Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc chiết xuất từ vang nho, trần bì và chè xanh

Đối với thuốc, tiêu chuẩn chất lượng là một văn bản khoa học kỹ thuật mang tính pháp lý trong đó quy định về chỉ tiêu, yêu cầu kỹ thuật, phương pháp kiểm nghiệm, bao gói, ghi nhãn, vận c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Đức Toàn PGS.TS Nguyễn Tường Vy

HÀ NỘI, NĂM 2014

Lời cảm ơn

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn

TS Nguyễn Đức Toàn- Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế và PGS.TS Nguyễn Tường Vy, Trường đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ tôi với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Hoá phân tích và các bộ môn khác của Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện luận văn này

Luận văn này được thực hiện tại Khoa Vật lý đo lường- Viện Kiểm nghiệm- Bộ Y tế, dưới sự quan tâm hướng dẫn và giúp đỡ tận tình, vô tư của các anh chị và các bạn trong Khoa Tôi xin chân thành cảm ơn tới toàn thể cán bộ Khoa Vật lý đo lường

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, TS Trần Việt Hùng và các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn

bè đã luôn động viên, chia sẻ cùng tôi trong cuộc sống và sự nghiệp

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2014

DS Nguyễn Khắc Tùng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tiêu chuẩn chất lượng thuốc 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Các cấp tiêu chuẩn chất lượng của thuốc 2

1.1.3 Nguyên tắc, căn cứ xây dựng tiêu chuẩn 3

1.1.4 Nội dung chính một tiêu chuẩn chất lượng về thuốc 3

1.1.4.1 Yêu cầu kỹ thuật 3

1.1.4.2 Phương pháp thử 4

1.1.4.3 Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản, hạn dùng 4

1.1.5 Thẩm định phương pháp phân tích 4

1.1.5.1 Tính đặc hiệu (specificity, selectivity) 5

1.1.5.2 Tính tuyến tính (linearity) 6

1.1.5.3 Khoảng xác định 6

1.1.5.4 Độ đúng (accuracy) 7

1.1.5.5 Độ chính xác (precision) 7

1.1.5.6 Giới hạn phát hiện (LOD) 8

1.1.5.7 Giới hạn định lượng (LOQ) 9

1.2 Cao thuốc và tiêu chuẩn chất lượng cao đặc 10

1.2.1 Định nghĩa 10

1.2.2 Yêu cầu chất lượng cao đặc 10

1.3 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu của đề tài 11

1.3.1 Nho và chiết xuất vang nho 11

1.3.2 Trần bì và chiết xuất trần bì 13

1.3.3 Chè xanh và chiết xuất chè xanh 19

1.4 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 22

1.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 22

1.4.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 23

1.4.2.1 Khái niệm 23

1.4.2.2 Pha tĩnh 23

1.4.2.3 Pha động 23

1.4.2.4 Detector dùng trong HPLC 24

1.4.2.5 Các thông số đặc trưng của HPLC 25

1.4.3 Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất trong cao 28

1.4.3.1 Phương pháp phân tích resveratrol 28

1.4.3.2 Phương pháp phân tích hesperidin 29

1.4.3.3 Phương pháp phân tích epigallocatechin gallat 31

1.4.3.4 Phương pháp phân tích đồng thời resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat 32

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Đối tượng nghiên cứu 34

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 34

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 34

2.2.2 Hóa chất, thuốc thử 35

2.3 Phương pháp nghiên cứu 35

2.3.1 Xác định một số chỉ tiêu chất lượng chung của cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 35

2.3.2 Xây dựng, thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat bằng HPLC 37

2.3.2.1 Xây dựng phương pháp 37

2.3.2.2 Thẩm định phương pháp 38

2.3.2.4 Định tính, định lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 39

2.4 Tính toán kết quả và xử lý số liệu 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42

3.1 Xác định các chỉ tiêu chất lượng chung của cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 42

3.1.1 Tính chất cảm quan 42

3.1.2 Tro toàn phần 42

3.1.3 Xác định giới hạn kim loại nặng trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 43

3.2 Định tính, định lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh bằng HPLC 44

3.2.1 Xây dựng phương pháp 44

3.2.1.1 Chuẩn bị mẫu 44

3.2.1.2 Lựa chọn bước sóng phát hiện 45

3.2.1.3 Lựa chọn cột sắc ký 47

3.2.1.4 Lựa chọn pha động 47

3.2.2 Thẩm định phương pháp 49

3.2.2.1 Khảo sát tính tương thích của hệ thống 49

3.2.2.2 Khảo sát tính đặc hiệu 50

3.2.2.3 Tính tuyến tính 51

3.2.2.4 Độ lặp lại 54

3.2.2.5 Độ đúng 55

3.2.2.6 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 56

3.2.3 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định tính, định lượng resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh 57

3.2.3.1 Định tính 57

3.2.3.2 Định lượng 60

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 61

4.1 Về đối tượng nghiên cứu 61

4.2 Về phương pháp nghiên cứu 62

4.3 Về kết quả nghiên cứu 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

* KẾT LUẬN 65

* KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN

CĐ

Acetonitril Cao đặc

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các yếu tố cần được đánh giá đối với một phương pháp phân tích 5

Bảng 1.2 Đặc điểm một số dung môi thường dùng trong HPLC 24

Bảng 3.1 Tính chất cảm quan của cao đặc 42

Bảng 3.2 Xác định độ tro toàn phần của cao đặc 43

Bảng 3.5 Kết quả xác định khoảng tuyến tính 52

Bảng 3.6 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 54

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 55

Bảng 3.8 Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với epigallocatechin gallat 56

Bảng 3.9 Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với hesperidin 56

Bảng 3.10 Kết quả xác định giới hạn phát hiện đối với resveratrol 57

Bảng 3.11 Kết quả định lượng resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong các mẫu cao nghiên cứu 60

