Đánh giá sự đa dạng trình tự AND ribosom ITS của ba loài dược liệu chứa berberin họ rutaceae ở việt nam

Mặc dù nhiều loài trong số này đã được ghi trong “Sách đỏ Việt Nam” như: Berberis julianae Schneid, Berberis wallichiana DC., Mahonia baelii Forti Carr, Thalictrum foliolosum DC,… nhưng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN LÊ BÌNH MAI

ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG TRÌNH TỰ

ADN RIBOSOM ITS CỦA BA LOÀI DƯỢC LIỆU CHỨA BERBERIN HỌ RUTACEAE Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN LÊ BÌNH MAI

ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG TRÌNH TỰ

ADN RIBOSOM ITS CỦA BA LOÀI DƯỢC LIỆU CHỨA

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC

60720408

Người hướng dẫn khoa học: TS Phùng Thanh Hương

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo hướng dẫn

luận văn của tôi, Tiến sĩ Phùng Thanh Hương, đã tạo mọi điều kiện, động viên và

giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn “Đánh giá sự đa dạng trình tự ADN ribosom ITS của ba loài dược liệu chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam” Tôi cũng xin chân

thành cảm ơn tới Thạc sĩ Hà Thu Trong suốt quá trình nghiên cứu, chị đã kiên nhẫn

hướng dẫn, trợ giúp và động viên tôi rất nhiều Sự hiểu biết sâu sắc về khoa học, cũng như kinh nghiệm của hai người thầy chính là tiền đề giúp tôi đạt được những thành tựu và kinh nghiệm quý báu

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, cán bộ Phòng Vi sinh phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ; Ban Giám Hiệu, bộ môn Hóa sinh, phòng Sau đại học, phòng Đào tạo trường Đại học Dược Hà Nội Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ này

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã động viên, khích

lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

1.1.1 Cấu trúc của AND ribosom nhân 3

1.1.2 Cấu trúc của ITS-rADN nhân 4

1.1.3 Vai trò của ITS-rADN nhân 7

1.1.4 Ứng dụng của ITS-rADN trong nghiên cứu cây thuốc 7

1.3 Các dược liệu chứa berberin ở Việt Nam và thế giới 11

1.4 Ba loài dược liệu là đối tượng nghiên cứu của đề tài 15

1.4.1 Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium) 15

1.4.2 Xít xa (Toddalia asiatica) 17

1.4.3 Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae) 19

2.4.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 25

2.4.2 Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR 25

2.4.3 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 27

2.4.4 Phương pháp tách dòng 27

2.4.5 Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli chủng

2.4.6 Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn 29

2.4.7 Phương pháp cắt ADN bằng enzym giới hạn 30

2.4.8 Phương pháp tinh sạch ADN plasmid 30

2.4.9 Phương pháp giải trình tự ADN 31

2.4.10 Phương pháp so sánh trình tự ADN 32

3.1 Kết quả giải trình tự ITS-rADN loài Muồng truổng 33

3.1.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Muồng truổng 33

3.1.2 Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Muồng truổng 34

3.1.3 Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng 35

3.1.4 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng 37

3.1.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng 41

3.1.6 Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 10 mẫu Muồng truổng 46

3.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Xít xa 47

3.2.2 Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Xít xa 48

3.2.3 Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Xít xa 49

3.2.4 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Xít xa 51

3.2.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Xít xa 52

3.2.6 Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa 55

3.3 Kết quả giải trình tự ITS-rADN loài Dấu dầu xoan 55

3.3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Dấu dầu xoan 55

3.3.2 Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Dấu dầu xoan 57

3.3.3 Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan 58

3.3.4 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan 60

3.3.5 Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Dấu

3.3.6 Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 5 mẫu Dấu dầu xoan 66

4.1 Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN 68

4.2 Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam 70

4.3 Về sự đa dạng di truyền của loài Xít xa ở Việt Nam 71

4.4 Về sự đa dạng di truyền của loài Dấu dầu xoan ở Việt Nam 72

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat

C-FLIP Cellular FLICE like inhibitory protein

DSS Dextran sodium sulfate

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylen Diamin Tetra acetic Acid

ETS External transcribed spacer

ITS Internal Transcribed Spacer (Vùng phiên mã nội)

ITS-rADN Internal Transcribed Spacer – ribosomal ADN (Trình tự ADN

ribosom đoạn ITS)

MCL-1 Myeloid cell leukemia – 1

NTS Non-transcribed spacer

PCR Polymerase Chain Reaction

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

ROS Reactive oxygen species

TAE Tris - Acetic acid – EDTA

TRAIL Tumor necrosis factor related apoptosis including ligand X-gal 5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2 của một số

Bảng 1.3 Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Tetradium

Bảng 1.4 Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Toddalia asiatica 18

Bảng 1.5 Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Zanthoxylum

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng tạo vector tái tổ hợp 27

Bảng 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng đọc trình tự 32 Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số của 10

Bảng 3.2 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 10 mẫu Muồng truổng 38 Bảng 3.3 Tỉ lệ %(G+C) và kích thước vùng ITS-rADN của 10 mẫu Muồng truổng 41 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 10 mẫu Muồng truổng 45 Bảng 3.5 Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số của 3

Bảng 3.6 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa 51

Bảng 3.7 Tỉ lệ %(G+C) và kích thước vùng ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa 52 Bảng 3.8 Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 3 mẫu Xít xa 54 Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số của 5

Bảng 3.10 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Dấu dầu xoan 61 Bảng 3.11 Tỉ lệ %(G+C) và kích thước vùng ITS-rADN của 5 mẫu Dấu

