Nghiên cứu phương pháp phân tích phát hiện nhanh thuốc giả sử dụng các thiết bị phổ raman

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI VIỆT PHƯƠNG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH THUỐC GIẢ SỬ DỤNG CÁC THIẾT BỊ PHỔ RAMAN LUẬN VĂN THẠC SỸ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI VIỆT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH THUỐC GIẢ SỬ DỤNG CÁC THIẾT BỊ

PHỔ RAMAN

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO ẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI VIỆT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH PHÁT HIỆN NHANH

THUỐC GIẢ SỬ DỤNG CÁC THIẾT BỊ

PHỔ RAMAN

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Việt Hùng

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến:

TS Trần Việt Hùng

là người thầy, người anh đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và chia

sẻ cho tôi những kinh nghiệm vô cùng quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn Khoa Kiểm Nghiệm Nguyên Liệu đã tạo điều kiện cung cấp cho tôi các tài liệu, thời gian cần thiết để hoàn thành luận văn này

Tôi xin cám ơn Ban giám đốc, các phòng ban, các cán bộ Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung ương đã giúp đỡ, cung cấp cho tôi những điều kiện cần thiết để hoàn thành luận văn nay

Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng suốt những năm học dưới mái trường này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp CH17 đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn

Hà Nội, ngày 29 tháng 8 năm 2014

Học Viên

Bùi Việt Phương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1.Tổng quan về thuốc giả 4

1.2 Tổng quan về một số thuốc được nghiên cứu trông đề tài 6

1.2.1 Ibuprofen……….7

1.2.2 Sildenafil……….7

1.2.3 Zidovudin………7

1.2.4 Lamivudine……… 8

1.3 Tổng quan về phổ quang học và phương pháp quang phổ Raman 8

1.3.1 Phổ quang học và 1 số phương pháp quang phổ 8

1.3.2 Phổ Raman 11

1.3.2.1 Lịch sử phát triển……….11

1.3.2.2 Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman………13

1.3.2.3 Cấu tạo của máy Raman……… 16

1.3.2.4 Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman……….16

1.3.2.5 Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn.21 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………… 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3 Các bước tiến hành thực nghiệm 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 26

3.1 Công thức bào chế viên nén và viên nang của các hoạt chất dùng trong nghiên cứu 26

3.1.1 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Ibuprofen 26

3.1.2 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Sildenafil 28

3.1.3 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Lamivudin 30

3.1.4 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Zidovudin 32

3.2 Kiểm tra chất lượng của các mẫu viên nghiên cứu 35

3.3 Kết quả đo phổ Raman 37

3.3.1 Kết quả nghiên cứu trên máy để bàn 37

3.3.2 Kết quả nghiên cứu trên máy cầm tay 46

3.3.3 Ứng dụng trong thực tế 50

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 52

Kết luận……… ……… 54

Đề xuất 54

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tỷ lệ thuốc kém chất lượng qua các năm từ 2009 – 2013 4

Bảng 1.2: Tỷ lệ thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng từ năm 2009 – 2013 4

Bảng 1.3: Tỷ lệ thuốc giả qua các năm từ 2009 – 2013 5

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Các thông số kỹ thuật của máy quang phổ Raman để bàn 22

Bảng 2.3 Các thông số kỹ thuật của máy quang phổ Raman cầm tay 23

Bảng 3.1: Công thức bào chế viên nén Ibuprofen 26

Bảng 3.2 Công thức bào chế viên nang Ibuprofen 27

Bảng 3.3: Công thức bào chế viên nén Sildenafil 28

Bảng 3.4 Công thức bào chế viên nang Sildenafil 29

Bảng 3.5: Công thức bào chế viên nén Lamivudin 30

Bảng 3.6 Công thức bào chế viên nang Lamivudin 32

Bảng 3.7: Công thức bào chế viên nén Zidovudin 32

Bảng 3.8 Công thức bào chế viên nang Zidovudin 34

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra chất lượng các mẫu viên được nghiên cứu 35

Bảng 3.10 Kết quả đo phổ Raman của một số mẫu ngoài thị trường 50

Bảng 3.11 Kết quả kiểm tra chất lượng của một số mẫu ngoài thị trường đã được khảo sát bàng máy quang phổ Raman 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Ibuprofen 7

