Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị mất vùng khứu giác và tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của rau đắng biển (bacopamonnieri (linn) wettst)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ MẤT VÙNG KHỨU GIÁC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH CỦA RAU ĐẮNG BIỂN BACOPA MONN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ TRÊN CHUỘT BỊ MẤT VÙNG KHỨU GIÁC VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH CỦA RAU ĐẮNG BIỂN

(BACOPA MONNIERI (LINN) WETTST)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều

sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô cùng đồng nghiệp

Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Thị

Nguyệt Hằng và TS Nguyễn Thị Lập, hai người thầy luôn tận tình hướng

dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị đồng nghiệp

và bạn bè công tác tại Khoa dược lý – sinh hóa - Viện dược liệu và Bộ môn Hóa sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội đã phối hợp và tạo điều kiện giúp tôi thực hiện luận văn

Lời cảm ơn cuối cùng xin gửi tới gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ của mình

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Trần Thị Hương Giang

1.1.6.1 Nhóm thuốc điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức 10

1.1.7 Hạn chế của thuốc điều trị sa sút trí tuệ hiện nay 13

1.1.7.2 Về tương tác thuốc, tác dụng không mong muốn 14

1.2 Cây rau đắng biển

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.2.1 Chuột ddY bị suy giảm trí nhớ/nhận thức do mất vùng

khứu giác (Olfactory bulbectomy of mice – OBX) 25 2.1.2.2 Tế bào NG 108-15 và protein β – amyloid 25-35 26

2.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết cồn 95%

rau đắng biển trên chuột suy giảm nhận thức do mất vùng khứu giác bằng thử nghiệm nhận diện vật thể và thử

2.2.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ bằng thử nghiệm nhận

dạng đồ vật (Object Recognization Test – ORT) 28 2.2.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ không gian bằng thử

2.2.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trên mô hình

gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein β – amyloid (Aβ

2.2.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cao chiết

cồn rau đắng biển trên tế bào NG 108 – 15 theo mô hình

rau đắng biển trên chuột suy giảm nhận thức do mất vùng khứu giác bằng thử nghiệm nhận diện vật thể và thử nghiệm mê lộ chữ Y

3.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ bằng thử nghiệm nhận

dạng đồ vật (Object Recognization Test – ORT) 36 3.1.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ không gian bằng thử

3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trên mô hình

gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein beta amyloid in

3.2.1 Ảnh hưởng của cao chiết cồn từ rau đắng biển lên khả

năng sống sót của tế bào thần kinh NG 108 – 15 42 3.2.2 Thăm dò khả năng gây độc của protein Aβ 25-35 trên tế

3.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cao chiết

cồn rau đắng biển trên tế bào NG 108 – 15 theo mô hình

4.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ bằng thử nghiệm nhận

dạng đồ vật (Object Recognization Test – ORT) 50 4.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ bằng thử nghiệm mê

4.2.3 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của rau đắng

biển bằng mô hình gây độc tế bào NG 108-15 bằng

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACh Acetylcholine

AChE Enzym Acetylcholinesterase

AD Bệnh Alzheimer (Alzheimer disease)

APP Protein tiền chất amyloid (Amyloid precursor protein)

Aβ 25-35 Amyloid β-Protein Fragment 25-35

BuChE Butyrylcholinesterase

ddY Dulbecco’s Modified Eagle Medium

g dl/kg gam dược liệu/kg thể trọng chuột

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

MAPT Một gen mã hóa protein Tau (Microtubule-Associated

Protein Tau) MNT Magnetic resonance tomography (Chụp cộng hưởng từ

cắt lớp)

NFTs Neurofibillary Tangles (Đám rối thần kinh)

NFT Đám rối thần kinh (Neurofibrillary tangle)

ORT Object Recognization Test OBX Olfactory Bulbectomy of mice RĐB: Rau Đắng Biển

ROESY Rotating frame Overhause Effect SpectroscopYYM

Y Maze SOD Superoxide dismutase SPECT Single Photon Emission Computed Tomography: chụp cắt lớp bằng bức xạ đơn photon

SSRIs Selective serotonin reuptake inhibitors (Các chất ức chế

tái hấp thu serotonin chọn lọc) SSTT Sa sút trí tuệ

βAP β-amyloid peptid

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sa sút trí tuệ là một nhóm bệnh lý mạn tính và tiến triển được định nghĩa là “sự xuất hiện và phát triển các rối loạn về nhận thức bao gồm suy giảm trí nhớ và có ít nhất một trong các triệu chứng: mất ngôn ngữ, mất động tác, mất nhận thức hoặc sự rối loạn trong việc thực hiện các chức năng trong hoạt động hàng ngày [2], [20]

Theo một số nghiên cứu thống kê đã được công bố trên thế giới có khoảng 25 triệu người bị sa sút trí tuệ năm 2000 tăng lên 63 triệu vào năm

2030 và 114 triệu vào năm 2050 Tỷ lệ độ tuổi cụ thể của sa sút trí tuệ là như nhau trên toàn thế giới Trong số những người sa sút trí tuệ, 60% sống ở các nước đang phát triển, con số này tăng lên 71% vào năm 2040 Tỷ lệ tăng số người bị sa sút trí tuệ ở những nước đang phát triển được dự đoán là cao hơn trong khu vực phát triển ba đến bốn lần [24]

Có rất nhiều các công trình nghiên cứu được thực hiện nhằm mục đích tìm ra phương pháp hiệu quả để đẩy lùi hiện tượng sa sút trí tuệ Các thuốc điều trị sa sút trí tuệ hiện nay chủ yếu là tân dược nhưng cũng chỉ kiểm soát được các triệu chứng chứ không thể ngăn chặn hoặc đẩy lùi bệnh Hơn nữa, giá thành thuốc này tương đối cao, và có những tác dụng phụ không mong muốn, như ỉa chảy, mất ngủ, buồn nôn, viêm phế quản, phân lỏng, chuột rút…và nhiều tác dụng khác mà chưa biết đến [27] Do đó, nhu cầu nghiên cứu phát triển các thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ và điều trị sa sút trí tuệ là rất cần thiết và được thế giới rất quan tâm

Ở Việt Nam, rau đắng biển hay còn gọi là rau sam trắng, được biết đến

là món ăn không chỉ phổ biến ở miền thôn quê mà còn ở những thành phố lớn, dành cho cả tầng lớp nghèo cũng như giàu trong xã hội Rau đắng biển cũng được sử dụng làm thuốc Y học cổ truyền Ấn Độ hàng nhiều thập kỷ qua,

để điều trị rất nhiều những rối loạn, đặc biệt là những rối loạn như lo lắng,

giảm sút trí tuệ và trí nhớ kém [1] Loài thực vật này đã được bán trên thị trường châu Âu dưới dạng thực phẩm chức năng để kích thích trí nhớ Do đó, rau đắng biển là đối tượng rất triển vọng để nghiên cứu làm thuốc điều trị sa sút trí tuệ

Thời gian gần đây nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các tác dụng dược lý của rau đắng biển trên thế giới được thực hiện ngày càng nhiều

Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Bacopa monnieri (L.) động vật cũng

