Triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi trail để đánh giá trên một số dược liệu

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRAIL: Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand TNF: Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u FADD: Fas-associating protein with death domain

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CAO THỊ TUẤT TRIỂN KHAI MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐỘC

TẾ BÀO TRUNG GIAN BỞI TRAIL ĐỂ ĐÁNH

GIÁ TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CAO THỊ TUẤT

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM ĐỘC TẾ BÀO TRUNG GIAN BỞI TRAIL ĐỂ ĐÁNH GIÁ

TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 60720408

Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng

TS Nguyễn Thị Lập

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS Phạm Thị

Nguyệt Hằng, TS Nguyễn Thị Lập đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị thuộc khoa Dược lý – Sinh hóa – Viện Dược Liệu đã giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại khoa

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội đã ủng hộ tôi trong quá trình học tập

và làm đề tài tốt nghiệp

Cuối cùng xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè – những người luôn sát cánh, động viên, khích lệ tôi cố gắng học tập, phấn đấu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2014

Học viên: Cao Thị Tuất

1.1.2 Phân loại ung thư theo nguồn gốc tế bào 3

1.1.6 Các thuốc điều trị ung thư hiện nay 11

1.2 Apoptosis (Tế bào chết theo chương trình) 14

1.3 TRAIL và các thụ thể của TRAIL 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Nghiên cứu triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian

bởi TRAIL

23

2.2.2 Nghiên cứu khả năng ức ché tế bào bằng mô hình thử nghiệm

độc tế bào trung gian bởi TRAIL

26

3.1 Triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi

TRAIL

29

3.1.1 Khảo sát nồng độ nuôi cấy 2 dòng tế bào ung thư vú (MDA–

MB–231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa)

29

3.1.2 Khảo sát nồng độ TRAIL đối với từng dòng tế bào 30

3.1.3 Tác dụng của thuốc chữa ung thư đối chứng Adriamycin khi kết

hợp và không kết hợp với TRAIL

31

3.2 Đánh giá tác dụng ức chế của 27 mẫu dược liệu trên mô hình

thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL

32

3.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế của 27 mẫu dược liệu trên 2 dòng tế

bào ung thư vú (MDA- MB-231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TRAIL: Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand

TNF: Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử khối u)

FADD: Fas-associating protein with death domain (Fas-protein liên kết có miền

chết)

DD: Death domain (Miền chết)

DISC: Death-inducing signaling complex (phức hợp tín hiệu gây chết)

Apaf-1: Apoptotic protease-activating factor-1 (yếu tố hoạt hóa các enzyme ly

giải protein liên quan đến quá trình Apoptosis)

MMP: Mitochondrial membrane permeabilization (tính thấm hoá của màng ty

thể)

AIF: Apoptosis inducing factor (yếu tố gây ra apoptosis)

Bid: Bcl-2 inhibitory BH3-domain-containing protein ( protein có BH3 ức chế

Bcl-2)

Bcl-2: B-cell lymphoma

Bcl- XL: B-cell lymphoma- extra large

OPG: Osteoprotegerin

SMAC/DIABLO: Second mitochondria-derived activator of caspase/direct

inhibitor of apoptosis binding protein with low pI (protein hoạt hóa caspase có

nguồn gốc tư ty thể / ức chế trực tiếp của protein liên quan quá trình apoptosis

với pI thấp)

XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis (chất ức chế liên kết với X của quá trình

apoptosis)

MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide

DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium

Adr: Adriamycin

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Khảo sát nồng độ nuôi cấy dòng tế bào ung thư vú

Bảng 3.2: Khảo sát nồng độ nuôi cấy dòng tế bào ung thư tử cung (Hela) 29

Bảng 3.3: Tác dụng ức chế của TRAIL trên 2 dòng tế bào ung thư 30

Bảng 3.4: Tác dụng ức chế của Adriamycin trên 2 dòng tế bào ung thư 31

Bảng 3.5: Tác dụng ức chế của Adriamycin trên dòng tế bào ung thư vú

(MDA- MB-231) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 32

Bảng 3.6: Tác dụng ức chế của Adriamycin trên dòng tế bào ung thư tử

cung (Hela) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 32

Bảng 3.7: Danh sách các mẫu thử tác dụng ức chế 2 dòng tế bào ung thư

Bảng 3.8: Tác dụng ức chế của các mẫu thử trên dòng tế bào ung thư vú

(MDA- MB-231) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 35

Bảng 3.9: Tác dụng ức chế của các mẫu thử trên dòng tế bào ung thư tử

cung (HeLa) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 37

Bảng 3.10: Nồng độ IC50 của các mẫu dược liệu trên dòng tế bào ung thư

vú (MDA- MB-231) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 39

Bảng 3.11: Nồng độ IC50 của các mẫu dược liệu trên dòng tế bào ung thư

tử cung (Hela) khi có TRAIL (T+) hoặc không có TRAIL (T-) 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh ung thư ngày càng có xu hướng gia tăng không chỉ ở các nước phát triển mà ngay cả các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam Theo Tổ chức

Y tế thế giới, hàng năm có trên 12 triệu trường hợp mắc mới ung thư [44] Và tỷ

lệ mắc bệnh này đang có xu hướng gia tăng ở phần lớn các nước trên thế giới Theo thống kê năm 2008 cho thấy trên toàn cầu có khoảng 28 triệu người đang sống chung với bệnh ung thư Nếu không có các biện pháp can thiệp kịp thời thì con số này sẽ lên tới 75 triệu vào năm 2030 [44] Chỉ riêng ở Việt Nam năm

2000, tỷ lệ mắc chung của bệnh ung thư ở nam giới là 14/100.000 dân, ở nữ giới

là 101/100.000, thì đến năm 2010 tỷ lệ này ở nam giới tăng đến 181/100.000 dân

và ở nữ giới tăng đến 134/100.000 dân [5, 6]

Ở các nước phát triển ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai sau bệnh tim mạch Ở các nước đang phát triển ung thư đứng hàng thứ ba sau bệnh nhiễm trùng/ ký sinh trùng và tim mạch Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm có khoảng trên 7,6 triệu người chết do ung thư Tỷ lệ chết do ung thư chiếm tới 13% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở người Theo dự báo đến năm 2030, số người chết vì ung thư hàng năm khoảng 17 triệu người [27] Ở Việt Nam, theo báo cáo của Bộ Y tế tại hội nghị khoa học quốc tế về phòng chống ung thư tổ chức ở Bệnh viện Bạch Mai ngày 11/4/2013, số ca tử vong do ung thư hằng năm khoảng 82.000 trường hợp