Bảng 3.12 Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Dấu dầu xoan 66

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.3 Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium) 15

Hình 1.5 Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae) 19

Hình 3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số của 10 mẫu Muồng truổng 33 Hình 3.2 Sản phẩm PCR của 10 mẫu Muồng truổng 35 Hình 3.3 Ảnh điện di plasmid tách từ các khuẩn lạc của 10 mẫu Muồng truổng 36

Hình 3.4 Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI của 10

Hình 3.5 So sánh gióng hàng trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của 10

Hình 3.6 Cây phân loại 10 mẫu Muồng truổng dựa trên so sánh trình tự

Hình 3.7 Kết quả tách chiết ADN tổng số của 3 mẫu Xít xa 47

Hình 3.9 Ảnh điện di plasmid tách từ các khuẩn lạc của 3 mẫu Xít xa 49

Hình 3.10 Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI của 3

Hình 3.16 Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI của 5 60

mẫu Dấu dầu xoan

Hình 3.17 So sánh gióng hàng trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của 5

Hình 3.18 Cây phân loại 5 mẫu Dấu dầu xoan dựa trên so sánh trình tự

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin, một alcaloid có nhân isoquinolin, là hoạt chất có nhiều tác dụng chữa bệnh như: tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng kháng một số động vật nguyên sinh [1], tác dụng chống ung thư, hạ huyết áp, hạ glucose máu,… [33, 35,

59, 63] Các tác dụng này đã được chứng minh trên in vio, in vitro và đã được ứng

dụng rộng rãi trong lâm sàng

Berberin được phát hiện trong 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau, trong đó ở Việt Nam có: họ Mao lương (Ranunculaceae), họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Rutaceae), họ Anh túc (Papaveraceae) Với các giá trị làm thuốc rất lớn và tính chất quý hiếm của các loài trên, chúng đã và đang được khai thác triệt để để làm thuốc, chiết xuất và buôn bán

ở thị trường trong nước cũng như xuất khẩu qua Trung Quốc, dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên các loài thực vật cho berberin ở Việt Nam Mặc dù nhiều loài

trong số này đã được ghi trong “Sách đỏ Việt Nam” như: Berberis julianae Schneid, Berberis wallichiana DC., Mahonia baelii (Forti) Carr, Thalictrum foliolosum DC,… nhưng cho đến nay, ngoài một số nghiên cứu quy mô nhỏ về nhân

giống và bảo tồn, vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu hóa ở mức độ phân tử về đa dạng di truyền các loài cây này một cách sâu rộng

và có hệ thống Để tiến tới quản lý, bảo vệ và khai thác hợp lý nguồn tài nguyên các dược liệu chứa berberin nói trên, một dự án đánh giá tiềm năng di truyền các nguồn gen dược liệu chứa berberin ở Việt Nam được triển khai từ tháng 6 năm 2011 với các nội dung chính: thu thập và lưu trữ mẫu, phân tích đặc điểm hình thái, chỉ tiêu nông học; phân tích hàm lượng berberin; phân tích đa dạng di truyền nguồn gen

Trong phạm vi đề tài luận văn cao học, chúng tôi tiến hành một phần nhỏ trong dự án, tập trung vào phân tích đa dạng di truyền các loài chứa berberin họ

Rutaceae ở Việt Nam Hiện nay, trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, quan hệ

tiến hóa trên thế giới, nhiều chỉ thị phân tử đã và đang được áp dụng rộng rãi làm tiêu chí đánh giá, trong đó, một trong những chỉ thị được dùng phổ biến nhất là trình tự vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom nhân (ITS-rADN) do nhiều ưu điểm về cả giá trị khoa học và khả năng áp dụng thực tế Do đó, trong đề tài này,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu về trình tự ITS-rADN nhân của 3 loài dược liệu chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam với mục tiêu:

- Xác định được trình tự ITS-rADN nhân của các mẫu thu hái thuộc 3 loài

dược liệu chứa berberin ở Việt Nam gồm: Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae), Xít xa (Toddalia asiatica), Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium)

- So sánh độ tương đồng trình tự ITS-rADN nhân giữa các mẫu thu được của mỗi loài trong 3 loài nói trên để đánh giá sự đa dạng di truyền của dược liệu chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam

Chương I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom nhân (ITS-rADN nhân)

1.1.1 Cấu trúc của ADN ribosom nhân

ADN ribosom (rADN) là các gen mã hóa rARN nằm trong nhân tế bào và đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài rADN là gen

có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho bất kỳ protein nào Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa Phần lớn trình tự nucleotid trên phân tử rADN tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở

để tìm ra sự tương đồng và khác biệt về di truyền khi so sánh giữa các bậc phân loại khác nhau [56]

rADN được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm với các phương pháp như nhân dòng và giải trình tự ADN Ngoài ra trên cơ sở kỹ thuật PCR, một số phương pháp mới được phát triển gần đây như RFLP, RAPD, AFLP đã được áp dụng để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của sinh vật thay vì phân tích toàn bộ trình tự vùng rADN

Cấu trúc của rADN được mô tả trong hình 1.1:

(a): Vị trí của ADN ribosom trên nhiễm sắc thể

(b): Các đoạn gen (18S-5,8S-26S) xếp liên tiếp nhau trên ADN ribosom IGS: Vùng đệm giữa các gen; NTS: vùng không phiên mã;

ETS: vùng phiên mã ngoại; ITS: vùng phiên mã nội

Hình 1.1 Cấu trúc của vùng rADN [45]