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của Sildenafil 7

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Zidovudin 8

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Lamivudin 8

Hình 1.5: Các vùng quang phổ 9

Hình 1.6: Sơ đồ phân chia các phương pháp quang phổ 10

Hình 1.7 Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu 14

Hình 1.8.Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng lượng 15

Hình 1.9 Cấu tạo của máy quang phổ Raman 16

Hình 2.1.Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng Renishaw 23

Hình 2.2 Máy quang phổ Raman cầm tay hãng BW-TEX 24

Hình 3.1 Phổ Raman chuẩn của Ibuprofen 37

Hình 3.2 Phổ Raman chuẩn của Sildenafil 38

Hình 3.3 Phổ Raman chuẩn của Lamivudin 38

Hình 3.4 Phổ Raman chuẩn của Zidovudin 39

Hình 3.5 Hình ảnh chồng phổ của viên nang CT1 Ibuprofen 40

Hình 3.6 Hình ảnh chồng phổ của viên nang CT1 Sildenafil 40

Hình 3.7 Hình ảnh chồng phổ của viên nang CT1 Lamivudin 41

Hình 3.8 Hình ảnh chồng phổ của viên nang CT1 Zidovudin 41

Hình 3.9 Phổ Raman của Viên nang Placebo Ibuprofen CT1 43

Hình 3.10 Phổ Raman của Viên nang Placebo Sildenafil CT2 43

Hình 3.11 Phổ Raman của Viên nang Placebo Lamivudin CT3 44

Hình 3.12 Phổ Raman của Viên nang Placebo Zidovudin CT2 44

Hình 3.13: Hình ảnh chồng phổ của viên nang Ibuprofen CT2 hàm lượng 50% 45

Hình 3.14: Hình ảnh chồng phổ của viên nang Sildenafil CT1 hàm lượng 50% 45

Hình 3.15: Hình ảnh chồng phổ của viên nang Lamivudin CT2 hàm lượng 50% 46 Hình 3.16: Hình ảnh chồng phổ của viên nang Zidovudin CT2 hàm lượng 50% 46

Hình 3.17 Phổ Raman chuẩn của Ibuprofen trên máy cầm tay 47

Hình 3.18 Phổ Raman chuẩn của Sildenafil trên máy cầm tay 47

Hình 3.19 Phổ Raman chuẩn của Lamivudin trên máy cầm tay 48

Hình 3.20 Phổ Raman chuẩn của Zidovudin trên máy cầm tay 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuốc giả, thuốc kém chất lượng đang là một vấn đề không chỉ làm đau đầu các cơ quan chức năng mà còn là mối hiểm họa với nhiều người bệnh Nguy hiểm hơn, những năm qua thuốc giả đã được bày bán cả ở hiệu thuốc, đi vào cả bệnh viện thông qua đấu thầu Theo WHO, năm 2006, doanh số bán thuốc giả, thuốc kém chất lượng đạt 45 tỷ Euro, chiếm 10% thị trường dược phẩm thế giới

Ở châu Âu, có khoảng 2,7 triệu thuốc bị thu giữ trong năm 2006, tăng 3,84% so với năm 2005 Những nước như Anh, tỉ lệ thuốc giả, thuốc kém chất lượng chiếm 1% số thuốc lưu hành trên thị trường Trong khi đó, con số này là 30% ở các nước Mỹ Latin, Đông Nam Á, châu Phi, … Và khoảng 50% số thuốc được bán qua mạng là giả

Châu Á đang được xem là khu vực bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi nạn thuốc giả, đặc biệt vùng Đông Nam Á

Ở Việt Nam, tỷ lệ thuốc kém chất lượng chiếm khoảng 2,9% - 3,3% Năm

2010, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tiến hành lấy 32313 mẫu lấy và phát hiện 1008 mẫu lấy không đạt chất lượng (chiếm 3,12%, thấp hơn năm 2009 là 0,21%), trong đó có 159 thuốc nhập khẩu và 849 thuốc sản xuất trong nước

Các loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng phần nhiều là thuốc tân dược như: thuốc điều trị sốt rét, thuốc chống lao, thuốc tránh thai hỗn hợp, thuốc chống cúm H5N1, thuốc kháng virus viêm gan và thuốc AIDS; một số thuốc thông thường, tiêu thụ nhiều như: hạ nhiệt giảm đau thông thường, kháng sinh thông thường

Đặc biệt gần đây, thuốc đông y vốn là lĩnh vực được coi là an toàn cũng đã

có dấu hiệu bị làm giả Việc trộn các thuốc tân dược vào đông dược để tăng tác dụng tức thì của thuốc đông dược Điển hình, các nhóm thuốc tân dược hay được trộn vào thuốc đông dược như nhóm thuốc giảm béo, chống viêm không Steroid,

thuốc ức chế PDE – 5, corticoid, thuốc trị tiểu đường, thuốc hạ mỡ máu, thuốc điều trị goute …

Các loại thuốc chữa bệnh sốt rét bị làm giả nhiều nhất với tỉ lệ thuốc giả lên tới 51% Nhiều dược phẩm giả chữa bệnh lao, AIDS, vắc xin viêm màng não cũng được tìm thấy trên thị trường Ước tính trên thế giới có khoảng từ 10.000 tới 200.000 người, hoặc có thể hơn, đã chết do sử dụng thuốc giả Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO), 1/5 trong số 1 triệu người chết vì bệnh sốt rét hàng năm có thể được cứu sống nếu điều trị bằng thuốc thật

Phát hiện thuốc giả ngoài thị trường thường sử dụng minilab nhưng nhược điểm của Minilab là phải xử lý mẫu phức tạp, dụng cụ mang theo cồng kềnh, độc hại vì phải sử dụng hóa chất

Hiện nay các phương pháp phổ sử dụng thiết bị cầm tay, đặc biệt là hồng ngoại gần và Raman đang được phát triển trên thế giới và có vai trò quan trọng trong phát triển thuốc giả

Phương pháp phổ Raman được ghi trong các dược điển tiên tiến như dược điển Mỹ (USP), dược điển châu Âu (EP)…, nhưng trong dược điển Việt Nam thì chưa ghi, và phổ Raman trong kiểm nghiệm thuốc chưa được nghiên cứu ở Việt Nam