Trước sự nguy hiểm của ung thư, con người đã, đang và tiếp tục tìm cách phòng và chữa trị Có nhiều phương pháp để điều trị ung thư như phẫu thuật, vật

lý trị liệu (xạ trị), hóa trị liệu (dùng thuốc điều trị ung thư), tăng cường miễn dịch, vaccine…,tuy nhiên hiệu quả chưa thực sự cao và gây ra nhiều tác dụng phụ

TRAIL là một thành viên của đại gia đình hoại tử khối u TNF gây chết tế bào theo chương trình và giết tế bào ung thư một cách đặc hiệu nhưng có rất ít hoặc không có tác dụng phụ trên phần lớn những tế bào thường [61, 62] TRAIL hiện

đang được được sử dụng trong chiến lược điều trị ung thư [58] TRAIL liên kết với 2 receptor có chứa miền gây chết tế bào là TRAIL-R1 và TRAIL-R2 làm chết tế bào theo chương trình [50] Tuy nhiên, một số dòng tế bào ung thư, đặc biệt là khối u ác tính lại có khả năng chống lại sự chết tế bào theo chương trình gây bởi TRAIL, dẫn đến hạn chế trong việc sử dụng TRAIL trong liệu pháp điều trị ung thư [48] Việc dùng kết hợp TRAIL với phương pháp hóa trị liệu ung thư hoặc xạ trị có tác dụng kích thích gây độc tế bào khối u một cách đặc hiệu, tuy nhiên liệu pháp điều trị này dẫn đến độc không chỉ đối với những tế bào ác tính

mà còn diệt luôn cả tế bào lành [64] Do đó, việc nghiên cứu để tìm ra những chất an toàn, có hiệu quả để làm cho TRAIL có tác dụng điều trị ung thư đang được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới Chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc các dẫn xuất của nó chính là ứng cử viên tiềm năng trong liệu pháp điều trị này

Xuất phát từ tình hình này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Triển khai

mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL để đánh giá trên một

số dược liệu” với các mục tiêu sau:

1 Triển khai được mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL

2 Đánh giá được tác dụng của 26 mẫu dược liệu trên mô hình này

Chương 1 TỔNG QUAN 1.2 Đại cương về bệnh ung thư

1.1.1 Định nghĩa

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách

vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa hơn của cơ thể bằng cách đi vào máu hoặc hệ bạch huyết [5]

1.1.2 Phân loại ung thư theo nguồn gốc tế bào:

Hiện nay các loại ung thư được các nhà khoa học phân chia theo nguồn gốc phát sinh tế bào của chúng, gồm [1, 8, 30]:

● Carcinoma (nguồn gốc biểu bì): là dạng ung thư phổ biến nhất, xuất phát

từ những tế bào có nguồn gốc từ lá phôi trong và lá phôi ngoài Đó là các loại ung thư phổi, ung thư vú, ung thư trực tràng…

● Sarcoma: là dạng ung thư ít gặp hơn, xuất phát từ những tế bào có nguồn gốc từ lá phôi giữa và là những tế bào thuộc vào hệ thống cơ, xương, sụn, mỡ,

mô liên kết

● Lymphoma: là dạng ung thư tương đối hiếm gặp, xuất phát từ các hạch bạch huyết và các mô thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể như ung thư lymphoma Burkitt

● Leukemia: là dạng ung thư nguy hiểm do biểu hiện bệnh rất sớm, ở cả trẻ

em và người lớn, xuất phát từ các tế bào máu non thuộc tủy xương và có xu hướng tích tụ thành số lượng lớn trong hệ máu như ung thư bạch cầu cấp tính

1.1 3 Cơ chế sinh bệnh ung thư

1.1.3.1 Cơ chế gen

Các gen đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển ung thư bao gồm

sự phân chia tế bào, biệt hoá, tạo mạch máu, xâm lấn và chết tế bào Quá trình này liên quan chặt chẽ đến tổn thương hai nhóm gen: gen sinh ung thư oncogene

và gen kháng ung thư, cả hai loại gen này luôn tồn tại trong mọi tế bào bình

thường và đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát quá trình sinh sản tế bào, sự biệt hoá tế bào và quá trình chết theo chương trình của tế bào, đồng thời cả hai gen này liên kết chặt chẽ trong quá trình sinh ung thư giúp cho sự ổn định sinh học của cơ thể [5]

Gen sinh ung thư: hiện nay đã tìm ra được trên 50 loại oncogen có vai trò tổng hợp ra protein đóng góp vào sinh ung thư Các gen sinh ung thư có thể thuộc nhóm các yếu tố tăng trưởng bị hoạt hoá bất thường (c-sis); các thụ thể yếu tố tăng trưởng (HER2/neu và FMS); các phân tử dẫn truyền tín hiệu tế bào (c-SRC, Ras và cFMS) hoặc là các yếu tố sao chép của nhân tế bào (c-myc) Bất

cứ đột biến hoạt hoá nào trong các gen trên đều có thể làm gia tăng dẫn truyền tín hiệu làm cho tế bào đi vào chu kỳ không hợp lý và có liên quan đến sự sinh ung thư [8]

Trái với các gen sinh ung thư, các gen kháng ung thư mã hoá cho những protein kiểm soát phân bào theo hướng ức chế, làm chu kỳ phân bào bị dừng ở một pha nào đó, thường ở pha G1, các gen kháng ung thư còn có chức năng làm biệt hoá tế bào, hoặc mã hoá tế bào chết theo chương trình, khi các gen kháng ung thư bị bất hoạt do đột biến sẽ làm biến đổi tế bào lành thành tế bào ác tính Cho đến nay người ta đã biết đến các gen ức chế u gồm APC, BRCA1, BRCA2, NF1, NF2, WT1 và VHL, đặc biệt gen RB và p53 có ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào Gen RB ức chế chu kỳ tế bào bằng cách gắn kết với E2F1 và ngăn cản các gen này (gen cần cho tế bào vào pha S) Gen RB bị đột biến trong nhiều loại ung thư, các gen khác có thể có đột biến ở các nơi khác nhau trong chu kỳ tế bào có

RB tham gia Khi mất chức năng dẫn truyền tín hiệu tế bào của RB có thể làm mất sự kiểm soát ngăn cản chu kỳ tế bào Khi kết hợp với các đột biến khác gây

ra mất các tín hiệu gây chế tế bào, do đó làm gia tăng chuyển dạng tế bào ác tính Gen p53 ngăn cản chu kỳ tế bào bằng cách hoạt hoá sao chép ra CK1, P21

