Đánh giá mức độ kích thích miễn dịch của pidotimod việt nam sản xuất và dạng pha chế dùng uống trên động vật thí nghiệm

Các nghiên cứu trên động vật  Tác động lên đại thực bào Các thí nghiệm trên chuột bị ức chế miễn dịch chứng tỏ pidotimod có tác động tích cực lên chức năng của ĐTB khả năng hóa ứng độ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ KIM KHUYÊN

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD VIỆT NAM SẢN XUẤT VÀ DẠNG PHA CHẾ DÙNG UỐNG TRÊN ĐỘNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐẶNG THỊ KIM KHUYÊN

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH CỦA PIDOTIMOD VIỆT NAM SẢN XUẤT VÀ DẠNG PHA CHẾ DÙNG UỐNG TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ

NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH

MÃ SỐ: 60720408

Người hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Văn Rư PGS.TS Vũ Mạnh Hùng

HÀ NỘI, NĂM 2014

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới người

thầy: TS Nguyễn Văn Rư – GV Bộ môn Hóa Sinh – trường Đại học Dược

Hà Nội và PGS.TS Vũ Mạnh Hùng – Trưởng bộ môn duợc lý – Học viện

quân y đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô, các kỹ thuật viên – Bộ môn Hóa Sinh và bộ môn Dược Lực - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội – những người thầy đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập thạc sỹ tại trường Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành luận văn

Hà nội, ngày 20 tháng 07 năm 2014

Đặng Thị Kim Khuyên

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG: 5

DANH MỤC HÌNH: 5

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Một số nghiên cứu về Pidotimod 3

1.1.1 Cấu trúc hóa học của Pidotimod 3

1.1.2 Dược động học của Pidotimod 3

1.1.3 Tác dụng dược lý của pidotimod 4

1.1.4 Độc tính và tương tác thuốc 10

1.2 Tổng quan về sinh lý miễn dịch 11

1.2.1 Khái niệm về miễn dịch 11

1.2.2 Miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immunity) 11

1.2.3 Miễn dịch đặc hiệu (specific immunity) 12

1.2.4 Các cơ quan và tế bào tham gia quá trình ĐƯMD 12

1.2.5 Tổng quan về sinh lý bệnh suy giảm miễn dịch: 14

1.3 Chất kích thích miễn dịch và nguyên lý đánh giá tác dụng 16

1.3.1 Khái niệm 16

1.3.2 Cơ chế tác dụng của các chất KTMD 16

1.3.3 Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất KTMD 17 1.4 Các kỹ thuật đã được sử dụng để đánh giá tác dụng KTMD của Pidotimod 18

1.4.1 Tác động lên miễn dịch tế bào 18

1.4.2 Tác động trên quá trình miễn dịch dịch thể 22

1.4.3 Tác động trên các đại thực bào 24

1.4.4 Tác động không đặc hiệu trên hệ lưới nội mô: độ thanh thải keo mực Tàu 25

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị 27

2.2.1 Nguyên liệu 27

2.2.2 Thuốc và hóa chất 27

2.2.3 Thiết bị 27

2.3 Nội dung nghiên cứu 28

2.4 Thiết kế nghiên cứu 28

2.4.1 Chuẩn bị 28

2.4.2 Tiến hành thí nghiệm 30

2.4.3 Một số chỉ tiêu đánh giá trong thí nghiệm 31

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 33

3.1 Sự biến đổi khối lượng chuột 33

3.2 Ảnh hưởng của Pidotimod lên khối lượng lách tương đối 35

3.3 Ảnh hưởng của pidotimod lên khối lượng tuyến ức tương đối 37

3.4 Ảnh hưởng của pidotimod lên số lượng bạch cầu 39

3.5 Ảnh hưởng của Pidotimod lên chức năng của thực bào của lưới nội mô 41

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 45

4.1 Về lựa chọn mức liều và phương pháp thử nghiệm Pidotimod 45

4.2 Về kết quả nghiên cứu 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC………

RCT Nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng

DANH MỤC BẢNG:

DANH MỤC HÌNH:

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Y học hiện đại đang phải đối mặt với nguy cơ gia tăng cao của các

nhóm bệnh nguy hiểm như: HIV, ung thư, nhiễm khuẩn các vi khuẩn đề

kháng thuốc… Nguyên nhân của những bệnh này là hệ miễn dịch của người

bệnh bị suy giảm do các tác nhân môi trường, hóa chất, thuốc…

Từ cuối những năm 1990 nhiễm trùng đường hô hấp cấp (NTHHC)

được gọi là "đại dịch bị lãng quên, với một sự phân hóa rõ ràng giữa các nước

đang phát triển và các nước công nghiệp hóa về tỷ lệ tử vong và tỷ lệ mắc

bệnh liên quan đến NTHHC [7] Thực trạng này vẫn đúng trong hơn 20 năm

tiếp theo, khi sự ra đời của thuốc kháng sinh và vắc-xin mới góp phần kiểm

soát các dạng NTHHC đe dọa mạng sống nhất, nhưng không kiểm soát được

nhiều các dạng NTHHC do virus Virus là tác nhân chính chịu trách nhiệm về

NTHHC trong độ tuổi trẻ em Một cách tiếp cận tích cực trong việc ngăn chặn

và điều trị NTHHC là tăng cường miễn dịch không đặc hiệu và tăng cường cơ

chế phòng vệ bẩm sinh ở trẻ Các chất kích thích miễn dịch có nguồn gốc

thiên nhiên hoặc tổng hợp với cơ chế tác dụng khác nhau đã được giới thiệu ở

nhiều nước để ngăn chặn NTHHC ở trẻ Các chất kích thích miễn dịch đã

được tìm thấy và có nguồn gốc rất đa dạng như: interleukin (IL),

interferon (IFN), BCG, bronchovaxom, lentinan, levamisol imuthiol… Các

chất kích thích miễn dịch này đã được sử dụng và có hiệu quả rất khả quan

Pidotimod là một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu đã được

phát triển bởi hãng Poli Industria Chimica – Italia Đây là một phân tử

dipeptid có tác dụng kích thích miễn dịch và đã được sử dụng trong điều trị ở

2

nhiều nước trên thế giới như Mexico, Costa Rica, Nga, Italia, Georgia, Hy

lạp, Hàn Quốc, Trung Quốc… Một số biệt dược của Pidotimod được lưu hành

ở các nước phát triển như: Adimod, Imunorix, Onaka, Pigitil, Polimod…

Hiện nay các nghiên cứu về bào chế pidotimod trên thế giới đang tập trung

vào hướng làm tăng cường chất lượng và sinh khả dụng của các dạng thành

phẩm pidotimod [33], [42], [43], [32]

Trong thời gian gần đây Pidotimod đã được bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội nghiên cứu và tổng hợp thành công ở dạng bột nguyên

liệu thô Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá mức độ kích thích miễn

dịch của Pidotimod Việt Nam sản xuất và dạng pha chế dùng uống trên động vật thí nghiệm” nhằm đánh giá tác dụng kích thích miễn dịch của Pidotimod được tổng hợp ở Việt Nam với mục tiêu là:

1 Đánh giá được mức độ kích thích miễn dịch của Pidotimod dạng

nguyên liệu sản xuất ở Việt Nam

2 Đánh giá được hiệu quả kích thích miễn dịch của Pidotimod sản xuất

tại Việt Nam dưới dạng pha chế dung dịch uống

3

1.1 Một số nghiên cứu về Pidotimod

1.1.1 Cấu trúc hóa học của Pidotimod

 Danh pháp

- Tên theo danh pháp quốc tế: Pidotimod

- Tên khoa học: acid thiazolidine-4-carboxylic

(R)-3-[(S)-(5-oxo-2-pyrrolidinyl)carbonyl] Mã ATC: L03AX05 [21], [27], [48]

 Công thức hóa học

- Công thức phân tử: C9H12N2O4S

- Khối lượng phân tử: 244,26 g/mol

- Công thức cấu tạo: [21], [27]

 Tính chất lý hóa

- Bột tinh thể không mùi, màu trắng hoặc trắng ngà

- Điểm chảy 194oC–198oC, sự chảy kèm theo phân hủy nhanh chóng

- Năng suất quay cực [α]25

D: 150oC

- Độ tan của Pidotimod trong nước là 37,8 (g/l) [21]

1.1.2 Dược động học của Pidotimod

Trên động vật (chuột, chó): Pidotimod hấp thu nhanh qua đường uống,

tốc độ thải trừ nhanh (T1/2 = 1 giờ), thể tích phân bố lớn, thuốc phân bố nhanh vào các cơ quan chính, đặc biệt là gan và thận Sự bài tiết qua nước tiểu ở dạng không chuyển đổi là 75,6% sau tiêm tĩnh mạch và 31,1% sau uống Sinh

4

khả dụng của thuốc là 100% qua đường tiêm bắp và 27% qua đường uống [18]

Trên người: Thuốc hấp thu nhanh qua đường uống và sinh khả dụng là

40 – 44%, T1/2 = 4 giờ, không phụ thuộc liều và đường dùng [35], [7], thuốc không bị chuyển hóa và thải trừ hầu hết ở dạng chưa chuyển hóa ra ngoài nước tiểu, thể tích phân bố lớn (khoảng 30 lít) [35]

1.1.3 Tác dụng dược lý của pidotimod

Nhiều nghiên cứu trong ống nghiệm, trên động vật thí nghiệm và trên người trước đây cho thấy pidotimod có tác dụng dược lý trên hệ miễn dịch rất

rõ ràng, tác động trên nhiều tế bào, nhiều khâu của quá trình miễn dịch

1.1.3.1 Các nghiên cứu trên động vật

 Tác động lên đại thực bào

Các thí nghiệm trên chuột bị ức chế miễn dịch chứng tỏ pidotimod có tác động tích cực lên chức năng của ĐTB (khả năng hóa ứng động, khả năng sản xuất gốc độc, sản sinh các cytokin gây viêm) [17], [45], [47]

 Pidotimod làm tăng tính hóa ứng động của ĐTB

Prednisolon làm giảm khả năng hóa ứng động của các ĐTB xuống còn 1/4 so với nhóm chứng (không bị ức chế miễn dịch, p < 0,001), nhưng khi điều trị với pidotimod, khả năng hóa ứng động của ĐTB đã được tăng cường một cách rõ rệt và phục hồi gần như hoàn toàn so với nhóm chứng (kể cả đường uống và tiêm phúc mạc) [17], [47] Các nghiên cứu mới nhất chứng mình rõ rằng pidotimod làm tăng cường chức năng của ĐTB M2 [29]

 Pidotimod kích thích ĐTB tăng cường sản xuất các gốc độc

Khi sử dụng prednisolon gây suy giảm miễn dịch và ủ cùng các tác nhân thích hợp sẽ làm giảm đáng kể quá trình sản xuất các gốc độc của ĐTB (anion superoxid, p < 0,01; NO, p < 0,001) Và khi điều trị cùng với pidotimod thì sự

ức chế này gần như bị loại bỏ, đưa lượng NO, superoxid trở về mức ban đầu [17], [47]

5

 Pidotimod kích thích ĐTB sản sinh ra các cytokine gây viêm

Khi được hoạt hóa, các ĐTB cũng có thể tạo ra những cytokin gây viêm như TNF-α, IL-1 và IL-6 Nghiên cứu trên chuột bị ức chế miễn dịch bởi prednisolon và được kích thích bởi các yếu tố gây viêm như LPS, bào tử nấm

Aspergilus fumigatus sự sản sinh TNF-α thấp hơn đáng kể so với nhóm chứng

(không bị ức chế, p < 0,05) nhưng khi được điều trị bằng pidotimod thì lượng TNF-α được hồi phục và thậm trí còn tăng so với nhóm chứng (p < 0,001) [18], [47]

 Tác động lên tế bào D

Pidotimod tác dụng lên cả tế bào D trưởng thành, thông qua thụ thể HLA-DR, các phân tử CD83 và CD86 để kích thích tế bào D giải phóng các chất kháng viêm, thúc đẩy sự phát triển của tế bào T để tăng cường quá trình thực bào [9], [39], [40], [26]

 Tác động lên tế bào đuôi gai chuột

Khi phân tích những thay đổi của tế bào đuôi gai (DCs) gây ra bởi pidotimod (thymic peptide pidotimod - PTD) Những thay đổi trên tế bào đuôi gai ở cả hai loại tủy xương được đánh giá bằng các phương pháp: sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM), phương pháp đo dòng tế bào (FCM), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), sinh học, khảo nghiệm và phương pháp miễn dịch ELISA Kết quả cho thấy PTD có khả năng tạo ra DC phynotypic trưởng thành được minh chứng bằng biểu hiện của các phân tử bề mặt quan trọng như MHC II, CD80 và CD86 Ngoài ra, các xét nghiệm chức năng đã chứng minh sự ức chế tuyến yên của ACP trong DCs, khi thực bào xảy ra thì các DCs giảm, đồng thời với kháng nguyên thì thể hiện theo xu hướng gia tăng lên Do đó kết quả cuối cùng cho thấy PTD kích thích sản xuất các cytokin nhiều hơn [49]

 Tác động lên tế bào NK

Nghiên cứu trên tế bào NK lách chuột ở các tuần tuổi khác nhau (10 tuần

và 30 tuần) được ủ với tế bào YAC-1 có gắn đồng vị phóng xạ 51Cr cho thấy,

6

pidotimod liều cao (200mg/kg) tăng cường hoạt động của tế bào NK (không phân biệt so với chứng), liều thấp hơn thay đổi không đáng kể, thậm chí còn gây ức chế (liều 50 mg/kg) Kết quả này cho thấy pidotimod có khả năng điều biến hoạt động của NK [41]

 Tác động lên tế bào lympho

- Trên miễn dịch qua trung gian tế bào: Nghiên cứu các phản ứng tạo

hoa hồng với hồng cầu cừu, phản ứng tăng sinh đáp ứng với các mitogen (Con – A, LPS), phản ứng quá mẫn muộn với DNCB hay phản ứng chống thải ghép ở chuột bị gây suy giảm miễn dịch và được điều trị bằng pidotimod đều tăng lên có ý nghĩa thống kê so với nhóm không được điều trị Các kết quả đều thể hiện pidotimod có khả năng phục hồi các chức năng của hệ miễn

dịch qua trung gian tế bào trở về mức bình thường [17], [45]