Nhằm góp phần nâng cao năng lực kiểm nghiệm thuốc và góp phần thực

hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu một số phương pháp phân tích phát hiện

nhanh thuốc giả sử dụng các thiết bị phổ hiện đại (Phổ Raman, Phổ hồng ngoại gần chuyển dạng Fourier và phổ nhiễu xạ tia X-XRD)”, chúng tôi thực hiện đề

tài:

“Nghiên cứu phương pháp phân tích phát hiện nhanh thuốc giả sử

dụng các thiết bị phổ Raman” với 2 mục tiêu:

1, Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng thuốc bằng thiết bị quang phổ Raman để bàn và quang phổ Raman cầm tay với các thuốc có chứa các hoạt chất Ibuprofen, Sildenafil, Lamivudin, Zidovudin

2, Xây dựng được bộ phổ chuẩn và thư viện phổ chuẩn của các chất trên

để phục vụ nghiên cứu và kiểm tra chất lượng thuốc trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về thuốc giả

Tại điều 2 chương 1 của Luật Dược- năm 2005, quy định rõ: Thuốc kém chất lượng là thuốc không đạt tiêu chuẩn chất lượng đã đăng ký với cơ quan có thẩm quyền Thuốc giả là sản phẩm được sản xuất dưới dạng thuốc với ý đồ lừa đảo, thuộc một trong những trường hợp sau đây: a) Không có dược chất; b) Có dược chất nhưng không đúng hàm lượng đã đăng ký; c) Có dược chất khác với dược chất ghi trên nhãn; d) Mạo tên, kiểu dáng công nghiệp của thuốc đã đăng ký bảo hộ sở hữu

công nghiệp của cơ sở sản xuất khác

Ở Việt Nam, tỷ lệ thuốc kém chất lượng chiếm khoảng 2,5% - 3,3% Năm

2013, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tiến hành lấy 39853 mẫu lấy và phát hiện 1004 mẫu lấy không đạt chất lượng (chiếm 2,52%, thấp hơn năm 2012 là 0,57%), trong đó có 186 thuốc nhập khẩu và 762 thuốc sản xuất trong nước

Bảng 1.1: Tỷ lệ thuốc kém chất lượng qua các năm từ 2009 - 2013

Đặc biệt gần đây, thuốc đông y vốn là lĩnh vực được coi là an toàn cũng đã có dấu hiệu bị làm giả Việc trộn các thuốc tân dược vào đông dược để tăng tác dụng tức thì của thuốc đông dược Nếu thuốc đông dược thành phần có trộn hoạt chất hoá dược (tân dược) nhưng không công bố trên nhãn hoặc tân dược mà ghi nhãn là thuốc đông dược, thực chất là thuốc tân dược thì được coi là thuốc giả Đây không chỉ là vấn đề riêng của nước ta mà các nước trên thế giới cũng rất quan tâm Trong những năm gần đây, ở nước ta, cùng với sự phối hợp của các cơ quan công an, thanh tra dược, hệ thống kiểm nghiệm từ Trung ương đến địa phương đã phát hiện nhiều loại thuốc này Trong số đó, bao gồm cả thuốc có hoặc không có nguồn gốc, thuốc sản xuất trong nước hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là chưa được cấp số đăng

ký

Các thuốc này ngày càng được làm giả một cách khéo léo và tinh vi: ví dụ trộn tân dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc,…

Điển hình, năm 2010, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương phát hiện chế phẩm đông dược “Viên Bổ Thận Hà Thành”, là thực phẩm chức năng, dùng để bổ thận tráng dương, tăng cường sinh lý, có trộn trái phép Sildenafil (một chất ức chế men PDE-5, có tác dụng cương dương) có hàm lượng lên tới 98mg/viên Năm 2011, phát hiện thấy trộn trái phép Sibutramin trong một số thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm béo như Lishou, Juji hay phát hiện Dexamethason trong bài thuốc gia truyền

bổ tỳ chữa chứng biếng ăn, còi cho trẻ em

Tháng 3 năm 2011, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW phối hợp với Quản lý thị trường đã phát hiện thuốc Zinnat giả và gần đây nhất tháng 4 năm 2012, Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm - Thực phẩm Hưng Yên đã phát hiện thuốc tiêm Voltarén® 75mg giả

1.2 Tổng quan về một số thuốc được nghiên cứu trong đề tài

Căn cứ vào tình hình cụ thể của bệnh tật và thị trường thuốc Việt Nam, chúng tôi xin đưa ra một số nhóm thuốc với các hoạt chất cụ thể để nghiên cứu và sau này

sẽ mở rộng ra các đối tượng tiếp theo Trước hết, chúng tôi tập trung đối tượng vào những thuốc được sử dụng rộng rãi như điều trị virus và các kháng sinh phổ rộng hay được các bác sĩ kê đơn Những thuốc này rất dễ bị làm giả vì những lý do sau: thứ nhất, khi tung ra thị trường nó dễ tiêu thụ, thứ hai, chúng là những thuốc phổ biến hoặc thuốc phục vụ cho các chương trình Quốc gia nên khi bị làm giả thì chúng ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng, và cuối cùng là do số lượng thuốc điều trị các bệnh này lớn nên chúng dễ trà trộn vào thị trường mà cơ quan quản lý rất khó kiểm soát hết Vì vậy rất cần các biện pháp phát hiện nhanh để kiểm soát được số lượng lớn thuốc hơn

Cụ thể các hoạt chất và một số tính chất cơ bản của nó như sau:

1.2.1 Ibuprofen [1]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Ibuprofen

Tên khoa học: Acid (2RS)-2-[4-(2-Methylpropyl)phenyl]propanoic

Công thức: C13H18O2

Phân tử lượng: 206,3

Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hay tinh thể không màu Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, dicloromethan, methanol và ether Tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng và carbonat kiềm

1.2.2 Sildenafil [32]

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của Sildenafil

Tên khoa học: pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl)phenylsulfonyl]-4-methylpiperazine

1-[4-ethoxy-3-(6,7-dihydro-1-methyl-7-oxo-3-propyl-1H-Công thức phân tử: C22H30N6O4S

Phân tử lượng: 474,6

Tính chất: Bột kết tinh màu trắng đến xám nhạt, không mùi, vị đắng, không tan trong nước và ethanol

1.2.3 Zidovudin [32]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Zidovudin

Tên khoa học: methylpyrimidine-2,4-dion

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Lamivudin

Tên khoa học: yl]pyrimidin-2(1H)-one

4-Amino-1-[(2R,5S)-2-(hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-Công thức: C18H11N3O3S

Phân tử lượng: 229,3

Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, tan trong nước

1.3 Tổng quan về phổ quang học và phương pháp quang phổ Raman

1.3.1 Phổ quang học và 1 số phương pháp quang phổ

Ngày nay phương pháp quang học nói chung và phương pháp phân tích quang phổ nói riêng đang đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong ngành kiểm nghiệm thuốc Các phương pháp phân tích quang học dựa trên việc nghiên cứu sự tương tác của bức xạ ánh sáng trên chất khảo sát hoặc sự phát ra các bức xạ ánh sáng dưới một tác động hóa lý nào đó Vùng phổ quang học giới hạn từ vùng hồng ngoại xa đến vùng

Hình 1.5: Các vùng quang phổ

Và trong phân tích thì người ta phân thành 2 loại chính: quang phổ hấp thụ nguyên tử và quang phổ hấp thụ phân tử:

Hình 1.6: Sơ đồ phân chia các phương pháp quang phổ

Các phương pháp phân tích quang học đang được sử dụng là:

- Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS ( phương pháp đo quang)

Dựa trên khả năng hấp thụ chọn lọc các bức xạ rọi vào dung dịch chất nghiên cứu, độ hấp thụ này phụ thuộc vào nồng độ chất tan

-Phương pháp quang phổ hấp thụ IR (quang phổ hồng ngoại)

Khi phân tử chất nghiên cứu bị chiếu tia hồng ngoại, các nhóm nguyên tử của

nó sẽ hấp thụ năng lượng và thay đổi trạng thái dao động, tạo nên một đỉnh hấp thụ đặc trưng trên phổ IR, bước sóng xuất hiện đỉnh và tập hợp các đỉnh là cơ sở của việc định tính

- Phương pháp quang phổ huỳnh quang

Dựa trên khả năng phát ra các bức xạ nhìn thấy có bước sóng xác định và có cường độ phụ thuộc vào hàm lượng của chất nghiên cứu, khi nó bị một chùm tia tử ngoại chiếu vào

- Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

Dựa trên khả năng hấp thụ các bức xạ đặc trưng chiếu vào khi chất nghiên cứu đã được nguyên tử hóa trong ngọn lửa hoặc trong lò Dựa vào phần năng

lượng bức xạ bị hấp thụ có thể định lượng được các nguyên tố

- Phương pháp đo độ phân cực

Dựa trên sự đo góc quay của mặt phẳng ánh sáng phân cực đi qua dung dịch nghiên cứu

- Phương pháp đo độ khúc xạ

Dựa trên sự đo chiết suất (góc khúc xạ) của ánh sáng đi qua chất nghiên cứu

Ngoài ra còn các phương pháp phân tích quang học khác như đo độ đục, đo

quang ngọn lửa, đo phổ phát xạ nguyên tử, đo phổ phát xạ Plasma…

Các phương pháp này có độ chính xác cao nhưng do thiết bị và máy móc cồng kềnh nên chúng chỉ được lắp đặt tại các phòng thí nghiệm, bên cạnh đó công tác chuẩn bị mẫu lại tốn thời gian và các thủ tục hành chính rất phức tạp từ lúc lấy mẫu cho đến lúc có kết quả Khoa học và công nghệ phát triển, cùng với sự phát triển của công nghệ Nano, các thiết bị phân tích ngày càng được thu nhỏ lại và có những thiết

bị cầm tay cùng với một số kỹ thuật, phương pháp phân tích tích hợp trong nó để có thể mang đi lại dễ dàng đồng thời cho kết quả nhanh và tương đối chính xác Các phương pháp phổ Hồng ngoại gần chuyển hóa Fourier, phương pháp Quang phổ Raman, và phương pháp Nhiễu xạ tia X-XRD đã, đang và sẽ rất có triển vọng giúp chúng ta phát triển các thiết bị trên và chắc chắn trong tương lai nó sẽ là những phương tiện đắc lực để giúp cho việc kiểm soát chất lượng thuốc tốt hơn