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Nho (Vitis sp) 11

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của resveratrol 12

Hình 1.3 Quả quýt và dược liệu trần bì 13

Hình 1.4.Cấu trúc cơ bản các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus 15

Hình 1.5 Cấu trúc hoá học của hesperidin 15

Hình 1.6 Sơ đồ chiết xuất citroflavonoid 18

Hình 1.7 Chè xanh (Camellia sinensis) 19

Hình 1.8 Cấu trúc các polyphenol chính trong chè xanh [37] 20

Hình 1.9 Sắc ký đồ và các thông số đặc trưng 26

Hình 2.1 Máy HPLC – UV 34

Hình 3.1 Phổ tử ngoại của epigallocatechin gallat trong methanol 46

Hình 3.2 Phổ tử ngoại của hesperidin trong methanol 46

Hình 3.3 Phổ tử ngoại của resveratrol trong methanol 46

Hình 3.4 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp với tỷ lệ pha động (20: 80) 48

Hình 3.5 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp với tỷ lệ pha động (30: 70) 48

Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu 51

(A): mẫu trắng; (B): chuẩn hỗn hợp; (C): mẫu thử cao đặc hỗn hợp 51

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của epigallocatechin gallat 52

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của hesperidin 53

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của resveratrol 54

Hình 3.10 Sắc đồ định tính mẫu thử 58

Hình 3.11 Phổ UV-Vis của resveratrol (A) chuẩn, (B) thử 59

Hình 3.12 Phổ UV-Vis của hesperidin (A) chuẩn, (B) thử 59

Hình 3.13 Phổ UV-Vis của epigallocatechin gallat (A) chuẩn, (B) thử 60

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xơ vữa động mạch là bệnh liên quan đến sinh mệnh nhiều người, trong hầu hết mọi gia đình Các số liệu thống kê cho thấysố lượng người mắc chứng bệnh nàylà rất lớn và không ngừng gia tăng Xơ vữa động mạch là hiện tượng xơ hoá thành động mạch, đây là nguyên nhân gây ra nhiều biến chứng tim mạch nguy hiểm như nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não.Cho đến nay, việc điều trị vẫn không đạt kết quả tốt, hơn nữa việc sử dụng thuốc lại gây ra nhiềutác dụng phụ [1] Trước thực tế đó, các nhà khoa học trong nước đã tích cực nghiên cứu các loại thảo dược với mong muốn tạo ra các sản phẩm đông dược có thể điều trị bệnh hiệu quả

mà không gây ra các tác dụng bất lợi Các dược liệu nho, trần bì, chè xanh đã được các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới nghiên cứu rất nhiều về tác dụng dược lý,các nghiên cứu này đã chứng minh được tác dụng chống oxy hoá và ngăn ngừa xơ vữa động mạch của nho, trần bì, chè xanh là rất tốt Để tạo ra tác dụng hiệp đồng của các dược liệu trên, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương - Bộ

Y tế đề xuất đề tài nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng chống oxy hoá, ngăn ngừa xơ vữa động mạch của viên nang bào chế từ chiết xuất của các dược liệu trên Vấn đề đặt ra là muốn cho sản phẩm tạo thành có chất lượng tốt, ổn định và có thể vươn ra thế giới trong điều kiện kinh tế hội nhập thì sản phẩm phải có quy định về các đặc tính kỹ thuật và yêu cầu quản lý dùng làm chuẩn đánh giá sản phẩm Chính

vì vậy, yêu cầu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho sản phẩm là rất quan trọng

Chúng tôi thực hiện đề tài "Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc chiết

xuất từ vang nho, trần bì và chè xanh" để góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất

lượng cho sản phẩm trong đề tài trên của Viện Kiểm nghiệmthuốc Trung ương

Đề tài thực hiện với hai mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất trong cao

2 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng của cao

lý bắt buộc áp dụng nhằm đảm bảo chất lượng cho một sản phẩm nào đó

Đối với thuốc, tiêu chuẩn chất lượng là một văn bản khoa học kỹ thuật mang tính pháp lý trong đó quy định về chỉ tiêu, yêu cầu kỹ thuật, phương pháp kiểm nghiệm, bao gói, ghi nhãn, vận chuyển, bảo quản và các yêu cầu khác có liên quan đến chất lượng thuốc Đây là cơ sở để các các cơ quan kiểm nghiệm (hoặc người kiểm nghiệm) tiến hành thực nghiệm, đánh giá kết quả, công bố kết quả (bằng phiếu kiểm nghiệm) đánh giá chất lượng thuốc là đạt hay không đạt và có được phép lưu hành (hoặc sử dụng) hay không [4], [7]

1.1.2 Các cấp tiêu chuẩn chất lượng của thuốc

Tiêu chuẩn chất lượng thuốc của Việt Nam bao gồm tiêu chuẩn quốc gia và tiêu chuẩn cơ sở

- Tiêu chuẩn quốc gia (TCVN) về chất lượng thuốc và các phương pháp kiểm nghiệm thuốc được quy định tại Dược điển Việt Nam

- Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) do cơ sở sản xuất thuốc xây dựng và công bố TCCS không được thấp hơn TCVN về chất lượng thuốc

Tiêu chuẩn chất lượng của thuốc đã được Bộ Y tế cho phép lưu hành là tài liệu pháp lý, là căn cứ để cơ quan quản lý, cơ quan kiểm tra chất lượng thuốc xác định

và kết luận về chất lượng thuốc trong quá trình sản xuất, lưu hành và sử dụng Các

cơ sở đăng ký, sản xuất, kinh doanh thuốc có trách nhiệm đảm bảo chất lượng thuốc cho đúng tiêu chuẩn chất lượng đã đăng ký trong quá trình sản xuất, bảo quản, phân phối thuốc đến người sử dụng

