Nghiên cứu đặc điểm hình thái, di truyền và bán định lượng gymnemagenin của loài dây thìa canh lá to (gymnema latifolium wall ex wight) ở việt nam

Tương tự năm 2010, Phạm Văn Hải đã có những nghiên cứu bước đầu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall.. ex Wig

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM

WALL EX W ) Ở V Ệ NAM

LUẬN VĂN C SĨ DƢ C ỌC

N - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƢ NG ĐẠI H C DƢ C HÀ NỘI

N UYỄN Ị U ỀN

N ÊN CỨU ẶC ỂM ÌN Á ,

D UYỀN V BÁN ỊN LƢ N YMNEMA EN N CỦA LO DÂY ÌA

CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM

N – 2014

LỜ CẢM ƠN

Em xin được bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn và lời cảm ơn sâu sắc nhất

tới PGS TS Trần Văn Ơn và ThS NCS Phạm Hà Thanh Tùng - Bộ môn

Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy đã tận tình hướng dẫn,

định hướng, truyền cảm hứng và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới em sinh viên Đoàn Thị Phương –

K66, Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn sẵn sàng hỗ trợ em trong quá

trình thực hiện

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các chị kĩ thuật viên

và các em sinh viên nghiên cứu khoa học - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn

Lời sau cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, các anh chị và bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên Nguyễn Thị Thu Hiền

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ẶT VẤN Ề 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 3

1.1.1 Về thực vật 3

1.1.2 Về đa dạng di truyền 4

1.1.3 Về thành phần hoá học 5

1.1.4 Về tác dụng sinh học 9

1.2 TỔNG QUAN VỀ P ƯƠN P ÁP N ÊN CỨU 11

1.2.1 Nghiên cứu đặc điểm di truyền 11

1.2.2 Phương pháp vân tay sắc ký 13

1.2.3 Bán định lượng dựa vào phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 15

Chương 2 Ố Ư NG VÀ P ƯƠN P ÁP N ÊN CỨU 17

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 17

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 17

2.1.2 Dung môi, hóa chất 17

2.1.3 Máy móc, thiết bị 18

2.2 P ƯƠN P ÁP N ÊN CỨU 19

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 19

2.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền 20

2.2.3 Vân tay sắc ký Gymnema latifolium Wall ex Wight 22

2.2.4 Bán định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

3.1 ẶC ỂM THỰC VẬT CÁC MẪU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 27

3.1.1 Các đặc điểm hình thái đặc trưng của các mẫu 27

3.1.2 Tổng hợp các so sánh về đặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu 31

3.2 ẶC ỂM DI TRUYỀN CÁC MẪU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 33

3.2.1 Tách chiết ADN 33

3.2.2 Kết quả khuếch đại ADN (PCR) 33

3.2.3 Xác định trình tự ADN ribosom vùng ITS 34

3.2.4 So sánh trình tự ADN ribosom vùng ITS 35

3.2.5 Xây dựng cây phân loại 37

3.3 VÂN TAY SẮC KÝ CÁC MẪU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 39

3.3.1 Vân tay sắc ký các mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight 39

3.3.2 Bán định lượng Gymnemagenin trong các mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight bằng phương pháp P LC 41

Chương 4 BÀN LUẬN 44

4.1 VỀ ẶC ỂM HÌNH THÁI 44

4.2 VỀ ẶC ỂM DI TRUYỀN 45

4.2.1 Trình tự ADN ribosom vùng ITS 1

4.2.2 a dạng di truyền các mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight dựa vào trình tự ADN ribosom vùng ITS 46

4.3 VÂN TAY SẮC KÝ CỦA LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 48

4.4 SƠ B BÁN ỊN LƯ NG GYMNEMAGENIN TRONG CÁC MẪU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 49

4.4.1 Về thẩm định quy trình bán định lượng Gymnemagenin bằng phương pháp HPTLC 49

4.4.2 Về kết quả bán định lượng 50

4.5 VỀ TÍNH MỚI CỦA Ề TÀI 52

KẾT LUẬN 54

KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Vị trí nơi thu các mẫu trong nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Đặc điểm hình thái mô tả các mẫu G.latifolium Wall ex

Wight

19

Bảng 2.3 Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR 21 Bảng 2.4 Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml) 24 Bảng 3.1 Đặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu 32 Bảng 3.2 Đặc điểm nucleotids của các mẫu nghiên cứu 34 Bảng 3.3 Các đoạn ADN bảo thủ đặc trưng cho tất cả các mẫu

nghiên cứu

34, 35

Bảng 3.4 Hệ số tương đồng di truyền trình tự của các mẫu G

latifolium Wall ex Wight nghiên cứu và G sylvestre

(Retz) R Br ex Schult (Genbank)

Hình 1.3 Định tính Gymnemagenin trong các phân đoạn ethyl acetat

trong mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight

8

Hình 1.4 Cấu trúc hoá học của hợp chất GLHE9 (a), GLHE7(b) 9

Hình 1.6 Sơ đồ thủy phân acid gymnemic tạo Gymnemagenin 15 Hình 3.1 Mẫu GL1 (Tây Ninh; 11o23’13.6”N - 106o09’37.6”E) 27 Hình 3.2 Mẫu GL2 (Gia Lai; 13o59’44.5”N - 108o26’58.3”E) 28 Hình 3.3 Mẫu GL3 (Hòa Bình; 20o45’20.9”N - 105o12’33.9”E) 29 Hình 3.4 Mẫu GL4 (Thái Nguyên; 21o52’51.8”N - 105o43’08.5”E) 30 Hình 3.5 Mẫu GL5 (Tuyên Quang; 22o03’33.2”N - 105o10’16.8”E) 31

Hình 3.8 Đoạn nuleotide đặc trƣng phân biệt 2 loài trong chi

Gymnema R Br

37

Hình 3.9 Cây phát sinh loài đƣợc xây dựng từ các mẫu Gymnema

latifolium Wall ex Wight và Gymnema sylvestre (Retz) R

trong chi Gymnema R Br

48

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ

viết tắt Tên đầy đủ Diễn giải

ADN Acid Deoxyribo Nucleic Acid Deoxyribo Nucleic

BLAST Basic Local Alignment Search Tool Công cụ tìm kiếm đồng bộ trình tự

CMC Chemistry, Manufacture and Control Hóa học, sản xuất và kiểm soát

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC High Performance Thin Layer

Chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

IND Investigation New Drug Trung tâm nghiên cứu thuốc mới

ITS Internal Transcribed Spacer Vùng phiên mã nội

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

RAPD Random Amplified polymorphic

DNA

Phân tích đa hình AND khuếch đại ngẫu nhiên

rbcL Ribulose-1,5-biphosphate Ribulose-1,5-biphosphate

rps16 Ribosomal protein S16 Ribosomal protein S16

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SFDA State Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược

phẩm Trung Quốc

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

UPGMA Unweighted Pair Group Method with

Arithmetic Mean

Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài dạng có gốc

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

ẶT VẤN Ề

Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, cây dây thìa canh (Gymnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) đã được sử dụng từ hơn 2000 năm nay để điều trị

đái tháo đường [59], [61] Từ đó đến nay, các nhà khoa học vẫn đang tìm kiếm và sàng lọc tác dụng điều trị đái tháo đường tương tự cây dây thìa canh từ các loài khác

nhau trong cùng chi Gymnema R Br Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các

loài trong cùng một bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng tác dụng sinh học giống nhau Một số nghiên cứu trên thế

giới đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài Gymnema

montanum Hook.f., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema yunnanense

Tsiang, Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây dây thìa canh đầu tiên được thực hiện bởi

Đỗ Anh Vũ (2007), tác giả đã nghiên cứu về đặc điểm thực vật và tác dụng hạ

đường huyết của cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.)