Mỗi đoạn gen lặp lại của rADN gồm các vùng IGS, 18S, ITS1, 5,8S, ITS2 và

26S IGS là vùng kém bảo tồn nhất của ADNr Ở đầu kết thúc 5’ của 18S và đầu kết thúc 3’ của 26S có một vùng được biết đến là vùng phiên mã ngoại ETS (external transcribed spacer) Các vùng rADN 5,8S, 18S, 26S phiên mã thành các đoạn tiền rARN riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng phiên mã nội (ITS) và các vùng phiên mã ngoại (ETS) Vùng phiên mã 18S tạo thành tiểu đơn vị nhỏ (SSU), vùng 26S cộng với 5,8S tạo thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosom

Trong các vùng này, vùng 18S và vùng ITS được coi là những marker phân

tử hiện đang được dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền và quan hệ tiến hóa [15,

45, 43]

1.1.2 Cấu trúc của ITS-rADN nhân

Vùng phiên mã nội (ITS) của ADN ribosom thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại thực vật Vùng ITS có 3 phần: ITS1, ITS2 và vùng có tính bảo tồn cao là 5,8S nằm giữa (hình 1.2.)

Vùng ITS

Hình 1.2 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS [15]

Ở một số loài thực vật có hoa, kích thước của vùng ITS1 và ITS2 thường nhỏ hơn 300 bp (ITS1: 187-298 bp; ITS2 : 187-252 bp) Vùng tiểu phân 5,8S có kích thước không đổi là 163-164 bp Ở thực vật, kích thước của vùng ITS xấp xỉ 650-750

bp ở thực vật hạt kín và khoảng xấp xỉ 1500-3700 bp ở thực vật hạt trần [15, 39] Vùng ITS1 thường có kích thước lớn hơn vùng ITS2, ví dụ 1 số loài sau:

Adoxaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Canellaceae, Malvaceae, Onagraceae, Polemoniaceae, Ranunculaceae, Salicaceae, Saxifragaceae, Styracaceae, và Winteraceae Ngược lại, ở một số loài vùng ITS2 có kích thước lớn hơn vùng ITS1

như: Betulaceae, Cucurbitaceae, Scrophulariaceae và Viscaceae Ở loài Solanaceae, 2 vùng này có kích thước bằng nhau [17, 24]

Bảng 1.1 Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2 của

một số loài thực vật hạt kín [15]

Loài

ITS1 ITS2 Kích thước

(bp)

% G+C Kích thước

(bp)

% G+C

Adoxaceae, Viburnum, 28 loài 224-231 59-69 215-227 59-69

Asteraceae, Madiina, 42 loài 254-261 48-51 216-223 50-53

Asteraceae, Lactucea, 45 loài 246-253 52-54 220-222 53-58

Betulaceae, Alnu, 11 loài 215-216 58-64 228-229 53-65

Betulaceae, Betula, 3 loài 214-219 62-63 226-231 63-65

Brassicaceae, Arabidopsis,1 loài 268 57 187 55

Brassicaceae, Sinapis, 1 loài 265 51 188 54

Cucurbitaceae, Cucumis, 1 loài 216 56 237 60

Cucurbitaceae, Cucurbita, 2

loài

187-229 51-60 245-525 54-66

Fabaceae, Galegeae, 31 loài 221-231 55-60 207-217 50-54

Onagraceae, Epilobium, 22 loài 240-244 53-62 211-216 54-60

Poaceae, Pooideae,10 loài 217-223 55-64 213-221 59-67

Loài

ITS1 ITS2 Kích thước

(bp)

% G+C Kích thước

(bp)

% G+C

Polemoniace, 38 loài 242-262 42-65 187-195 48-62

Rosaceae, Maloideae, 20 loài 208-221 65-72 211-224 67-72

Scrophulariaceae,Mimulus, 8

loài

189-214 44-49 203-225 45-48

Solanaceae, Lycopersicon, 1 loài 217 68 217 71

Solanaceae, Nicotiana, 1 loài 216 69 217 65

Styracaceae, Styrax, 19 loài 255-264 208-221

Viscaceae, Arceuthobiu, 22 loài 208 31-36 226 30-37

1.1.3 Vai trò của ITS-rADN nhân

Trình tự nucleotid của vùng ITS vừa mang tính bảo thủ (ở đoạn 5,8S) vừa mang tính siêu biến (ở đoạn ITS1 và ITS2) nên cho phép phân biệt được giữa các đơn vị ở bậc phân loại thấp (dưới giống- genus) Vùng ITS-rADN nhân có khả năng phản ánh quan hệ giữa những loài có nguồn gốc tiến hóa gần gũi trong khi đó trình

tự nucleotid của vùng 18S, một marker phân tử phổ biến khác có mức độ bảo thủ

quá cao nên không đủ chi tiết để phân định giữa các loài lân cận trong cùng chi [13]

Ưu điểm của vùng ITS trong nghiên cứu phát sinh loài:

- Vùng ITS mang đặc tính di truyền của cả “bố” và “mẹ”, khác với các marker ADN lạp thể hay ADN ti thể chỉ mang đặc tính di truyền của “mẹ”

- Với độ lặp lại cao trong ADN ribosom của thực vật, mỗi đoạn ADN được sắp xếp lặp lại hàng nghìn bản ở nhiễm sắc thể, do đó thuận lợi cho việc phát hiện, khuếch đại và xác định trình tự ADN ribosom cũng như vùng ITS trên đó