để ngăn cản sự hoạt hoá của CdK để nó không thể phospho hoá RB Gen này cũng làm cho tế bào dừng lại ở pha G1 và làm tế bào chết theo chương trình

(apoptosis) Khi đột biến gây bất hoạt gen p53 là nguyên nhân của hơn 50% trường hợp ung thư [5, 7]

1.1.3.2 Cơ chế tế bào

Người trưởng thành bình thường trung bình có khoảng 1 triệu tỷ tế bào xuất phát từ một trứng được thụ tinh Số lượng tế bào mới trong cơ thể được tạo ra bằng số lượng tế bào chết đi và luôn giữ ở mức hằng định Khi ung thư, tế bào sinh sản vô hạn độ ngoài sự kiểm soát của cơ thể đã phá vỡ mức hằng định (tế bào sinh nhiều hơn tế bào chết)

Cơ chế của tăng sinh số lượng của các quần thế tế bào có thể do chu trình tế bào được rút ngắn dẫn đến tăng số lượng tế bào được tạo ra trong một đơn vị thời gian, hoặc do giảm vận tốc tế bào chết đi cũng đưa đến kết quả có nhiều tế bào được tạo ra hơn Một cơ chế khác là tế bào Go trở lại chu trình làm tăng thêm số lượng tế bào trong một đơn vị thời gian [5]

Sự tăng sinh vô hạn độ của tế bào ung thư còn liên quan đến cơ chế mất sự

ức chế tiếp xúc: tế bào bình thường khi đang ở quá trình phân chia, nếu tiếp xúc với tế bào bình thường khác cũng đang phân bào thì quá trình phân bào chấm

dứt Trong ung thư cơ chế này không còn [5]

1.1.3.2 Cơ chế khác

Các yếu tố vi môi trường cũng ảnh hưởng đến sự sống còn của tế bào ung thư Các biến đổi đường dẫn truyền tín hiệu gây chết tế bào, đột biến các tín hiệu duy trì sự sống thay đổi các yếu tố tăng trưởng hay tác động của cytokin làm thuận lợi cho khối u phát triển [5]

Sinh ung thư còn liên quan tới cơ chế suy giảm miễn dịch: ung thư hay gặp

ở bệnh nhân nhiễm HIV hoặc những người dùng thuốc ức chế miễn dịch

1.1.4 Nguyên nhân bệnh sinh

1.1.4.1 Tác nhân vật lý

● Bức xạ ion hoá

Bức xạ ion hoá chính là nguồn tia phóng xạ phát ra từ các chất phóng xạ tự nhiên hoặc từ nguồn phóng xạ nhân tạo dược dùng trong khoa học và y học có khả năng ion hoá vật chất khi bị chiếu xạ Người ta biết rằng có nhiều cơ quan xuất hiện ung thư sau khi bị chiếu xạ nhưng loại nguyên nhân này chỉ chiếm 2 đến 3% trong số các trường hợp ung thư, chủ yếu là ung thư tuyến giáp, ung thư phổi và ung thư bạch cầu [6, 44]

● Bức xạ cực tím

Tia cực tím có trong ánh sáng mặt trời Càng gần xích đạo tia cực tím càng mạnh Tác nhân này chủ yếu gây ra ung thư ở da Những người làm việc ngoài trời như nông dân và thợ xây dựng, công nhân làm đường có tỷ lệ ung thư tế bào dày và tế bào vảy ở vùng da hở (đầu, cổ, gáy) cao hơn người làm việc trong nhà Đối với những người da trắng sống ở vùng nhiệt đới, tỷ lệ ung thư hắc tố cao hơn hẳn người da màu do ảnh hưởng của tia cực tím khi tắm nắng

1.1.4.2 Thuốc lá

Thuốc lá là nguyên nhân của khoảng 90% ung thư phế quản phổi [6] Tính chung thuốc lá gây ra khoảng 30% trong số các trường hợp ung thư chủ yếu là ung thư phế quản phổi và một số ung thư vùng mũi họng, ung thư tụy, ung thư đường tiết niệu Trong khói thuốc lá chứa rất nhiều chất hydrocarbon thơm Trong đó, phải kể đến chất 3-4 Benzopyren là chất gây ung thư trên thực nghiệm

Qua thống kê cho thấy người hút thuốc lá có nguy cơ mắc ung thư phế quản gấp 10 lần người không hút Hút thuốc ở tuổi càng trẻ càng có nguy cơ cao

Những người không hút thuốc mà sống trong một khoảng không gian hẹp với người hút thuốc, khói thuốc cũng có nguy cơ gây ung thư Đây được gọi là hút thuốc thụ động Điều lưu ý đặc biệt là trẻ em nhiễm khói thuốc lá rất nguy hại

1.1.4.3 Dinh dưỡng

Dinh dưỡng đóng vai trò khoảng 35% trong các nguyên nhân gây bệnh ung thư [3] Nhiều bệnh ưng thư có liên quan đến dinh dưỡng như ung thư thực quản, ung thư dạ dày, ung thư gan, ưng thư đại trực tràng, ưng thư vòm mũi họng, ưng thư vú, ưng thư nội tiết

- Các chất gây ung thư chứa trong thực phẩm, thức ăn:

+ Nitrosamin và các hợp chất N- Nitroso khác, là những chất gây ung thư thực nghiệm trên động vật Các chất này thường liên quan đến ung thư dạ dày và ung thư vòm họng

+ Anatoxin sinh ra từ nấm mốc Aspergillus flavus Đây là một chất gây ra bệnh ung thư gan, bệnh phổ biến ở các nước nhiệt đới Loại nấm mốc này thường có trong ngũ cốc bị mốc nhất là lạc mốc

+ Các thực phẩm có chứa các dư lượng, tàn tích của các thuốc trừ sâu, không chỉ có thể gây ra ngộ độc cấp tính mà còn có khả năng gây ung thư

+ Một số cách nấu thức ăn và bảo quản thực phẩm có thể sẽ tạo ra chất gây ung thư như benzopyren và một số sản phẩm gây đột biến gen…

1.1.4.4 Những yếu tố nghề nghiệp

Khi làm việc trong môi trường nghề nghiệp con người tiếp xúc với cả bức

xạ ion hoá và virus, nhưng những tác nhân sinh ung thư quan trọng nhất trong nghề nghiệp chính là các hoá chất dược sử dụng Ước tính nhóm nguyên nhân này gây ra khoảng từ 2 đến 8% số ung thư tùy theo mỗi khu vực công nghiệp [6] Ngày nay do công nghiệp hoá phát triển mạnh mẽ, ưng thư nghề nghiệp không chỉ có ở các nước đã phát triển mà còn ở các nước đang phát triển