- Trên miễn dịch dịch thể: Đánh giá ĐƯMD dịch thể của pidotimod,

người ta sử dụng hai phản ứng với hai kháng nguyên khác nhau (LPS – đối với miễn dịch thể không phụ thuộc tuyến ức; hồng cầu cừu 3% - đối với miễn dịch dịch thể phụ thuộc tuyến ức) trên chuột đã có ĐƯMD với các kháng nguyên này để đo hiệu giá kháng thể Dựa vào các kết quả này, có thể nói rằng, pidotimod có tác dụng làm tăng cường ĐƯMD với các kháng nguyên

này, đưa hiệu giá kháng thể trở về mức bình thường [17], [45]

 Tác dụng chống lại vi sinh vật

ĐƯMD chống vi sinh vật là chức năng quan trọng và cần thiết để bảo vệ

cơ thể chống lại các vi sinh vật gây bệnh Các nghiên cứu trên chuột cho thấy, pidotimod có tác dụng bảo vệ, làm tăng tỷ lệ sống của con vật trước tình trạng nhiễm vi khuẩn hoặc virus

khuẩn của pidotimod, đã có nhiều mô hình thực nghiệm khác nhau được thiết lập Trong đó có 5 mô hình nhằm: xác định liệu trình điều trị với pidotimod cho hiệu quả thấp nhất; đánh giá hiệu lực tác dụng của thuốc trên nhiều chủng

7

vi khuẩn; so sánh hiệu lực của pidotimod với những thuốc được chọn làm chuẩn; đánh giá tác dụng của thuốc trên chuột bị gây ức chế miễn dịch; nghiên cứu hiệu lực của thuốc khi kết hợp với các kháng sinh β-lactam [19] Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng, dù cho không có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng candida ở điều kiện in vitro, nhưng pidotimod thực sự có khả năng kích thích cơ chế miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể với hiệu quả cao, tác dụng của pidotimod là rõ rệt và có ý nghĩa thống kê cao sau 5 lần sử dụng trước tình trạng nhiễm khuẩn Pidotimod chống lại sự lây nhiễm của nhiều chủng vi khuẩn với mức liều 0,01 – 100 mg/kg i.p × 5 lần Pidotimod

có tác dụng tương đương hoặc tốt hơn so với các thuốc chuẩn so sánh như bestatin, N-acetylmuramyl-L-Ala-D-iso-Glu-OH và tuftsin; thể hiện rõ tác dụng bảo vệ trên chuột đã được gây ức chế miễn dịch, cũng như giúp tăng cường tác dụng kháng khuẩn in vivo của các kháng sinh cefotaxim và ampicillin, theo hướng hỗ trợ hoặc hiệp đồng (kháng sinh diệt vi khuẩn trực tiếp và pidotimod tác động lên hệ miễn dịch làm tăng khả năng tiêu diệt vi khuẩn của cơ thể) [19], [45], [38], [23]

và 2 mức liều (virus) gây nhiễm khác nhau: virus viêm màng não (Mengovirus), virus Herpes simplex (HSV), và virus cúm A chủng PR – 8 Pidotimod được dùng 15 ngày trước khi gây nhiễm và trong suốt quá trình chuột bị nhiễm virus cho tới khi chết Tác dụng của thuốc thể hiện ở tỷ lệ sống sót khác nhau giữa lô chỉ nhiễm virus (lô chứng) và lô nhiễm virus nhưng được điều trị bằng pidotimod (lô thử) Thời gian mà một nửa số chuột

bị chết ở lô chứng và lô thử: Với Mengovirus tương ứng là 3 và 5,5 ngày; với HSV tương ứng là 3 và 5 ngày; với virus cúm A PR – 8 là 3 và 6,5 ngày Thời gian mà tất cả chuột chết ở lô chứng là 7 ngày còn ở lô thử là 8 ngày [24] Pidotimod không phải là thuốc chống virus đặc hiệu Các dữ liệu nghiên cứu toàn cầu chỉ ra rằng, tác dụng của pidotimod không phụ thuộc vào loại

8

virus và không liên quan chặt chẽ đến cơ chế nhân lên của mỗi loại virus [24], [45]

 Tác dụng chống ký sinh trùng

Các nghiên cứu của pidotimod trên các vật chủ nhiễm ký sinh trùng được tập

trung vào chủng Toxoplasma gondii là một loài sinh vật đơn bào ký sinh lây lan qua đường thức ăn và Toxoplasma gondii gây ra bệnh lý Toxoplasmosis,

là một bệnh lý có tỷ lệ người mắc cao nhưng chỉ đặc biệt nguy hiểm ở các bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch Kết quả thử nghiệm cho thấy pidotimod có

tác dụng đáng kể giúp vật chủ hạn chế được tác động của Toxoplasma gondii

và kéo dài thời gian sống của chuột nhiễm bệnh [30], [50]

Trên hệ tiết niệu

Các thông số về thể tích nước tiểu và nồng độ ion niệu không có sự sai khác với bình thường ở chuột được cho dùng pidotimod liều 100 và 200 mg/kg i.p và 200 mg/kg p.o Duy chỉ có ở liều 400 mg/kg p.o nồng độ ion Na+

và K+ có tăng hơn so với trị số bình thường [37]

Các khảo sát khác

Pidotimod không có tác dụng chống viêm, không gây hạ glucose máu, không gây tê tại chỗ, không ảnh hưởng tới kết tập tiểu cầu hay sự đáp ứng của ruột cô lập thử với histamin, acetylcholin và BaCl2 [37]

9

1.1.3.2 Các nghiên cứu trên người

Các nghiên cứu trên người nhằm mục đích: Xác nhận các kết quả thu được ở động vật và kiểm tra các tác động trên hệ miễn dịch của pidotimod với đối với các quần thể bệnh nhân có tình trạng suy giảm miễn dịch khác nhau

- Nghiên cứu trên các bệnh nhân bị ung thư, và bệnh nhân bị khối u (mới và di căn) cho thấy bổ sung Pidotimod làm tăng đáp ứng với các mitogen (con – A, PHA) và sự tăng tiết IL – 2 của các tế bào đơn nhân vùng ngoại vi và của các tế bào lympho T ở nhóm bệnh nhân này

- Nghiên cứu trên nhóm bệnh nhân lớn tuổi (đặc trưng là suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào): Pidotimod kích thích ĐTB phúc mạc tăng tiết cytokine IFN-γ và giảm tiết IL-6 so với trước khi sử dụng và so với nhóm chứng sử dụng giả dược Pidotimod cũng kích thích tế bào lympho T tăng tiết IL-2 và tăng đáp ứng với PHA đáng kể so với nhóm giả dược [45]

- Trên đối tượng là trẻ em bị nhiễm trùng đường hô hấp, pidotimod làm giảm đáng kể tất cả các thông số thời gian sốt, điều trị kháng sinh, tỷ lệ tái phát [41] Nghiên cứu RCT trên 120 bệnh nhân nhi bị nhiễm trùng hô hấp tái phát cho thấy, pidotimod đã làm giảm 35% nguy cơ tái phát, giảm thời gian nhập viện (86%) và giảm điều trị kháng sinh (47%); p < 0,01 Nếu tái phát có xảy ra ở những bệnh nhân này, các triệu chứng của bệnh nhân cũng giảm nhanh hơn[13]