được thực hiện thành công trên quy mô lớn Tuy nhiên ở Việt Nam những

nghiên cứu về tác dụng dược lý của Bacopa monnieri (L.)chưa nhiều, để có

thể khẳng định được tác dụng dược lý trong điều trị sa sút trí tuệ và phát triển thành sản phẩm thuốc cần có nhiều nghiên cứu cụ thể hơn nữa Với mục đích

đó chúng tôi tham gia thực hiện đề tài:

Nghiên cứu tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bị mất vùng khứu

giác và tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cây rau đắng biển (Bacopa

monnieri (Linn) wettst)

Với mục tiêu cụ thể:

- Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết cồn 95% rau đắng biển trên chuột suy giảm nhận thức do mất vùng khứu giác bằng thử nghiệm nhận diện vật thể và thử nghiệm mê lộ chữ Y

- Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh của cây rau đắng biển trên mô

hình gây độc tế bào NG 108-15 bằng protein beta amyloid in vitro

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh sa sút trí tuệ

1.1.1 Khái niệm

Sa sút trí tuệ là hội chứng lâm sàng do bệnh của não Ở đó nhiều chức năng thần kinh cao cấp suy giảm gây ảnh hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống [2]

Theo tiêu chuẩn chẩn đoán của DSM - IV: Sa sút trí tuệ bao gồm nhiều chức năng suy giảm nhận thức trong:

để thực hiện những hoạt động này thì họ vẫn đạt được các thành tích trí tuệ ở mức chuẩn của người bình thường Các hoạt động thường ngày của họ cũng không bị ảnh hưởng [2]

Theo thống kê, sa sút trí tụê là rối loạn phổ biến hàng thứ 2 trong các rối loạn tâm thần ở người cao tuổi, thì Alzheimer là bệnh đứng hàng đầu trong các nguyên nhân gây sa sút trí tuệ: 50 - 60% các trường hợp sa sút trí tuệ là do bệnh Alzheimer; 10 - 15% các trường hợp sa sút trí tuệ là có sự phối hợp giữa bệnh Alzheimer và bệnh mạch máu não Bệnh Alzheimer gặp ở 5% người trên 60 tuổi và tỷ lệ này cứ 5 năm lại tăng lên gấp đôi Trong các nghiên cứu

lâm sàng khác nhau, tỉ lệ bệnh nhân rối loạn trí nhớ và nhận thức chuyển sang

sa sút trí tuệ hàng năm từ 6% đến 25% [24]

1.1.2 Dịch tễ

Thống kê và ước tính theo phương pháp Delphin của Ferri CP, Prince

M, Brayne C, và cộng sự năm 2005 trên thế giới có khoảng 25 triệu người năm 2000 tăng lên 63 triệu vào năm 2030 và 114 triệu vào năm 2050 Họ cho rằng tỷ lệ độ tuổi cụ thể của chứng mất trí là như nhau trên toàn thế giới Trong số những người mất trí nhớ, 60% sống ở các nước đang phát triển, con

số này tăng lên 71% vào năm 2040 Tỷ lệ tăng trong số người bị mất trí nhớ được dự đoán là trong lĩnh vực phát triển cao hơn trong khu vực phát triển ba đến bốn lần [24]

Theo báo cáo “gánh nặng bệnh tật toàn cầu” (the global burden of disease) của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2003 bệnh suy giảm trí nhớ đóng góp 11,2% năm sống ốm yếu với khuyết tật ở những người từ 60 tuổi trở lên, cao hơn đột quỵ (9,5%), rối loạn cơ xương (8,9%), bệnh tim mạch (5,0%), và tất

cả các dạng ung thư (2,4%) Tỷ trọng khuyết tật do bệnh mất trí nhớ gây ra, theo ước tính của một đồng thuận quốc tế và chuyên gia đa ngành, là cao hơn

so với hầu hết các bệnh khác, ngoài chấn thương tủy sống và ung thư giai đoạn cuối Knapp và cộng sự ước tính rằng ở Anh 224 000/ 461 000 người cao tuổi bị suy giảm trí nhớ sống trong các cơ sở chăm sóc y tế với chi phí 4.6 tỷ bảng (8,2 tỷ USD) mỗi năm (tương đương 0,6% GDP cả nước) Tại

Mỹ, chi phí hàng năm của chăm sóc không chính thức là 18 tỷ đô la [24]

Khoảng 40 triệu người trên thế giới bị suy giảm trí nhớ trong đó có đến hơn 60% là do bệnh Alzheimer thường gặp ở người cao tuổi và số lượng người mắc Alzheimer ngày càng cao Việt Nam có hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer Bệnh nhân Alzheimer cần được

phát hiện và điều trị sớm nhằm góp phần làm chậm tiến triển của bệnh, giảm bớt đau khổ cho bệnh nhân cũng như gánh nặng cho gia đình và xã hội [1]

Theo thống kê của viện Lão khoa quốc gia 2005, Việt Nam có hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là Alzheimer

1.1.3 Phân loại

Sa sút trí tuệ do bệnh lý thoái hoá:

- Sa sút trí tuệ vỏ não: Bệnh Alzheimer

- Sa sút trí tuệ hỗn hợp vỏ và dưới vỏ: Sa sút trí tuệ thể Lewy, loạn dưỡng chất trắng

- Sa sút trí tuệ dưới vỏ: Bệnh Parkinson, liệt trên nhân tiến triển, thoái hoá vỏ - hạch nền, bệnh Huntington, bệnh Wilson…

- Sa sút trí tuệ thùy trán - thái dương, gồm cả bệnh Pick [2], [27]

Sa sút trí tuệ không do bệnh lý thoái hoá:

- Sa sút trí tuệ do hồi máu não đa ổ, sa sút trí tuệ thể mạch máu (bệnh Binswanger, trạng thái lỗ khuyết), bệnh não sau chấn thương, viêm mạch

- Sa sút trí tuệ do ngộ độc, rối loạn chuyển hoá (thiếu B1, bệnh nội tiết, nghiện rượu, nghiện ma tuý)

- Sa sút do bệnh lý viêm nhiễm, suy giảm miễn dịch do virus (HIV, bệnh Whipples, giang mai thần kinh, bệnh Prion) [2], [27]

1.1.4 Tiêu chuẩn chuẩn đoán:

Để chẩn đoán sa sút trí tuệ cần căn cứ vào các tiêu chuẩn sau (ICD 10

và DSM - IV):

Rối loạn trí nhớ ngắn hạn (khả năng ghi nhận các thông tin mới) và dài hạn (các kiến thức đã học trước kia)

Có suy giảm các hoạt động nhận thức (ít nhất một trong các lĩnh vực kèm theo đây):

- Tư duy trừu tượng

- Phân tích, đánh giá

- Nhân cách

Suy giảm hoạt động nghề nghiệp và quan hệ xã hội

Không có bằng cớ về sự hiện diện của trạng thái sảng và các yếu tố nguyên nhân gây ra suy giảm trí nhớ

Việc nghiên cứu cận lâm sàng một cách toàn diện cần được thực hiện nhằm chẩn đoán xác định và khám phá ra các nguyên nhân sa sút trí tuệ có thể điều trị được Các tiến bộ của các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh não hiện nay (như chụp C.T sọ não, MRT, SPECT) đã giúp ích rất nhiều cho chẩn đoán nguyên nhân sa sút trí tuệ [2], [27]