1.3.2 Phổ Raman

1.3.2.6 Lịch sử phát triển

Năm 1928, chỉ với các thiết bị đo đạc thô sơ, sử dụng ánh sáng mặt trời làm nguồn kích thích, kính hiển vi làm bộ phận hội tụ ánh sáng tán xạ, “detector” bằng mắt thường, Chandrasekhra Venkata Raman đã phát hiện ra một hiệu ứng tán xạ ánh sáng yếu, hiệu ứng này sau đó được đặt theo tên ông, hiệu ứng Raman Với điều kiện thiếu thốn như thế, sự phát hiện ra một hiện tượng yếu như tán xạ Raman là một thành quả rất đáng khâm phục và nó đã giúp ông đạt được giải Nobel vật lý năm

1930 [24]

Theo thời gian, những bước cải tiến trong các bộ phận của thiết bị đo đạc tán xạ Raman đã diễn ra Những nghiên cứu đầu tiên được tập trung vào sự phát triển nguồn ánh sáng kích thích Các loại đèn từ các nguyên tố khác nhau đã được phát triển (như heli, chì, kẽm) nhưng không đạt yêu cầu bởi vì cường độ ánh sáng tán xạ thu được vẫn rất yếu Nhiều năm sau đó, người ta nghiên cứu áp dụng và phát triển nguồn kích thích bằng đèn thủy ngân, nhưng nó vẫn không mang lại hiệu quả như mong muốn Cho tới tận năm 1962, đã có bước ngoặt lớn trong công nghệ Raman,

đó là người ta đã đưa laser vào làm nguồn kích thích cho tán xạ Raman Các loại nguồn Laser sử dụng phổ biến thời đó chủ yếu là laser thuộc vùng UV-VIS như Laser Ar+(351,1-514,5nm); Kr(337,4-674,4nm) và cho đến gần đây các nguồn laser

IR và NIR được đưa vào sử dụng làm hạn chế rất nhiều hiện tượng huỳnh quang (một hiện tượng tác động mạnh đến việc thu phổ Raman).[16]

Nhưng vẫn có nhiều hạn chế khiến cho quang phổ Raman phát triển tương đối chậm Đầu tiên là khó khăn trong việc điều khiển hoàn hảo hệ thống quang học Thứ hai là huỳnh quang trong chất mẫu ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát hiện Raman Thứ ba, tán xạ Raman là tán xạ yếu, tản mát, muốn ghi được chính xác phổ của nó thì cần phải chiếu xạ laser kích thích trong một thời gian dài, điều này dẫn đến sự phân hủy và biến tính của mẫu Vậy nên, mặc dù bản chất là một phương

pháp phân tích không phá hủy mẫu, nhưng một vài trường hợp, phổ Raman lại được nhận định là một phương pháp phá hủy mẫu.

Những năm 1900, đã có một cuộc cách mạng mới trong quang phổ Raman Nhờ

sự phát triển của một loạt các bộ phận như nguồn laser, sự tiến bộ về công nghệ của detector, sự phát triển vượt bậc của các bộ lọc quang, sự cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các phương pháp phân tích dữ liệu … mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng rãi hơn Đặc biệt, với sự phát triển công nghệ nano, ngoài máy quang phổ Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ

bộ, khảo sát tại thực địa các mẫu cần phân tích

1.3.2.7 Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman

Trong khi quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ, phản xạ và phát xạ ánh sáng, quang phổ Raman dựa trên hiện tượng tán xạ Tán xạ này xảy ra do va chạm giữa các photon và các phân tử Ánh sáng tới với tần số 0 trên một phân tử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E=h 0 Ví dụ nguồn laser có bước sóng 500 nm và công suất 1W chứa khoảng 2,5x1018 photon trong một giây Các photon này gồm cả các photon tương tác cũng như những photon truyền qua mà không tương tác với các phân tử

Hầu hết các photon trong số này va chạm đàn hồi với phân tử và không thay đổi năng lượng sau khi va chạm, các bức xạ phát ra sau đó được gọi là tán xạ Rayleigh

Vì vậy, tán xạ Rayleigh gồm những photon có cùng tần số với ánh sáng tới

Một số lượng rất nhỏ của photon va chạm không đàn hồi với các phân tử và trao đổi năng lượng sau va chạm Nếu phân tử nhận năng lượng h từ photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h( 0 – ) , và tần số của photon tán xạ khi đó là

0 – Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng h từ phân tử, các năng lượng của

các photon tán xạ tăng lên thành h( 0 + ) và tần số của photon tán xạ là 0 + Tán

xạ mà có sự trao đổi năng lượng của photon với một phân tử như trên được gọi là tán

xạ Raman Và các tán xạ có tần số 0 – và có tần số 0 + được gọi tương ứng là“tán xạ Stokes” và“tán xạ đối Stokes”

Hình 1.7 Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu

Khi chiếu bức xạ điện từ h vào một phân tử, năng lượng có thể bị hấp thu hoặc phát xạ

 Tán xạ Rayleigh xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với nguyên tử

 Tán xạ Raman xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với liên kết trong phân tử

Cũng như các phép đo quang phổ khác, khi đo tán xạ Raman ta khảo sát sự thay đổi các mức năng lượng trong phân tử Quá trình trao đổi năng lượng có thể xảy ra giữa các mức năng lượng của điện tử, các mức năng lượng của dao động hoặc quay, nhưng khi khảo sát quang phổ Raman chúng ta chỉ khảo sát năng lượng dao động phân tử, cụ thể hơn đó là dao động dọc theo trục của các liên kết

Hình 1.8 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes Tán xạ Stokes xảy ra khi một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng kích thích Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng thái năng lượng cơ bản, nên tán xạ Stokes dễ xảy ra hơn và chiếm đa số Vì vậy, trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes

Hình 1.8.Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng lượng

Một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman đặc trưng cho sự thay đổi tần

số trong hiệu ứng Raman được gọi là “Raman shift” Đối với một chất, cường độ của các bức xạ tương ứng trên Raman shift là khác nhau, chúng tạo nên phổ Raman đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi nhóm chức thì cho đỉnh phổ ở các số

sóng đặc trưng khác nhau Vì vậy, phân tích phổ Raman, chúng ta có thể xác định được chính xác một chất và nghiên cứu cấu trúc của chất ấy

1.3.2.8 Cấu tạo của máy Raman

Máy quang phổ Raman được phát triển bởi nhiều công ty, nhiều hãng sản xuất khác nhau Nhưng về cơ bản nó bao gồm năm bộ phận sau: Nguồn laser, bộ phận đựng mẫu, quang phổ kế, detector, hệ quang Hình 1.9 mô tả các bộ phận cơ bản của máy quang phổ Raman

Hình 1.9 Cấu tạo của máy quang phổ Raman 1.3.2.9 Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman

nước, dạng đa hình, và các liên kết hydro Phương pháp phân tích quang phổ Raman hầu như không yêu cầu việc chuẩn bị mẫu, vì vậy mà tiết kiệm về thời gian, không cần sử dụng thêm các dụng cụ bổ trợ khác, tiết kiệm công sức và tiết kiệm chi phí

 Có thể đo phổ Raman trực tiếp xuyên qua các bao bì đựng, các chai lọ thủy tinh, các vỏ bao film… mà không cần phải xâm lấn vào các cấu tạo bên trong mẫu, không làm hỏng cấu tạo của thành phẩm, ảnh hưởng đến mẫu đo và vì vậy mà không làm gián đoạn hoặc gây hao phí trong quá trình sản xuất Điều này rất thuận tiện trong việc theo dõi và kiểm soát chất lượng sản phẩm trong các khâu của quá trình sản xuất dược phẩm

 Phương pháp quang phổ Raman có thể phân tích được chỉ với một lượng mẫu nhỏ Điều này rất quan trọng trong việc đánh giá sự đồng nhất của mẫu đo, phân tích để phát hiện các chất chỉ với một lượng mẫu nhỏ Ngoài ra, nó còn

có ý nghĩa trong quá trình theo dõi các phản ứng hóa học, bởi vì ở giai đoạn đầu của phản ứng thì sản phẩm tạo ra là rất ít và khó để nhận biết được

 Phép phân tích vừa đơn giản, không phải chuẩn bị mẫu và vừa cho kết quả nhanh Điều này giúp tiết kiệm thời gian phân tích, do đó chúng ta sẽ sớm có kết luận trong các phép phân tích định tính xác định mẫu đo; còn trong sản xuất dược phẩm thì việc cho kết quả sớm giúp chúng ta có những điều chỉnh kịp thời nhằm được những sản phẩm như ý muốn

 Việc đo quang phổ Raman khá là dễ dàng, vì vậy mà việc đào tạo để sử dụng được một thiết bị quang phổ Raman sẽ rất đơn giản, áp dụng được cho nhiều loại đối tượng phổ thông khác nhau mà không nhất thiết phải có kiến thức chuyên sâu Việc sử dụng dễ dàng như vậy giúp cho máy quang phổ Raman ngày càng được phổ cập hơn, phương pháp phân tích phổ Raman được ứng dụng trong nhiều ngành nghề khác nhau hơn, nhất là trong công tác Hải quan

và Pháp y, những ngành cần phải cho kết quả sàng lọc nhanh, độ tin cậy cao

 Sự ra đời của thiết bị FT-Raman với độ lặp lại cao tạo điều kiện cho sự phát triển các đầu thu có khẩu độ lớn, cho phép tia laser tập trung được vào một lượng mẫu lớn hơn, tín hiệu Raman thu được nhiều hơn, và chúng ta phân tích được một lượng mẫu lớn hơn khi cần thiết

 Nước hấp thu tán xạ Raman kém, vì vậy rất thuận tiện cho việc đo phổ của các chất ở dạng dung dịch trong nước

 Đầu dò sợi quang sử dụng công nghệ của cáp quang giúp kích thích và thu tín hiệu Raman ở một khoảng cách xa, ở trong những điều kiện độc hại, đo mẫu trong lòng của bao bì đựng lớn, điều kiện môi trường có nhiệt độ cao…

Khi nói đến phổ dao động phân tử, quang phổ Raman và IR luôn có quan hệ mật thiết với nhau, có tính chất bổ sung cho nhau trong trong các phép phân tích xác định cấu trúc phân tử So với phương pháp quang phổ IR thì phương pháp phân tích phổ Raman có một số lợi thế hơn như sau:

- Đối với các hợp chất hút ẩm và các hợp chất nhạy trong không khí, cho vào ống thủy tinh nút kín rồi thu phổ Raman, trong phổ IR thì ống thủy tinh hấp thụ bức

- Nhờ bước sóng laser kích thích ngắn hơn là bước sóng trong vùng hồng ngoại nên tia laser có khả năng đâm xuyên cao hơn, thu được tín hiệu từ sâu bên trong mẫu hơn, bên cạnh đó, cũng do nước và thủy tinh không hấp thụ phổ Raman

mà phương pháp quang phổ Raman có thể dùng để định lượng chất rắn trong viên,

chất lỏng trong dung dịch nước Phổ IR không có được điều này và nó chủ yếu là dùng để định tính

