7- 12, , các amid 13, 14, các hợp chất lactam 15 - 19, các hợp chất phenol 20- 24, (cấu trúc các chất đƣợc trình bày

ở bảng 1.3) các polysaccharid coixan A, B, C [72] và một số acid béo nhƣ acid stearic, acid oleic, acid linoleic [65]

6

OH

octacosanol (C28)

H HO

Campesterol

9

C O O

HO

OCH 3

Feruloyl campesterol

H HO

Sitosterol

H HO

Stigmasterol

O O

H O OCH 3

Feruloyl stigmastanol

14

NH O

OH

(CH2)13C

H2HO

O

Methyl dioxinndole-3-acetate

OH OCH 3

18

 Rễ: chứa tinh bột, protein, chất béo [27], một số hợp chất benzoxazinon 25 –

30 có tác dụng chống viêm đã phân lập [45] Cấu trúc các chất đƣợc trình

bày ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của rễ cây Ý dĩ

Gần đây nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã phân lập và xác định đƣợc cấu

trúc của 7 chất từ thân Ý dĩ bao gồm : stigmast-4-en-3-on 31, β-sitosterol 32,

19

stigmasterol 33, (E)-ethyl-3-(4-hydroxyphfrenyl) acrylat 34, acid isovanillic 35 ,

4-hydroxy benzaldehyd 36 [18], [23] và acid p-coumaric 37 [37]

Hình 1.1 Thành phần hóa học của thân cây Ý dĩ

 Theo định hướng tác dụng điều trị sỏi tiết niệu, nhóm nghiên cứu của chúng

tôi đã sơ bộ đánh giá bước đầu tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat in

vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của thân Ý dĩ Kết quả

cho thấy dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ ở nồng độ 1g/ml (tính theo dược liệu khô

tuyệt đối) có tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat in vitro với tỷ lệ phần

trăm ức chế là 39% Tác dụng ức chế tăng dần theo nồng độ

21

Trên hình ảnh sỏi quan sát được dưới kính hiển vi nhận thấy dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ làm giảm số lượng tinh thể, nhiều tinh thể tồn tại ở dạng calci oxalat dihydrat (COD) là dạng dễ đào thải khỏi cơ thể Trong số các phân đoạn dịch chiết, phân đoạn ethyl acetat là phân đoạn có tác dụng ức chế mạnh nhất sự hình thành

tinh thể calci oxalat in vitro Từ phân đoạn ethyl acetat nhóm nghiên cứu đã phân

lập được thành phần chính là acid p-coumaric [37] Kết quả đánh giá tác dụng

in vitro trên sỏi tiết niệu của acid coumaric cho thấy: ở nồng độ ≥ 1mM, acid

p-coumaric thể hiện tác dụng ức chế sự hình thành tinh thể rõ rệt, tác dụng ức chế này tăng dần theo nồng độ Phần trăm ức chế tối đa đạt được là 72,0% ở nồng độ 10mM Tác dụng ức chế hình thành tinh thể calci oxalat của acid p-coumaric mạnh hơn chứng dương natri citrat, với giá trị IC50 là 2,35 mM (khoảng tin cậy 95%: 1,47 – 3,10) so với 9,61 mM (khoảng tin cậy 95%: 8,29 – 11,16) của natri citrat [36]

1.3.6 Kiểm nghiệm Ý dĩ theo tiêu chuẩn Dược điển

Ý dĩ đã được sử dụng làm thuốc từ lâu chủ yếu với bộ phận dùng là hạt Hiện nay một số Dược điển đã có tiêu chuẩn kiểm nghiệm hạt Ý dĩ đó là Dược điển Việt Nam IV, Dược điển Trung Quốc, Dược điển Châu Âu với thứ Ý dĩ được quy định

trong Dược điển là Coix lachryma - jobi L var ma-yuen Stapf, họ Lúa (Poaceae)

Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm trong các Dược điển này gồm: mô tả đặc điểm hạt, đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột, định tính bắng sắc ký lớp mỏng, độ ẩm, độ tro toàn phần, tạp chất, tỷ lệ vụn nát, chất chiết được trong dược liệu [21], [48], [49] Riêng Dược điển Trung Quốc và Dược điển Châu Âu có thêm tiêu chuẩn định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng chất đối chiếu là glycerin trioxalat [48] hoặc triolein [49]