- Các nghiên cứu của tác giả Carta và cộng sự chỉ ra rằng Pidotimod có tác dụng In vitro trong viêc tăng cường khả năng của vật chủ để chống lại NTHHC[14], [8]

+ Thông qua các tác dụng khác nhau trên các enzyme ở bề mặt tế bào (extracellular-signal-regulated kinase-ERK1/2) và các yếu tố kappa trên nhân (nuclear factor-kappa B; NF-kB), Pidotimod làm tăng cường sự biểu hiện của các receptor toll-like 2 protein (là một loại receptor có tác dụng khởi đầu kích thích các phản ứng chống truyền nhiễm)

10

+ Pidotimod có liên quan tới sự giảm xuống các phân tử kết dính gian bào (ICAM)-1 của virus cúm, sự giải phóng Interleukin (IL)-8 và các yếu tố hóa hướng động mạnh cho bạch cầu trung tính Các hiện tượng này cơ chế để chống lại sự truyền nhiễm

+ Tác giả Carta và cộng sự kết luận rằng Pidotimod dường như điều chỉnh chức năng của các tế bào biểu mô hô hấp giúp giảm sự lây nhiễm virus

- Nghiên cứu RCT trên 60 bệnh nhân nhi bị nhiễm trùng tiết niệu tái phát cho thấy, so với giả dược, những bệnh nhân sử dụng pidotimod có thời gian phục hồi nhanh hơn (9,6 so với 12,3 ngày); thời gian điều trị kháng sinh ngắn hơn (6,9 so với 8,3 ngày); và một số triệu chứng chính (sốt, bí tiểu, tiểu nhiều lần, tiểu ra máu…) giảm nhanh hơn [16]

- Trên bệnh nhân bị viêm amidal cấp tính: Pidotimod làm giảm đáng

kể tần số các bệnh nhiễm trùng cũng như cải thiện các dấu hiệu lâm sàng (ho, khó nuốt) và thời gian điều trị kháng sinh

- Trên nhóm bệnh nhân Down bị nhiễm trùng đường hô hấp: pidotimod làm giảm đáng kể tần số, mức độ nghiêm trọng và thời gian truyền nhiễm so với nhóm chứng không được điều trị [45], [51]

1.1.4 Độc tính và tương tác thuốc

Tương tác thuốc: Pidotimod không làm thay đổi nồng độ và tác dụng

của các thuốc dùng cùng Pidotimod khá an toàn khi điều trị cùng với các thuốc khác [37]

Độc tính: Nghiên cứu độc tính của Pidotimod trên chuột nhắt, chuột

cống, chó, cho thấy pidotimod khá an toàn, độc tính thấp

- Độc tính cấp thể hiện ở liều rất cao: Đối với cả 2 loại chuột: > 8000 mg/kg (p.o và i.p.), > 4000 mg/kg (i.v và i.m) Ở chó, liều độc > 4000 mg/kg (p.o.), > 2000 mg/kg (i.v và i.m)

- Độc tính mạn: theo dõi ở chuột trong vòng 4 tháng (với i.v.) và 12 tháng (với p.o.), pidotimod không thể hiện độc tính ở liều 200 mg/kg (i.v.) và liều 800 mg/kg (p.o.), liều này cao gấp 32,5 lần liều sử dụng trên lâm sàng

11

Tương tự, theo dõi độc tính trên chó 26 tuần với tiêm bắp và 52 tuần với đường uống, pidotimod không gây độc ở liều 300 mg/kg (i.m.) và liều 600 mg/kg (p.o.), các liều này cao hơn liều sử dụng trên lâm sàng lần lượt là 48,8

- Chỉ số điều trị ở chuột dao động trong khoảng 40 – 80 [20]

Như vậy, các khảo sát cho thấy pidotimod khá an toàn, ngoài tác dụng

trên hệ thống miễn dịch thì sự tác động tới các hoạt động chức năng khác là không có hoặc không rõ ràng Tính đơn nhất trong tác động của Pidotimod (chỉ trên hệ miễn dịch) là một thuộc tính có lợi trong điều trị, do đó hạn chế được những tác dụng phụ không mong muốn [12]

1.2 Tổng quan về sinh lý miễn dịch

1.2.1 Khái niệm về miễn dịch

Miễn dịch (immunity) là khả năng của cơ thể nhận biết, đáp ứng và loại

bỏ các yếu tố lạ gây hại

Khi bị yếu tố gây bệnh (kháng nguyên) xâm nhập, trước tiên cơ thể vận hành ngay một số tế bào và phân tử sẵn có để kịp thời ngăn chặn, xử lý, sau

đó tạo ra các tế bào và phân tử đặc hiệu tương ứng với từng loại kháng nguyên khác nhau để loại trừ chúng

Phân loại ĐƯMD: gồm 2 loại

- ĐƯMD tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu)

- ĐƯMD thu được (miễn dịch đặc hiệu) [3], [6]

1.2.2 Miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immunity)

12

Được hình thành trong quá trình tiến hóa của của động vật để chống lại

sự xâm nhập, gây nhiễm của các vi sinh vật gây bệnh Miễn dịch không đặc hiệu không để lại trí nhớ, khá ổn định và ít bị sai sót

Các mô, tế bào, phân tử tham gia vào ĐƯMD không đặc hiệu:

- Da và niêm mạc: là hàng rào đầu tiên ngăn cản sự xâm nhập của các vi

sinh vật gây hại

 Protein phản ứng C (CRP: C-reactive protein)

 Interferon (IFN): Có hoạt tính không đặc hiệu chống lại các virus [6]

1.2.3 Miễn dịch đặc hiệu (specific immunity)

Là trạng thái miễn dịch xuất hiện do kháng thể đặc hiệu tương ứng với từng kháng nguyên được tạo ra sau khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên (ngẫu nhiên hoặc chủ động) Miễn dịch đặc hiệu có khả năng nhận dạng được hầu hết kháng nguyên và để lại trí nhớ miễn dịch

Miễn dịch đặc hiệu gồm miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào với sự đảm nhiệm của các tế bào lympho B và lympho T [6]

1.2.4 Các cơ quan và tế bào tham gia quá trình ĐƯMD

1.2.4.1 Cơ quan lympho trung ương

13

Là nơi sinh sản và biệt hóa tế bào lympho đến trưởng thành, đủ khả năng xử lý kháng nguyên

Tủy xương: Là cơ quan trung ương của mọi tế bào máu, nhạy cảm với

tia xạ và các thuốc chống phân bào

Tuyến ức: Đảm nhiệm chức năng huấn luyện, phân chia, biệt hóa, các tế

bào lympho T là nhờ một số yếu tố hòa tan (thymulin, thymosin α1, …) [6]