1.1.5 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

Bệnh sa sút trí tuệ có nhiều dạng khác nhau, mỗi dạng bệnh sa sút trí tuệ có những nguyên nhân riêng

Bệnh sa sút trí tuệ do bệnh lý thoái hóa:

Alzheimer là một trong những hình thức phổ biến nhất của sa sút trí tuệ

do bệnh lý thoái hóa (50 – 60% các trường hợp) Tuy nhiên nguyên nhân và

cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer chưa được biết chính xác Tuổi tác và yếu tố gen di truyền là những nguy cơ quan trọng nhất Các dấu hiệu tổn thương phổ biến trong bệnh Azheimer là sự xuất hiện của đám rối thần kinh

và cấu trúc mảng bám ở một số vùng của vỏ não, teo vỏ não và sự thoái hóa của hệ cholinergic

Giả thuyết beta amyloid:

β - amyloid peptid (βAP) là những sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa bao gồm 36 - 43 axit amin βA42 ít phổ biến hơn so với các βAP nhưng lại dễ bị kết tụ và hình thành mảng bám Sự mất cân bằng giữa sản xuất, thanh thải các peptid làm cho các βAP dư thừa tích lũy và kết tụ lại gây độc cho tế bào

Giả thuyết chỉ ra sự tích tụ β-amyloid peptid (βAP) được coi là độc tố làm ngăn cản quá trình cân bằng ion calci, ức chế chức năng của một số enzyme và khả năng sử dụng glucose của tế bào thần kinh đồng thời kích hoạt

sự chết theo chương trình (apoptosis)[10], [20], [23] Người ta vẫn chưa biết chính xác sự biến đổi trong việc sản xuất β-amyloid peptid (βAP) đến mức độ nào thì gây ra bệnh Alzheimer

Giả thuyết đám rối thần kinh (Neurofibrillary Tangles - NFTs)

Đám rối thần kinh - NFTs thường được tìm thấy trong các tế bào của vùng hải mã và vỏ não ở người bệnh Alzheimer NFTs được hình thành từ protein tau phosphoryl hóa bất thường Protein tau có vai trò ổn định cấu trúc

vi ống, giúp hệ thống vi ống thực hiện chức năng nâng đỡ tế bào, chức năng vận chuyển và vận động tế bào chất Khi sợi tau bị phosphoryl hóa bất thường tại một vị trí cụ thể, chúng không thể liên kết một cách hiệu quả với các vi ống làm chức năng của chúng bị gián đoạn dẫn tới gây chết tế bào Mật độ của các NFTs tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh mất trí nhớ bởi chúng là một dấu hiệu về sự chết đi của các tế bào thần kinh NFTs cũng được tìm thấy trong bệnh sa sút trí tuệ khác ngoài bệnh Alzheimer [10], [20], [23]

Giả thuyết cholinergic và những bất thường về các chất dẫn truyền thần kinh khác

Rối loạn chức năng và thoái hóa tế bào lan tỏa dẫn đến một loạt các khiếm khuyết dẫn truyền thần kinh, trong đó các bất thường trên hệ

cholinergic là nổi bật nhất Sự mất hoạt động của hệ cholinergic tương quan thuận với mức độ nghiêm trọng của bệnh Alzheimer Vào giai đoạn muộn của bệnh Alzheimer, số lượng các tế bào thần kinh cholinergic và số lượng các thụ thể nicotinic trong vùng hải mã và vỏ não giảm xuống Thụ thể nicotinic trước sinap có vai trò kiểm soát việc giải phóng của acetylcholin, cũng như các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng khác cho bộ nhớ và tâm trạng, bao gồm: glutamat, serotonin và norepinephrin Giả thuyết cholinergic lý giải việc mất tế bào cholinergic là nguyên nhân suy giảm nhận thức trong bệnh Alzheimer, do đó, việc tăng chức năng hệ cholinergic có thể cải thiện triệu chứng mất trí nhớ [10], [20], [23]

Giả thuyết apolipoprotein E

Những nghiên cứu đã tìm thấy nhiều mối liên hệ giữa cholesterol và sự xuất hiện của bệnh Alzheimer Apolipoprotein E là một lipoprotein có nhiệm

vụ vận chuyển cholesterol trong não ApoE4 có liên quan đến tăng lắng đọng của βAP và được cho là đóng vai trò như một chất điều hòa thúc đẩy trong quá trình bệnh sa sút trí tuệ mạch máu Cholesterol được vận chuyển bằng LDL vào tế bào thần kinh và liên kết với NFTs Mức cholesterol cao trong tế bào thần kinh não có thể làm thay đổi chức năng màng tế bào, dẫn đến hình thành các βAP và các mảng bám [10], [20], [23]

Các chất gây viêm trung gian

Giả thuyết cho rằng, khi βAP kết tụ, các thực bào tiểu thần kinh đệm (microglia) được kích hoạt và tăng cường phản ứng của các tế bào hình sao với các mảng bám Các thực bào tiểu thần kinh đệm làm giảm βAP bằng cơ chế thực bào Các tế bào hình sao đưa βAP vào tế bào chất gián tiếp qua receptor và vận chuyển βAP vào tuần hoàn chung, do đó cũng làm giảm βAP Tuy nhiên, việc kích hoạt mạn tính các tiểu thần kinh đệm dẫn tới giải phóng các cytokin như interleukin-1(IL-1), interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử u

(TNF-α), nictric oxid … làm tổn thương các tế bào thần kinh và thúc đẩy quá trình viêm liên tục Trên thực tế, nhiều cytokin và chemokin tăng lên trong não bệnh nhân Alzheimer, và một số kiểu đa hình gen tiền viêm được báo cáo

là có liên quan với bệnh Alzheimer [10], [20], [23]

Bệnh sa sút trí tuệ không do bệnh lý thoái hóa

Ngày càng có nhiều bằng chứng về một mối quan hệ nhân - quả giữa các bệnh tim mạch và những yếu tố nguy cơ tim mạch với tỷ lệ mắc bệnh sa sút trí tuệ Các yếu tố nguy cơ tim mạch cũng là những yếu tố nguy cơ sa sút trí tuệ bao gồm: tăng huyết áp, tăng lipoprotein cholesterol tỉ trọng thấp (LDL-cholesterol), giảm lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao (HDL- cholesterol) và bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường có thể làm tăng nguy cơ mất trí nhớ thông qua các yếu

tố liên quan đến "hội chứng chuyển hóa" (rối loạn lipid máu và tăng huyết áp)

và thông qua bất thường insulin Rối loạn trong con đường tín hiệu insulin (insulin - signaling pathways), cả ở ngoại vi và ở não, có liên quan đến bệnh

sa sút trí tuệ Insulin cũng có vai trò trong việc điều chỉnh sự chuyển hóa của βAP và protein tau

Các bệnh mạch máu não làm giảm cung cấp các chất dinh dưỡng cho tế bào thần kinh và giảm độ thanh thải của βAP từ não bộ, làm tăng tốc độ lắng đọng amyloid và làm tăng độc tính của amyloid cho tế bào thần kinh do đó làm nặng thêm khả năng nhận thức của bệnh sa sút trí tuệ