 Nhược điểm và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình đo phổ

Tuy đã được phát triển từ rất lâu, có rất nhiều ưu điểm như vậy, nhưng chi phí cho các thiết bị quang phổ Raman còn rất cao, nên nó rất khó để được sử dụng rộng rãi như một phép phân tích thông thường Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến phép đo phổ Raman đó là hiện tượng huỳnh quang, sự nóng lên của mẫu đo, sự hấp thụ phổ Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu và ảnh hưởng của độ phân cực

Nếu nền mẫu đo cho huỳnh quang, tín hiệu của phép đo sẽ có những thành phần huỳnh quang trong đó

Tín hiệu huỳnh quang xuất hiện khi bước sóng laser kích thích trùng lặp với một dải hấp thụ của mẫu đo Huỳnh quang thường phủ lên tín hiệu Raman, nó như là một nền dốc khá phẳng, có thể gây ra một đường nền ảo với độ nhiễu thấp và làm giảm tỉ

lệ S/N của các tín hiệu Raman Dải bước sóng và cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào thành phần hóa học của vật liệu phát huỳnh quang Bởi vì tín hiệu huỳnh quang thường mạnh hơn tín hiệu Raman nên chúng thường bao phủ và làm suy giảm đáng

kể tín hiệu Raman Muốn triệt tiêu hoặc hạn chế huỳnh quang chúng ta tường sử dụng các detector vùng NIR Tuy nhiên việc làm giảm tín hiệu huỳnh quang bằng cách sử dụng nguồn laser kích thích có bước sóng dài một phần nào đó cũng làm giảm cường độ của tín hiệu Raman Chính vì vậy để tỷ lệ S/N của tín hiệu lớn nhất, chúng ta phải tính toán để cân bằng giữa các yếu tố: loại bỏ huỳnh quang, cường độ phát hiện và sự đáp ứng của detector Huỳnh quang chất rắn đôi khi được giảm thiểu bằng cách chiếu bức xạ laser vào mẫu đo một khoảng thời gian trước khi đo Quá trình này được gọi là photobleaching, nó là quá trình làm giảm các loại hấp thụ cao Photobleaching kém hiệu quả hơn trong chất lỏng, nơi có các mẫu di động

Quá trình chiếu laser kích thích, có thể làm nóng mẫu và gây ra một loạt các ảnh hưởng như làm thay đổi trạng thái vật lý của mẫu (nóng chảy), chuyển đổi dạng thù hình, đốt cháy hoặc làm phân hủy mẫu Nguy cơ làm nóng mẫu tăng khi công suất nguồn laser lơn hoặc kích thước của nguồn laser càng nhỏ (độ tụ cao) trong trường hợp sử dụng thấu kính hội tụ Vấn đề này thường xảy ra với các chất màu, chất hấp thụ ánh sáng tốt hoặc các hạt nhỏ có khả năng truyền nhiệt kém Những ảnh hưởng của việc làm nóng mẫu lên quá trình thu phổ Raman có thể nhận ra khi quan sát trực tiếp mẫu đo hoặc qua quan sát phổ đồ Một số cách đơn giản làm giảm sự nóng lên của mẫu đó là giảm thông lượng tia laser, di chuyển mẫu hoặc chùm laser trong quá trình đo, tăng tính truyền nhiệt của mẫu bằng cách cho tiếp xúc với các vật dẫn nhiệt tốt

Sự hấp thụ các tín hiệu Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu đo cũng có thể xảy ra Tuy việc sử dụng laser NIR để kích thích cùng với hệ thống FT-Raman làm giảm hiện tượng huỳnh quang, nhưng chính việc sử dụng laser NIR lại ảnh hưởng lớn đến sự thu tín hiệu Raman Các ảnh hưởng này nhiều hay ít phụ thuộc và hệ quang của máy quang phổ Raman và phụ thuộc vào bản chất của mẫu đo Tuy nhiên sự ảnh hưởng này không quá nặng nề như trong việc đo phổ hấp thụ NIR bởi vì với bước sóng dài thì độ xâm nhập và bên trong mẫu đo của chùm laser là ít, tín hiệu Raman thu được chủ yếu là từ lớp mỏng ngoài cùng và vì lớp này mỏng nên độ hấp thụ tín hiệu Raman là không đáng kể

Cuối cùng, chúng ta cần phải nhớ rằng bức xạ laser là phân cực, vì vậy phổ Raman của mẫu tinh thể cũng như các mẫu có cấu trúc định hướng có thể khác nhau phụ thuộc vào cách mà chúng được tạo thành

1.3.2.10 Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn

Với sự phát triển mạnh mẽ như vậy, ngày nay quang phổ Raman không chỉ còn là phương pháp phân tích cơ bản sử dụng trong phòng thí nghiệm mà còn được ứng

dụng trong nhiều ngành khoa học khác nhau Trong khoa học vật liệu, quang phổ Raman giúp xác định cấu trúc vật liệu, xác định thành phần cấu tạo trong hỗn hợp rắn Trong pháp y, người ta sử dụng quang phổ Raman như một công cụ hiệu quả để tìm ra các chất độc hại, gây tử vong hoặc dùng phương pháp phổ Raman để bổ sung khẳng định kết luận pháp Y Trong khảo cổ học, người ta dùng phổ Raman để tìm ra các kim loại, đá quý, xác định nguồn gốc các cổ vật Trong hải quan, phổ Raman dùng để kiểm tra nhanh phát hiện các chất cấm như ma túy, chất gây nghiện, hướng thần, chất kích thích…Và đặc biệt trong ngành Dược có rất nhiều ứng dụng quan trọng trong việc định tính và định lượng các các thuốc trong quá trình giám sát và kiểm tra chất lượng thuốc