1.2.4.2 Cơ quan lymopho ngoại vi

Là nơi tế bào lympho trú ngụ và biệt hóa dưới tác động của kháng nguyên

Hạch lympho: Được coi như một cái lọc đối với các phân tử lạ ngoại

lai và các mảnh vụn từ mô hoại tử, là trung tâm của sự tuần hoàn các tế bào lympho, nơi tế bào tiếp xúc với kháng nguyên

Lách: có nhiệm vụ lọc và dự trữ máu cho cơ thể, ngoài ra còn là nơi

tập trung kháng của kháng nguyên vào cơ thể bằng đường máu

Các mô lympho không có vỏ bọc: Nằm rải rác ở niêm mạc đường tiêu

hóa, hô hấp, tiết niệu,… [6]

1.2.4.3 Các tế bào tham gia quá trình ĐƯMD

Lympho bào: chiếm khoảng 20 - 30 % tổng số bạch cầu trong máu, có

vai trò chủ chốt trong miễn dịch đặc hiệu Khi kháng nguyên xâm nhập vào

cơ thể, sẽ gặp phải hàng loạt cơ chế bảo vệ tự nhiên không đặc hiệu nhằm tiêu diệt hoặc loại trừ chúng ra khỏi cơ thể Nếu kháng nguyên vượt qua được hàng rào này, và có đủ thời gian, chúng sẽ gặp phải các chất bảo vệ đặc hiệu trong ĐƯMD đặc hiệu ĐƯMD đặc hiệu xuất hiện sẽ làm ĐƯMD tự nhiên được tăng cường [6]

Tế bào diệt tự nhiên NK (natural killer): Là một tiểu quần thể tế bào

giống lympho, có khả năng diệt một số tế bào đích: Tế bào u, tế bào vật chủ nhiễm virus Chức năng quan trọng của NK là kiểm soát miễn dịch, ngăn chặn

sự di cư của tế bào u qua máu, bảo vệ cơ thể chống lại sự nhiễm virus Các tế

14

bào NK có thể hạn chế hoặc làm trầm trọng hơn các phản ứng miễn dịch [5], [41], [48]

Tế bào thực bào đơn nhân (monocyte): đóng vai trò phòng thủ do khả

năng thực bào các loại ký sinh trùng và vi khuẩn Các ĐTB còn có vai trò quan trọng trong sự khởi động quá trình miễn dịch đặc hiệu, chúng cần thiết cho việc hoạt hóa các tế bào lympho T và lympho B trước sự xâm nhập của các kháng nguyên ngoại lai Bên cạnh đó, ĐTB còn tiết ra các chất cytokin như IL-1, IL-6, TNF-α khởi phát quá trình viêm không đặc hiệu [5], [16], [25], [27], [45]

Các tế bào máu khác: Bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ái kiềm và

dưỡng bào (mastocyte), Bạch cầu ái toan đều có vai trò quan trọng trong ĐƯMD của cơ thể với kháng nguyên

1.2.5 Tổng quan về sinh lý bệnh suy giảm miễn dịch:

Suy giảm miễn dịch là tình trạng của cơ thể sống trong đó hệ thống miễn dịch hoạt động yếu, không đáp ứng được với yêu cầu của cuộc sống bình thường, dẫn đến không chống lại được với các vi sinh vật gây bệnh

mà hậu quả là cơ thể bị nhiễm trùng nặng đi đến tử vong hay nói cách khác là sinh ra rất ít kháng thể đặc hiệu trong khi cơ thể khác lại sinh miễn dịch khi đặt trong cùng điều kiện

Suy giảm miễn dịch được chia làm hai loại:

Suy giảm miễn dịch bẩm sinh

Suy giảm miễn dịch bẩm sinh hay tiên phát là do những bất thường mang tính di truyền, tạo ra những khuyết tật trong hệ thống miễn dịch, có thể là:

+ Suy giảm miễn dịch ngay từ tế bào gốc chung cho cả hai dòng lympho bào B và T

+ Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng T: Có 2 trường hợp: Suy giảm nặng dòng T do sự suy giảm hoạt động của tuyến ức làm cho dòng lympho

15

bào T không trưởng thành và biệt hoá được, do đó không có miễn dịch qua trung gian tế bào Hiện tượng này gọi là hội chứng George Trường hợp thứ hai là rối loạn quá trình hoạt hoá của lympho bào T trưởng thành

+ Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng B: Có thể là do tổn thương tuỷ xương mà không có biệt hoá dòng lympho bào B hoặc có thể có sai sót trong quá trình hoạt hoá của lympho bào B trưởng thành dẫn đến rối loạn

sự tổng hợp các kháng thể dịch thể

+ Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng các tế bào thực bào và sản xuất

bổ thể gây giảm tế bào thực bào và thiếu hụt bổ thể

Suy giảm miễn dịch mắc phải

Suy giảm miễn dịch mắc phải là một trạng thái bệnh lý rất hay gặp, là một hiện tượng thứ phát sau nhiều bệnh Nhất là các bệnh gây suy dinh dưỡng, nhiễm độc, ảnh hưởng của một số thuốc gây ức chế miễn dịch và

do kết quả của các bệnh truyền nhiễm như ở người là nhiễm virus HIV - Một bệnh nan y của thời đại

• Suy giảm miễn dịch thứ phát do suy dinh dưỡng

Người ta đã thấy rõ rằng khi cơ thể bị suy dinh dưỡng sẽ xuất hiện trạng thái suy giảm miễn dịch cả không đặc hiệu lẫn đặc hiệu mà cơ chế bệnh sinh ra là do thiếu nguyên liệu trong sinh tổng hợp các chất, đặc biệt

là thiếu đạm

• Suy giảm miễn dịch thứ phát do nhiễm trùng

Trong tất cả các trường hợp nhiễm khuẩn (virus, vi khuẩn, nấm hay

ký sinh trùng) Nếu kéo dài sẽ gây suy dinh dưỡng dẫn đến suy giảm miễn dịch Nhiễm virus dẫn đến rối loạn đáp ứng miễn dịch và làm suy giảm miễn dịch dễ dẫn đến các bội nhiễm các bệnh khác

Nhiễm khuẩn mãn tính, đặc biệt là nhiễm vi khuẩn nội bào như bệnh hủi, lao thì bao giờ cũng gây ra suy giảm miễn dịch tế bào

16

Ở người, trong căn bệnh thế kỷ AIDS do nhiễm bởi loại Retrovirus HIV-I và HIV-II, chúng có ái tính đặc biệt với phân tử CD4 và Receptor với một số chemokin có trên các tế bào có thẩm quyền miễn dịch mà chủ yếu là các lympho bào Th và đại thực bào Virus làm ly giải các tế bào

TCD4 hoặc bất hoạt chúng, số lượng tế bào TCD4 suy giảm trầm trọng ở người nhiễm HIV (bình thường tỷ lệ TCD4/TCD8 là 2/1, khi nhiễm HIV thì

có thể chỉ là 0,5/1)

Từ giảm sút Th dẫn đến suy giảm miễn dịch trầm trọng

• Suy giảm miễn dịch thứ phát do một số bệnh khác

Các bệnh ác tính như ung thư, bệnh máu ác tính và các bệnh về thận như suy thận, thận nhiễm mỡ đều dẫn đến suy giảm miễn dịch