Những giả thuyết khác được đề xuất để giải thích bệnh sa sút trí tuệ bao gồm sự oxy hóa, rối loạn chức năng ty thể, và những ảnh hưởng của estrogen

ở phụ nữ sau mãn kinh Rối loạn chức năng của ty thể có thể làm gián đoạn quá trình chuyển hóa năng lượng trong tế bào thần kinh, giải phóng các gốc tự

do và gây mất cân bằng oxi hóa Estrogen được cho là có vai trò thúc đẩy tăng trưởng tế bào thần kinh và ngăn chặn quá trình oxi hoá như một tác nhân

chống oxi hóa, do đó sẽ có lợi cho các tế bào tiếp xúc với βAP Estrogen có thể đóng vai trò trong việc duy trì dẫn truyền thần kinh qua cholinergic, tăng

số lượng thụ thể NMDA ở các vùng não liên quan đến việc ghi lại những ký

ức mới và ngăn ngừa tổn thương tế bào Thực tế, estrogen làm tăng lưu lượng máu não, tăng sử dụng glucose, làm giảm nồng độ ApoE trong huyết tương,

và làm giảm căng thẳng do liên quan đến quá trình giải phóng glucocorticoid

Cho tới nay, chưa có cơ chế bệnh sinh nào được chứng minh là cơ chế chính Nhưng tất cả các giả thuyết đều dẫn đến một hậu quả: sự thoái hóa của

tế bào thần kinh trong vùng não cao hơn; hình thành NFTs và mảng bám; sự suy giảm hoạt động nghiêm trọng hệ cholinergic và sự mất nhận thức tiến triển từ từ cho tới khi bệnh nhân tử vong [10], [20], [23]

1.1.6 Thuốc điều trị sa sút trí tuệ

1.1.6.1 Nhóm thuốc điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức

Thuốc kháng enzym cholinesterase

Nhóm này được sử dụng vì có tình trạng suy giảm thụ thể acetylcholin

và nicotin trong hệ thần kinh trung ương ở các bệnh nhân sa sút trí tuệ do bệnh Alzheimer và những khiếm khuyết này gây suy giảm trí nhớ, nhận thức

Cho tới nay thuốc kháng enzym cholinesterase được xem là nhóm thuốc chính trong điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác, nhóm thuốc này đã được chứng minh là có hiệu quả hơn placebo trong việc điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác khi được sử dụng ở giai đoạn bệnh nhẹ hay nặng trung bình (10 - 24 điểm MMSE), tuy nhiên các thuốc này không làm ngăn chặn được diễn tiến tự nhiên của bệnh

Các thuốc kháng enzym cholinesterase được khuyến cáo sử dụng trong hướng dẫn điều trị của National Institute of Clinical Exellence 2006 (NICE)

và của Hội Thần Kinh Hoa kỳ nhưng không được khuyến cáo sử dụng trong điều trị các bệnh lý sa sút trí tuệ khác

Các thuốc thuộc nhóm này bao gồm: tacrin, donepezil, rivastigmin, galantamin [2], [10], [23]

Tacrin

- Tên quốc tế IUPAC: 1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-amine

- Mã ATC: N06DA01

- Công thức phân thử: C13H14N2

Hình 1.1: Công thức phân tử của tacrin

- Tính chất: Tacrin là bột trắng, dễ tan trong nước, trong dung dịch acid hydrocloric 0.1N, dung dịch đệm acetat pH 4, dung dịch đệm phosphat (pH 7.0 đến pH 7.4), dung dịch methanol, ethanol, dimethylsufoxid và propylen glycol, hơi tan trong acid linoleic và polyethylen glycol 400

- Tác dụng: Tacrin là thuốc đầu tiên thuộc nhóm ức chế acetylcholinesterase được cục quản lý dược Mỹ phê duyệt điều trị bệnh Alzheimer năm 1993 Tuy nhiên, do độc tính trên gan, cùng với sự xuất hiện của nhiều thuốc cùng nhóm có ít độc tính hơn, tacrin không còn được sử dụng hoặc với một số hướng dẫn chỉ dùng như lựa chọn thứ 2 trong điều trị bênh Alzheimer [20]

Nhóm thuốc háng thụ thể N-methyl D aspartate (NMDA)

Nhóm này có memantin là thuốc đối kháng thụ thể N-methyl D aspartat (NMDA) của hệ thống glutamat do có hiện tượng tăng hoạt hóa thụ thể NMDA làm tổn thương các neuron thần kinh trong các bệnh lý thoái hóa thần

kinh Memantin được sử dụng cho những bệnh nhân suy giảm nhận thức thể mạch não và các bệnh nhân Alzheimer từ vừa tới nặng [10], [20], [23]

Các thuốc chống oxy hóa và các nhóm khác

Vitamin E: Giảm tổn thương do tế bào bị oxy hóa bởi các gốc tự do Ginkgo Biloba: Thuốc có tác dụng tăng tuần hoàn, cải thiện triệu chứng

sa sút trí tuệ Tuy nhiên tác dụng này không tốt bằng nhóm kháng enzym cholinesterase

Estrogen: Ảnh hưởng đến quá trình bảo vệ và dinh dưỡng thần kinh, Kháng viêm NSAID: có một số nghiên cứu cho thấy nhóm này có tác dụng giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer [20], [23]

1.1.6.2 Nhóm điều chỉnh hành vi (Tăng cường hoạt tính serotonin)

Nhóm này có tác dụng tăng cường tái hấp thu serotonin chọn lọc SSRIs

có tác dụng giúp bệnh nhân điều chỉnh hành vi, chống trầm cảm, tránh kích thích hoặc lú lẫn

Nhóm này gồm có fluoxetin, citalopram, escitalopram, paroxetin [10], [20], [23]

Các thuốc chống oxy hóa và các nhóm khác

Vitamin E: Giảm tổn thương do tế bào bị oxy hóa bởi các gốc tự do Ginkgo Biloba: Thuốc có tác dụng tăng tuần hoàn, cải thiện triệu chứng

sa sút trí tuệ Tuy nhiên tác dụng này không tốt bằng nhóm kháng enzym cholinesterase

Estrogen: Ảnh hưởng đến quá trình bảo vệ và dinh dưỡng thần kinh, Kháng viêm NSAID: có một số nghiên cứu cho thấy nhóm này có tác dụng giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer [2], [10], [20], [23]