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy thân Ý dĩ cũng là một dược liệu đáng

quan tâm Tuy nhiên Dược điển các nước chưa có tiêu chuẩn kiểm nghiệm thân Ý

dĩ

22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Dược liệu

Dược liệu là phần, bỏ lá của cây Ý dĩ

- Mẫu 1: thu hái tại Từ Liêm – Hà Nội vào tháng 10 năm 2012 và được TS Trần Thế Bách - Phòng Thực Vật - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật

giám định tên khoa học là: Coix lachryma-jobi L var lachryma–jobi L., họ Lúa (Poaceae)

- Mẫu 2, mẫu 3: thu hái tại Phú Lương - Thái Nguyên vào tháng 11 năm 2013

và được PGS.TS Trần Văn Ơn - Bộ môn Thực Vật - Trường Đại học Dược

Hà Nội giám định tên khoa học lần lượt là: Coix lachryma–jobi L var

lachryma–jobi L và Coix lachryma–jobi L var ma-yuen Stapf, họ Lúa

(Poaceae)

Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng thực vật, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật và Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội

Dược liệu được sấy khô, tán nhỏ, bảo quản trong túi nilon buộc kín để nơi khô ráo

Hình 2.1 Cây Ý dĩ

23

 Hóa chất :

- Ethylen glycol 1,111 – 1,115g/ml (Xilong chemical); Natri citrat (Merck)

- Chất chuẩn: acid p-coumaric của hãng Sigma- Aldrich với hàm lượng 99,6%

- Methanol, nước cất, acid phosphoric, acid formic đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC

- Dung môi: methanol, ethyl acetat, toluen, acid formic… dùng cho chiết xuất

và sắc kí đạt tiêu chuẩn phân tích

 Bản mỏng : Bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 của hãng Merck

 Động vật thí nghiệm :

- Chuột cống trắng sáu tuần tuổi, giống đực, cân nặng khoảng 110 ± 20 gam, do Học viện quân y cung cấp

- Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm đến cân nặng khoảng

140 ± 20 gam trước khi thực hiện nghiên cứu, động vật được cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.1.2 Thiết bị

- Kính hiển vi kết nối máy ảnh của hãng Laica

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R210

- Tủ sấy Binder

- Đèn tử ngoại Vilbez Lourmat (hai bước sóng λ = 254 nm và λ = 366 nm)

- Máy đo độ ẩm Sartorius

- Máy chấm SKLM Linomat 5 của hãng Camag ; hệ thống chụp ảnh và lưu ảnh Respon 3 của hãng Camag

- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC-LC 10A (Shimadzu), cột tách Ascentis C18 (250mm x 4,6 mm; 5µm)

- Máy cất nước 2 lần Hamillton của hãng Hamillton Laboratory Glas Limited

- Máy đo pH Euteck instrument pH 510

- Máy li tâm HERMLE Z300

- Cân phân tích Precisa XT, cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius)

24

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Xây dựng một số phương pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ:

 Về đặc điểm vi học

 Về thành phần hóa học:

- Định tính bằng phản ứng hóa học

- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

- Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric bằng HPLC

 Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý

dĩ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng một số phương pháp kiểm nghiệm thân Ý dĩ

2.3.1.1 Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm về vi học

Nghiên cứu đặc điểm vi học của thân Ý dĩ được tiến hành trên nhiều mẫu và

trên cả 2 thứ khác nhau đó là Coix lachryma-jobi L var lachryma-jobi L và Coix

lachryma-jobi L var ma-yuen Stapf theo phương pháp trong tài liệu [2], [7], [30]

Từ đó đưa ra các tiêu chuẩn cụ thể để kiểm nghiệm dược liệu về mặt vi học

 Đặc điểm vi phẫu thân Ý dĩ

- Chọn mẫu: sau khi thu hái, chọn nhiều mẫu thân không quá già hoặc quá non, ngâm trong hỗn hợp nước – glycerin – ethanol (1:1:1) để làm mềm và bảo quản