1.1.4.5 Một số thuốc và nội tiết

Người ta thấy các kiểu hoá trị ung thư khác nhau, rõ ràng đã làm tăng nguy

cơ bệnh bạch cầu ở những bệnh nhân còn sống hơn một năm sau khi được chẩn đoán

Các hóa chất có hoạt tính sinh ung thư theo trung tâm nghiên cứu ung thư quốc tế bao gồm: Busulphan, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Melphalan, Treosulphan…

Sự ức chế miễn dịch sau khi cấy ghép cơ quan, cũng làm bệnh nhân có nguy cơ cao mắc bệnh ung thư Tuy nhiên, vai trò sinh ung thư của các thuốc dùng để ức chế miễn dịch vẫn còn đang bàn cãi

Một số loại nội tiết tố được dùng trong các lĩnh vực thực hành y khoa khác nhau Người ta thấy một số nhóm nội tiết tố làm tăng nguy cơ ung thư sau khi dùng chúng Dùng các thuốc ngừa thai có nguy cơ bị ung thư vú, ung thư buồng trứng Tuy nhiên điều này cần phải nghiên cứu thêm

1.1.4.6 Các tác nhân sinh học

● Virus sinh ung thư

Có bốn loại virus liên quan đến cơ chế sinh bệnh ung thư [1, 8],

Virus Epstein – Barr người ta thấy xuất hiện ở trong các khối ung thư vòm mũi họng Ở nhiều bệnh nhân ung thư vòm còn thấy kháng thể chống lại kháng nguyên của virus Epstein - Barr Tuy nhiên người ta chưa khẳng định vai trò gây bệnh trực tiếp của virus Epstein - Barr đối với ung thư vòm mũi họng

Virus Viêm gan B gây ung thư gan nguyên phát hay gặp ở châu Phi và châu Á trong đó có Việt Nam Virus này khi thâm nhập cơ thể gây viêm gan cấp, kể cả nhiều trường hợp thoáng qua Tiếp theo là một thời kỳ dài viêm gan mạn tiến triển không có triệu chứng Tổn thương này qua một thời gian dài sẽ dẫn đến hai biến chứng quan trọng đó là xơ gan toàn bộ và ung thư tế bào gan Virus gây u nhú thường truyền qua đường sinh dục Loại này được coi là có liên quan đến các ung thư vùng âm hộ, âm đạo và cổ tử cung, các nghiên cứu đang tiếp tục

Virus HTLV 1 là loại virus (retro virus) liên quan đến bệnh bạch cầu tế bào

T gặp ở Nhật Bản và vùng Caribe

● Ký sinh trùng và vi khuẩn có liên quan đến ung thư

Có một loại ký sinh trùng được coi là nguyên nhân gây ung thư, đó là sán Schistosoma Loại sán này thường có mặt trong ung thư bàng quang và một số ít ung thư niệu quản Tuy nhiên cơ chế sinh ung thư của loại sán này chưa được giải thích rõ

Vi khuẩn Helicobacter – Pylori là một trong các nguyên nhân gây viêm dạ dày mạn tính và ung thư dạ dày

1.1.4.7 Yếu tố di truyền và suy giảm miễn dịch

● Yếu tố di truyền

Nguyên nhân của khoảng 33% ung thư trên người ngày nay đã được biết và các yếu tố môi trường được cho là giữ vai trò quan trọng ở phần lớn bệnh ung thư [44] Tuy nhiên di truyền cũng là một yếu tố quan trọng liên quan đến ung thư

Một số ung thư liên quan đến di truyền như: ung thư phổi (ung thư sinh ra

từ môi trường quan trọng nhất cho tới thời điểm hiện tại), có một vài nghiên cứu

về men hydrocarbon-hydroxylase, một enzym cần cho sự chuyển hoá hydrocarbon từ khói thuốc, gợi ý rằng sự hiện hữu của loại men này trong phổi con người, về mặt di truyền có thể kiểm soát bởi một gen đơn với cặp allen cao (H) và thấp (L) So với những người mang LL, những người HH có nguy cơ bị ung thư phổi gấp 36 lần Hay u Wills, u nguyên bào võng mạc hai mắt và những bệnh nhân mang chứng đa polyp có tính chất gia đình là thí dụ về các loại ung thư truyền theo tính trội theo mô hình của Mendel…

Người ta có thể định vị gen trong bệnh đa polyp mang tính gia đình ở nhiễm sắc thể số 5, trong bệnh Von Reclmghausen ở nhiễm sắc thể số 17…

● Suy giảm miễn dịch và AIDS

Trên động vật thực nghiệm sự gia tăng về mối nguy cơ bị ung thư đi đôi với sự suy giảm miễn dịch Người bị suy giảm miễn dịch mang tính di truyền hay mắc phải thường dễ bị ung thư và thời gian ủ bệnh ngắn hơn, chủ yếu là bệnh lymphoma hệ võng

Ở những bệnh nhân ghép cơ quan cho thấy sự suy giảm miễn dịch do thuốc

là rõ nhất Và những người này có nguy cơ mắc bệnh lympho không Hodgkin tăng 32 lần, ung thư gan và đường mật trong gan tăng 30 lần, ung thư phổi tăng hai lần, ung thư bàng quang hơn năm lần, ung thư cổ tử cung gần năm lần… Người có HIV dương tính có nguy cơ cao bị sarcoma Kaposi và lympho không Hodgkin, ung thư hậu môn, ung thư gan và ung thư cổ tử cung… Điều này cần được làm rõ thêm

1.1.5 Triệu chứng lâm sàng

Thông thường ung thư có thời gian ủ bệnh khá dài, ban đầu không có triệu chứng lâm sàng rõ ràng và khi xuất hiện triệu chứng rõ rệt thường là khi bệnh đã tiến triển trầm trọng

Ung thư là tập hợp của nhiều dạng bệnh ung thư khác nhau nên triệu chứng của ung thư rất đa dạng và khác nhau ở tùy thể bệnh ung thư [4]

Triệu chứng của ung thư được phân làm ba nhóm chính:

- Triệu chứng tại chỗ

- Triệu chứng của di căn

- Triệu chứng toàn thân

Triệu chứng tại chỗ: các khối u bất thường hay phù nề, chảy máu, đau

hoặc loét Chèn ép vào mô xung quanh có thể gây ra các triệu chứng như vàng

da

Triệu chứng của di căn (lan tràn): hạch bạch huyết lớn lên, ho, ho ra máu,

gan to, đau xương, gãy xương ở những xương bị tổn thương và các triệu chứng thần kinh Đau có thể gặp ở ung thư giai đoạn tiến triển, nhưng thông thường đó không phải là triệu

Triệu chứng toàn thân: sụt cân, chán ăn và suy mòn, tiết nhiều mồ hôi (đổ

mồ hôi trộm), thiếu máu và các hội chứng cận u đặc hiệu, đó là tình trạng đặc biệt được gây ra bởi ung thư đang hoạt động, chẳng hạn như huyết khối hay thay đổi nội tiết tố

1.1.6 Các thuốc điều trị ung thư hiện nay

Có 7 nhóm thuốc chính được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư [57]: các thuốc alkyl hóa, các kháng sinh chống ung thư, các thuốc kháng chuyển hóa, các alkaloid và các chất có nguồn gốc tự nhiên, các phức hợp platin hữu cơ, các hormone, và nhóm thuốc sinh học

- Nhóm thuốc alkyl hóa: Melphalan, chlorambucil, Isophosphamid, Busulphan, Carmustin…

- Nhóm kháng sinh chống ung thư: Doxorubicin, Daunorubicin, Dactinomycin, Bleomycin…

- Nhóm thuốc kháng chuyển hóa: Methotrexat, 6-Mercaptopurin, Gemcitabin, 5-Fluorouracil…

- Các alkaloid và các chất có nguồn gốc tự nhiên: Vinblastin sulfat, Vincristin sulphat, Paclitaxel, Docetaxel, Irinotecan…

- Các phức hợp platin hữu cơ: Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin…

- Các hormone và kháng hormone: estrogen, androgen, các progesterone…

- Nhóm thuốc sinh học: Các Interferon alpha (INF-), Interferon gama, Interleukin-2 (IL-2), Yếu tố hoại tử u (TNF) (TNF- và TNF-, TRAIL…), Erythropoietin, các kháng thể đơn dòng như: Bevacizumab, Trastuzumab, Rituximab…

Ở đây chúng tôi trình bày về một số thuốc điển hình

● Melphalan:

Đây là một thuốc tác nhân alkyl hóa kiểu azotiperid Thuốc gây độc tế bào ung thư bằng cách tác dụng trên DNA với phản ứng thay thế một nguyên tử H của acid nucleic bằng nhóm alkyl dẫn đến các thông tin mã hoá trên DNA bị thay đổi dẫn đến ức chế sự sao mã hoặc sao mã không chính xác gây đột biến hoặc làm chết tế bào Melphalan được sử dụng trong điều trị u đa tủy, u tinh hoàn, u buồng trứng, ung thư vú….Hạn chế của thuốc là độc tính cao trên hệ máu, là thuốc độc bảng A

● Doxorubicin:

Là một thuốc thuộc nhóm kháng sinh chống ung thư, cơ chế tác dụng của thuốc: ức chế enzyme topoisomerase, tăng tạo các gốc tự do, gắn vào màng tế bào ức chế hoạt hóa phosphatidyl inositol Thuốc được dùng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bạch cầu tủy mạn, bệnh Hodgkin, sarcom lưới, sarcom lympho…

● Methotrexat:

Đây là thuốc kháng chuyển hóa, Methotrexat ức chế cạnh tranh với enzyme dihydrofolat reductase làm giảm acid tetrahydrofolic, làm giảm tổng hợp thymidilat, methionin, serin, purin dẫn đến giảm sinh tổng hợp DNA và protein làm cho tế bào không nhân lên được Thuốc được dùng điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp, ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư tinh hoàn, carcinoma biểu mô đường hô hấp…Tuy nhiên thuốc gây độc mạnh, gây suy tủy, độc thân,

dễ kháng thuốc

● Vinblastin sulphat:

Là alkaloid được chiết xuất từ cây dừa cạn Thuốc có tác dụng kìm tế bào,

ức chế đặc hiệu pha M của chu kỳ tế bào Vinblastin gắn đặc hiệu vào tubulin nên ngăn cản tạo vi cấu trúc hình ống, ức chế sự tách đôi của nhiễm sắc thể Ở liều thấp thuốc làm ngừng phân chia tế bào, liều cao diệt tế bào Vinblastin điều trị bệnh Hodgkin, bệnh sarcom lympho, sarcom lưới, u tủy mạn tính…Hạn chế của thuốc là tác dụng phụ gây độc thần kinh như co giật, giảm hoặc mất trương lực cơ, mất phản xạ sâu…

● Cisplatin:

Thuốc gây độc tế bào ung thư theo cơ chế giống thuốc nhóm alkyl hóa Cisplatin ức chế quá trình sinh tổng hợp DNA dẫn đến tế bào không nhân lên được hoặc làm chết tế bào Thuốc được dùng trong điều trị u tinh hoàn, buồng trứng, ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư dạ dày….Tuy nhiên thuốc gây độc tính thận, thính giác, ức chế tủy xương…

● Interferon alpha (INF-):

Tác dụng điều biến miễn dịch của INF- bao gồm hoạt hoá tế bào diệt tự nhiên, điều biến sự sản xuất kháng thể của lympho B và tạo trên bề mặt tế bào các kháng nguyên phù hợp tổ chức (MHC) làm cho khối u nhạy cảm hơn với việc tiêu diệt qua miễn dịch trung gian Tuy vậy, các tác dụng chống u chính của INF- có thể liên quan tới tác dụng trực tiếp chống tăng sinh