1.1.7 Hạn chế của thuốc điều trị sa sút trí tuệ hiện nay

1.1.7.1 Về hiệu quả điều trị

Bệnh sa sút trí tuệ là hậu quả của những thoái hóa không hồi phục thần kinh não bộ Các phương pháp điều trị hiện tại không có hiệu quả kéo dài tuổi thọ, chữa khỏi, hoặc tạm dừng hoặc đảo ngược quá trình sinh lý bệnh [49] Hai nhóm thuốc chính đang sử dụng là thuốc ức chế cholinesterase và thuốc tác dụng trên hệ glutamat dựa trên hai giả thuyết cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer (chiếm 60 - 70% nguyên nhân gây sa sút trí tuệ) Tuy nhiên, cơ chế bệnh sinh chính đến nay còn chưa được xác định rõ ràng và hai giả thuyết này chỉ là một phần trong rất nhiều con đường dẫn đến việc tế bào thần kinh bị phá hủy Nhóm thuốc ức chế cholinesterase chỉ định cho trường hợp bệnh nhẹ đến trung bình, có hiệu quả ổn định nhận thức tạm thời, hoặc làm giảm rất nhỏ sự suy giảm nhận thức, 20-30% bệnh nhân đã điều trị giảm được 7 điểm trong thang điểm đáng giá nhận thức ADAS-Cog (tương đương giảm được 1 năm suy giảm nhận thức), hay giảm chỉ giảm 5-15% so với giả dược khi theo dõi từ 6 đến 12 tháng [23], [27] Memantin được dùng cho bệnh nhân ở giai đoạn trung bình đến nặng, ở những người không dùng được thuốc ức chế cholinesterase [38] Một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu quả của memantin khi đánh giá bằng thang ADAS-cog so với giả dược ở thời điểm 12

- 24 tuần điều trị, nhưng không cho thấy lợi ích từ 24 – 48 tuần [37]

Những nhóm thuốc điều trị triệu chứng không thuộc nhận thức: các thuốc chống loạn thần, thuốc chống trầm cảm, chống co giật được sử dụng khi những triệu chứng về tâm - thần kinh ở mức độ nghiêm trọng, gây khó khăn cho chức năng hoạt động của bệnh nhân và các hoạt động chăm sóc cần thiết của người chăm sóc, hoặc có thể gây nguy hiểm cho bản thân bệnh nhân hoặc người khác Việc điều trị phải dựa trên sự cân bằng giữa lợi ích và nguy cơ [38], [55] Ngoài ra, thuốc hướng thần còn có tác dụng kháng cholinergic, vì

vậy chúng có thể làm bệnh trầm trọng hơn hoặc tác động đến việc sử dụng thuốc ức chế cholinesterase [22]

1.1.7.2 Về tương tác thuốc, tác dụng không mong muốn

Nhóm ức chế cholinesterase

Tác dụng không mong muốn của nhóm ức chế cholinesterase thường

do các tác dụng kích thích cholinergic quá mức và phụ thuộc vào liều như: buồn nôn, nôn, tiêu chảy, đau bụng, chóng mặt, nhức đầu, tiết nước bọt, đổ

mồ hôi, nhịp chậm, chuột rút, ngất, mệt mỏi, mất ngủ, kích động… Trong đó nôn, buồn nôn, tiêu chảy được báo cáo nhiều nhất Tacrin gây nhiễm độc gan sau khoảng 3 tháng ở 30 - 40% số bệnh nhân biểu hiện bởi tăng men gan và trở lại bình thường sau khi ngừng thuốc [27], [22]

Tương tác thuốc của các thuốc trong nhóm ức chế cholinesterase có thể gặp như: donepezil và glantamin chuyển hóa qua hệ cytocrom P450, emzym CYP3A4, nên chúng có nguy cơ gây tương tác với các thuốc ức chế hoặc gây cảm ứng trên hệ enzym này: carbamazepin, dexamethason, phenobarbital, phenytoinand, rifampicin, erythromycin… Ngoài ra, các thuốc trong nhóm còn có thể gây tương tác thuốc với các nhóm: thuốc chống loạn thần, các azol chống nấm, nhóm ức chế thụ thể H2, chẹn kênh calci, các thuốc tác dụng lên acetylcholin khác… [28]

1.1.8 Một số mô hình nghiên cứu

Dựa trên cơ chế bệnh sinh, các mô hình hiện đại nghiên cứu về thuốc điều trị sa sút trí tuệ lần lượt ra đời

Mô hình sàng lọc đầu tiên phải kể đến là nghiên cứu các chất có tác dụng ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase Đây là mô hình đơn giản,

dễ làm và ít tốn kém [22]

Hệ thống tế bào, như các dòng tế bào thần kinh (NG 108-15) hoặc tế bào thần kinh vỏ não được nuôi cấy nguyên phát cũng được sử dụng để đánh giá thuốc điều trị Alzheimer, bằng cách gây độc các tế bào này bằng protein beta - amyloid hoặc glutamat [31], [32], [65] Thuốc điều trị Alzheimer sẽ có khả năng phục hồi tổn thương hoặc làm tăng khả năng sống sót của tế bào thần kinh

Trên mô hình động vật, người ta sử dụng một số loại chuột chuyển gen mang bệnh Alzheimer như chuột Tg2576, PSAPP (hiện nay đang được sử dụng trên thế giới) Tuy nhiên, chi phí để mua chuột chuyển gen là tương đối cao [31]

Một số mô hình gây mất trí nhớ cho chuột bằng hóa chất như tiêm scopolamin bằng đường phúc mạc, hoặc truyền colchicin vào não chuột cống cũng được sử dụng [50]

Bên cạnh đó, các mô hình phẫu thuật gây mất trí nhớ cho chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Mô hình gây mất trí nhớ

do thiếu máu não cục bộ (ischemia induced learning and memory deficit) bằng cách thắt 2 động mạch cảnh đồng thời gây hạ huyết áp bằng cách rút máu đuôi chuột đã được giáo sư Kinzo Matsumoto sử dụng để nghiên cứu thuốc điều trị Alzheimer từ năm 2000 [65] Đây là cũng là mô hình đã triển khai thành công tại Viện Dược liệu

Một mô hình mới cũng được sử dụng hiện nay là mô hình gây suy giảm học và nhớ trên chuột mất vùng khứu giác (learning and memory deficit in olfactory bulbectomized mice) của giáo sư Kinzo Matsumoto áp dụng từ năm

2011 [65]

1.2 Cây rau đắng biển

Ở Việt Nam, rau đắng biển hay còn gọi là rau sam trắng, được biết đến

là món ăn không chỉ phổ biến ở miền thôn quê mà còn ở những thành phố lớn, dành cho cả tầng lớp nghèo cũng như giàu trong xã hội Loài thực vật này được người Hindu (Ấn Độ) gọi là Brahmi, vốn là một từ có nguồn gốc

“Brahma” có nghĩa là đấng sáng tạo, là một trong tam vị nhất thể bên cạnh hai ngôi còn lại là Vishnu (Đấng Bảo Tồn) và Shiva (Đấng Hủy Diệt) Rau đắng biển được sử dụng làm thuốc y học cổ truyền Ấn Độ hàng nhiều thập kỷ qua,

để điều trị rất nhiều những rối loạn, đặc biệt là những rối loạn như lo lắng, giảm sút trí tuệ và trí nhớ kém Loài thực vật này đã được bán trên thị trường châu Âu dưới dạng thực phẩm chức năng để kích thích trí nhớ Do đó, rau đắng biển là đối tượng đáng chú ý để nghiên cứu làm thuốc điều trị bệnh

Alzheimer.[1]