- Trình tự ITS có tính phổ quát (universal), vì thế các cặp mồi dùng cho phản ứng khuếch đại đã được thương mại hóa và sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu khác nhau, không cần phải thiết kế mồi riêng cho mỗi nghiên cứu

- Vùng ITS có kích thước nhỏ nên dễ dàng khuếch đại

Với những ưu điểm trên, trình tự nucleotid vùng ITS của rất nhiều loài đã được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới rất phong phú, thuận lợi cho phân tích và so sánh trình tự gen [45]

Trong nghiên cứu di truyền, vùng phiên mã nội của rADN có một số ứng dụng quan trọng như: xác định các điểm đột biến trong quá trình hình thành loài, đánh giá sự tương đồng trình tự ADN, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra các cây tiến hóa loài, đánh giá đa dạng di truyền trong phạm vi một bậc phân loại [12]

1.1.4 Ứng dụng của ITS-rADN trong nghiên cứu cây thuốc

Với những ưu điểm nổi trội trên, giá trị dữ liệu về trình tự vùng ITS được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu phát sinh loài, đánh giá đa dạng di truyền hay nhận diện dược liệu

Chi Zanthoxylum có hơn 200 loài như Zanthoxylum piperitum, Zanthoxylum schinifolium và Zanthoxylum bungeanum Trong nền y học cổ truyền của Trung

Quốc, quả của các loài trong chi này được dùng làm thuốc để điều trị đau thượng vị

và thuốc bổ máu Zanthoxylum là một chi phức tạp có nhiều điểm khác biệt giữa

các loài, vì vậy phương pháp dựa vào các đặc tính hình thái bên ngoài và các đặc tính sinh lí không thể phân biệt một cách chính xác quan hệ của các loài Để giải quyết khó khăn này, ngày nay các nhà nghiên cứu đã sử dụng trình tự gen để xác định hệ thống phát sinh loài Trong nghiên cứu của Sun Yan-Lin đã lựa chọn vùng

ITS để phân biệt các loài trong chi Zanthoxylum Kết quả nghiên cứu không những cung cấp trình tự ITS của loài Zanthoxylum piperitum mà còn giúp phân biệt được Zanthoxylum piperitum với loài Zanthoxylum schinifolium, qua đó giải thích quan

hệ giữa các loài trong chi Zanthoxylum [62]

Một số nghiên cứu ở Việt Nam gần đây trong lĩnh vực cây thuốc bắt đầu hướng vào phân tích tính đa dạng sinh học ở cấp độ phân tử, dựa trên chỉ thị RAPD hoặc ADN ribosom ITS Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Nga cho thấy trình tự

ADN vùng gen ITS của 12 mẫu dược liệu thuộc chi Đẳng Sâm có chiều dài giữa

các loài dao động từ 638 đến 650 bp, tỷ lệ GC trong vùng này khoảng từ 60,3% đến 62,5%, có 113 điểm sai khác giữa các loài, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự, trong

đó có 51 sai khác được tìm thấy ở vùng ITS1, 8 điểm ở vùng 5,8S và 53 điểm ở vùng ITS2 Trong đó sai khác trong nội loài từ 0,0-0,2%, sai khác giữa các loài khác nhau đạt đến 15,4% Nghiên cứu này kết luận sự đa hình trong trình tự nucleotid ở vùng ITS1 và ITS2 là rất cao, tại đây xảy ra các biến đổi lớn như thêm hoặc mất một đoạn nucleotid, trong khi đó vùng 5,8S với chiều dài trung bình khoảng 164 bp

là vùng bảo thủ cao, với sự biến đổi rất ít trong trình tự ở tất cả các loài Trong các mẫu nghiên cứu, 11 mẫu có trình tự tương đồng hoàn toàn 100% với trình tự ADN

của loài C javanica trên GenBank, 1 mẫu có trình tự tương đồng hoàn toàn với trình tự ADN của loài C tangshen trên GenBank [9]

Trong lĩnh vực nhận diện dược liệu, nghiên cứu của Xing GUO và cộng sự cho thấy vùng gen ITS cung cấp số lượng thông tin đặc trưng lớn nhất và khả năng

phân biệt tốt nhất 6 mẫu Hedyotis L họ Rubiaceae, phân biệt 14 loài Hedyotis L,

bao gồm cả loài chính thống trong phương thuốc điều trị khối u “Baihuasheshecao”

có nguồn gốc từ H diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H corymbosa

(L.) Lam [60]

1.2 Tổng quan về berberin

Berberin là alcaloid có nhân isoquinolin, có trong nhiều các cây thuộc các họ khác nhau như: Berberidaceae, Ranunculaceae, Rutaceae, Menispermaceae, Papaveraceae [7] Berberin có công thức hóa học:

Các tác dụng đã được phát hiện của berberin bao gồm:

a Tác dụng kháng khuẩn: Hoạt chất berberin có phổ kháng khuẩn rộng đối với

một số chủng gram (+) và gram (-), berberin có tác dụng ức chế các vi khuẩn

Streptococcus, Pneumococcus, Vibrio cholera, Bacillus anthracis ở nồng độ 1:16.000, Streptococcua viridians, Sh Shigae, Sh Flexneri, Bacillus diphtheria, B subtilus 1:8.000, B typhoid 1:1.000 Đối với Vibrio cholera đã được xử lý trước với

berberin đem tiêm truyền cho những con thỏ thì không gây nên những triệu chứng thổ tả Điều đó chứng tỏ độc tố của vi khuẩn tả đã bị trung hòa hoặc bị bất hoạt Trên những thỏ còn non cho uống trước berberin, sau đó 18 – 24 giờ bơm vào ruột thỏ một liều độc tố tả gây chết thì phòng ngừa được hiện tượng tiêu chảy do độc tố gây nên và kéo dài được thời gian sống của thỏ dùng thuốc [1]