Ngoài ra ở các cơ thể già, do có những thay đổi trong hoạt động miễn dịch, người ta thấy có những suy giảm miễn dịch rõ rệt, do đó ở người già thường thấy tăng khả năng nhiễm khuẩn, hay bị ung thư, mắc bệnh tự miễn (thấp khớp) , chính là do sự suy giảm miễn dịch

Như vậy, ĐƯMD là một quá trình phức tạp xảy ra khi có sự tiếp xúc của

kháng nguyên ngoại lai và hệ miễn dịch Điều hòa hoạt động của hệ miễn dịch, giữ cân bằng nội môi cần có sự tham gia và phối hợp của nhiều cơ quan,

tổ chức và tế bào sẽ giúp cho cơ thể chống lại các kháng khuyên gây bệnh

1.3 Chất kích thích miễn dịch và nguyên lý đánh giá tác dụng

1.3.1 Khái niệm

Các chất KTMD là những chất đưa vào cơ thể nhằm biến đổi khả năng của các tế bào đáp ứng với kháng nguyên hoặc làm thay đổi sự tương tác giữa các tế bào hay giữa các chất trung gian cần thiết cho sự tạo nên

một ĐƯMD [3], [5]

1.3.2 Cơ chế tác dụng của các chất KTMD

Chủ yếu theo 2 cơ chế:

1.3.3 Nguyên lý một số thử nghiệm đánh giá tác dụng của chất KTMD

Chất KTMD tác động vào nhiều khâu trong quá trình miễn dịch Vì vậy, các kỹ thuật đánh giá tác dụng của các chất KTMD rất đa dạng và có thể thực hiện theo các khâu chính sau đây:

Khâu xử lý kháng nguyên thông qua hoạt động của ĐTB:

- Kỹ thuật ức chế di tản ĐTB

- Kỹ thuật điện di ĐTB

- Kỹ thuật ức chế dính bạch cầu

- Kỹ thuật ức chế trải giăng bạch cầu

- Đo hoạt tính thực bào và đánh giá khả năng tiêu hóa nội tế bào của ĐTB

Có thể đánh giá chức năng của ĐTB trong giai đoạn cảm ứng miễn dịch bằng cách xác định tỷ lệ % các ĐTB có ăn kháng nguyên và số lượng kháng nguyên bị vây bắt ở mỗi ĐTB (chỉ số thực bào) [3]

Khâu hiệu ứng của đáp ứng miễn dịch: Lympho bào T

- Thử nghiệm chuyển dạng lympho bào: dựa vào đặc tính của lympho T, khi có mặt của kháng nguyên đặc hiệu, các lympho bào mẫn

Khâu đáp ứng miễn dịch của lympho bào B và kháng thể Ig

- Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch

- Kỹ thuật tạo hoa hồng EAC: Dùng để phát hiện lympho B mang thụ thể dành cho bổ thể, sử dụng hồng cầu cừu E được bao phủ bởi hémolysin – kháng thể IgM (A) và bổ thể (C) thành phức hợp EAC

- Kỹ thuật Jerne: Phát hiện lympho bào B tiết kháng thể Thực hiện trên môi trường thạch hoặc môi trường lỏng, dựa trên nguyên lý tạo quầng dung huyết khi cho tế bào lympho tiếp xúc với hồng cầu cừu đồng thời với

sự có mặt của bổ thể

- Đánh giá tương đối lượng kháng thể bằng cách xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh dựa trên phản ứng ngưng kết hồng cầu [3]

Như vậy, đối với một chất KTMD, có khá nhiều phương pháp để

đánh giá tác dụng trên hệ miễn dịch Tùy vào điều kiện thực tế cũng như đối tượng, mục tiêu cần đánh giá để lựa chọn phương pháp tối ưu mang lại hiệu quả cao

1.4 Các kỹ thuật đã được sử dụng để đánh giá tác dụng KTMD của Pidotimod

1.4.1 Tác động lên miễn dịch tế bào

 Tế bào bạch huyết của chuột với hồng cầu của cừu

19

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Wilson [17] Cá thể chuột (khoảng 25g) được chia thành 8 nhóm, mỗi nhóm 10 cá thể Chúng được trị liệu trong 7 ngày với pidotimod 2 lần mỗi ngày (100-200mg/kg tiêm qua đường bụng, 220-400 mg/kg qua đường uống) và vào ngày thứ 2, thứ 3 của liệu trình với loại corticosteroid tổng hợp (5mg/kg tiêm dưới da) Nhóm kiểm soát (mỗi một liệu trình gồm một nhóm loại này) chỉ nhận được nước muối và steroid với kế hoạch tương tự

Vào ngày thứ 4, các cá thể chuột được miễn dịch bởi việc tiêm qua phúc mạc 5 x 108 hồng cầu của cừu trong dung dịch nước muối làm dung dịch đệm (PBS) Những tế bào này được chuẩn bị bằng việc ly tâm (500g trong 15 phút) máu cừu có chứa một loại muối của axit citric, hồng cầu đã kết tủa sau đó được rửa sạch 2 lần trong dung dịch PBS và lại được tiến hành ly tâm (350g trong 10 phút) để loại bỏ lớp bên ngoài, ngưng tụ lại trong dung dịch PBS và trở thành nồng độ 2,5 x 109 tế bào/ml

Các cá thể chuột bị giết chết bằng lấy lá lách Mô này được đặt vào trong 1ml dung dịch Hank lạnh, thái nhỏ, được đồng tính hoá và được lọc qua gạc thấm Chất đồng chất này được rửa sạch 2 lần trong dung dịch Hank, được tiến hành li tâm (350g trong 10 phút) và được ngưng tụ lại Sự ngưng tụ này được xem là 6 x 107 tế bào/ml và được đếm bằng máy đếm Coulter sau khi làm cho dung giải hồng cầu 100µl chất ngưng tụ này được thêm vào với 100µl ngưng tụ hồng cầu cừu (3 x 108 tế bào/ml) được trộn lẫn trong 0,8 ml dung dịch Hank và được khuấy nhẹ nhàng trong 1 phút Tất cả mẫu đã được chuẩn bị được ủ ở nhiệt độ 40C trong 24 giờ và sau đó lại được khuấy nhẹ nhàng, các tế bào có hình hoa thị của chất ngưng tự này được đếm bằng kính hiển vi trong một buồng ngăn Burker

 Tế bào bạch huyết T- và B- qua phản ứng tăng sinh với chất gây giãn phân

20

Những thí nghiệm được tiến hành trên 4 nhóm, mỗi nhóm gồm 9 cá thể chuột Theo phương pháp của Severison [45], các cá thể chuột (loại 18-20 g) được trị liệu 2 lần/ngày trong 6 ngày với 100 mg/kg chất pidotimod tiêm qua phúc mạc hoặc 200 mg/kg tiêm dưới da và bị làm suy giảm khả năng miễn dịch bằng chất cyclophosphamide (40 mg/kg tiêm qua đường bụng) vào ngày thứ 5 của liệu trình Các mẫu kiểm soát chỉ nhận được dung dịch nước muối thay vì pidotimod và cyclophosphamide (mẫu âm tính) hoặc dung dịch nước muối và cyclophosphamide (mẫu “trắng”)