[13] Tương tự năm 2010, Phạm Văn Hải đã có những nghiên cứu bước đầu về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight) ở Hòa Bình [6] Đáng lưu ý là cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) cũng có Gymnemagenin tương tự

và có tác dụng hạ đường huyết cao hơn cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre

(Retz.) R Br ex Schult.) trên mô hình gây tăng đường huyết chuột bằng

Streptozocin (STZ) [9], [11] Bên cạnh đó, cây dây thìa canh lá to (Gymnema

latifolium Wall ex Wight) có khả năng sinh trưởng tốt đồng thời sinh khối lớn

hơn so với cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) Như vậy

có thể sơ bộ nhận định cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) cũng có tác dụng và thậm chí là tiềm năng hơn so với cây dây thìa canh (Gymnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) Góp phần vào việc nghiên cứu sâu hơn về cây

dây thìa canh lá to ở Việt Nam (Gymnema latifolium Wall ex Wight), đề tài

“Nghiên cứu đặc điểm hình thái, di truyền và bán định lượng Gymnemagenin

của loài dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) ở Việt Nam”

đƣợc thực hiện với các mục tiêu :

 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các mẫu dây thìa canh lá to (Gymnema

latifolium Wall ex Wight) thu hái tại Việt Nam

 Nghiên cứu đặc điểm di truyền phân tử của các mẫu dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight)

 Bán định lƣợng Gymnemagenin có trong các mẫu dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight) nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Về thực vật

1.1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [16], dây thìa canh

lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) có vị trí phân loại như sau:

+ Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

+ Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

+ Phân Lớp Hoa Môi (Lamiidae) + Bộ Long Đởm (Gentianales) + Họ Trúc Đào (Apocynaceae)

+ Phân Họ Thiên lý (Asclepiadoideae)

+ Chi Gymnema R.Br

+ Loài Gymnema latifolium Wall ex Wight Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) được biết đến ở Ấn

Độ với các tên đồng nghĩa khác là Gymnema khandalense Santapau và Gymnema

kollimalayanum A Ramachandran & M B Viswan [56]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật của loài

Thân leo tới 6 m Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ Cuống lá 1,5-4

cm, có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13×5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm Đài hình trứng, phủ lông măng Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng [11]

Trụ nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy Khối phấn hình thuôn Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi Quả đại hình mác nhọn, mũi cong, 4,5-5,5×1,5-2 cm, có lông dày đặc Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm×5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3 cm [11]

Phân bố: Đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [56], Việt Nam (Cúc Phương, Hoà Bình, Thái Nguyên) [11]

1.1.2 Về đa dạng di truyền

Năm 2012, Phạm Hà Thanh Tùng đã công bố nghiên cứu xác định sự khác biệt di truyền sử dụng chỉ thị phân tử RAPD của 26 mẫu thuộc 5 loài trong chi

Gymnema R.Br., trong đó có 4 mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight Kết quả

cho thấy, 3 mẫu ở miền Bắc Việt Nam (Hoà Bình, Thái Nguyên và Tuyên Quang) cùng nằm trong cùng một nhóm di truyền, trong khi đó 1 mẫu ở gần khu vực miền Trung Việt Nam không cùng nhóm này Kết quả cho thấy sự khác biệt của các mẫu theo sự phân bố địa lý [11]

Năm 2013, Vũ Thị Thanh Thuý đã giải trình tự thành công đoạn gen ITS của

8 mẫu trong chi Gymnema R.Br Kết quả đã xác định sự tương đồng di truyền của 2 mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight là 0,99 và đã phát hiện đoạn trình tự

CGGCCCAAA ở vị trí nucleotid 56 trên vùng khảo sát ITS1+5.8S+ITS2 hoàn toàn

khác biệt và là đặc trưng cho loài Gymnema latifolium Wall ex Wight so với trình

tự gen đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (Genbank) Kết quả chứng minh khả năng nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các mẫu sử dụng đoạn trình tự gen ITS và

là cơ sở của việc công bố trình tự gen của các mẫu nghiên cứu trên ngân hàng gen thế giới [10]

Trên cơ sở dữ liệu của ngân hàng gen thế giới (Genbank), loài Gymnema

latifolium Wall ex Wight cũng đã được công bố trình tự của 3 vùng gen: rbcL, rps16, trnL-F Theo đó, Surveswaran S., Kamble M., Yadav S.R., Corke H và Sun

M (2013) đã công bố trình tự vùng gen rbcL dài 1266 bp với mã số truy cập trình

tự là EU232692 Mới đây, Surveswaran S., Sun M., Grimm G.W và Schumann S (2014) trong nghiên cứu của mình đã công bố trình tự vùng gen intron

Liede-rsp16 dài 763 bp (HG530601) và trình tự vùng trnL-F dài 837 bp (HG530575) [53],

[64]

1.1.3 Về thành phần hoá học

Cho đến nay các nghiên cứu hóa học được tập trung vào loài Gymnema

sylvestre (Retz) R Br ex Schult, theo đó lá của Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex

Schult có chứa triterpene saponin thuộc nhóm oleanan (thành phần chính là các acid gymnemic và gymnemasaponin) và nhóm dammaran (thành phần chính là các gymnemaside) [14] Các thành phần khác bao gồm anthraquinon, flavon, hentriacontan, pentatriacontan, phytin, resin, acid tartaric, acid formic, acid butyric, lupeol, β-amyrin, stigmasterol, và calcium oxalat [52] Ngoài ra trong thân của

Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Schult còn có chứa alkaloid [14]

Thành phần tác dụng chính được xác định là acid gymnemic, là tên chung của các acid hữu cơ thuộc nhóm saponin triterpenoid khung olean [14] và về bản chất acid gymnemic không phải là một chất tinh khiết mà là một hỗn hợp các chất Theo thời gian nghiên cứu đã có những công bố khoa học về acid gymnemic như sau:

Theo Warren và Pfaffmann (1959), acid gymnemic là hỗn hợp của acid gymnemic A1 (chiếm 70%) và acid gymnemic A2 (chiếm 30%) Walter Stocklin (1969) thì cho rằng acid gymnemic là hỗn hợp của 4 acid gymnemic A1, A2, A3 và