3

Trong quá trình quản lý sản xuất, lưu hành thuốc, cơ sở kinh doanh có thể áp dụng tiêu chuẩn chất lượng nội bộ, bao gồm tiêu chuẩn chất lượng thuốc đã được

Bộ Y tế xem xét và các chỉ tiêu chất lượng bổ sung khác [5]

1.1.3 Nguyên tắc, căn cứ xây dựng tiêu chuẩn

- Dựa trên tiến bộ khoa học và công nghệ, kinh nghiệm thực tiễn, yêu cầu về quản lý chất lượng và đảm bảo chất lượng thuốc và xu hướng phát triển kinh tế- xã hội

- Sử dụng tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực, tiêu chuẩn nước ngoài làm

cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn và quy chuẩn kỹ thuật, trừ trường hợp các tiêu chuẩn

đó không phù hợp với đặc điểm về địa lý, khí hậu, kỹ thuật, công nghệ của Việt Nam

- Bảo đảm tính thống nhất của hệ thống tiêu chuẩn và hệ thống quy chuẩn kỹ thuật của Việt Nam [11]

- Căn cứ xây dựng tiêu chuẩn

+ Tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực, tiêu chuẩn nước ngoài,

+ Kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật,

+ Kinh nghiệm thực tiễn,

+ Kết quả đánh giá, khảo nghiệm, thử nghiệm, kiểm tra, giám định [11]

1.1.4 Nội dung chính một tiêu chuẩn chất lượng về thuốc

Tiêu chuẩn chất lượng thuốc gồm 3 phần chính: yêu cầu kỹ thuật; phương pháp thử; đóng gói, ghi nhãn- bảo quản- hạn dùng [7]

1.1.4.1 Yêu cầu kỹ thuật

Yêu cầu kỹ thuật là các quy định cụ thể về công thức bào chế, tiêu chuẩn chất lượng của các nguyên phụ liệu và yêu cầu chất lượng của thuốc Yêu cầu chất lượng quy định cụ thể các chỉ tiêu chất lượng và giới hạn / yêu cầu đối với từng chỉ tiêu Mỗi dạng bào chế có các chỉ tiêu chất lượng được quy định chung trong các dược điển, giới hạn / yêu cầu đối với mỗi chỉ tiêu tuỳ thuộc vào từng sản phẩm cụ thể tuy nhiên phải đáp ứng quy định chung

4

1.1.4.2 Phương pháp thử

Phương pháp thử là phần không thể thiếu của tiêu chuẩn chất lượng quy định

cụ thể các điều kiện tiến hành (các hoá chất, thuốc thử, trang thiết bị, dụng cụ), phương pháp chuẩn bị mẫu, cách thức tiến hành, xử lý và đánh giá kết quả Mỗi chỉ tiêu phải ghi rõ phương pháp thử riêng, nếu sử dụng các phương pháp thử chung phải ghi rõ cụ thể tên dược điển, ấn bản và chuyên luận áp dụng

1.1.4.3 Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản, hạn dùng

Nội dung này quy định các dạng đóng gói của thuốc (ví dụ vỉ mấy viên, hộp mấy vỉ, chai bao nhiêu ml ) cách thức ghi nhãn thuốc, điều kiện bảo quản và hạn dùng của thuốc

1.1.5 Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp phân tích là yêu cầu trong quá trình xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nhằm đánh giá mức độ phù hợp của phương pháp phân tích đối với sản phẩm thuốc có đảm bảo đưa ra kết quả đúng và chính xác hay không Tuỳ thuộc các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử, việc thẩm định phương pháp có các chỉ tiêu và yêu cầu khác nhau

Các yếu tố cần được thẩm định đối với một phương pháp phân tích được minh hoạ ở bảng 1.1:

5

Bảng 1.1: Các yếu tố cần được đánh giá đối với một phương pháp phân tích

Loại quy trình phân tích Định tính

Giới hạn tạp chất

Dấu (-) nhằm chỉ các đặc trưng này không cần phải đánh giá

Dấu (+) nhằm chỉ các đặc trưng này cần phải đánh giá

1.1.5.1 Tính đặc hiệu (specificity, selectivity)

- Khái niệm:

Tính đặc hiệu là khả năng xác định chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác trong mẫu thử Phép thử được gọi là đặc hiệu khi đảm bảo đồng thời 2 điều kiện: (1) khẳng định chắc chắn sự có mặt của chất phân tích và (2) phân biệt được chất phân tích với hợp chất khác có mặt trong mẫu thử

- Nguyên tắc xác định: chuẩn bị các mẫu sau:

+ Mẫu đối chiếu: mẫu có chứa chất cần phân tích;

+ Mẫu thử: chuẩn bị mẫu theo phương pháp thử quy định;

+ Mẫu placebo: thành phần giống mẫu thử nhưng không có chất cần phân tích, chuẩn bị mẫu đúng như chuẩn bị mẫu thử;

+ Mẫu trắng: chuẩn bị như chuẩn bị mẫu thử, nhưng không sử dụng mẫu + Tiến hành phân tích các mẫu theo điều kiện phân tích quy định

- Yêu cầu:

+ Đáp ứng của chất phân tích trong mẫu thử phải giống với trong mẫu đối chiếu (ví dụ với sắc ký lớp mỏng phải có vết cùng màu và cùng Rf, với sắc ký lỏng phải có píc có cùng thời gian lưu và cùng phổ đồ)

+ Đáp ứng của chất phân tích có thể là thể tích/ số mol chất phản ứng trong phương pháp chuẩn độ, độ hấp thụ trong phương pháp đo phổ UV-Vis, diện tích/ chiều cao của píc trong phương pháp sắc ký )

- Nguyên tắc xác định:

+ Tiến hành pha và phân tích một dãy dung dịch chuẩn gồm ít nhất ba mức nồng độ xung quanh nồng độ định lượng của chất cần phân tích theo phương pháp thử

+ Tính tuyến tính được đánh giá bằng hệ số tương quan tuyến tính r

- Khoảng xác định được lấy từ kết quả nghiên cứu tính tuyến tính, kết hợp với kết quả độ đúng, độ chính xác

+ Tiến hành định lượng và xác định tỷ lệ % thu hồi lượng chất phân tích thêm vào;

- Yêu cầu: tỷ lệ % thu hồi phải nằm trong khoảngtừ 98,0% đến 102,0%, độ đúng = (100% - % thu hồi) ≤ 2%

Yêu cầu về độ đúng có thể thay đổi tuỳ đối tượng phân tích, phương pháp thử

Độ lặp lại được đánh giá và biểu thị bằng độ lệch chuẩn (SD) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD %)

- Nguyên tắc xác định

+ Độ lặp lại được đánh giá dựa trên kết quả của nhiều lần định lượng lặp lại (thường tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ 100% nồng độ thử, hoặc 3 lần định lượng tại 3 khoảng nồng độ khác nhau)

+ Độ tái lặp (reproducibility): tiến hành phân tích trên nhiều phòng thử nghiệm khác nhau

- Yêu cầu: với phép định lượng RSD ≤ 2,0% Yêu cầu độ lặp lại có thể thay đổi tuỳ đối tượng phân tích, phương pháp thử và mục đích sử dụng

1.1.5.6 Giới hạn phát hiện (LOD),

+ Cách 2: tiến hành xây dựng đường chuẩn của chất phân tích ở nồng độ gần bằng LOD để tính độ dốc (slope), và phân tích lặp lại mẫu có nồng độ chất phân tích gần LOD để tính độ lệch chuẩn (SD) Giới hạn phát hiện LOD được tính theo công thức:

= 3,3

9

Trong đó là độ lệch chuẩn của đáp ứng của chất phân tích có nồng độ gần LOD;

S là độ dốc của đường chuẩn của chất phân tích ở khoảng nồng độ gần LOD

1.1.5.7 Giới hạn định lượng (LOQ)

- Nguyên tắc xác định

Xác định nồng độ chất phân tích thấp nhất mà tại đó độ đúng và độ chính xác đáp ứng yêu cầu

LOQ thường được tính theo công thức:

=10 Trong đó là độ lệch chuẩn của đáp ứng của chất phân tích có nồng độ gần LOD;

S là độ dốc của đường chuẩn của chất phân tích ở khoảng nồng độ gần LOD

Cao đặc là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20% [2]

1.2.2 Yêu cầu chất lượng cao đặc

Theo quy định của DĐVN IV cao đặc phải đạt các yêu cầu chung sau đây:

- Cảm quan: thể chất, màu sắc mùi, vị, cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng

- Mất khối lượng do làm khô: cao đặc không quá 20%

- Kim loại nặng: đáp ứng yêu cầu quy định trong chuyên luận riêng

- Định tính: phải có phản ứng định tính của các dược liệu dùng để bào chế cao thuốc

- Dung môi tồn dư: khi cao được điều chế sử dụng các dung môi ngoài nước

và cồn

- Dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật

- Định lượng: tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu định lượng hoạt chất trong cao

- Đạt yêu cầu quy định về độ nhiễm khuẩn [2]

Ngoài ra còn có thể bổ sung các chỉ tiêu như: cắn sau khi nung (tro toàn phần, tro không tan trong acid ); cắn không tan trong nước; chất chiết được trong cao

11

1.3 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu của đề tài

1.3.1 Nho và chiết xuất vang nho

- Nho (Vitis sp.)

Hình 1.1: Nho (Vitis sp)

Người Pháp và một số nước Châu Âu khác rất nổi tiếng vì thích ăn những thức

ăn có nhiều mỡ và hàm lượng cholesterol cao Song “nghịch lý của nước Pháp” mà mọi người đều biết, tỷ lệ mắc bệnh tim mạch và ung thư ở Pháp lại thuộc hàng thấp nhất phương tây Nguyên nhân vì người Pháp uống rất nhiều rượu nho, các chuyên gia phát hiện trong rượu nho có chứa một chất có hoạt tính rất tốt với tên gọi resveratrol

Resveratrol là polyphenol có cấu trúc hóa học đã được xác định là trans -3,5,4' trihydroxystilbene (hình 1.2) Từ 10 năm nay, resveratrol đã được nghiên cứu rất nhiều về hoạt tính sinh học Kết quả khảo sát trên súc vật thí nghiệm cho thấy nó có tác dụng trên nhiều loại bệnh tật nguy hiểm, bảo vệ hệ tim mạch, phòng bệnh thần kinh (Alzheimer, Parkinson), phòng và điều trị được nhiều dạng ung thư, kể cả một

số ung thư đã di căn, chống virus, chống nấm, chống viêm, chống oxy hóa, chống béo phì, tăng lực, kéo dài tuổi thọ Nhiều nhà khoa học cho rằng resveratrol là hy vọng sống của người bệnh tiểu đường, ung thư tiền liệt tuyến v.v.Đã có hơn 18.000 bài báo nghiên cứu toàn diện về resveratrol Những nghiên cứu này còn tiếp tục Resveratrol đã được dùng ở các nước tiên tiến dưới dạng thực phẩm chức năng [12]