Về cơ chế tác dụng kháng khuẩn của berberin, một số tác giả cho rằng có liên quan đến tác dụng ức chế sinh tổng hợp ARN, ADN và protein của thuốc đối với vi khuẩn Nhóm ammonium bậc 4 rất cần thiết cho tác dụng kháng khuẩn, những dẫn chất không có ammonium bậc 4 như tetrahydroberberin có tác dụng kháng khuẩn rất yếu [1]

Một số nghiên cứu đã được thực hiện cho thấy berberin có thể sử dụng để

chống lại nhiễm khuẩn MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus - Staphylococcus aureus kháng Methicillin) [64]

b Tác dụng kháng nấm: Berberin sulfat với nồng độ 10 – 25 mg/ml ức chế sự sinh trưởng của các nấm Alternaria spp Aspergillus flavus, A fumigates, Candida albicans, Curvularia spp., Drechslera spp., Fusarium spp., Rhizopus oryzae, Scophulariopsis spp.,… [1]

c Tác dụng kháng đơn bào: Berberin trên ống kính với nồng độ 1:5000 và trên

chuột nhắt trắng đã gây nhiễm amip với liều 50mg/kg bằng đường uống có tác dụng

ức chế sự sinh trưởng của amip

Berberin còn có tác dụng diệt Typanosoma brucei rhodesiense với nồng độ

Thử nghiệm trên mô hình chuột Wistar gây ung thư ruột kết bằng DMH cho thấy berberin có thể ức chế sự hình thành khối u ACF và gây ra bởi DMH + DSS, Các tác dụng chống khối u của berberin có thể thông qua một con đường chưa biết

rõ nhưng thông qua đó biểu hiện của protein và mARN COX-2 bị ức chế [58]

Berberin có tác dụng tăng cường gây chết tế bào ung thư qua trung gian TRAIL trong ung thư thận ở người thông qua việc điều hòa giảm c-FLIP và MCL-1 thông qua trung gian ROS [34]

e Tác dụng hạ huyết áp: Sulfat berberin tiêm truyền tĩnh mạch trên thỏ gây hạ

huyết áp, chậm nhịp tim Tác dụng này cũng xuất hiện ở những chuột cống trắng đã cắt dây thần kinh số X ở cả hai bên Chlorid berberin dùng với liều từ 0,5 – 5 mg/kg cho thỏ gây mê bằng urethan gây hạ huyết áp kéo dài Tác dụng hạ huyết áp có thể

do ức chế α –andrenoceptor chứ không phải do tác dụng giãn mạch Trên tiêu bản

cô lập động mạch phổi thỏ và động mạch vành tim mèo, berberin không có tác dụng

giãn mạch trực tiếp nhưng lại đối kháng với hiện tượng co mạch do các thuốc giống adrenalin gây nên [1]

f Tác dụng hạ glucose máu: Berberin có tác dụng làm giảm lượng glucose

trong máu tương đương với tác dụng của metformin [63] Các cơ chế của tác dụng này bao gồm sự ức chế aldose reductase [59], hoạt hóa enzym đường phân, ức chế tân tạo đường [63] Một nghiên cứu mới chỉ ra rằng berberin có thể khắc phục tính kháng insulin thông qua điều chỉnh các phân tử quan trọng trong con đường dẫn truyền tín hiệu của insulin [36]

Theo Prabhakar và cộng sự, berberin được sử dụng để tăng tác dụng của metformin và 2,4-thiazolidinedione, và có thể thay thế một phần các sản phẩm thuốc thương mại trên thị trường, nhằm làm giảm độc tính và tác dụng phụ của các thuốc này [47]

Berberin hydroclorid ở nồng độ 150mg/kg theo đường uống, dùng hàng ngày, mỗi ngày 1 lần trong 3 tuần trên chuột gây đái tháo đường bằng streptozotocin có tác dụng giảm nồng độ glucose trong máu, cải thiện chức năng gan, thận, điều hòa nồng độ lipid ở chuột gây đái tháo đường bằng streptozotocin [41]

1.3 Các dược liệu chứa berberin ở Việt Nam và thế giới

Trên thế giới có khoảng 150 loài thực vật có berberin đã được phát hiện,

thuộc 23 chi (Berberis, Coptis, Corydalis, Dicranostigma, Euodia, Glaucium, Hydratis, Macleaya, Mahonia, Nandina, Papaver (Papaveraceae), Phellodendron, Sanguinaria, Sankezhen, Thalictrum, Chelidonium, Cissampelos, Coscinium, Cyclea, Toddalia, Xanthorhiza, Xylopia, Zanthoxylum) và 7 họ, bao gồm:

Annonaceae, Berberidaceae, Fumariaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae, Rutaceae, trong đó các họ chủ yếu là Berberidaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae và Rutaceae [2]

Ở Việt Nam thống kê cho thấy berberin có ở 20 loài thực vật thuộc 5 họ khác nhau là Berberidaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Rutaceae, Papaveraceae (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Các loài chứa berberin ở Việt Nam

TT Tên

cây

Tên khoa học

Họ

Bộ phận chứa berberin

Hàm lượng alcaloid toàn phần (%)

Hàm lượng berberin (%)

Tài liệu tham khảo

1 Hoàng

liên gai

Berberis wallichiana

Berberidaceae Thân, vỏ 0,35 -

2,5

[1, 2, 5]

6 Cổ An

Arcangelisia flava (L.)