A4 Khi thực hiện phản ứng giáng hóa 4 acid gymnemic này, Stocklin đã làm sáng

tỏ cấu thành của gymnemic acid gồm có phần đường glucofururono lacton, tera-O-acetyl-D-glucuronic acid cùng một đường chưa xác định được cấu trúc) và hỗn hợp aglycon (gồm genin G, genin J, genin K), tiến hành phản ứng kiềm hóa các genin thu được Gymnemagenin và hỗn hợp các acid (hình 1.2) [52]

(tri-O-acetyl-β-D-Hình 1.1 Cấu tạo acid gymnemic A 1 , A 2 , A 3 và A 4 [52]

Tiến hành phân lập trên sắc ký cột, Sinsheimer và cs đã công bố acid gymnemic là hỗn hợp của 4 acid gymnemic A, B, C, D và cũng đã chỉ ra rõ hơn cấu tạo của các genin G, J, K và N [51], [52] Khác với việc acid gymnemic A1 có thể chuyển dạng sang gymnemic A2 [14], cấu trúc của 4 acid gymnemic A, B, C và D là hoàn toàn khác nhau

Bảng 1.1 Cấu tạo của acid gymnemic A – D [50]

formic

Acid acetic

Acid Iso- valeric

Acid tiglic

Gần đây nhất, từ dịch chiết nóng lá cây Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex

Schult, Yoshikawa và cộng sự đã phân lập được 18 gymnemic acid (đánh số từ I đến XVIII) có cấu trúc và khả năng hạ đường huyết như trong hình 1.2 [14], [60], [61], [62]:

OH

OR2

CH2OR4H

H H OH

OH H

OH

H H OH H

OH OH H

OH

H H OH

Mba = 2-methylbutyroyl

CH3O

Ac

O

Bz

8 Acid gymnemic VIII -gluA3- -OG mba H H (-)

12 Acid gymnemic XII -gluA3- -glc tga H Ac 1

Hình 1.2a Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập được từ Gymnema

sylvestre (Retz) R Br ex Schult và tác dụng hạ đường huyết tương ứng [14]

STT Acid gymnemic R 1 R 2 R 3 R 4 TD*

Ghi chú: TD*: tác dụng hạ đường huyết × tác dụng hạ đường huyết cuả acid

gymnemic I; (-) **: không phát hiện được

Hình 1.2b Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập được từ Gymnema

sylvestre (Retz) R Br ex Schult và tác dụng hạ đường huyết tương ứng [14]

Tại Việt Nam, thử nghiệm ban đầu đã xác định các nhóm chất có trong dây

thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) thu hái tại Hòa Bình có thành

phần chính gồm: saponin, flavonoid, tanin, sterol, chất béo acid amin, đường khử và coumarin [6]

Trong nghiên cứu năm 2012, trên sản phẩm thuỷ phân phân đoạn ethyl acetat

của dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) đã phát hiện có pic sắc

ký tương ứng với Gymnemagenin trên sắc ký đồ (hình 1.3)

Hình 1.3 ịnh tính Gymnemagenin trong các phân đoạn ethyl acetat

trong mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight

a Gymnemagenin chuẩn

b Phân đoạn ethyl acetat của Gymnema latifolium Wall ex

Wight sau khi thủy phân [11]

Mới đây nhất, phân lập từ phân đoạn ethyl acetat của bột dược liệu dây thìa

canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) thu được hợp chất GLHE9 (được

xác định là 3β-acetoxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-20-on) và hợp chất GLHE7 (lupeol acetat) (hình 1.4) [4]

Ngoài ra, chưa xác định được tài liệu nào trên thế giới công bố về các hợp

chất được phân lập từ dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight)

12

8 7 6

9 10 5

29 28

26

22 17 12

8 27 7 6

9 10 5

1 2 3

23 24

29 20 30

19 21

18 11

28

15 16

Theo Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương và cộng sự (2011), dịch chiết lá

Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) ở Việt Nam có tác dụng

hạ đường huyết trên cả chuột bình thường (24,07%) tác dụng cao nhất thể hiện sau

4 giờ, kéo dài đến 5 giờ và trên chuột gây tăng đường huyết bởi Streptozotocin (36,31%) sau 10 ngày cho uống dịch chiết Liều dùng thích hợp lá dây thìa canh là cắn toàn phần được pha thành hỗn dịch trong nước cất với tỉ lệ 1:1, với liều 0,5ml/25g, tương ứng với 10g lá khô/kg thể trọng [9]

Kết quả thử nghiệm cho thấy tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá Dây

thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) mạnh hơn Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult.) Kết quả này đã được chuyển giao cho

Công ty Dược Khoa - Trường Đại học Dược Hà Nội, là nơi duy nhất ở Việt Nam trồng trọt Dây thìa canh lá to theo quy trình hướng dẫn “Thực hành tốt Trồng trọt cây thuốc” (GAP- WHO) Công ty đã cho ra đời sản phẩm Trà tiểu đường DK-Betics, phần cốt lõi là cây thuốc Dây thìa canh và Dây thìa canh lá to

Ngoài các công bố trên, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa có

một công bố chính thức nào về tác dụng sinh học của Dây thìa canh lá to (Gymnema

latifolium Wall ex Wight)

1.1.4.2 Tác dụng kháng khuẩn

Các nhà khoa học nhận thấy Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult và

Gymnema montanum Hook có tác dụng kháng khuẩn trên cả chủng vi khuẩn gram

âm và gram dương [45] Phù hợp với quan điểm các loài trong cùng một bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng tác

dụng sinh học giống nhau, các nhà khoa học cũng đã nhận thấy Gymnema

kollimalayanum A Ramachandran & M B Wiswan (tên đồng nghĩa của Gymnema latifolium Wall ex Wight [20]) có tác dụng kháng khuẩn tương tự

A Ramachandran và D Natarajan (2010) đã tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết nước và dịch chiết dung môi hữu cơ (hexan, methanol, acetone,

petroleum ether, ethanol) của bột lá Gymnema kollimalayanum A Ramachandran &

M B Wiswan thu hái tại Peninsular Ấn Độ trên 8 chủng vi khuẩn gram âm

(Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella paratyphi, Shigella boydi, S

brunci, S dysentriae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica) và 2 chủng

vi khuẩn gram dương (Cornybacterium diptheriae và Enterococus faecalis) Kết

quả thu được cho thấy dịch chiết nước không có tác dụng kháng khuẩn Ngoại trừ

dịch chiết methanol không có tác dụng trên Cornybacterium diptheriae và Proteus

vulgaris, các dịch chiết dung môi hữu cơ của bột lá Gymnema kollimalayanum A

Ramachandran & M B Wiswan còn lại đều cho tác dụng Dịch chiết hexan cho tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất Đường kính vòng tròn kháng khuẩn của các dịch chiết đã nghiên cứu trong khoảng 10 – 21 mm [44]