12

Cấu trúc hoá học của resveratrol

OH

OH HO

C14H12O3 ptl: 228,24 g/mol

Hình 1.2: Cấu trúc hoá học của resveratrol

Resveratrol đã được sản xuất từ thực vật thiên nhiên như: Nho, lạc, thông, vỏ bạch dương, cốt khí củ… Mỗi nguyên liệu có ưu thế riêng, trong đó, cốt khí củ (polygonum cuspidatum) được ưa chuộng vì là loại thực vật dễ trồng, hàm lượng hoạt chất cao, đã dùng từ lâu trong đông y không có độc tính Hàm lượng resveratrol trong cốt khí củ cao nhất, sau đó là vỏ và hạt nho Resveratrol cũng đã được tổng hợp hóa học, sản phẩm tổng hợp dùng chủ yếu để sản xuất mỹ phẩm Tổng hợp cần đến các hóa chất đắt tiền nên ít dùng Vì vậy, từ nguyên liệu thiên nhiên, resveratrol được sản xuất bằng cách chiết xuất bằng dung môi [12]

Hoạt tính sinh học:

Tác dụng phòng chống xơ vữa động mạch [20], phòng chống bệnh tim mạch [19], đặc biệt là chứng nhồi máu cơ tim của resveratrol đã được chứng minh Tác động của resveratrol lên các yếu tố liên quan cơ chế hình thành xơ vữa động mạch

và các yếu tố nguy cơ xơ vữa động mạch do làm giảm sự biểu hiện của phân tử kết dính tế bào, kích thích yêu tố bạch cầu đơn nhân, enzym metalloproteinase, các yếu

tố tăng trưởng và ức chế kết tập tiểu cầu, làm tăng sinh tế bào cơ trơn Đồng thời resveratrol làm giảm cholesterol toàn phần, triglycerides, làm tăng HDL-cholesterol, ức chế sự biểu hiện hoạt động của protein-C và làm giảm mức độ tiến triển sản phẩm cuối cùng glucation và thụ thể của nó trong các mô mạch máu Resveratol làm giảm các yếu tố nguy cơ cho mảng xơ vữa vỡ LDL-cholesterol có vai trò quan trọng hình thành nên mảng xơ vữa và viêm nội mô động mạch Resveratol làm tăng biểu hiện và hoạt động của receptor LDL tại gan, receptor giữ vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipoprotein, làm giảm nồng độ LDL-cholesterol

13

trong huyết thanh [54] Resveratrol có tác dụng chống oxy hóa và có khả năng tạo phức kim loại nên có tác dụng chống lại quá trình oxy hóa LDL [19], [21] Đồng thời, resveratrol làm tăng HDL đến 12%, hạ đường huyết, cải thiện tuần hoàn, ngăn ngừa sự ngưng kết tiểu cầu, giảm hình thành huyết khối, do đó làm giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim

Ngoài ra resveratrol còn được biết đến là một hoạt chất có tác dụng phòng chống ung thư, ức chế sự phát triển của các tổn thương trước khi phát triển thành u, chống lại cả 3 giai đoạn hình thành và phát triển khối u là giai đoạn khởi đầu, phát triển và di căn

Resveratrol có tác dụng hiệu quả trong chống lão hóa bao gồm các dấu hiệu tuổi già, bệnh thoái hóa thần kinh, Alzheimer và Parkinson…

- Trong nước, đã có một số nghiên cứu chiết xuất resveratrol:

Năm 2006, nhóm nghiên cứu Bộ môn Hóa dược, ĐH Dược Hà nội đã công bố nghiên cứu tổng hợp resveratrol [16]

PGS TS Vũ Đình Hoàng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu công nghệ chiết tách resveratrol từ nguồn thực vật Việt Nam [13]

1.3.2 Trần bì và chiết xuất trần bì

- Trần bì là vỏ quả chín phơi hay sấy khô của quả Quýt, có tên khoa học là

Citrus reticulate Blanco, họ cam (Rutaceae)

Hình 1.3: Quả quýt và dược liệu trần bì

Những nghiên cứu khoa học cho thấy dược liệu trần bì có các nhóm thành phần hoạt chất:

Coumarin: Các coumarin có nhiều trong các cây thuộc họ rutaceae nói chung Một số coumarin hay gặp trong các loài citrus là bergamottin, bergapten, imperatorin, isoimperatorin, osthol, psoralen Coumarin có các tác dụng sinh học chống ung thư [47],[52] chống oxy hóa, kháng virus, kháng khuẩn, [37]

Alkaloid: Các alkaloid có nhiều trong họ rutaceae Thông thường các loài citrus có chứa alkaloid có cấu trúc protoalkaloid là dẫn xuất của tyramin Các alkaloid này có tác dụng diệt côn trùng [52]

Flavonoid: flavonoid là thành phần chính và quan trọng trong các loài citrus, phân bố ở tất cả các bộ phận và đặc biệt có hàm lượng cao trong vỏ quả [33] Hiện nay số lượng flavonoid đã được phân lập và xác định từ vỏ quả các loài citrus là khoảng hơn 60 chất, thuộc các nhóm flavanon, flavon, flavonol, và anthocyanin (hình 1.4) Thông thường, các flavonoid tồn tại trong citrus ở cả dạng aglycon tự do

và dạng glycosid [44]

15

Hình 1.4: Cấu trúc cơ bản các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus

Thành phần flavonoid chính có trong tất cả vỏ quả của các loài Citrus là các citroflavonoid: naringenin, hesperitin và các glycosid của chúng là naringin, hesperidin là các thành phần chính của vỏ quả các loài Citrus Các chất này chiếm hàm lượng rất lớn, có thể tới 5−10% tính theo vỏ quả khô Điều đặc biệt là narigenin, naringin, hesperitin và hesperidin có hàm lượng lớn trong các loài thuộc chi Citrus nhưng lại rất hiếm gặp ở các chi và họ khác

Cấu trúc hoá học của hesperidin

Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của hesperidin

Hoạt tính sinh học:

Tác dụng chống oxy hóa: các flavonoid có nhóm hydroxy (OH) gắn với vòng

thơm có tác dụng chống oxy hóa [40] Nếu flavonoid có nhóm catechin (nhóm

o-dihydroxy), hay có một nhóm OH ở vị trí số 3 và số 5 sẽ cho tác dụng chống oxy hóa mạnh [40], [52] Các nhóm này có tác dụng loại bỏ các gốc tự do trong của cơ thể, như các gốc tự do superoxid (O2-●), hydroxy (OH●), lipid peroxyl (LOO●), lipid alkoxyl (LO●), oxyd nitric (NO●) Các gốc tự do là nguyên nhân gây ra quá trình oxy hóa trong cơ thể, chúng có thể gây ra sự oxy hóa lipid, protein và kể cả DNA [23] Khi các quá trình oxy hóa xảy ra nhiều trong cở thể, chúng sẽ gây ra sự phá hủy các tế bào và do đó dẫn đến bệnh tật

Các citrus flavonoid, vì vậy, có tác dụng chống oxy hóa mạnh [43], [19] Thông thường thì các aglycon flavonoid có tác dụng mạnh hơn các glycosid của chúng [52] Chúng giúp cơ thể chống lại sự oxy hóa lipid, protein và DNA gây ra bởi các gốc tự do

Tác dụng trên hệ mạch

16

Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của các flavonoid chiết xuất từ thực vật chỉ ra rằng chúng có khả năng làm giảm tính thẩm thấu và tính dễ vỡ của các thành mạch Hesperidin nói riêng, các hợp chất flavonoid nói chung đã được rất nhiều công trình nghiên cứu chứng tỏ khả năng ngăn chặn, hạn chế sự gia tăng tính thẩm thấu của các mao mạch [18],[22],[25],[26] Năm 1939, Morii chỉ ra rằng với liều sử dụng 30 mg một ngày hesperidin làm giảm tính thẩm thấu của các mao mạch và gia tăng sức đề kháng của các mao mạch trong nhiều ca điều trị lâm sàng các bệnh viêm màng phổi, lao phổi, bệnh Grave, bệnh tê phù Từ đó, hesperidin được sử dụng làm thuốc tăng sức đề kháng của hệ mao mạch

Năm 1940 Scarborough sử dụng hesperidin trong điều trị chứng xuất huyết do

sử dụng thạch tín và bệnh giang mai Kết quả thực nghiệm của ông cho thấy hesperidin có tác dụng làm tăng độ bền và khả năng chịu đựng của các mao mạch Năm 1941 Higby sử dụng hesperidin trong điều trị lâm sàng bệnh xuất huyết và những rối loạn gây ra bởi chứng dòn thành mạch Kết quả cho thấy vai trò của hesperidin trong việc gia tăng độ bền thành mạch là do nó ức chế ảnh hưởng của các enzyme tác động đến tính thấm và tính dễ vỡ của các mao mạch [48]

Tác dụng kháng viêm

Năm 1994, Galasti và cộng sự đã chứng minh khả năng kháng viêm và giảm đau đáng chú ý của hesperidin trên chuột thực nghiệm Cũng trong năm đó Emin và cộng sự công bố số liệu nghiên cứu dược lý cho thấy có thể sử dụng hesperidin làm thuốc kháng viêm rẻ tiền, đặc biệt là trong những bệnh nhân mẫn cảm với các thuốc kháng viêm không chứa steroid thông thường [18],[22]

Hesperidin khi sử dụng phối hợp với diosmin có tác dụng chống lại các bệnh

viêm nhiễm cả trong thử nghiệm in vivo và in vitro [48]

Hoạt tính kháng virut

Các nghiên cứu in vitro trên tế bào nuôi cấy của Wacker và Eilmes tiến hành

vào các năm 1975 và 1978 cho thấy hesperidin có hoạt tính kháng virut gây viêm miệng có mụn nước ở các nồng độ khác nhau và có hoạt tính kháng virut cúm Năm

1999, Lee và cộng sự phát hiện thấy hesperidin có hoạt tính kháng virut yếu đối với virut herpes đơn hình Milddleton chứng minh hoạt tính kháng virut của hesperidin

17

đối với virut herpes type-I, para influenza -3, poliovirus type-I, virut hỗn bào hô hấp trên mô tế bào đơn lớp Mucsi và Pragai chứng minh tác dụng ức chế virut của hesperidin đối với virut herpes đơn hình type-I ở người (HSV-I) và virut suid herpes

type-I (Pseudorabies virus) [18]

- Nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid từ các loại vỏ thuộc chi Citrus đã được Viện Dược liệu thực hiện thành công trong đề tài cấp Sở khoa học công nghệ Hà Nội “Nghiên cứu qui trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả một số loài thuộc chi citrus, họ cam (Rutaceae)” với sản phẩm của đề tài là qui trình chiết xuất tinh chế bột citroflavonoid qui mô pilot có hàm lượng hesperidin trên 50% với đầy

đủ chỉ tiêu đánh giá

18

SƠ ĐỒ CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID

Hình 1.6: Sơ đồ chiết xuất citroflavonoid

+ Ethanol 70%

Chiết hồi lưu

Thu hồi dung môi áp suất giảm

+ Làm nguội trong 24 giờ

Để lắng

Gạn, lọc

Rửa tủa bằng cồn Lọc chân không

Sấy chân không

19

1.3.3 Chè xanh và chiết xuất chè xanh

- Chè xanh (Camellia sinensis)

Cây chè hay cây trà có tên khoa học là Camellia sinensis thuộc họ Theaceae

Hình 1.7: Chè xanh (Camellia sinensis)

Ở Việt Nam, hàng trăm năm nay, cây chè vẫn được coi là một cây trồng truyền thống, mang tính đặc sản Chè được trồng khắp nơi ở Việt Nam, nhất là ở các vùng đồi, núi thấp, tương đối bằng phẳng