- Cắt tiêu bản bằng máy cắt cầm tay

- Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung nước Javen, rửa sạch bằng nước, tẩy tiếp bằng chloralhyrdrat 75%, rửa lại bằng nước, ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nước đến hết acid Sau đó tiến hành nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh methylen

- Quan sát, mô tả và chụp ảnh: Lên tiêu bản bằng dung dịch glycerin rồi quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn máy ảnh

 Đặc điểm bột dược liệu

25

- Sấy khô dược liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C sau đó dùng dao cầu cắt nhỏ rồi nghiền bằng thuyền tán Rây lấy bột mịn

- Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị

- Lên tiêu bản bột dược liệu bằng nước cất, quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên kính hiển vi có gắn máy ảnh Ảnh các đặc điểm được chuyển vào máy vi tính, ghép thành ảnh hoàn chỉnh

2.3.1.2 Xây dựng phương pháp kiểm nghiệm về hóa học

 Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu bằng các phản ứng hóa

học

Sử dụng các phản ứng hóa học thường quy như mô tả trong tài liệu [6] để xác định một số nhóm chất chính có trong thân Ý dĩ Cách tiến hành như ở phụ lục

2 và được tóm tắt ở bảng 2.1

- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%

27

Từ kết quả định tính đưa ra phương pháp kiểm nghiệm dược liệu bằng phản ứng hóa học

 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón, thêm

MeOH 80% ngập dược liệu, ngâm lạnh 24h, lọc lấy dịch chiết MeOH, cô đến cắn Hòa tan cắn trong khoảng 10ml nước rồi đem chiết với EtOAc (2 lần x 10ml) Dịch chiết ethyl acetat được loại nước bằng Na2SO4 khan, bay hơi dung môi đến cắn Lấy cắn hòa tan trong 5ml MeOH để được dung dịch chấm sắc kí

- Chuẩn bị dung dịch chất đối chiếu: hòa tan acid p-coumaric trong MeOH để được

dung dịch có nồng độ khoảng 1mg/ml

- Chuẩn bị bản mỏng: bản mỏng tráng sẵn silicagel 60F254 (Merck) Bản mỏng được hoạt hóa ở 1100C trong 1h

- Dung môi khai triển: Toluen : ethylacetat: acid formic (7:3:1)

- Đưa chất lên bản mỏng: 10 µL mẫu thử; 0,5 µL chất đối được đưa lên bản mỏng

dưới dạng vạch dài 8mm

- Khai triển: 10 cm

- Làm khô: trong không khí

- Quan sát: dưới ánh sáng tử ngoại ở 2 bước sóng 254 nm và 365 nm

- Hiện màu: sử dụng thuốc thử vanillin/acid sulfuric, sấy bản mỏng ở 1100C trong 5 phút Quan sát dưới ánh sáng thường

 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC

Khảo sát quá trình xử lí mẫu

Dựa vào độ tan của acid p-coumaric để lựa chọn dung môi chiết xuất cho phù hợp Sau đó tiến hành khảo sát quá trình xử lí mẫu tiếp theo để loại tạp chất trong dịch chiết

Khảo sát điều kiện sắc kí

Phép phân tích được thực hiện trên hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector UV-VIS

28

Điều kiện khảo sát ban đầu được tiến hành dựa trên kết quả định lượng acid

p-coumaric bằng phương pháp HPLC trong cây Leptadinia reticulate của Geetha và

cộng sự [51] Tiến hành khảo sát điều kiện sắc kí trên cột tách Ascentis C18 (250mm

x 4,6 mm; 5µm); pha động gồm MeOH phối hợp với acid formic 1% hoặc acid phosphoric 0,01% theo các tỷ lệ khác nhau; khảo sát chương trình dung môi rửa giải đẳng dòng (isocratic elution) hoặc rửa giải gradient (gradient elution)