Vào ngày thứ 7, lá lách bị lấy đi và thái nhỏ để có được chất ngưng tụ

tế bào lách Các tế bào được rửa sạch 2 lần trong môi trường dung dịch RPMI

1640 trung tính trộn với 10% huyết thanh bào thai dê đã bị khử hoạt tính ở nhiệt độ 560C trong 30 phút, 3 x 10-5 mol/l chất 2-mercaptoethanol, 25 mmol/l dung dịch đệm HEPES, 2mmol/l 2-glutamine, 100U/ml penicilin và

100 µg/ml streptomycin

Các tế bào có thể sống được được đếm bằng việc loại trừ Trypan, được ngưng tụ ở mức 106 tế bào/ml và được đặt vào mật độ chất giãn phân phù hợp Mẫu nhân ba lên được chuẩn bị cho mỗi sự ngưng tụ tế bào Sau 48 giờ ủ

ở nhiệt độ 370C trong không khí ẩm với 5% CO2, 1 µCi 3H-TdR được hoà tan trong dung dịch RPMI 1640 được thêm vào 8 giờ sau, các tế bào được kết tủa lại bởi 5% axit tricloroacetic và được lọc, tính phóng xạ được đo bằng một quang phổ kế bức xạ lỏng – được chuẩn bị để đếm triti (đồng vị phóng xạ của hyđro) Để kích thích sự sinh sôi nhanh của tế bào bạch huyết Concanavalin

A (Con-A, 6 µg/ml) và trong một thí nghiệm riêng biệt, lipopolysaccharide (LPS, 30 µg/ml) đã được sử dụng Một thí nghiệm được tiến hành mà không

có sự tạo phôi dâu kích thích

 Phản ứng quá mẫn chậm với dinitrochlorobenzene (DNCB)[37]

Theo Corsini các cá thể chuột được làm cho nhạy cảm với DNCB (25µl trong một dung dịch 20mg/ml trong axêtôn) được tiêm vào da bụng 24 nhóm cá thể

21

chuột, mỗi nhóm 10 cá thể (khoảng 30g) được sử dụng Pidotimod được tiêm vào bằng đường bụng (100-200 mg/kg) hoặc bằng cách đưa vào dạ dày bằng ống (200-400mg/kg) 2 lần/ngày trong suốt 2 ngày trước khi xảy ra sự nhạy cảm đối với DNCB, ngày nhạy cảm và 2 lần/ngày với chất là suy giảm miễn dịch (loại corticosteroid tổng hợp 0,50 mg/kg tiêm dưới da) từ ngày thứ 10 trở

đi, sau ngày trở nên nhạy cảm cho tới ngày chết Nhóm kiểm soát chỉ nhận dung dịch nước muối (thay vì pidotimod) và loại corticosteroid tổng hợp Vào ngày thứ 12, các cá thể chuột nhận được sự trị liệu liên quan đến da (tai) chất DNCB (5 µl dung dịch axêtôn loại 10mg/ml); 6, 24 và 48 giờ sau khi nhận được sự trị liệu này, các cá thể chuột bị giết chết và tại của chúng bị cắt và đem lên cân khối lượng Các giá trị được thể hiện khi trị liệu: tỷ lệ khối lượng tai không được trị liệu

 Phản ứng mảnh ghép chống lại ký chủ (GvH) với các cá thể chuột bị suy giảm khả năng miễn dịch đóng vai trò như những cá thể cho

Các cá thể chuột C57BL/6 được sử dụng như những “cá thể cho” trong thí nghiệm Abuaf và các cá thể chuột BDFI (C57BL/6 x DBA/2) là “cá thể nhận”

Cá thể cho được trị liệu 2 lần/ngày trong 8 ngày với dung dịch nước muối hoặc pidotimod (100 mg/kg tiêm qua đường bụng hoặc 200mg/kg qua đường uống) và sau đó bị làm cho suy giảm khả năng miễn dịch với cyclophosphamide loại 100mg/kg tiêm qua đường bụng 48 giờ trước khi hy sinh

Vào ngày thứ 9, lá lách của cá thể cho bị đâm để có được sự ngưng tụ

tế bào Các tế bào được rửa sạch 2 lần trong dung môi RPMI 1640 trung tính cùng với 2-glutamine (0,03%), penicilin (100U/ml) và streptomycin (100µg/ml) và được đếm sau khi biến sang màu xanh Trypan Chất ngưng tụ

từ mỗi cá thể cho được tiêm bằng cách truyền qua tĩnh mạch vào một cá thể chuột nhận, một sự ngưng tụ tế bào lá lách từ cùng một BDFI được tiêm vào

22

một nhóm kiểm soát 9 ngày sau đó, các cá thể nhận hy sinh và phản ứng miễn dịch mà tại đó sự ngưng tụ các tế bào lá lách của các cá thể cho được ước lượng với mỗi cá thể nhận như là “chỉ số tế bào lá lách” (SI) như sau:

SI = (khối lượng lá lách/khối lượng cơ thể chuột được sử dụng)/(khối lượng lá lách/khối lượng cơ thể chuột kiểm soát)

1.4.2 Tác động trên quá trình miễn dịch dịch thể

 Đáp ứng của kháng thể với một kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức

Cá thể chuột (nặng khoảng 25g) được sử dụng thuốc theo phương pháp Poli et al Các cá thể chuột được chia thành 5 nhóm, mỗi nhóm 16 cá thể: nhóm cá thể thường, nhóm chứng được miễn dịch (không bị ức chế miễn dịch), nhóm được miễn dịch + dùng cyclophosphamide, nhóm được miễn dịch + dùng cyclophosphamide + dùng pidotimod với liều 100mg/kg thể trọng đường tiêm màng bụng hoặc 200mg/kg đường uống

Vào ngày 0, các cá thể chuột được tiêm màng bụng 0,2 ml hồng cầu cừu 3% trong PBS nhằm mục đích gây miễn dịch Xét nghiệm được tiến hành vào ngày thứ 21 với cùng một lượng hồng cầu

Chuột được cho sử dụng pidotimod 1lần/ngày trong ba ngày trước khi được gây miễn dịch, và tiếp tục cho đến ngày thứ 40 sau đó Các cá thể chuột được gây ức chế miễn dịch qua tiêm phúc mạc cyclophosphamide (liều 120mg/kg thể trọng) vào các ngày thứ 3, thứ 4 và thứ 5 sau khi được gây miễn dịch

Hiệu giá kháng thể được xác định vào ngày thứ 12, 20, 29, và 40 sau ngày gây miễn dịch qua một phản ứng ngưng kết với hồng cầu cừu ở nồng độ 5x108 tế bào / ml sau khi loại bỏ các yếu tố miễn dịch khỏi huyết thanh ở nhiệt độ 56oC trong 30 phút Quan sát kết quả phản ứng sau khi ủ 2 giờ ở 370C Các mẫu đã được nhân ba, sử dụng huyết thanh từ 4 cá thể chuột mỗi nhóm

Vào ngày 0, cá thể chuột được tiêm màng bụng 40µg lipopolysaccharid (LPS, Difco, Detroit, Mỹ) trong dung dịch nước muối sinh lý, với mục đích gây miễn dịch