D Natarajan, R Yuvarajan, R Srinivasan, M Gomathi (2011) đã tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết các dung môi hữu cơ (chloroform, acetone,

methanol) của lá Gymnema kollimalayanum A Ramachandran & M B Wiswan cũng thu hái tại Ấn Độ trên 5 chủng vi khuẩn gram âm (Escherichia coli,

Psuedomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Klebseilla pneumoniae, Salmonella typhi) và 3 chủng vi khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus, Streptococci

pneumoniae, Bacillus subtilis) Ngoại trừ dịch chiết acetone không có tác dụng trên

chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, các dịch chiết còn lại đều cho tác dụng kháng

khuẩn Đường kính vòng tròn kháng khuẩn của các dịch chiết đã nghiên cứu trong khoảng 7 - 11 mm [40]

1.2.1 Nghiên cứu đặc điểm di truyền

1.2.1.1 Phương pháp mã hóa ADN (“ADN barcoding”) trong phân loại học

Phân loại học ngày nay gây ra nhiều trở ngại cho các nhà khoa học khi cần đưa ra phương pháp nhận dạng nhanh, chính xác, có độ lặp lại cao và được chấp nhận rộng rãi Những vấn đề về phân loại học đã dẫn tới sự phát triển của phương pháp mới có thể nhận dạng nhanh bất kì một loài nào dựa trên trình tự ADN thu được của loài đó Theo giả thuyết, các nhà khoa học đưa ra khái niệm “đoạn ADN được mã hóa” (“ADN barcoding”) là một trình tự ADN có chiều dài từ 400 bp đến

800 bp có thể được phân lập từ tất cả các loài thực vật hoặc động vật trên Trái Đất [24], [48] Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, công nghệ giải trình tự và phân tích dữ liệu sinh học, đoạn ADN được mã hóa cho phép nhận biết hoặc khôi phục các thông tin từ các loài đã biết và khám phá ra hàng nghìn loài mới Đoạn ADN đã được mã hóa trở thành công cụ thiết yếu cho các nhà phân loại học giúp nhận biết và quản lý được toàn bộ hệ sinh thái rộng lớn và nhiều biến đổi [31]

Một đoạn ADN đã được mã hóa, theo định nghĩa đơn giản nhất, là một hoặc nhiều đoạn trình tự gen ngắn được tách ra từ hệ gen của một loài được sử dụng để nhận diện loài đó [31] Đoạn trình tự gen này phải thỏa mãn ba tiêu chuẩn: (1) tính đặc hiệu chứa những thông tin di truyền quan trọng của loài, (2) chứa những vị trí thích hợp giúp việc gắn các cặp mồi PCR dễ dàng và (3) độ dài thích hợp để thuận tiện cho việc tách chiết và giải trình tự ADN Tiêu chuẩn thứ tư được một số nhà khoa học đưa ra thêm đó là đoạn trình tự phải có chất lượng tốt [26], [32] Paul Hebert và đồng nghiệp (2003) là những người đầu tiên đề nghị ứng dụng những đoạn trình tự ADN ngắn đã được mã hóa để nhận diện di truyền với mục đích có thể nhận diện nhanh, tin cậy ở mức độ loài trong hệ sinh vật Ứng dụng này được thực hiện đầu tiên trên động vật [24], [25] Sau đó, qua hàng loạt các nghiên cứu sàng lọc

trên hệ gen thực vật, ba vùng gen trong plastid (rbcL, matK và trnH-psbA) và một

vùng gen trong nhân (ITS) là những đoạn ADN tiêu chuẩn để lựa chọn trong hầu hết các nhận diện các loài thực vật và nấm [19], [32], [41], [49]

Phương pháp nhận diện các loài dựa trên đoạn trình tự ADN đã được mã hóa gồm hai bước cơ bản: (1) xây dựng thư viện gồm các đoạn ADN đã được mã hóa của các loài đã biết và (2) nhận diện các loài chưa biết thông qua đối chiếu, so sánh đoạn ADN được mã hóa của các loài chưa biết với các đoạn trình tự đã biết trong thư viện Thuật toán đồng bộ trình tự được sử dụng để đồng bộ một đoạn trình tự ADN chưa biết với một đoạn trình tự ADN đã được mã hóa của loài đã biết thông qua tìm kiếm dữ liệu trình tự giống nhất với trình tự chưa biết [47] Ngân hàng gen (Genbank) cung cấp công cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) để tìm kiếm sự đồng bộ giữa một trình tự chưa biết và một trình tự đã biết trong thư viện [31]

1.2.1.2 Vùng phiên mã nội của ADN Ribosom (ITS – rADN)

Nghiên cứu về ADN thực vật, có 3 loại ADN thường được chọn làm đối tượng nghiên cứu, đó là: ADN nhân, ADN lạp thể và ADN ty thể Trong số đó, ADN nhân tỏ ra có nhiều ưu thế trong nghiên cứu phân loại thực vật bởi ADN nhân

có mức độ tiến hóa nhanh hơn, cho phép phân tích được sự khác biệt về di truyền ngay cả giữa các loài trong cùng 1 chi hay giữa các cá thể của cùng một loài Trong

cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu nhiều nhất là vùng ADN ribosom 18S-26S và vùng phiên mã nội (internal transcribed spacer – ITS) với nhiều đoạn lặp về trình tự nucleotid [10] Riêng vùng phiên mã nội (ITS), năm 1998, ngân hàng gen thế giới (Genbank) đã công nhận 2900 trình tự này của các loài thực vật hạt kín [27] Một khảo sát của Álvarez và Wendel (2003) thấy rằng khoảng 1/3 (34%) các nghiên cứu công bố về phát sinh loài (phylogenetic analyses) trong vòng 5 năm chỉ dựa trên duy nhất trình tự ITS [15]

Cấu trúc của ITS – rADN được xác định nằm trong vùng 18S – 26S ADN ribosome nhân, gồm 3 phần: tiểu đơn vị 5.8S – trình tự có tính bảo tồn cao trong tiến hóa và 2 vùng phiên mã nội ITS 1 và ITS 2 [17] Độ dài trình tự phần tiểu đơn

vị 5.8S gần như không khác nhau (163 hoặc 164 bp), trong khi đó độ dài vùng phiên

mã nội ITS có sự khác nhau ITS 1 (187 bp đến 298 bp) và ITS 2 (187 bp đến 252 bp) Toàn bộ vùng ITS ở thực vật có hoa có độ dài dưới 700 bp [17]

Hình 1.5 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS [17]

1.2.2 Phương pháp vân tay sắc ký

1.2.2.1 Vài nét về phương pháp vân tay sắc ký trong nghiên cứu

Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học Tất cả các loại hình sắc ký đều có nguyên tắc tách giống nhau: mẫu phân tích được hòa tan

trong một pha động Pha này có thể là một chất khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh

được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn Các chất tan là thành phần của mẫu

sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, nhờ đó kỹ thuật này rất có giá trị trong việc tách, phân lập, tinh chế và nhận dạng các thành phần trong hỗn hợp [21]

Theo Liang Y.Z và cộng sự (2004), dấu vân tay sắc ký của sản phẩm từ dược liệu là một hệ sắc ký của hoạt chất và các thành phần hóa học khác có trong dược liệu, có thể là từ dược liệu thô, bán thành phẩm hay thành phẩm bằng kỹ thuật phân tích thích hợp Các kỹ thuật thường được sử dụng để phân tích trong phương pháp dấu vân tay sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC) [34], [36], [63] Phương pháp vân tay ngày nay được chấp nhận trên toàn cầu để đánh giá chất lượng của dược liệu làm thuốc Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

(FDA) chấp nhận vì phương pháp này có thể được sử dụng để kiểm soát chất lượng của các sản phẩm và nguyên liệu có nguồn gốc dược liệu trong ứng dụng về hóa học, sản xuất và kiểm soát (CMC) của trung tâm nghiên cứu thuốc mới (IND) Bên cạnh

đó, Pháp, Đức, Anh, Ấn Độ và Tổ chức Y Tế thế giới (WHO) cũng chấp thuận phương pháp vân tay để đánh giá chất lượng của thuốc từ dược liệu Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Trung Quốc (SFDA) đã yêu cầu các nhà sản xuất tiêu chuẩn hóa thuốc tiêm và nguồn nguyên liệu thô nguồn gốc dược liệu sử dụng phương pháp vân tay sắc ký [63]

1.2.2.2 Phương pháp vân tay sắc ký dựa vào kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp phân tích vân tay thường được sử dụng để phân tích dược liệu vì đơn giản, nhanh gọn và kinh tế Tuy nhiên, phương pháp phân tích dựa vào TLC cũng có một số hạn chế : độ phân giải thấp, độ nhạy thấp và khó phát hiện được một hỗn hợp chất,… [63]

Halpaap (1973) là người đầu tiên nhận thấy rằng tiện ích của các hạt silica gel

có kích thước nhỏ (5-6 µm) về thời gian khai triển, giá trị hệ số lưu giữ Rf và chiều cao bản mỏng khi chuẩn bị các bản TLC Đến năm 1977, Zlatkis và Kaiser lần đầu tiên công bố chính thức về HPTLC Cùng với sự hỗ trợ của hệ thống máy móc, phương pháp HPTLC cho khả năng tách tốt hơn và độ lặp lại của phương pháp cao hơn Cho đến ngày nay, phương pháp HPTLC đã được sử dụng rộng rãi như một hình thức tân tiến nhất của công cụ TLC [21], [36]

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) mà cụ thể là HPTLC thường được lựa chọn để phân tích dấu vân tay sắc ký vì tính linh hoạt, nhanh và kinh tế HPTLC có thể nhận diện được nhiều mẫu khác nhau tại cùng thời điểm và có thể tách từ dịch chiết thô của dược liệu với hệ dung môi thích hợp mà không cần quá trình tinh chế trước đó Nhìn chung phương pháp này có thể được sử dụng đầu tay để sơ bộ xác định vân tay sắc ký của dược liệu

1.2.3 Bán định lượng dựa vào phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Cho đến nay chưa có nghiên cứu chuẩn hóa thành phần tác dụng nào được

thực hiện đối với dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall ex Wight Tuy nhiên các nghiên cứu đã chỉ ra trong thành phần hóa học của Gymnema latifolium

Wall ex Wight có Gymnemagenin [11], thêm vào đó, trên cơ sở thử nghiệm dây

thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall ex Wight có tác dụng hạ đường huyết cao hơn dây thìa canh Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Schult [9] Có thể thấy rằng trong dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall ex Wight cũng có thành phần

acid gymnemic – là thành phần chính gây hạ đường huyết Như vậy chuẩn hóa theo đơn chất tác dụng được phân lập và tinh khiết hóa như Gymnemagenin có thể được

sử dụng nhằm chuẩn hóa thành phần tác dụng của Gymnema latifolium Wall ex Wight

Chuẩn hóa theo Gymnemagenin: đây là chất chuẩn đánh dấu (marker) được sử dụng phổ biến nhất Gymnemagenin được tạo ra do quá trình thủy phân acid gymnemic toàn phần trong điều kiện kiềm và acid [43], [54]

H H

OH HO

H HO

Acid gymnemic II 2-methyl butyroyl Ac

Acid gymnemic III 2-methyl butyroyl H

Acid gymnemic IV tigloyl H

Công thức phân tử: C30H50O Khối lượng phân tử: 506,71

Hình 1.6 Sơ đồ thủy phân acid gymnemic tạo Gymnemagenin [29]

Dựa trên diện tích hoặc dựa trên cường độ màu (khi phun thuốc thử hoặc khi soi UV) của các vết xuất hiện trên bản mỏng (đặc biệt là bản mỏng hiệu năng cao),

Gymnemagenin Acid gymnemic

Thủy phân với kiềm và acid

nếu có mẫu chuẩn tương ứng, có thể bán định lượng một chất (hay một nhóm chất)

có trong mẫu thử HPTLC được ứng dụng trong bán định lượng bằng phương pháp

so sánh Một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau được pha sẵn Dựa vào mối liên hệ giữa nồng độ chất chuẩn đã biết và diện tích pic đáp ứng của chất đó trên sắc ký đồ để từ đó xây dựng đường chuẩn định lượng Đo tín hiệu đáp ứng diện tích pic của chất cần phân tích trong mẫu thử và nội suy nồng độ từ đường chuẩn đã xây dựng ở trên [8]

Năm 2004, V Puratchimani và S Jha đã nghiên cứu chuẩn hóa Gymnema

sylvestre (Retz) R Br ex Schult dựa vào chuẩn Gymnemagenin bằng phương pháp

HPTLC Theo đó dịch chiết dược liệu được chuẩn bị bằng phương ngấm kiệt trong 95% ethanol : nước (1:1) trong khoảng 48h, chất chuẩn Gymnemagenin (nồng độ 1 mg/ml), hệ chạy sắc ký chloroform : methanol (9:1) Kết quả thu được giá trị hệ số lưu giữ của gymnemagenin Rf = 0,27, đường chuẩn được xây dựng với lượng chất chuẩn gymnemagenin trong khoảng 4-10 µg, hệ số tương quan r = 0,99 cho thấy mối tương quan đáng tin cậy giữa nồng độ và diện tích pic Kết quả bán định lượng

thu được hàm lượng Gymnemagenin trong lá dây thìa canh Gymnema sylvestre

(Retz) R Br ex Schult chiếm 1,61% trọng lượng khô của lá [42]