1.2.1 Đặc điểm thực vật học của rau đắng biển

Rau đắng biển (sam trắng) có tên khoa học là Bacopa monnieri (Linn), thuộc họ hoa mõm sói (Scrophulariacaceae) Các tên đồng danh là Bacopa monniera (L.) Pennell yes, Bacopa monniera (L.) Wettst, Lysimachia monnieri (L.) Cent., Graticola monnieri (L.), Monniera cunefolia Michaux, Herpestis monniera (L.) Kunth.[1], [8]

Hình 1.1: Cây rau đắng biển Bacopa monnieri (Linn)

(Nguồn:http://en.wikipedia.org/wiki/Bacopa_monnieri)

Rau đắng biển là dạng cây thảo sống quanh năm, có thân nhẵn, mọc bò

rễ dài 10 - 40cm Các cành mọc đứng mềm, không lông, rất đắng Lá mọc đối, không cuống, thuôn hình muỗng, dài cỡ 1cm, gân chính hơi khó thấy Hoa màu tím xanh hoặc trắng nhạt, mọc riêng lẻ ở nách lá Quả nang hình trứng có mũi, nhẵn, có đài tồn tại Hạt nhiều, rất nhỏ

Phân bố: Loài thực vật này sống rộng rãi ở Ấn Độ, Pakistan,

Afghanistan, Nepal, Sri Lanka, vùng cận nhiệt đới ở Mỹ, vùng nhiệt đới ở châu Á, trong đó có Việt Nam, châu Phi và châu Úc Tại Việt Nam, cây được gặp hầu như trên toàn quốc, tại các vùng đồng bằng và trung du miền Bắc và miền Nam

Rau đắng biển được trồng phục vụ cho thương mại với mục đích làm làm thuốc và đạt sản lượng là 40.000 – 50.000 kg/hecta [1],[8]

1.2.2 Các nghiên cứu về hóa học

Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới về thành phần hóa học của rau đắng biển Trong cây có chứa:

- Alkaloid: hydrocotylin, brahmin và herestin [18]

- Glycosid: asiaticosid và thanakunicid [18]

- Flavonoid: apigenin và luteonin [53]

- Phenylethnoid glycoside: monnieraside I–III và plantainoside B

- Cucurbitacin: bacobitacin A–D, cucurbitacin E

Trong đó thành phần quan trọng nhất phải kể đến đó là các hợp chất thuộc nhóm saponin có chứa trong rau đắng biển

Hai saponin là chất rắn kết tinh lần đầu tiên vào năm 1965 bởi Chatterji được đặt tên là bacosid-A (điểm chảy 250o

C) và bacosid-B (điểm chảy

203oC) [31]

Bacosid A ban đầu được xác định có tên khoa học là 3-( arabinopyranosyl)–O-β-D-glucopyranosid-10, 20-dihydroxy-16-keto-dammar-24-ene dựa vào phân tích cấu trúc của các sản phẩm thủy phân là bacogenin A1, A2, A3, A4 Trong đó bacogenin A1 và bacogenin A2 được đề

-L-nghị cấu trúc dạng (I) [30],[31] Bacogenin A4, một thành phần có hàm lượng

lớn được cho là có cấu tạo dạng (II) với đặc điểm có phổ UV hấp thụ cực đại

tại 279 nm, chính đặc điểm này đã được ứng dụng để định lượng các bacosid bằng UV thông qua các dẫn xuất thủy phân bằng acid của chúng.[31]

HO

H R

OH O

arabinopyranosyl] jujubogenin (còn gọi là bacopaside X) và bacopasaponin C [26] Bacosid A thường được tách ra cùng với bacosid B, trước đây, người ta cho rằng bacosid B chỉ khác với bacosid A ở phần đường thể hiện ở khả năng quay cực và có thể là một đồng phân của bacosid A Cho đến những năm 90 của thế kỷ trước cấu trúc của bacosid B vẫn chưa xác định được [46] Gần đây, với sự trợ giúp của các kỹ thuật tách và xác định cấu trúc hiện đại, bacosid B đã được xác định là một hỗn hợp của các saponin có aglycon là các jujubogenin hoặc pseudojujubogenin như: bacopasid N1, bacopasid N2, bacopasid-IV và bacopasid-V [10]

HO

bacoside A

O OH

Bacosid A1, một saponin kém phân cực và có hàm lượng thấp đã được phân lập và xác định cấu trúc bởi Jain và cs bằng sắc ký cột lặp lại nhiều lần

từ phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết cồn [10] Cấu trúc của bacosid A1 được xác định là 3-O-[ -arabinopyranosyl (1→3)- -L-arabinopyranosylljujubogenin, gồm phần aglycone là một jujubogenine và phần đường là L-arabinose-pyranosyl

O

O

O OH

O

O O OH HO

O

O OH

O

O HO O

O

HO

HO OH

OH O HO OH

OH OH

O

O

O OH

O

O HO

Hai saponin là bacopasid I và bacopasid II đã được Chakravarty phân lập

và xác định cấu trúc từ Bacopa monnieri vào năm 2001 [40] Sau đó, cũng các

tác giả này đã phân lập 3 saponin mới từ rau đắng biển là bacopaside III, IV và V với cấu trúc lần lượt là 3-O- -L-arabinofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl jujubogenin, 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-3)- -L-arabinopyranosyl jujubogenin, 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1-3)- -L-arabinofuranosyl pseudo-jujubogenin [48]

Hou và cs đã phân lập được một saponin mới năm 2002 đặt tên là bacopasaponin G, một dẫn xuất được Matsutaka đặt tên là (3R)-1-octan-3yl-(6-O-sulfonyl)-β-D-glucopyranosid, một phenylethanoid glycosid mới là 3,4-dihydroxyphenylethyl alcohol (2-O-feruloyl)-β-D-glucopyranoside và một glycosid mới khác là phenylethyl alcohol [5-O-p-hydroxybenzoyl- β -D-apiofuranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranosid [48]

Ngoài thành phần hoạt chất chính là các saponin đã được phân lập và xác định cấu trúc, một số thành phần khác đã được tìm thấy trong rau đắng biển như acid betulinic, wogonin, oroxindin, acid betulic, stigmastarol, beta-sitosterol cũng như nhiều loại acid amin khác nhau như alpha alanin, acid apartic, acid glutamic và serin và ester của nó Các hydrocarbon bão hòa như heptacosan, octacosan, nonacosan, triacontan, hentracontan, dotriacontan, và nhiều hợp chất hữu cơ khác như nicotin, acid brahmic, acid isobrmic, vallerin, acid pectic, acid béo, tannin, tinh dầu, acid ascorbic, acid thanakunic [3]

1.2.3 Các nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý

1.2.3.1 Tác dụng dƣợc lý chung

Rau đắng biển được sử dụng trong Y học cổ truyền Ấn Độ cách đây

3000 năm để điều trị bệnh lo lắng, cải thiện nhận thức và trí nhớ Có rất nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng loài thực vật này có tác dụng trong điều trị các bệnh về tim mạch, hô hấp, những rối loạn về thần kinh, chứng mất ngủ, chứng điên, trầm cảm, chứng rối loạn tâm thần, chứng co giật, stress, chống viêm, giảm đau, hạ sốt, quét gốc tự do, chống peroxy hóa lipid [48] Rau đắng biển cũng được báo cáo là có tác dụng gây ngủ tương tự như barbiturat, tác dụng chống ung thư và được sử dụng như thuốc an thần Ngoài ra còn có tác dụng ngăn chặn và làm lành viêm loét dạ dày