INF- có tác dụng tốt trong bệnh bạch cầu tế bào tóc và trong giai đoạn sớm của bệnh bạch cầu tuỷ mạn Thuốc cũng có hoạt tính cao ở u lympho ác tính không Hodgkin độ ác tính thấp, đa u tuỷ xương và u lympho tế bào T ở da Ngoài ung thư hắc tố và ung thư biểu mô tế bào thận, một số ung thư biểu mô tế bào vẩy và tế bào đáy của da cũng đáp ứng với INF- Các chỉ định khác của INF- bao gồm nhiễm trùng mãn với viêm gan C, Condylom mào gà và carcinomatosis

thanh quản ở tuổi thiếu niên

Tuy hiện nay có nhiều thuốc điều trị ung thư nhưng hầu như các thuốc này

có tác dụng gây độc tế bào không đặc hiệu, thuốc có nhiều tác dụng phụ không mong muốn và vẫn chưa đạt được hiệu quả cao Do đó việc nghiên cứu tìm ra các chất mới có khả năng điều trị căn bệnh ung thư, cũng như ngăn cản sự phát triển của các tế bào ung thư, đặc biệt các hoạt chất có nguồn gốc dược liệu luôn được các nhà khoa học trong nước và thế giới quan tâm Đến nay, đã có nhiều hoạt chất chống ung thư có nguồn gốc tự nhiên đã được khám phá ra và đem vào

sử dụng trên lâm sàng Các hoạt chất điển hình là paclitaxel (taxol), vinblastin

và vincristin, camptothecin, adriamycin…Ngoài ra đã có nhiều hoạt chất được tách chiết từ thực vật có tác dụng hỗ trợ điều trị căn bệnh ung thư cũng như ngăn chặn sự phát triển của khối u được tìm thấy như: đu đủ (Carica papaya L.) thuộc

họ đu đủ (Papayaceae) [43], gấc (Momordica cochinchinensis Streng) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) [5], trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) thuộc họ thủy tiên (Amaryllidaceae) [10]

Với mong muốn tìm kiếm thêm các ứng viên tiềm năng có triển vọng phát triển thành thuốc điều trị ung thư từ dược liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để triển khai mô hình sàng lọc này

1.2 Apoptosis (Tế bào chết theo chương trình)

1.2.1 Quá trình apoptosis

Bên cạnh sự hoại tử và sự tự thực, apoptosis là quá trình thứ ba quyết định cái chết của tế bào Apoptosis xảy ra ở tất cả các động vật đa bào Đây là quá trình quan trọng đối với cuộc sống con người

Apoptosis là không chỉ là một quá trình hoạt động theo thứ tự, mà nó còn là một quá trình yên lặng bằng cách tháo dỡ các tế bào nhưng không lan truyền bừa bãi đến các tế bào xung quanh Ở cấp độ tế bào, quá trình này đặc trưng bởi một

sự khởi phát làm thủng các tế bào và sau đó phá vỡ những mối liên hệ tế bào-tế bào Các tế bào co tròn lại vào màng nội bào và các bào quan cô đặc lại nhiều hơn trong tế bào chất, sau đó chúng sẽ tối hơn [53]

Đáng chú ý là ở thời kì muộn của quá trình, các bào quan vẫn còn nguyên vẹn và bình thường cho thấy hoạt động chuyển hóa vẫn còn quan trọng đối với

tế bào trong thời gian đầu Các thành phần tế bào chất không bị rò rỉ khỏi tế bào,

vì vậy, đáp ứng viêm không được tạo ra Trong nhân, chất nhiễm sắc cô đặc tối

đa và thường tạo ra các phần hình lưỡi liềm bao quanh màng nhân hoặc pycnosis Các endonuclease tách một cách chính xác DNA giữa các nucleosome, cho ra những mảnh vỡ của 180 (hay nhiều hơn) đôi base Những mạng lưới nội bào khác như Golgi, lưới nội chất và ty thể cũng bị phân mảnh đáng kể Trong khi quá trình phân cắt DNA tiếp tục, nhân bắt đầu vỡ thành từng mảnh và tế bào tương tự cũng chia tách thành một số mảnh nhỏ còn nguyên vẹn hoặc các thể apoptosis không bắt màu thuốc nhuộm Sau đó xảy ra sự thực bào, một quá trình trong đó các đại thực bào di cư hay các tế bào biểu mô khoẻ mạnh xung quanh nuốt các mảnh vỡ của tế bào Kết quả là, các thể apoptosis gắn vào một túi được bao bọc bởi màng trong một tế bào gọi là thể thực bào Cuối cùng, tế bào chủ

hay thể thực bào và chất chứa của nó dần dần bị suy thoái, và trong nhiều trường hợp, một tế bào mới thay thế tế bào cũ trong một vài giờ [53, 55]

Hình 1.1: Tiến trình Apoptosis

1.2.2 Các con đường apoptosis

1.2.2.1 Con đường ngoại sinh

Con đường ngoại sinh được khởi động bởi các kích thích ngoại bào, chẳng hạn như phóng thích các yếu tố tăng trưởng kích động sự gắn của các thụ thể chết xuyên màng (một tập hợp con họ thụ thể TNF, bao gồm cả TNFR1, Fas/CD95, thụ thể TRAIL-R1 và TRAIL-R2) với các ligand cùng nguồn gốc với chúng Điều này làm hoạt hoá trực tiếp các thụ thể này thông qua quá trình trimer hóa và một phức hợp tín hiệu gây chết (DISC) lớn ở mặt tế bào chất của màng bào tương Quá trình apoptosis được bắt đầu bằng việc lắp phức hợp tín hiệu gây chết với Fas-protein liên kết có miền chết (FADD) Miền chết (DD)

Nhân xẹp lại, màng tế bào tiếp tục phồng xẹp

Hình thành các thể apoptosis

Ly giải các

thể

apoptosis

của các thụ thể được trimer hóa tương tác với một miền tương đồng trong FADD, qua đó mà FADD tuyển chọn và điều biến sự kích hoạt tự động caspase khởi phát, tiền caspase 8 (và có thể của caspase 10) Caspase 8 hoạt động sau đó

ly giải protein bằng cách cắt đứt và kích hoạt caspase 3, 6 và 7, dẫn đến các việc kích hoạt thêm caspase cho đến khi đến đỉnh trong quá trình ly giải protein chất nền và chết tế bào [53]

Hình 1.2: Sơ đồ con đường apoptosis nội sinh và ngoại sinh

1.2.2.2 Con đường nội sinh

Con đường nội sinh dựa trên tính thấm hoá của màng ty thể (MMP) để giải phóng các yếu tố tiền apoptosis như cytochrome c-apoptosis từ khoảng gian màng của bào quan này Trong điều kiện của stress tế bào, những chất chống apoptosis trong họ protein Bcl-2 (ví dụ, Bcl-2 và Bcl-XL), cư trú trong màng ty thể bên ngoài, có thể mất ổn định thông qua giảm biểu hiện, hoặc bổ sung các