Các kết quả thu được ứng với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR) của chất phân tích, độ phân giải (RS) và hệ số đối xứng pic (AS) Phương pháp đánh giá dựa trên lí thuyết Van Deemter sao cho RS ≥ 1,5; AS nằm trong khoảng từ 0,8-1,5 Thời gian lưu (tR) của các chất phân tích không quá lớn nhưng phải đảm bảo tách xa nhau [8], [16]

Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc kí, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric bằng HPLC trong Ý dĩ:

Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ

thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền

- Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu của nền

Để xác định LOD, ta phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích và xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N) (S

là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền, S/N = 2-3) Giới hạn định lượng LOQ = 3,3x LOD [16]

Xây dựng đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính

Tiến hành chuẩn bị và phân tích 7 mẫu chuẩn có nồng độ là 0,635; 1,27; 2,54; 6,35; 12,7; 25,4; 63,5 µg/ml Xây dựng phương trình hồi quy giữa diện tích pic và nồng độ acid p-coumaric có trong mẫu chuẩn Từ các thông số thu được tính toán hệ

Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại của phương pháp là mức độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm

cá thể khi phương pháp được áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính độ lệch chuẩn tương đối, với yêu cầu RSD ≤ 2% [16]

 Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để định lượng acid p-coumaric trong thân 3 mẫu Ý dĩ, mỗi mẫu được định lượng 3 lần, lấy kết quả trung bình

2.3.2 Đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân

Ý dĩ

- Mục đích: Áp dụng mô hình gây sỏi tiết niệu trên động vật thực nghiệm đã

triển khai cho chuột cống trắng giống đực khỏe mạnh được uống nước hàng ngày có

bổ sung tác nhân gây sỏi là ethylen glycol nồng độ 0,75% trong vòng 4 tuần để gây

30

sỏi calci oxalat lắng đọng trong thận để đánh giá tác dụng in vivo trên sỏi tiết niệu

của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ [35]

- Chuẩn bị dịch chiết dược liệu:

1kg mẫu dược liệu 1 (Coix lachryma – jobi L var lachryma – jobi L.) được

chiết với dung môi là ethanol 70% bằng cách ngâm ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ thu dịch chiết lần 1 Bã dược liệu tiếp tục được chiết lần 2, lần 3 với ethanol 70% và tiến hành rút dịch chiết sau 24 giờ Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc 0,45 µm, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, tiếp tục cô dịch chiết được cao lỏng 3:1 để thử tác dụng sinh học

- Bố trí thí nghiệm:

Chuột cống trắng giống đực được chia ngẫu nhiên thành 3 lô:

Tất cả các lô chuột đều được gây sỏi bằng dung dịch EG 0,75% bổ sung vào nước uống hàng ngày Cho chuột ăn với chế độ ăn bình thường

Lô chứng bệnh: Hàng ngày chuột được uống nước với thể tích 1ml/100g chuột

Lô chứng dương: Hàng ngày chuột được uống dung dịch natri citrat 25% (kl/tt) với liều 2,5g/kg chuột

Lô Ý dĩ: Hàng ngày cho chuột uống cao lỏng Ý dĩ với liều 2,52g/kg chuột Chuột uống nước cất và các dung dịch theo qui định vào cùng một thời điểm trong ngày trong suốt quá trình thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trong 28 ngày

Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, thu gom nước tiểu 5 giờ để xác định thể tích, pH, số lượng và kích thước tinh thể calci oxalat trong nước tiểu Giải phẫu thận chuột để làm mô bệnh học

Quy trình thí nghiệm được mô tả trong hình 2.2

31

Hình 2.2 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng của dịch chiết toàn phần thân

Ý dĩ trên mô hình gây sỏi tiết niệu in vivo

Các thông số đánh giá

 Thể tích nước tiểu

Nước tiểu 5 giờ được lấy vào ngày trước ngày kết thúc thí nghiệm thông qua lồng hứng nước tiểu Rút thức ăn trong quá trình lấy mẫu Nước tiểu ngay sau đó được xác định thể tích bằng ống đong

Vào thời điểm ban đầu, cho chuột uống nước, thuốc đối chiếu natri citrat hoặc cao lỏng Ý dĩ đã được quy định theo lô Sau đó, cứ mỗi 2h cho chuột uống