Thời gian gần đây, rau đắng biển được nghiên cứu sâu hơn và thành phần hóa học có tác dụng dược lý chính là các bacosid Nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng dịch chiết rau đắng biển và bacosid đóng vai trò quan trọng đối với khả năng học và nhớ Rau đắng biển và các saponin của nó làm giảm

lo lắng và trầm cảm trên chuột cống trắng [52] Nó có tác dụng chống oxy hóa tốt và bảo vệ các tế bào trong não [62]

Những nghiên cứu trên đã cho thấy tác dụng diệu kỳ của rau đắng biển, chính vì vậy có thể hiểu tại sao người Hindu gọi loài thực vật này là Brahmi

1.2.3.2 Tác dụng đối với những rối loạn tâm thần

Những nghiên cứu nước ngoài

Cao chiết rau đắng biển và một số hoạt chất của nó, bao gồm bacopasid

I, II, bacopasaponin C đã được báo cáo có tác dụng chống trầm cảm trên mô hình chuột bơi cưỡng bức và mô hình treo đuôi chuột [66] Một nghiên cứu gần đây của Manavi và cs (2010) cũng đã chứng minh rằng rau đắng biển ở liều dùng 80 mg/kg có tác dụng chống lại rối loạn gồm cả trầm cảm và lo lắng [19] Những kết quả này gợi ý rằng rau đắng biển có tiềm năng dùng để điều trị bệnh trầm cảm và đồng thời vừa rối loạn lo lắng vừa trầm cảm

Rau đắng biển cũng được biết đến tác dụng có lợi đối với bệnh động kinh Một số nghiên cứu gần đây đã khẳng định loài thực vật này và hoạt chất bacosid A của nó đóng vai trò kiểm soát cơn động kinh thông qua việc giảm thụ thể GABA ở vùng thể vân và vùng hải mã trong não chuột cống trắng [34]

Nghiên cứu trên động vật thực nghiệm đã cho thấy cao chiết rau đắng biển liều 40 mg/kg có tác dụng kích thích khả năng học tập trên mô hình đáp ứng lẩn tránh ở chuột cống trắng [19] Bacosid A và –B của rau đắng biển đã được chứng minh có tác dụng kích thích trí nhớ trên chuột cống trắng Chúng tác động đến vùng hải mã, vùng vỏ não và vùng dưới đồi dẫn đến tăng hoạt

tính protein kinase và tăng hàm lượng protein Điều này gợi ý rằng hoạt chất bacoside có tác dụng cải thiện dẫn truyền thần kinh và phục hồi tổn thương thần kinh thông qua sự phục hồi synap thần kinh

Một nghiên cứu gần đây đã cho thấy cao chiết cồn rau đắng biển có tác dụng kích thích nhận thức và bảo vệ thần kinh trên mô hình bệnh Alzheimer gây bởi ion ethylcholine aziridinium [40] Ngoài ra, có một nghiên cứu chỉ ra cao chiết rau đắng biển có tác dụng làm giảm mức độ beta - amyloid trong não của chuột chuyển gen mang bệnh Alzheimer (chuột PSAPP) [32] Trên mô

hình in vitro, cao chiết rau đắng biển cũng có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh

vỏ não nuôi cấy nguyên phát, đã bị tổn thương bởi protein beta – amyloid [69] Tuy nhiên, nghiên cứu này cũng chỉ mới dừng lại ở việc thử tác dụng của cao chiết cồn rau đắng biển Do đó, để phát triển rau đắng biển làm thuốc điều trị bệnh Alzheimer cần có những nghiên cứu thêm về tác dụng cải thiện trí nhớ, nhận thức trên các mô hình bệnh Alzheimer và thành phần hợp chất có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh

Những nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương đã nghiên cứu một số tác dụng dược lý của cao chiết cồn rau đắng biển, kết quả cho thấy loài thực

vật này có tác dụng chống oxy hóa in vitro, chống stress, cải thiện khả năng

học tập và nhận thức trên chuột bị gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin [2,3]

Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu của Viện Dược Liệu cũng đã đánh giá

về tác dụng cải thiện học và nhớ của cao chiết cồn rau đắng biển trên mô hình chuột nhắt trắng bị suy giảm trí nhớ do thiếu máu não cục bộ, một trong những mô hình mất trí nhớ giống bệnh Alzheimer Mô hình này đã được sử dụng phổ biến trên thế giới để nghiên cứu thuốc phục hồi/ cải thiện trí nhớ [72]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

2.1.1.1 Nguồn gốc

Rau đắng biển dùng trong thí nghiệm được thu thập tại thành phố Hồ Chí Minh Dược liệu đã được tiến sỹ Phạm Thanh Huyền (trưởng khoa Tài nguyên dược liệu – Viện Dược Liệu) giám định mẫu và lưu mẫu tại viện (mẫu

số INM 484)

2.1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Dược liệu rau đắng biển được phơi hoặc sấy ở nhiệt độ 60oC đến khi đạt độ ẩm khoảng 5% Nghiền mẫu đến kích thước phù hợp và bảo quản trong túi kín cho tới khi đưa vào nghiên cứu chiết xuất

Dược liệu rau đắng biển được nghiền nhỏ tới kích thước thích hợp, sau

đó đem chiết với dung môi cồn 95% (tỷ lệ 1:12 w/v) trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng Sau khi lọc đem đông khô đến khi thu được cao chiết có độ ẩm 7,2% Bảo quản cao chiết ở nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm cho đến khi sử dụng

Hình 2.1: Quy trình chiết tách rau đắng biển bằng cồn 95%

Nguyên liệu thô (1kg)

Dịch chiết cồn

Cao chiết cồn (độ ẩm 7%) (119,1g)

Cồn 95% (12 lít) (1:12 w/v), 48 giờ, nhiệt độ

phòng

Đông khô Bảo quản ở to

phòng

Bằng phương pháp phân tích sắc kí lỏng phổ khối ở điều kiện thích hợp xác định được cao chiết cồn 95% từ rau đắng biển có thành phần như sau:

Bảng 2.3: Thành phần bacosid của mẫu nghiên cứu

2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu

2.1.2.1 Chuột ddY bị suy giảm trí nhớ/nhận thức do mất vùng khứu giác

(Olfactory bulbectomy of mice – OBX)

Đối tượng sử dụng để thực nghiệm trong nghiên cứu là chuột ddY khoảng 9 tuần tuổi do công ty Japan SLC Inc, Shizuoka, Nhật Bản cung cấp Chuột ddY được tập luyện nuôi ổn định trong phòng chăn nuôi ít nhất 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm Chuột được cung cấp thức ăn và nước uống đầy

đủ Nhiệt độ phòng luôn duy trì ở khoảng 24 +/- 1oC, độ ẩm 65%, chu kì sáng/tối là 12h (sáng từ 7h00 – 19h00)