Thành phần polyphenol trong chè, hay được gọi là flavon hay catechin, chiếm 30- 40% trong cao chiết trà xanh Các catechin chính trong chè xanh là epicatechin, epicatechin gallat, epigallocatechin, và epigallocatechin gallat, trong đó epigallocatechin gallatlà hoạt chất có hàm lượng cao nhất, có thể lên đến 50%

21

kích thích hoạt động của các enzyme giải độc tại gan, từ đó thúc đẩy quá trình giải độc của các hợp chất nội sinh, cũng như khả năng tạo phức của các ion kim loại, như ion sắt, các nhân tố khởi phát quá trình tạo ra các chất oxy hóa [52], [55] Tác dụng ngăn ngừa rối loạn chuyển hoá lipit và chống oxy hoá:

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà bộ môn hoá sinh trường đại học Y- Hà Nội về tác dụng của chè xanh Việt Nam trên rối loạn chuyển hoá lipit ở thỏ uống cholesterol cho thấy: dịch chiết chè xanh có tác dụng làm giảm rối loạn chuyển hoá lipit thể hiện ở mức độ cải thiện các chỉ số triglycerides, cholesterol toàn phần, LDL-Cholesterol huyết tương bị rối loạn ở thỏ gây tăng cholesterol máu thực nghiệm Mức tiêu thụ dịch chiết chè xanh có liên quan đến các chỉ số triglycerides, cholesterol toàn phần, LDL- cholesterol huyết tương ở thỏ gây tăng cholesterol máu thực nghiệm Tác dụng rõ nhất của dịch chiết chè xanh thể hiện ở liều 150 mg/ kg/ ngày [10]

Epigallocatechin gallat là một chất chống oxy hóa thuộc nhóm phenolic đã được tìm thấy trong nhiều loại thực vật trong đó có chè xanh Khả năng chống oxy hoá của epigallocatechin gallat là do nó có khả năng ức chế quá trình oxy hóa tế bào của lipoprotein tỷ trọng thấp và ức chế sự hình thành peroxynitrit gây ra các dấu hiệu tổn thương oxy hóa 8-hydroxy-2-deoxy guanosine và 3 nitrotyrosin [24],[55] Cao chè xanh (liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt trên sự giảm hàm lượng Malonyl dialdehyd và protein carbonyl của nhóm thử thuốc so với nhóm tiêm CCl4 để gây viêm gan cấp (p < 0,01) [8]

Nghiên cứu của Trần Thị Chi Mai và cộng sự đã chứng minh tác dụng của polyphenol chè xanh (camellia sinensis) trên trạng thái chống oxy hóa trong máu của chuột cống trắng gây đái tháo đường thực nghiệm[15]

Ngoài ra, epigallocatechin gallat còn được chứng minh là có khả năng bảo vệ hữu hiệu chống lại bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer, thiểu năng tuần hoàn não và kháng khuẩn epigallocatechin gallat còn thể hiện khả năng chống lại bệnh tiểu đường trong các mô hình động vật kháng insulin Khi nghiên cứu tác dụng của epigallocatechin gallat trên thực nghiệm, người ta đã phát hiện nồng độ cỡ ng/ml

Cao mềm chè xanh thu được từ việc cô đặc dịch chiết lá chè xanh trong dung dịch ethanol (2%, kl/kl) đến độ ẩm khoảng 20 đến 25% Hàm lượng catechin trong cao mềm chè xanh vào khoảng (20% ,kl/kl) [32]

Cao khô chè xanh thu được từ dịch chiết chè xanh trong cồn bằng cách cô đặc đến 40- 50% lượng chất rắn, sau đó sấy khô đến hàm lượng nước ít hơn 5% [32] Các chất chống oxy hóa có trong chiết xuất trà xanh gồm các catechin, trong

đó có bốn dẫn xuất epicatechin lớn; cụ thể là, epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECG) và epigallocatechin gallate (EGCG).Các thành phần khác có trong chiết xuất chè xanh bao gồm ba loại flavonoid, là kaempferol , quercetin, và myricetin [39]

1.4 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

1.4.1 Phương pháp xử lý mẫu

- Hoà tan mẫu:

+ Mẫu được hoà tan trong dung môi thích hợp sao cho khi gặp pha động các chất tan không bị tủa làm tắc cột và ảnh hưởng đến quá trình sắc ký

+ Thông thường mẫu được hoà tan bằng chính pha động sử dụng, nếu có sự hoà tan tốt Tuy vậy, không nên chọn dung môi có tính hoà tan cao để pha mẫu thử

vì có khả năng gây tắc cột khi chất tan giảm độ hoà tan trong pha động

+ Sử dụng máy lắc siêu âm hoặc các chất trợ tan để giúp hoà tan dễ dàng và hoàn toàn

- Loại các chất không tan và ảnh hưởng đến quá trình sắc ký:

+ Thường dùng màng lọc 0,45µm, trước khi tiêm vào máy HPLC,

+ Ly tâm để loại chất không tan sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm,

+ Loại muối và các chất diện hoạt,

23

- Cô đặc và pha loãng mẫu:

Điều chỉnh lượng mẫu thử và dung môi cho phù hợp, thường bắt đầu với một mẫu đậm đặc, sau đó điều chỉnh bằng cách pha loãng ra

1.4.2.2 Pha tĩnh

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích Trong HPLC pha tĩnh thông dụng nhất là silicagel dưới dạng hình cầu có kích thước 3- 10 µm Hiện nay, trong HPLC phân tích đều được tiến hành với silica được biến đổi hoá học, trong đó quan trọng nhất là loại C- 18 không phân cực [9]

- Đặc điểm một số dung môi thường dùng trong HPLC [9] như bảng 1.2

Bảng 1.2: Đặc điểm một số dung môi thường dùng trong HPLC

Độ phân cực

Tính tan trong nước

UV cut off (nm)