Pidotimod được cho sử dụng hai lần một ngày trong vòng 8 ngày, bắt đầu từ ngày thứ 4 trước khi tiêm LPS cho đến ngày thứ 3 sau khi tiêm Gây ức chế miễn dịch bằng cách tiêm màng bụng methotrexat liều 40mg/kg thể trọng vào ngày đầu tiên sau ngày gây miễn dịch

Bốn ngày sau khi tiêm LPS, đáp ứng miễn dịch của các cá thể chuột trong mỗi nhóm được đánh giá ở quy mô in vitro qua thử nghiệm tạo mảng tế bào (PFC) đối với hồng cầu cừu được bao phủ lipopolysaccharid (LCSE)

Hồng cầu cừu được bao phủ LPS qua quá trình ủ ở nhiệt độ 37oC trong 30-60 phút với LPS tiệt trùng (nồng độ 1 mg / ml trong PBS) Tỷ lệ hồng cầu : LPS là 3 : 1

Lá lách của chuột được nghiền nát trong 2.5 ml môi trường Eagle sửa đổi của Dulbecco (DMEM), tạo lại hỗn dịch trong 5 ml DMEM, lọc bằng gạc

và giữ ở nhiệt độ 00C Các tế bào được đếm bằng máy đếm Coulter sau khi dung giải hồng cầu 0,1 ml hỗn dịch này được trộn với 0,1 ml LCSE, rồi đưa vào ống nghiệm đã có sẵn 2,5 ml thạch Noble 1,6% được duy trì ở thể lỏng ở

450C Mỗi mẫu được dàn đều trên đĩa Petri và ủ ở 370C trong 2h Sau đó lấy

2 - 3ml huyết thanh chuột lang sạch có chứa bổ thể (đã pha loãng 1:10 trong

24

dung dịch đệm Verona) thêm vào mỗi đĩa Petri Sau 30 phút ủ ở nhiệt độ

370C, tiến hành đếm số lượng vòng tan huyết Đáp ứng kháng thể với LPS được thể hiện bằng tỷ số PFC/106 tế bào có nhân

1.4.3 Tác động trên các đại thực bào

 Quá trình sản xuất anion superoxide bởi các đại thực bào phúc mạc

Lịch trình thử nghiệm được thực hiện theo Nielsen Tác động của Pidotimod được đánh giá sau khi tiêm phúc mạc (liều 100 hoặc 200mg/kg thể trọng) và sau khi dùng đường uống (liều 200 hoặc 400 mg/kg thể trọng) Trong trường hợp này tác dụng của pidotimod được so sánh với roquinimex chuẩn ở liều 80mg/kg thể trọng đường uống

Các cá thể chuột (cân nặng 22-25g) được chia thành các nhóm, mỗi nhóm 10 cá thể: Nhóm chứng không dùng thuốc ức chế miễn dịch, nhóm dùng thuốc ức chế miễn dịch prednisolon (liều 0,5mg/kg thể trọng/ngày đường tiêm dưới da), nhóm được sử dụng prednisolon + pidotiomod Nhóm không sử dụng thuốc được tiêm màng bụng hoặc uống nước muối sinh lý thay cho pidotimod, pidotimod được cho dùng hai lần mỗi ngày trong vòng 11 ngày

Vào buổi sáng ngày thứ 12, các cá thể chuột được cho dùng liều pidotimod cuối cùng, sau đó được gây chết

Các đại thực bào được phân lập bằng cách rửa phúc mạc với lượng 5ml RPMI 1640/cá thể ở 37oC, sau đó rửa sạch hai lần, ly tâm 500g trong 15 phút

và phân tán tạo lại hỗn dịch trong cùng một môi trường Các tế bào thô (1x

106 tế bào/ml, nồng độ cuối cùng) của cùng nhóm thí nghiệm được nuôi ở

37oC trong môi trường RPMI 1640 trộn với 10% huyết thanh thai bê

Anion superoxid giải phóng từ đại thực bào được định lượng bằng sự giảm cytochrome C Một phần trong 1ml hỗn dịch tế bào được ủ ở nhiệt độ

37oC với 0,25 ml dung dịch cytochrome C ngựa (nồng độ 20mg/ml), sau đó kích thích phản ứng bằng 0,05 ml dung dịch phorbol-myristat acetat (PMA

Krebs-tự nhưng không có PMA) với hệ số tắt millimol là 29,5

 Tính hướng hóa chất không kích thích ex vivo của các đại thực bào phúc mạc

Lịch trình và các thuốc sử dụng cũng tương tự như trích dẫn ở trên (2.5.1) nhưng không có thuốc chuẩn nào được thử nghiệm và pidotimod chỉ được dùng với liều 100mg/kg thể trọng đường tiêm màng bụng hoặc đường uống Có 6 nhóm, mỗi nhóm gồm 6 cá thể chuột Phương pháp này theo phương pháp của Ward [47] Đại thực bào phúc mạc được phân lập bằng cách rửa trôi với nước muối sinh lý, sau đó rửa sạch với RPMI 1640 và tạo lại hỗn dịch trong RPMI 1640 + 10% huyết thanh thai bê ở nồng độ 2x106 tế bào/ml 0,2ml hỗn dịch này được đặt ở phần trên của buồng Boyden và 0,2 ml RPMI

1640 được đặt ở phần dưới Ở giữa hai phần có lớp polycarbonate phân cách (đường kính 13mm với kích thước lỗ 5µm) Hỗn dịch được ủ ở nhiệt độ 37oC trong 4h Sau đó mỗi màng được nhuộm theo kỹ thuật Pappenheim và các đại thực bào được đếm bằng kính hiển vi trên 10 vùng

1.4.4 Tác động không đặc hiệu trên hệ lưới nội mô: độ thanh thải keo mực Tàu

Các phép đo được thực hiện theo phương pháp của Biozzi và cộng sự [11] Sáu nhóm, mỗi nhóm gồm 5-8 cá thể chuột (cân nặng khoảng 20g) được đưa vào thử nghiệm: nhóm chứng không ức chế miễn dịch (dùng nước muối sinh lý), nhóm chứng ức chế miễn dịch, nhóm ức chế miễn dịch + sử dụng pidotimod (100-200 mg/kg thể trọng/ngày đường tiêm phúc mạc và 200 - 400mg/kg thể trọng/ngày theo đường uống) Pidotimod được cho dùng

27

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, khỏe mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp, khối lượng trung bình 20 ± 2 g

Tất cả động vật trên sau khi mua về được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn, nước uống, độ ẩm, và ánh sáng tại khu nghiên cứu động vật thực nghiệm của Bộ môn Dược Lực, trường Đại học Dược Hà Nội Chuột được nuôi một tuần trước khi tiến hành thử nghiệm để làm quen với môi trường Khi tiến hành thí nghiệm chuột đạt khối lượng 35 – 40g

2.2 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.2.1 Nguyên liệu

- Pidotimod Việt Nam do bộ môn Hóa dược trường đại học Dược

Hà Nội cung cấp (tiêu chuẩn cơ sở do bộ môn Hóa dược xây dựng)

- Pidotimod dạng bột nguyên liệu nước ngoài do công ty Joyochem cung cấp (tiêu chuẩn nguyên liệu do hãng sản xuất cung cấp)