Tiến hành phẫu thuật

Tiến hành gây mê cho chuột bằng phenolbarbital sodium (50mg/kg i.p) và

cố định trên hệ thống định vị chuột Rạch da bộc lộ phần hộp sọ bao phủ vị trí OBX, sau đó khoan thủng hộp sọ 1 lỗ có đường kính 1mm, phá hủy vùng khứu giác của chuột, sau đó lấp đầy vùng này bằng bọt cầm máu gelantin Sau khi kết thúc thí nghiệm, kiểm tra tất cả chuột xem vùng khứu giác đã được lấy hết hay chưa, loại bỏ kết quả hành vi của những chuột không lấy được dưới 70% vùng khứu giác hoặc những chuột có vùng vỏ não không còn nguyên vẹn

Chuột chứng cũng thực hiện tương tự nhưng không loại bỏ vùng OBX Khi kết thúc thí nghiệm OBX của chuột chứng phải được xác định là còn nguyên vẹn

Thử thuốc

Chuột thí nghiệm được chia làm 4 nhóm và cho uống mẫu thử

Bảng 2.4: Các nhóm chuột tiến hành thử tác dụng dược lý

Chứng sinh lý 12 Uống nước muối sinh lý

(0,4ml/20mg thể trọng)

- Trong vòng 1 tuần trước khi phẫu thuật

- Bắt đầu lại từ ngày thứ 3 sau phẫu thuật

- 1 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm

Chứng bệnh lý 11 Uống nước muối sinh lý

(0,4ml/20mg thể trọng) OBX + RĐB 12 Uống cao chiết cồn 95% rau

đắng biển 50mg/kg x 1 lần/ngày (pha trong dung môi là nước thể tích 0,4ml/20mg thể trọng)

OBX + tacrin 11 Tiêm phúc mạc liều

2,5mg/kg x 1 lần/ngày

2.1.2.2 Tế bào NG 108-15 và protein β – amyloid 25-35

Nguồn gốc

Tế bào NG 108-15 (Neuroblastoma x glioma hybrid cell, 108CC15) là

dòng tế bào lai giữa hai dòng tế bào riêng biệt: Tế bào u nguyên bào thần kinh chuột cống N18TG2 và tế bào u thần kinh đệm chuột nhắt C6BU-1 Đây là

mô hình tế bào đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sàng lọc cũng như cơ chế tác dụng của thuốc tác dụng lên thần kinh trung ương Tế bào NG 108-15 được cung cấp bởi giáo sư Michihisa Tohda, Khoa Dược lý, Đại học Toyama, Nhật Bản tài trợ

Nuôi cấy tế bào thần kinh NG 108 – 15 và chuẩn bị mẫu

Tế bào được rã đông từ tủ âm sâu -80oC sau đó được nuôi cấy ổn định trong môi trường DMEM có bổ sung thêm 10% FBS, 2ml L-Glutamin, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, điều kiện nuôi cấy trong tủ ủ 37oC không khí chứa 5% CO2 Khi tế bào dàn đều 70% bề mặt đĩa nuôi thì được chia vào đĩa 96 giếng để tiến hành thí nghiệm

Protein β – amyloid 25-35 (Aβ 25-35) được pha thành nồng độ 2mM, bảo quản ở -20oC Các protein này sẽ được ủ 2 ngày ở nhiệt độ 37oC để tạo

thành dạng kết tập (aggregation) trước khi tiến hành thí nghiệm

Mẫu nghiên cứu được pha thành các nồng độ khác nhau, bao gồm 50,

100, 200, 300 và 400 µg/ml trong môi trường DMSO đảm bảo nồng độ cuối

cùng trong mỗi giếng tế bào là 0,01% DMSO

2.1.3 Hóa chất, thiết bị

Hóa chất

Bảng 2.1: Nguồn gốc hóa chất

2 Phenolbarbital Sodium Wako

3 Protein beta-amyloid Aβ 25-35 Sigma St.louis, MO, USA

6 Phenolbarbital Sodium Wako, Nhật Bản

10 Penicillin và Streptomycin Sigma St.louis, MO, USA

11 Và các hóa chất khác

Trang thiết bị

Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng trong đề tài

1 Hệ thống định vị chuột Muromachi, Kikai Co., Ltd., Nhật Bản

2 Vật thể O1, O2, O3 Tự thiết kế theo cấu trúc của hãng Ugo

Basile (Ý)

3 Mê lộ nước chữ Y

5 Phần mềm phân tích kết quả

SMART ver 2.0 của Panlab

Tây Ban Nha

Giáo sư Kinzo Matsumoto, Trường

Đại học Toyama, Nhật Bản

6 Tủ lạnh âm sâu Sanyo Nhật Bản

7 Máy đọc ELISA Thermo

Labsystem

Thermo, Đức

8 Máy cất quay, bếp cách thủy,

cân phân tích, máy đông khô

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết cồn 95% rau đắng

biển trên chuột suy giảm nhận thức do mất vùng khứu giác bằng thử nghiệm nhận diện vật thể và thử nghiệm mê lộ chữ Y

Nơi thực hiện: Khoa dược lý, trường Đại học Toyama, Nhật Bản

2.2.1.1 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ bằng thử nghiệm nhận dạng

đồ vật (Object Recognization Test – ORT)

Nguyên tắc

Các nhóm chuột sau khi xử lý với mẫu thử sẽ được đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ tạm thời (short term memory) (trí nhớ ngắn hạn không liên quan đến vị trí không gian tương ứng với trí nhớ phân đoạn của con người)

bằng mô hình thử nghiệm nhận dạng vật thể vào ngày thứ 17 sau khi tiến hành phẫu thuật Mô hình này được thực hiện theo phương pháp của tác giả Yamada và cộng sự (2007) [63]

Phương pháp tiến hành:

Hệ thống dụng cụ gồm 1 hộp hình trụ kích thước 100 x 100 x 50 cm Các vật thể bao gồm O1, O2 giống hệt nhau và O3 có hình dạng và kích thước khác O1, O2

Một ngày trước khi tiến hành thử nghiệm ORT, chuột được đặt vào một hộp hình trụ cho phép chuột tự do khám phá không gian mới

Ngày tiếp theo, thử nghiệm ORT được tiến hành Thử nghiệm ORT gồm

có 2 giai đoạn, bao gồm giai đoạn luyện tập và giai đoạn kiểm tra

Giai đoạn luyện tập, mỗi chuột được đặt vào hộp hình trụ ngày hôm trước, có bổ sung thêm 2 đồ vật giống nhau O1 và O2 Chuột được phép khám phá tự do 2 đồ vật này trong 5 phút

Giai đoạn kiểm tra được tiến hành sau khi thực hiện giai đoạn luyện tập

30 phút Ở giai đoạn này, một trong hai đồ vật trong hình trụ được thay thế bởi một đồ vật có kích thước và hình dáng khác với 2 đồ vật ở giai đoạn luyện tập, đặt tên là O3 Chuột cũng được được phép khám phá những đồ vật này trong 5 phút giống ở giai đoạn luyện tập

Thời gian chuột khám phá các đồ vật sẽ được ghi lại bằng camera và tính toán sử dụng phần mềm SMART ver 2.5 (PanLab, S.L., Barcelona, Spain) do Giáo sư Kinzo Matsumoto, Trường Đại học Toyama, Nhật Bản cung cấp