Hàm lượng alcaloid toàn phần (%)

Hàm lượng berberin (%)

Tài liệu tham khảo

8 Dây

Sâm

Cyclea peltata

(Lamk.) Hook &

Hàm lượng alcaloid toàn phần (%)

Hàm lượng berberin (%)

Tài liệu tham khảo

Franch

Ranunculaceae Toàn cây 5 – 8

(Rễ)

[1, 7, 8]

đơn vị diện tích canh tác Điều này có thể thực hiện được thông qua việc trồng trọt

và nghiên cứu các chỉ tiêu hình thái, nông học của các mẫu

Với giá trị làm thuốc rất lớn và tính chất quí hiếm của các loài cây này, chúng đã và đang được khai thác triệt để để làm thuốc và buôn bán ở thị trường trong nước (Hoàng liên, Hoàng liên ô rô,…) cũng như chiết xuất berberin (Vàng đắng) và xuất khẩu qua Trung Quốc Điều này đã dẫn đến sự cạn kiệt nguồn tài nguyên các loài cho berberin ở Việt Nam Mặc dù hầu hết các loài này đã được ghi trong “Sách đỏ Việt Nam” nhưng cho đến nay, ngoài một số nghiên cứu quy mô nhỏ về nhân giống và bảo tồn, chưa có loài nào trong số này được trồng trọt, vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu hoá ở mức độ phân

tử về đa dạng di truyền các loài cây này một cách sâu rộng và có hệ thống

1.4 Ba loài dược liệu là đối tượng nghiên cứu của đề tài

1.4.1 Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium)

phụ 3-5mm, cuống có lông Hoa nở thành chùm, kích thước từ 9-19cm Mỗi bông hoa có bốn hoặc 5 cánh, dày khoảng 0,5 mm Cánh hoa mầu xanh lá cây, vàng hoặc trắng, khi khô chuyển sang mầu trắng đục đến mầu nâu Quả có ba nang, chứa lớp thịt xốp bao bên ngoài một lớp vỏ mỏng khi chín có mầu đen bóng, trong quả mỗi nang có 1 hạt tròn, mầu đen, kích thước từ 2,5 – 4 mm Hoa nở từ tháng 6 đến tháng

9 Quả xuất hiện từ tháng 9 đến tháng 12 Phân bố: Vùng Đông Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Đông bắc Ấn Độ, Việt Nam, Philippin, Inđônêxia, Malaysia, Myanma và Thái Lan, Lào, Campuchia) [6]

Từ những năm 1973, Hegnauer đã phân lập được berberin từ loài Tetradium glabrifolium [20] Tian-Shung Wu và cộng sự phân lập từ dịch chiết lá của Tetradium glabrifolium 29 hợp chất gồm: 3 alkaloid, 5 triterpenoid, 5 coumarin, 7

benzenoid, 2 tannin, 5 flavonoid, 1 đường và 1 nucleoside [54] Ng, K.M cũng tách

được từ Tetradium glabrifolium hợp chất 1/7- Hydroxyrutaecarpine thuộc nhóm Rutaecarpine – nhóm dược chất đang được nghiên cứu in vitro và in vivo về các tác

dụng trên tim mạch, chống huyết khối, chống ung thư, kháng viêm giảm đau,…[42, 51]

Kết quả trình tự gen của Tetradium glabrifolium đã công bố trên ngân hàng

gen thế giới gồm:

Bảng 1.3 Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Tetradium glabrifolium

STT Trình tự gen đã được công bố trên NCBI Mã số trên NCBI

Tên thường gọi: Cam núi, Cây bún, Dây nhiên, Dây cám, Lang cây

Xít xa thuộc cây nhỡ hay cây gỗ nhỏ, có cành non bò dài có thể tới 5-10m; cuống lá và gân các lá có gai nhiều và cong ở đầu Lá mọc so le, có cuống, có 3 lá chét có điểm tuyến, có gân giữa rất rõ Hoa khác gốc, nhiều, nhỏ, màu trắng, thành chùm đơn ở nách các lá, dài 3-4cm Quả dạng quả mọng, hình cầu cỡ 1cm, có u nẫn, màu vàng cam, dẹp, có 5 ô chứa mỗi ô 1 hạt hình thận, có vỏ dày, dài, màu nâu

sẫm hay đen đen, có mùi chanh, có vị cay thơm [5]

Phần gốc hóa gỗ của T asiatica có chứa 4 N-cyclohexylamide, đồng thời

cũng còn có toddasiatin, 6 alkaloid (skimmianin, norchelerythrin, oxyavicin, avicin,

oxynitidin và nitidin) Santapau H đã tìm được berberin trong rễ và vỏ của T asiatica [46] Các nghiên cứu mới gần đây đã tìm ra thêm toddaliamid,

methyltoddaloamid và toddasiatin Tổng cộng có đến 30 hợp chất được phân lập từ gốc hóa gỗ bao gồm: các coumarin, alkaloid, một benzoquinone, một toddanin amin

và hợp chất mới isocoreximin, trong đó có cyclohexylamin lần đầu được phân lập

từ nguồn gốc tự nhiên [27, 55]

Các tác dụng về dược lý của T.asiatica đã được chứng minh và ứng dụng gồm:

- Tác dụng chống viêm: tác dụng chống viêm của T asiatica được chứng

minh trên mô hình chuột thực nghiệm, tác dụng chống viêm phụ thuộc vào liều dùng [28]