Con đường nội sinh

Con đường

Thụ thể chết

Ty thể

thành viên tiền apoptosis của họ Bcl-2 (ví dụ: Bax, Bad, và Bak) Tỷ lệ giữa các chất tiền apoptosis và chất đối kháng apoptosis ngày càng lớn dẫn đến sự lắp ráp các oligomer Bax-Bak ở màng ngoài ty thể Những oligomer này làm tổn thương tính thấm của màng, cho phép sự thành lập những kênh đầy protein ngoài màng Kết quả là những yếu tố tiền apoptosis từ khoảng gian màng của ty thể được phóng thích vào tế bào chất Trong số này, Cytochrome c liên kết với Apaf-1, dATP và tiền caspase-9 để tạo thành thể apoptosome Thể apoptosome hoạt hóa caspase 9, rồi chất này tiếp tục hoạt hoá caspase 3, 6 và 7 [18, 53] Những chất thuộc họ Bcl-2 không phải là tác nhân duy nhất có khả năng xúc tiến MMP cần để phóng thích những yếu tố tiền apoptosis từ khoảng gian màng của ty thể Các protease cũng như các tác nhân khác (ceramide, các gốc oxy tự do phản ứng và Ca2+) cũng có thể có chức năng này MMP còn có thể lập trình một tế bào đi vào cái chết khi các caspase không được hoạt hoá Cái chết không phụ thuộc caspase này có thể xảy ra do sự mất chức năng không hồi phục của ty thể cũng như do ty thể phóng thích các chất tác động cái chết không phụ thuộc caspase bao gồm yếu tố gây ra apoptosis (AIF) và endonuclease G Cả 2 chất này đi từ tế bào chất đến nhân làm phân đoạn DNA và cô đặc nhiễm sắc chất [55]

Ở mức độ phân tử, sự giao thoa giữa 2 cơ chế apoptosis nội sinh và ngoại sinh xảy ra khi hoạt hoá caspase 3, 6, và 7 Hơn nữa, mục tiêu sinh lý của caspase 8 được hoạt hoá là Bid, một protein BH3- họ hàng duy nhất với Bcl-2, thiếu mất vùng xuyên màng Ở vài tế bào, để đáp ứng với các ligand thụ thể chết, caspase 8 cắt Bid thành phân đoạn tận cùng là carboxy bị cắt ngắn (tBid) đi

từ tế bào chất đến màng ngoài ty thể Những oligomer của tBid có thể khởi phát

sự thấm của màng ngoài ty thể, theo sau bởi sự phóng thích những yếu tố tiền apoptosis Bằng cách này, Bid cũng điều biến sự trao đổi giữa 2 con đường nội sinh và ngoại sinh của apoptosis [55]

1.3 TRAIL và các thụ thể của TRAIL

1.3.1 Cấu trúc và tác dụng

TRAIL là thành viên của đại gia đình hoại tử khối u TNF, ligand gây ra apoptosis TRAIL có trong một loạt các tế bào của con người bao gồm cả lá lách, tuyến ức, tuyến tiền liệt, ruột non [19] Người ta đã phát hiện TRAIL trong bạch cầu trung tính, trong tế bào diệt tự nhiên và bạch cầu đơn nhân khi kích thích bởi interferon có khả năng gây chết tế bào hoặc có thể được phân cắt để giải phóng vào vùng ngoài tế bào TRAIL cũng là những protein xuyên màng Đầu tận C ngoại bào của nó cho thấy sự tương đồng đặc biệt với những thành viên khác cùng họ Tuy nhiên, đầu tận N nằm trong tế bào chất ngắn hơn đáng

kể và không được bảo tồn ở các loài Dạng hoạt động sinh học của TRAIL là một homotrimer

Có 5 thụ thể cùng nguồn gốc khác nhau gắn với TRAIL Hai trong số đó, TRAIL-R1 (còn gọi là DR4) và TRAIL-R2 (còn gọi là DR5 hay Killer hay TRICK2) được xem là những thụ thể chết thật sự vì chúng tham gia với TRAIL gây ra apoptosis [22] Cấu trúc của TRAIL-R1 và TRAIL-R2 phù hợp với cấu trúc của những thụ thể chết với DD cần thiết để truyền tín hiệu apoptosis [25] TRAIL-R1 được tìm thấy ở phần lớn các mô của con người, bao gồm lách, tuyến ức, gan, bạch cầu trong máu ngọai biên, những tế bào T được hoạt hoá, ruột non và vài dòng tế bào ung thư TRAIL-R2 được tìm thấy ở cả mô lành và những dòng tế bào ung thư, nhưng đặc biệt nhiều trong lách, bạch cầu máu ngoại biên và bạch cầu được hoạt hoá Hai loại thụ thể TRAIL khác là TRAIL-R3 và TRAIL-R4 cũng được gọi là những thụ thể mồi Mặc dù khá giống với TRAIL-R1 và TRAIL-R2 ở vùng ngoại bào vào xuyên màng, TRAIL-R3 và TRAIL-R4 thiếu miền chết hoặc có một miền chết không chức năng Vì vậy mà

sự gắn kết của TRAIL với các thụ thể không kích hoạt apoptosis được Bản dịch

mã TRAIL-R3 và TRAIL-R4 được tìm thấy trong những mô lành của người mà không có trong phần lớn các dòng tế bào ung thư Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho rằng điều hoà nội bào truyền tín hiệu TRAIL gây ra tính kháng

apoptosis qua trung gian TRAIL của các tế bào bình thường nhiều hơn là do mật

độ bề mặt của những thụ thể mồi Năm mươi thụ thể của TRAIL được tìm ra là thụ thể hoà tan osteoprotegerin (OPG) OPG cũng có thể hoạt động như là một thụ thể mồi vì nó gắn hiệu quả với TRAIL nhưng không tạo ra apoptosis

Hình 1.3: Các thụ thể của TRAIL

Giống những ligand khác của họ TNF, TRAIL liên quan đến chức năng hệ thống miễn dịch và cân bằng nội môi TRAIL dường như kích hoạt apoptosis chuyên biệt ở những dòng tế bào ung thư hơn là những tế bào lành vì vậy nó có khả năng tiêu diệt khối tế bào ung thư một cách chọn lọc trong khi không ảnh hưởng đến tế bào bình thường [50]

1.3.2 Cơ chế tác dụng

Sự hủy hoại tế bào ung thư gây ra bởi TRAIL bắt đầu với sự kích hoạt của TRAIL-R1 hoặc TRAIL-R2 kích thích quá trình apoptosis theo 2 con đường ngoại sinh và nội sinh (hình 1.4) [19]

Trong một số dòng tế bào ung thư, ngoài con đường ngoại sinh, TRAIL kích hoạt các con đường tự hủy hoại bản chất, xảy ra khi hoạt động caspase-8 cắt Bid, thành viên trong gia đình Bcl-2 Cắt ngắn Bid di chuyển đến màng ty