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Một số chế phẩm thuốc tân dược có chứa các hoạt chất: Ibuprofen,

Sildenafil, Zidovudin, Lamivudin

- Các chất chuẩn: Ibuprofen, Sildenafil, Zidovudin, Lamivudin (Chuẩn Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương)

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Độ phân giải 4 cm-1

Hình 2.1.Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng Renishaw

Máy quang phổ Raman cầm tay hãng BW-TEX, tại Khoa Kiểm nghiệm Nguyên Liệu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Đã được thẩm định

Bảng 2.3 Các thông số kỹ thuật của máy quang phổ Raman cầm tay

Hình 2.2 Máy quang phổ Raman cầm tay hãng BW-TEX

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thu thập tài liệu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài Tham khảo các phương pháp và kỹ thuật phân tích của các nước tiên tiến trên thế giới về phổ Raman, cũng như ứng dụng của chúng trong phân tích dược phẩm

Nghiên cứu cách sử dụng, khai thác phần mềm trên thiết bị: Hiệu chỉnh thiết

- Chế tạo các viên chuẩn đạt yêu cầu chất lượng (Định tính, Định lượng);

- Chế tạo các viên Placebo: Là các viên có thành phần tá dược giống với viên chuẩn được chế tạo ở trên nhưng trong thành phần không có hoạt chất

- Đo phổ Raman của chất chuẩn, thiết lập thư viện phổ chuẩn;

- Đo phổ Raman của các mẫu viên nghiên cứu và viên placebo, xác định sự ảnh hưởng của tá dược, nền mẫu lên phổ viên;

- Lựa chọn một số thuốc trên thị trường, đo phổ Raman của các thuốc này;

- Thẩm định các phổ thu được: So sánh phổ của các thuốc trên thị trường với các phổ chuẩn (nguồn dữ liệu thu thập) và các phổ chất chuẩn, phổ của viên chuẩn (đo được) dựa vào hệ số chồng phổ hoặc các píc đặc trưng… Kiểm tra giới hạn phát hiện, xác định độ lặp lại của các phép đo

2.3 Các bước tiến hành thực nghiệm

- Xây dựng công thức viên nén, viên nang dựa trên hàm lượng thực tế trên thị trường và các tá dược cơ bản Mỗi loại viên được chế tạo trên 05 nền tá dược khác nhau và viên placebo, các mô hình tá dược dựa trên công thức của nhà sản xuất đã đăng ký sản phẩm ở Việt Nam;

- Kiểm tra chất lượng viên theo tiêu chuẩn chất lượng dự kiến;

- Đo phổ Raman của chất chuẩn và thiết lập thư viện phổ chuẩn:

- Đo phổ của các mẫu viên chứa dược chất, xác định hệ số chồng phổ so với thư viên phổ chuẩn đã thiết lập;

- Đo phổ của các mẫu viên placebo, xác định sự ảnh hưởng của tá dược;

- Tạo bột viên có hàm lượng 50% so với hàm lượng của các mẫu viên chế tạo,

đo phổ Raman của các mẫu bột, so sánh với phổ chuẩn đã thiết lập;

- Đo phổ của một số viên thực tế trên thị trường, so sánh với phổ chuẩn đã thiết lập

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1 Công thức bào chế viên nén và viên nang của các hoạt chất dùng trong nghiên cứu

3.1.1 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Ibuprofen

Bảng 3.1: Công thức bào chế viên nén Ibuprofen

Natri croscarmellose 20,0 Natri croscarmellose 20,0

Natri lauryl sulfat 3,0 Natri lauryl sulfat 3,0

PVP-K30 10,0 PVP-K30 10,0

Magnesi stearat 5,0 Magnesi stearat 5,0

Aerosil 2,0 Aerosil 2,0

Nước tinh khiết - Nước tinh khiết -

Bảng 3.2 Công thức bào chế viên nang Ibuprofen

Natri lauryl sulfat 5,0 Natri lauryl sulfat 5,0

Natri starch glycolat 15,0 Natri starch glycolat 15,0

Magnesi stearat 4,0 Magnesi stearat 4,0

3.1.2 Công thức bào chế viên nén và viên nang của hoạt chất Sildenafil

Bảng 3.3: Công thức bào chế viên nén Sildenafil

Magnesi stearat 3,0 Magnesi stearat 3,0

Nước tinh khiết - Nước tinh khiết -

Bảng 3.4 Công thức bào chế viên nang Sildenafil

Công

thức

Viên nang Sildenafil Viên nang Placebo Sildenafil

(Tá dược)

Thành phần Khối lượng

(mg) Số lô Thành phần

Khối lượng (mg) Số lô

Natri lauryl sulfat 10,0 Natri lauryl sulfat 10,0

Magnesi stearat 2,5 Magnesi stearat 2,5