- Tác dụng giảm đau, chống virus: nghiên cứu của Lu (2005) bằng phương

pháp MTS và PCR cho thấy T asiatica có tác dụng kháng virus H1N1 mạnh, các

tác dụng trong 24 giờ trước và sau nhiễm trùng [38]

- Tác dụng hạ sốt, tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm, chống tiêu chảy,

chống sốt rét, giảm glucose máu (dịch chiết ethyl acetat của T asiatica cho tác dụng

trên nhóm chuột bị gây tiểu đường) [31]

- Tác dụng chống ung thư và tác dụng chống oxy hóa,…

Trên ngân hàng gen thế giới có 41 trình tự về ADN của T asiatica Phần lớn

các nghiên cứu quan tâm đến vùng intergenic và ribulose-1,5- bisphosphate carboxylase/ tiểu đơn vị lớn oxygenase, vùng gen trnL Chỉ có 3 kết quả có liên quan đến rADN vùng ITS đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới

Bảng 1.4 Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Toddalia asiatica

STT Trình tự gen công bố trên NCBI Mã số trên NCBI

1 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 và 28S

1.4.3 Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae)

Muồng truổng mọc hoang ở khắp rừng núi các tỉnh phía Bắc nước ta, có cả ở Miền Nam Nhân dân thường lấy lá về nấu ăn, lấy rễ hoặc vỏ thân, vỏ rễ về sao vàng hoặc phơi khô làm thuốc Cây chứa alcaloit, chủ yếu là berberin Trong quả có một ít tinh dầu thơm xitronellal [8]

Alkaloid là hợp chất quan trọng nhất trong chi Zanthoxylum, được tìm thấy

ở phần lớn các loài và ở hầu hết các bộ phận trong cây Có 2 loại alkaloid chính được tìm thấy là isoquinolin (benzophenathridine, benzylisoquinoline, aporphine, protoberberin và berberin) và quinolin Ngoài ra còn nhiều hợp chất quan trọng

khác được tìm thấy trong chi Zanthoxylum như: lignan: đây là hợp chất có hoạt tính

sinh học cao: kháng sinh, chống ung thư, chống virut, chống côn trùng; Coumarin, amid, flavonoid, terpenen và sterol [11, 22, 57]

Với sự đa dạng của các hợp chất hóa học tìm được, chi Zanthoxylum đã và

đang được quan tâm nghiên cứu về tác dụng sinh học Kết quả thu được cho thấy tiềm năng phát triển các thuốc mới Các tác dụng sinh học chủ yếu của chi

Zanthoxylum liên quan đến: kháng sinh, kháng sâu bệnh, chống viêm, chống oxy

hóa, chống ung thư,… Trần Đức Dũng và cộng sự đã thử tác dụng của dịch chiết lá

Zanthoxylum avicenniae (YBB) trên tế bào ung thư biểu mô gan người HA22T ở cả

2 mô hình in vivo và in vitro Kết quả cho thấy dịch chiết YBB gây độc trên dòng tế

bào HA22T, giảm kích thước khối u ở chuột, tác dụng này phụ thuộc vào nồng độ thuốc [23]

Kết quả trình tự gen công trên ngân hàng gen thế giới của Zanthoxylum avicennae gồm:

Bảng 1.5 Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Zanthoxylum avicennae

STT Trình tự gen công bố trên NCBI Mã số trên NCBI

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu tách ADN tổng số:

- 10 mẫu cây Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae)

- 05 mẫu cây Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium)

- 03 mẫu cây Xít xa (Toddalia asiatica)

Các mẫu lá non của các loài nói trên được thu hái ở các vùng khác nhau, được giám định tên khoa học dựa trên các đặc điểm hình thái bởi Bộ môn Thực vật - Trường đại học Dược Hà Nội Các mẫu sau khi thu hái được rửa sạch bằng xà phòng chuyên dụng và tráng nước cất sau đó được bảo quản trong từng túi nilon hàn kín riêng biệt Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh sâu ở -200 C

Bảng 2.1 Danh sách địa điểm thu hái mẫu

Muồng truổng

2 ZA2 Công viên quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng, Quảng Bình

Xít xa

STT Kí hiệu mẫu Địa điểm thu hái

Dấu dầu xoan

 Dung dịch tách plasmid:

- Sol I: Tris HCL, pH 8:25mM, EDTA, pH 8: 10mM, glucose:50mM

- Sol II: NaOH:0,2M, SDS: 1%

- Sol III: đệm acetat kali 3M, pH 5,5

- Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1)

- Dung dịch TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM EDTA)

 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (LB, g/L):

- LB lỏng (g/L): Cao nấm men:5g, trypton:10g, NaCl:5g, pH 7,4 (chỉnh bằng NaOH 5N)

- LB đặc (g/L): Cao nấm men:5g, trypton:10g, NaCl:5g, agar:15g

 Hóa chất dùng cho điện di ADN:

- Dung dịch đệm điện di TAE 1X: lấy từ dung dịch gốc TAE 50X có thành phần như sau: Tris base:121g, acid acetic băng: 28,6mL, 0,5M EDTA pH 8,0: 50mL, nước khử ion vừa đủ: 500mL

- Gel Agarose 1%: 1 gam agarose, bổ sung 100mL đệm TAE 1X, làm tan agarose trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút Để nhiệt độ hạ xuống khoảng 500C rồi đổ ra khay điện di đã có lược tạo giếng tra mẫu

- Ethidium bromid (EtBr) dung dịch mẹ: 10mg/mL Hòa 1 gam EtBr vào 100mL H20 Khuấy từ từ cho tan đều Giữ trong lọ màu ở nhiệt độ phòng Khi dùng pha 20µL dung dịch mẹ trong 100mL đệm TAE 1X