Miền chết Màng tế bào

thể tại đó nó kích thích quá trình oligomer hóa của Bak và Bax Sau khi kích hoạt, Bax trải qua một sự thay đổi cấu trúc và di chuyển vào màng ty thể nơi các homooligomer hình thành Bak tồn tại như một protein màng ngoài ty thể và các hình thức homo-dimer, trimer và tetramer sau khi hoạt hóa Tiếp theo, sự thẩm thấu qua màng ty thể bên ngoài xảy ra, cho phép giải phóng protein ty lạp thể, bao gồm cả cytochrome c và SMAC / DIABLO Trong bào tương, SMAC / DIABLO tương tác với các chất ức chế liên kết với X của quá trình apoptosis (XIAP) để giải phóng caspase-9 và caspase-3 từ XIAP ức chế Cytochrome c liên kết với Apaf-1, dATP và tiền caspase-9 để tạo thành apoptosome nơi caspase-9 được kích hoạt Kích hoạt caspase-9 cắt caspase-3, sau đó phân cắt nhiều chất để bắt đầu apoptosis Tín hiệu chéo đã được chứng minh là tồn tại giữa các con đường tự hủy hoại tế bào ung thư bên ngoài và bên trong, cho thấy TRAIL có thể kích hoạt cả hai đường [19]

Hình 1.4: Cơ chế tác dụng của TRAIL

( : Kích thích, : Ức chế)

Tuy nhiên, việc ứng dụng TRAIL trong điều trị ung thư là rất hạn chế vì rất nhiều khối u của người, đặc biệt là một số khối u ác tính có khả năng chống lại

sự chết tế bào theo chương trình gây bởi TRAIL một cách hoàn toàn hoặc một phần Lý do tại sao các tế bào ung thư có thể kháng TRAIL cho đến nay vẫn chưa được hiểu rõ, nhưng có nhiều bằng chứng khoa học chứng minh do sự đột biến của các receptor gây chết; hoặc do quá biểu hiện của cFLIP, một chất ức chế caspase-8; hoặc XIAP; Bcl-xL; survivin; Mcl-1; và sự hoạt hóa NF-kB Những tác nhân trên có thể điều hòa một số cơ chế kháng TRAIL [16, 30] Do

đó trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu để tìm ra những chất an toàn, hiệu quả

có nguồn gốc tự nhiên để làm cho TRAIL có tác dụng trong điều trị ung thư thông qua mô hình đánh giá độc tế bào trung gian bởi TRAIL [15, 26, 33, 36,

38, 52, 56, 58, 64, 67] Và khả năng gây độc tế bào ung thư của các chất thường được đánh giá bằng thử nghiệm MTT Từ những nhiên nghiên cứu trên gợi mở cho chúng tôi hướng triển khai mô hình mới để sàng lọc các thuốc hỗ trợ điều trị ung thư từ dược liệu

1.4 Phương pháp MTT

Phương pháp MTT dùng để đánh giá khả năng gây độc tế bào của tác nhân nghiên cứu Phương pháp này dựa trên hoạt động của enzyme dehydrogenase của ty thể trong các tế bào sống Muối MTT được vận chuyển vào trong tế bào

và bị khử bởi enzyme dehydrogenase trong ty thể tạo ra sản phẩm formazan tích lũy trong tế bào Khả năng khử MTT của tế bào cho thấy mức độ nguyên vẹn của ty thể cũng như mức độ sống sót của tế bào Số lượng tinh thể formazan tạo thành được đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm,

sẽ phản ánh số lượng tế bào sống trong dịch nuôi cấy Cường độ màu của formazan càng đậm chứng tỏ khả năng sống sót của tế bào càng cao [24]

Hình 1.5: Phản ứng chuyển MTT thành formazan

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu:

Các dạng cao chiết của dược liệu và một số chất tinh khiết được cung cấp bởi khoa Hóa thực vật và khoa Phân tích tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

Đối tượng nghiên cứu:

Hai dòng tế bào ung thư bao gồm: tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa) được cung cấp bởi khoa Dược, Trường Đại học Chosun, Hàn Quốc

Hóa chất:

- Thuốc thử MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

- Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), huyết thanh thai bò, trypsin (Invitrogen, Mỹ)

- Adriamycin (Sigma, Mỹ), human TRAIL (Peprotech, Mỹ), và các hóa chất khác (penicillin và streptomycin…)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu triển khai mô hình thử nghiệm độc tế bào trung gian bởi TRAIL

2.2.1.1 Khảo sát nồng độ nuôi cấy 2 dòng tế bào ung thư vú 231) và tế bào ung thư tử cung (HeLa)

(MDA-MB-Tiến hành khảo sát ở 5 nồng độ khác nhau để lựa chọn ra nồng độ tối ưu đem nuôi cấy thử thuốc Ở nồng độ nào cho giá trị OD nằm trong khoảng 0,8-1,2 sẽ được lựa chọn

Cách tiến hành thí nghiệm:

- Hoạt hóa tế bào:

Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức bằng cách đem rã đông ở nhiệt độ 370C sau đó đem ly tâm loại bỏ môi trường, thu lại tế bào và các

tế bào được duy trì trong môi trường DMEM có bổ sung huyết thanh thai bò 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50.000 units/l và streptomycin 50 mg/l) Tế bào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch

- Nuôi cấy tế bào:

Đếm số lượng tế bào đã được hoạt hóa ở trên ở 5 nồng độ 5x104 tế bào/giếng, 2x104 tế bào/giếng, 1x104 tế bào/giếng, 5x103 tế bào/giếng, 2x103 tế bào/giếng và trải tế bào trên đĩa 96 giếng, mỗi nồng độ lặp lại ở 3 giếng sau đó nuôi cấy trong môi trường ở 37oC, 5% CO2 và 95% độ ẩm trong 24 giờ

- Đánh giá độc tế bào bằng thử nghiệm MTT:

Sau 24 giờ nuôi cấy thêm 10 µl MTT (5mg/ml) vào mỗi giếng nuôi cấy của đĩa nuôi cấy ở trên và ủ ở 37oC trong 3 giờ sau đó loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy và hoà tan formazan thu được bằng 100 µl dung môi DMSO 0,1% Tiếp theo đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót

- % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau:

+ % tế bào sống = [OD540 của tế bào được xử lý thuốc] / [OD540 của tế bào không được xử lý thuốc] x 100%

+ % ức chế = 100 - % tế bào sống

2.2.1.2 Khảo sát nồng độ TRAIL đối với từng dòng tế bào