Năm 2006, Valivarthi S R và cộng sự cho rằng phương pháp của V Puratchimani và S Jha cần được cải thiện thông qua việc thủy phân bằng acid và

base dịch chiết methanol của Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Schult Kết quả

của Valivarthi S R và cộng sự cho thấy khi dịch chiết được thủy phân, pic sắc ký của Gymnemagenin trong mẫu thử nhọn và cân đối hơn Hơn nữa khi kiểm tra lại bằng phương pháp HPLC và MS phương pháp đã được cải thiện này cho thấy dấu vết của Gymnemagenin, trong khi đó không phát hiện thấy Gymnemagenin trong dịch chiết được chuẩn bị theo phương pháp đã được tiến hành của V Puratchimani

và S Jha năm 2004 [43]

Chương 2 Ố Ư N V P ƯƠN P ÁP N HIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Các mẫu dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) được thu

hái tại 5 tỉnh: Tây Ninh, Gia Lai, Hòa Bình, Thái Nguyên, Tuyên Quang đã được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (Mã hiệu tiêu bản HNIP/18068, 18090 – 18093/14)

Bảng 2.1 Vị trí nơi thu các mẫu trong nghiên cứu

Nghiên cứu hình thái

Mẫu nghiên cứu ADN

Nghiên cứu hóa học

1 GL1 Núi Bà Đen, Tây Ninh

2.1.2 Dung môi, hóa chất

2.1.2.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền

- Nitơ lỏng

- Bộ kít chiết tách ADN thực vật GeneJET – số lô 00209197 (Thermo Scientific)

- Bộ kít tinh sạch ADN GenJet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific)

- Bộ kít giải trình tự ADN BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems)

- Dung dịch đệm TAE 1X: lấy từ dung dịch gốc TAE 50X có thành phần như sau: tris base (Sigma): 121 g, acid acetic glacial (Sigma): 28,6 ml, EDTA (Sigma) 0,5 M pH 8,0: 50 ml, nước khử ion vừa đủ: 500 ml

- Ethidium bromid (EtBr): 10 mg/ml (Sigma)

- Gel agarose 1%: 0,5 g agarose, bổ sung 50 ml đệm TAE 1X, đun cho tan dung dịch agarose trong lò vi sóng khoảng 90 giây Để nhiệt độ hạ xuống khoảng

60oC, thêm 10 µl EtBr rồi đổ ra khay điện di đã có lược tạo giếng tra mẫu

- Thang ADN 100 bp chuẩn (Thermo Scientific)

- Các cặp mồi ITS1 (5’–TCCGTAGGTGAACCTGCGG–3’) và ITS4 (5’–TCCGTAGGTGAACCTGCGG–3’) (Integrated DNA Technologies); ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) và ITS4 (5’–TCCGTAGGTGAACCTG -CGG–3’) (Integrated DNA Technologies)

2.1.2.2 Nghiên cứu hóa học

- Chất chuẩn: Gymnemagenin (96,50%) của hãng USP (U.S.Pharmacopeial Convention)

- Dung môi: methanol, acid hydrochloric đặc, acid sulfuric đặc, Kali hydroxyd ethyl acetate, nước cất

- Thuốc thử: vanilin/dung dịch acid sulfuric

Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV

2.1.3 Máy móc, thiết bị

2.1.3.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền

- Thiết bị bảo quản mẫu: tủ lạnh sâu -23oC (Biomedical Freezer – Sanyo)

- Dụng cụ tách chiết bao gồm: chày, cối sứ, máy ly tâm để bàn tốc độ cao Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu -30oC, ống eppendorf (0,2 ml; 1,5 ml), bể ổn nhiệt Memmert WNB10, máy lắc vortex IKA

- Dụng cụ nhân gen: Eppendorf Mastercycler Pro S, máy soi chụp ảnh gen UVP Gel-docIt , máy điện di Consort EV 222

- Dụng cụ giải trình tự gen: máy giải trình tự ABI 3730xl DNA Analyzer, máy nhân gen DNA Engine Tetrad 2 Peltier Therma Cycler (BIO-RAD)

2.1.3.2 Nghiên cứu hóa học

- Cân kỹ thuật sartorius, độ chính xác 0,01 g

- Máy xác định hàm ẩm AND MF-50

- Hệ thống chiết hồi lưu

- Máy cô quay Buchi

- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: máy chấm sắc

ký Linomat 5, buồng triển khai ADC2, buồng phát hiện TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCATS và VideoScan

- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ nhiều thể tích, bình định mức nhiều thể tích, ống nghiệm, pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, bình gạn

2.2 P ƯƠN P ÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

2.2.1.1 Phân tích hình thái

Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp mô tả phân tích [1], [3] Trong nghiên cứu các đặc điểm được mô tả, thuộc các nhóm: Dạng sống, Thân, Lá, Hoa, Quả, Hạt (bảng 2.2) Dụng cụ sử dụng trong phân tích bao gồm: Kính lúp soi nổi Leica EZ4, máy ảnh kỹ thuật số chụp trực tiếp (Canon EOS 60D + Canon 100mm f2.8 Macro) hoặc máy ảnh chụp qua kính lúp soi nổi (Canon SD4500IS)

Bảng 2.2 ặc điểm hình thái mô tả các mẫu G.latifolium Wall ex Wight

1 Dạng sống Dạng sống, chiều cao

1 Thân Hình dạng thân già, bề mặt cành non, màu sắc nhựa mủ

2 Lá Cách mọc của lá, cuống lá, hình dạng phiến, hình dạng mép,

số cặp gân chính, chiều dài x chiều rộng, bề mặt trên, bề mặt dưới

3 Hoa Kiểu cụm hoa, số hoa mỗi cụm, chiều dài cụm hoa, lá bắc,

đài (hình dạng, bề mặt), tràng (hình dạng, tràng phụ), bộ nhị (trụ nhị nhụy, thể truyền phấn), bộ nhụy (hình dạng kích thước lá noãn, núm nhụy

4 Quả Loại quả, hình dạng quả, kích thước dài x rộng

5 Hạt Hình dạng, chiều dài x chiều rộng, chiều dài mào lông

2.2.1.2 Xác định tên khoa học

Tên khoa học được xác định dựa trên khóa phân loại và mô tả loài trong các tài liệu thực vật trong nước (Khóa phân loại của Trần Thế Bách [2] , các bản mô tả trong sách Cây cỏ Việt Nam (tập 2, 2000) của Phạm Hoàng Hộ [7], Từ điển thực vật thông dụng của Võ Văn Chi [5]) và các tài liệu ngoài nước (Thực vật chí Trung Quốc [18], Thực vật chí Đài Loan [35], Thực vật chí Đông Dương [23]) Các mẫu sau khi tra khóa được so sánh đối chiếu với các tiêu bản type hoặc isotype của loài tham khảo từ mẫu lưu tại phòng tiêu bản Paris (phiên bản online) và các phòng tiêu bản trên thế giới (nếu có)

2.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền

2.2.2.1 Tách chiết ADN tổng số

Quy trình tách chiết ADN sử dụng bộ kít chiết tách ADN thực vật GeneJET (Thermo Scientific) gồm các bước sau:

- Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày

- Chuyển mẫu đã nghiền vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 350 µl Lysis Buffer A Lắc vortex 10 – 20 giây để trộn đều hỗn hợp đảm bảo tất cả bột lá được tiếp xúc đều với Lysis Buffer A

- Thêm 50 l Lysis Buffer B và 20 l RNase A

- Ủ ở 65oC trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc đảo ống trong lúc ủ

- Thêm 130 l Precipitation Solution và lắc đảo ống 2-3 lần Ủ trong đá 5 phút

- Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 5 phút

- Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới Thêm 400 l Plant gDNA Binding Solution và 400 l ethanol 96% và trộn đều

- Chuyển hỗn hợp dịch trên vào ống spin column được cung cấp sẵn Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch

- Thêm 500 l Wash Buffer I đã được thêm ethanol 96% vào ống spin column

Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch nổi Column được chuyển sang đặt trong ống eppendorf mới

- Thêm 500 l Wash Buffer II đã được thêm ethanol 96% Ly tâm với tốc độ

14000 vòng/phút trong 3 phút Loại bỏ ống eppendorf chứa dịch nổi Column chứa ADN được chuyển sang đặt trong ống eppendorf mới

- Thêm 100 l Elution Buffer để hòa tan ADN, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút Loại column, thu ống eppendorf có chứa ADN đã được hòa tan

- Bảo quản ADN ở nhiệt độ -20oC để thực hiện các bước tiếp theo

2.2.2.2 Khuếch đại ADN (PCR)

Phản ứng PCR được thực hiện với hỗn hợp phản ứng được trình bày ở bảng 2.3

+ Khuếch đại: 72oC trong 50 giây

Pha tổng hợp cuối cùng: 72oC trong 8 phút

2.2.2.3 Điện di ADN trên gel agarose

Đặt bản gel agarose vào trong máy điện di có dung dịch đệm TAE 1X và đã được thêm ethidium bromid, tra mẫu ADN cùng với chất chỉ thị xanh bromophenol vào giếng trên bản gel Chạy điện di ở điện thế 110V trong khoảng 30 phút Sau đó nhấc bản gel ra và quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 302 nm

2.2.2.4 Tinh sạch và giải trình tự ADN

Các mẫu ADN sau khi được khuếch đại được tinh sạch sử dụng bộ kít tinh sạch GenJet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) Các mẫu ADN đã tinh sạch được gửi sang phòng thí nghiệm Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự gen Phương pháp giải trình tự gen sử dụng bộ kít giải trình tự ADN BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems) trên máy giải trình tự ABI 3730xl DNA Analyzer và máy nhân gen DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD)

2.2.2.5 So sánh trình tự ADN

Trình tự ADN của 5 mẫu nghiên cứu được gửi đăng ký trình tự lên ngân hàng gen thế giới (Genbank) sử dụng phần mềm SEQUIN với các mã số KP126832 (GL1), KP126833 (GL2), KP126834 (GL3), KP163979 (GL4), KP126835 (GL5)

và so sánh với trình tự tương ứng của loài Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex

Schult đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (Genbank – FM178492) bằng công

cụ BLAST

2.2.2.6 Xây dựng cây phân loại dựa trên trình tự ADN

Trên cơ sở trình tự ADN của các mẫu nghiên cứu xây dựng cây phân loại bằng phần mềm Geneouis R8 phương pháp UPGMA, với hệ số bootstrap 10.000 lần) Cây phân loại này sẽ phản ánh mức độ gần gũi về quan hệ di truyền của các mẫu

2.2.3 Vân tay sắc ký Gymnema latifolium Wall ex Wight

2.2.3.1 Chuẩn bị mẫu

a Mẫu chuẩn

Hòa tan chính xác 15,0 mg Gymnemagenin chuẩn (hàm lượng 96,5 %) vào bình định mức 25,0 ml bằng methanol Hút chính xác 2,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 10,0 ml Thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều

ngăn mát tủ lạnh Ly tâm thu tủa, rửa tủa bằng nước cất đến pH 7 Đun hồi lưu tủa thu được với 50 ml KOH 2% trong methanol trong 4h thu được dịch B Cô dịch B tới cắn và hòa tan với 200 ml nước cất, sau đó lắc với ethylacetat cho đến khi lớp ethylacetat không màu Cất quay dịch chiết ethylacetat thu được đến cắn Cắn này được hòa tan vào bình định mức 20,0 ml methanol và tiến hành xác định vân tay sắc

ký và bán định lượng

2.2.3.2 Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký

- Bản mỏng: bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110˚C trong

30 phút Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm

- Đưa mẫu lên bản mỏng: mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat 5 Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 7,5 mm, cách mép dung môi từ 3,0 – 5,0 cm Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 10,0 mm Độ dài băng chấm 6,0 mm và thể tích chấm mỗi vết là 2,0 µl

- Hệ dung môi khai triển: Toluen: Ethylacetat: Acid formic (20:16:4)

- Điều kiện chạy HPTLC:

+ Điều kiện môi trường: nhiệt độ 26oC; độ ẩm tương đối 65%

+ Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; dung môi khai triển: 10,0 ml + Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút

+ Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút

+ Thời gian bão hòa bản mỏng: 4 phút

+ Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80,0 mm

- Bản mỏng được nhúng thuốc thử valinin/acid sulphuric (pha theo DĐVN IV), sau đó sấy ở 100oC trong 15 phút và hiện màu dưới ánh sáng thường

2.2.3.3 Xác định vân tay sắc ký

Cách thực hiện:

- Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử theo mục 2.2.3.1

- Triển khai sắc ký các mẫu thử và mẫu chuẩn theo điều kiện ở phần 2.2.3.2

có bổ sung thêm phần hiện màu dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm và 366 nm

- Chụp ảnh bản mỏng, xác định các vết chính trên sắc ký đồ và tính toán giá trị Rf tương ứng của từng vết Thực hiện 5 lần để tính giá trị trung bình và giá trị RSD của Rf .Các vết được lựa chọn là các vết xuất hiện ở đa số các mẫu thử

: giá trị trung bình của Rf

RSD: độ lệch chuẩn của các giá trị Rf

2.2.4 Bán định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

b Mẫu thử: chuẩn bị theo mục b phần 2.2.3.1

c iều kiện triển khai sắc ký: theo phần 2.2.3.2

Triển khai sắc ký lớp mỏng các mẫu thử và các mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng Xây dựng đường chuẩn bán định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ Gymnemagenin của các mẫu chuẩn Từ đường chuẩn bán định lượng, khảo sát được khoảng nồng độ Gymnemagenin trong các mẫu thử Từ đó tính hàm lượng % Gymnemagenin trong dược liệu theo công thức sau :

Cách tiến hành: chuẩn bị 3 mẫu sau:

 Mẫu trắng: dung dịch MeOH

 Mẫu thử: mẫu GL3 được chuẩn bị theo phần b mục 2.2.3.1

 Mẫu chuẩn: chuẩn Gymnemagenin (GMG4) được chuẩn bị theo phần a mục 2.2.3.1

Triển khai sắc ký với điều kiện đã được mô tả ở mục 2.2.3.2, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết và so sánh giá trị RSD của Rf [12]

Đánh giá kết quả: đánh giá dựa trên giá trị RSD của Rf Công thức tính RSD được ghi ở mục 2.2.3.3 Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu: (i) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; (ii) Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn

Giá trị đề nghị chấp nhận khi so sánh trị số R f: độ lệch chuẩn tương đối của giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ dung dịch thử không quá 5% Độ lệch giá trị Rf trên vết mẫu thử so với vết mẫu chuẩn không quá 5% [12]

b Tính tuyến tính

Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn theo mục a phần 2.2.3.1, dãy mẫu

chuẩn được pha theo mục a phần 2.2.4.1 Tiến hành triển khai HPTLC với dãy dung

dịch chuẩn trên Xây dựng phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng

độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu

Đánh giá: Dựa vào hệ số tương quan R2

của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính Trong nghiên cứu chấp nhận phương pháp có độ tuyến tính tốt với

R2>0,99

c ộ thích hợp của hệ thống

Cách tiến hành: Tiêm 6 lần dung dich chuẩn GMG3 được chuẩn bị theo mục

a phần 2.2.4.1, triển khai HPTLC theo điều kiện được mô tả ở mục 2.2.3.2

Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic Giá trị RSD của diện

tích (chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2,0% (đối với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12]

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

WALL EX WIGHT

Trong 5 mẫu nghiên cứu, chỉ có mẫu GL3 thu hái ở Hoà Bình đã thu được đầy đủ tất cả các bộ phận cơ quan sinh dưỡng (thân, lá) và cơ quan sinh sản (hoa, quả, hạt) Các mẫu còn lại chỉ thu được các bộ phận là cơ quan sinh dưỡng (thân, lá) Riêng mẫu GL1 (Tây Ninh) thu thêm được đặc điểm cụm hoa và GL2 (Gia Lai) thu được quả và hạt (bảng 3.1)

3.1.1 Các đặc điểm hình thái đặc trưng của các mẫu

a Mẫu GL1: Thân già phình không dạng cánh rõ rệt, thân non có nhiều lỗ vỏ, toàn

thân có nhựa mủ màu vàng và phủ lông màu sét Lá mọc đối, chiều dài cuống lá 2,5 – 4 cm Phiến lá hình trứng, gốc lá hình tim, ngọn lá nhọn lá dày, chỉ số lá chiều dài/chiều rộng (1 – 1,5), kích thước là 8-13 cm × 5-8 cm Gân bên 6 cặp dạng lông chim, mép lá phủ lông mịn Cụm hoa xim dạng đầu thành đôi ở mấu, có lông dày, thưa (hình 3.1)

Hình 3.1 Mẫu L1 ( ây Ninh; 11 o 23’13.6”N - 106 o 09’37.6”E)

b Mẫu GL2: Thân già phình dạng cánh, thân non có nhiều lỗ vỏ, toàn thân có nhựa

mủ màu vàng và phủ lông màu sét Lá mọc đối, chiều dài cuống lá 1,5 – 3 cm Phiến lá hình trứng, gốc lá nhọn gần tròn, ngọn lá nhọn lá dày, chỉ số lá chiều dài/chiều rộng (1,5 – 1,7), kích thước là 8-13 cm × 5-8 cm Gân bên 5 cặp dạng lông chim, mép lá phủ lông mịn Quả đại hình mác nhọn, 5,5 x 1,5 cm Hạt hình trứng,

có túm lông ở đầu (hình 3.2)

Hình 3.2 Mẫu L2 (Gia Lai; 13 o 59’44.5”N - 108 o 26’58.3”E)

c Mẫu GL3: Thân leo tới 6 m Thân già phình dạng cánh, thân non có nhiều lỗ vỏ,

các nhánh có nhiều lông tơ Cuống lá 1,5-4 cm, có lông tơ dày đặc; phiến lá

8-13×5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 5-6 cặp Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc Một cụm mang

rất nhiều hoa, mùi thơm Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm Đài hình trứng, phủ lông măng Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài Ống hoa có

5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng Trụ nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy Khối phấn hình thuôn Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi Quả đại hình mác nhọn, mũi cong, 4,5-5,5×1,5-2 cm, có lông dày đặc Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm×5 mm,

mép dạng màng; mào lông dài 3 cm (hình 3.3)

Hình 3.3 Mẫu L3 (Hòa Bình; 20 o 45’20.9”N - 105 o 12’33.9”E)

d Mẫu GL4: Thân leo tới 6 m Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ Cuống lá

1,5-4 cm, có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13×5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng

dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 5-6 cặp (hình 3.4)

Hình 3.4 Mẫu GL4 (Thái Nguyên; 21 o 52’51.8”N - 105 o 43’08.5”E)

e Mẫu GL5: Thân già phình dạng cánh không rõ, thân non có nhiều lỗ vỏ, các

nhánh có nhiều lông tơ Cuống lá 1,5-4 cm, có lông tơ dày đặc; phiến mỏng, kích thước 8-13×5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn

kéo dài, gân bên 6 cặp (hình 3.5)

Hình 3.5 Mẫu L5 (Tuyên Quang; 22 o 03’33.2”N - 105 o 10’16.8”E)

3.1.2 Tổng hợp các so sánh về đặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu

Đặc điểm thực vật của các mẫu nghiên cứu được tổng hợp, so sánh trong bảng 3.1 Đối chiếu với các đặc điểm cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản (nếu có) của các mẫu nghiên cứu đều tương ứng giống với các mô tả trước đây và tiêu bản SYNTYPE (KEW- K000872840) và LECTOTYPE (KEW - K000872839, K000872841) Do đó các mẫu được sơ bộ xác định đúng là loài nghiên cứu

Gymnema latifolium Wall Ex Wight Một số đặc điểm có sự biến động giữa các

mẫu nghiên cứu bao gồm: (i) Thân già phình dạng cánh: nhiều, rõ (mẫu GL2, GL3, GL4) và thưa, không rõ cấu trúc dạng cánh (mẫu GL1, GL5), (ii) Gốc lá hình tim (GL1, GL5) và nhọn gần tròn (mẫu GL2, GL3, GL4), (iii) Lá mỏng, ngọn lá nhọn

kéo dài (GL5)

Bảng 3.1 ặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu

Thân già phình dạng cánh Ít Nhiều Nhiều Nhiều Ít

Cụm hoa xim dạng đầu thành đôi ở

Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa

nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu

núm nhụy Khối phấn hình thuôn Đầu

núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi

X

Quả đại hình mác nhọn, mũi cong, có

lông dày đặc

5,5 x 1,5 cm

4,5 x 1,5 cm Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1

cm×5 mm, mép dạng màng; mào lông

dài 3 cm