- Đệm tra mẫu ADN 5X: Tris-HCl 1M pH 8,0 : 1mL EDTA 0,5 M pH 8,0: 0,2mL, glycerol: 2mL, xanh bromophenol 1%: 2mL

 Bộ kit chiết tách ADN thực vật Plant Tissue (Solution Type) của hãng Solgen Co.Ltd

 Để tách dòng gen, sử dụng bộ kit TA cloning kit (Invitrogen) Trong bộ kit này gồm các thành phần : vector PCR 2.1 (đã mở vòng có đầu dính T), enzym T4-

ligase, đệm ligase 10X, tế bào E.coli chủng TOP10F’

 Bộ kit tinh sạch vector tái tổ hợp phục vụ cho mục đích giải trình tự gen (Fermentas)

2.3 Trang thiết bị

Máy xác định trình tự ADN tự động-ABI 3100 Avant (Applied Biosystems, Mỹ), máy ly tâm lạnh (Microcentrifuge – Sorvall, Mỹ), máy điện di ADN (Mupid, Nhật Bản), máy soi chụp ảnh gel (Bio – Rad), máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy

ổn nhiệt dùng nước (Memmert), máy quang phổ huỳnh quang (Nanodrop 3300, Mỹ), cân phân tích, cân điện tử, lò vi sóng (Samsung), tủ lạnh 40C, tủ lạnh sâu -

200C (Sanyo, Nhật Bản), tủ lạnh sâu -800C, tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, máy li tâm (Universal 320R), bình nitơ lỏng

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu

ADN tổng số

Tách chiết ADN tổng số

Khuếch đại gen ITS-rADN

Tinh sạch ADN plasmid

Chọn dòng mang

plasmid pCR2.1

ITS-rADN

Điện di agarose Gen ITS-rADN

Giải trình tự gen ITS-rADN

Biến nạp ADN plasmid vào

E.coli

Cắt plasmid bằng enzym EcoRI

Tách chiết ADN plasmid

Gắn gen ITS-rADN vào plasmid pCR 2.1

2.4.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

● Nguyên tắc: Tế bào thực vật được nghiền vỡ trong điều kiện làm lạnh làm

cho ADN được hòa tan trong dung dịch SDS được thêm vào giúp ADN dễ hòa tan

hơn

Quy trình tách chiết ADN sử dụng bộ kit chiết tách ADN thực vật Plant Tissue (Solution Type) của hãng Solgen Co Ltd gồm các bước sau:

- Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng dụng cụ nghiền tissue lyser II

- Chuyển mẫu đã nghiền vào ống 1,5mL

- Thêm 300L dung dịch ly giải tế bào vào mẫu

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút

- Chuyển dịch trong sang ống 1,5 mL chứa 300L isopropanol 100%

- Lắc đảo 50 lần nữa

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút (các vi hạt ADN sẽ tạo thành và lắng xuống)

- Loại bỏ dịch nổi, làm khô ống bằng giấy thấm sạch

- Thêm 500L ethanol 80% và lắc đảo vài lần để rửa sạch hạt ADN

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút Đổ từ từ dịch ethanol, thu tủa

- Làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

- Thêm 40L ADN hydration solution vào tủa ADN

- Hydrat hóa ADN bằng cách ủ mẫu ở 650C trong 1h

- Bảo quản ADN ở -200C đến -800C [48]

2.4.2 Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR

 Nguyên tắc: Một đoạn gen có trình tự xác định được khuếch đại từ một

khuôn ADN dựa trên sự lai đặc hiệu của cặp mồi và ADN khuôn theo nguyên tắc

bổ sung và phản ứng kéo dài chuỗi nhờ enzym ADN polymerase Kết quả là tạo thành một số lượng lớn bản sao ADN sau một số chu trình nhiệt trong thời gian ngắn

 Tiến hành:

- Thành phần phản ứng PCR:

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR

Dung dịch đệm cho Taq polymerase (10X) 2,5

- Chu trình nhiệt của phản ứng:

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian

2.4.3 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose

 Nguyên tắc: Các đoạn ADN mang điện tích âm nên di chuyển trong điện

trường từ cực âm sang cực dương Trên bản gel agarose, các đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trong điện trường

Nhuộm ADN bằng ethidium bromid để quan sát ADN dưới đèn tử ngoại ở 254nm

 Tiến hành: Đặt bản gel agarose vào trong máy điện di có dung dịch đệm

TAE 1X, tra mẫu ADN cùng với chất chỉ thị xanh bromophenol vào giếng trên bản gel Chạy điện di ở điện thế 110V Sau đó nhuộm bản gel bằng ethidium bromid, rửa sạch bằng nước cất rồi quan sát dưới đèn tử ngoại 254nm

2.4.4 Phương pháp tách dòng

● Nguyên tắc: Tách dòng đoạn ADN ribosom ITS được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1, sử dụng bộ sinh phẩm tách dòng của hãng Invitrogen

Thành phần phản ứng trình bày trong bảng 2.5:

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng tạo vector tái tổ hợp

Dung dịch đệm của T4-ligase (10X) 1

Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào E.coli chủng TOP10F’ để cấy trải

trên môi trường LB có bổ sung ampicillin và X-gal, sau đó ủ 370C qua đêm Các

khuẩn lạc E.coli chứa vector tách dòng pCR 2.1 tái tổ hợp mang sản phẩm PCR

sẽ có màu trắng

14oC

24 giờ