Độ nhớt (cP, 25°C)

- Quá trình rửa giải:

+ Rửa giải đẳng dòng: thành phần và tỷ lệ pha động không thay đổi trong suốt quá trình rửa giải

+ Rửa giải gradient: pha động liên tục thay đổi (do tỷ lệ các thành phần tạo nên pha động thay đổi) trong suốt quá trình rửa giải Lúc này, độ phân cực của pha động cũng sẽ bị biến đổi và thường tăng hiệu quả tách [3]

1.4.2.4 Detector dùng trong HPLC

- Đặc điểm detector

Detector là một trong những bộ phận thiết yếu nhất của máy HPLC để phát hiện ra chất phân tích sau khi đi ra khỏi cột

Phát hiện chất phân tích có thể dựa vào:

+ Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích: detector UV-Vis hoặc huỳnh quang + Tính chất chung của chất phân tích trong pha động: detector chỉ số khúc xạ

và detector đo độ dẫn điện [3]

- Detector tử ngoại và khả kiến (UV-Vis)

25

Cho đến nay, detector hấp thụ tử ngoại- khả kiến là loại detector thông dụng nhất trong HPLC Nguyên tắc của detector này là pha động từ cột đi ngang qua tế bào đo được chiếu một chùm tia tử ngoại hay khả kiến Detector này có tính chọn lọc vì chỉ phát hiện được các chất tan hấp thụ tia UV hay khả kiến Dung môi dùng trong trường hợp này phải hấp thụ rất ít hay không hấp thụ tia bức xạ và chỉ được phép chứa một lượng cực nhỏ các tạp chất hấp thụ trong vùng tử ngoại

Các detector UV-Vis có thể có bước sóng cố định hoặc thay đổi được Detector có bước sóng biến đổi có thể vận hành trong khoảng bước sóng 190- 700nm Detector này có độ nhạy khá cao, khoảng 1 µg/ml [9]

- Detector dãy diod quang (PDAD)

Đây là detector được phát triển từ detector UV-Vis Hiện nay, detector này được dùng rộng rãi nhất trong lĩnh vực kiểm nghiệm và nghiên cứu Tia đa sắc sau khi đi qua tế bào đo mang chất mẫu được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một dãy diod quang Mỗi diod quang nhận một tia tương ứng với một băng có độ dài sóng hẹp Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thụ ở một bước sóng nhất định Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong một giây bởi một bộ phận vi xử lý

Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tách trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của píc sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của một chất chuẩn biết trước

1.4.2.5 Các thông số đặc trưng của HPLC

- Thời gian lưu: của một chất tan là thời gian từ lúc tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện píc của chất tan trên sắc ký đồ Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một chất tan, trong điều kiện sắc ký nhất định thời gian lưu là một hằng số đối với một chất tan Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào bản chất, cấu tạo, và tính chất của chất đó Trong một phép phân tích nếu thời gian lưu quá nhỏ thì sự tách kém, còn thời gian lưu quá dài (tR> 20 phút) thì píc

bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài [9], [17]

h: chiều cao pic

: thời gian lưu

Để định tính cần so sánh thời gian lưu của píc chất đó trên sắc ký đồ của dung dịch thử với thời gian lưu của chất chuẩn trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn [5]

- Hệ số phân bố: là tỷ lệ giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và trong pha động tại thời điểm cân bằng:

=Khi nồng độ chất tan không quá cao thì K là một hằng số, chỉ phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và nhiệt độ Đối với một chất, K càng lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh nên sẽ di chuyển chậm và ngược lại [17]

- Hệ số dung lượng k’: biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong pha động với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất

27

tan trong pha động ở thời điểm cân bằng Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8 [5]

- Độ chọn lọc α:

Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A, B có

và khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị độ chọn lọc α:

với điều kiện >

α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng (α từ 1,5 đến 2,0 là tối ưu) [17]

- Số đĩa lý thuyết N: là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động

Số đĩa lý thuyết N được tính theo một trong ba công thức sau:

≤ 0,5- 1: hai píc tách nhau, có thể xác định được nhưng bị chồng phủ nhiều hay ít

≤ 1: hai píc có thể bắt đầu tách nhau nhưng chưa hoàn toàn

≤ 1,25: hai píc hầu như tách khỏi nhau hoàn toàn

- Hệ số bất đối xứng: hệ số bất đối xứng thường dùng để đánh giá tính cân đối của pic

ký bẩn píc kéo tuyến trước có thể do lượng mẫu đưa vào quá lớn so với năng lực cột Khi sự bất đối xứng của píc càng gia tăng, tính thích hợp và độ chính xác sẽ càng trở nên kém tin cậy hơn [9]

1.4.3 Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất trong cao

1.4.3.1 Phươngpháp phân tích resveratrol

Các nghiên cứu về phương pháp phân tích resveratrol trong nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau đã công bố ở việt Nam cũng như trên thế giới cho thấy phương pháp chủ yếu được sử dụng là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao vớidetector UV hoặc detector khối phổ Đây là hai phương pháp chính được sử dụng để định lượng resveratrol

Nuno Ratola, Joaquim Luís Faria và Arminda Alves đã sử dụng phương pháp HPLC với detector UV để nghiên cứu phân tích và định lượng resveratrol trong rượu vang nho ở vùng Alentejo Bồ Đào Nha Với điều kiện sắc ký: cột Lichrokart C18 của Merck (5 µm, 4,6 × 250 mm), pha động nước : acetonitril : acid acetic tỷ lệ ( 70 : 29,9 : 0,1), tốc độ dòng 1ml/ phút, thể tích tiêm 20 µl, detector 310 nm Kết quả nghiên cứu xác định được sự có mặt của resveratrol trong tất cả 47 mẫu rượu vang đỏ với nồng độ khác nhau, trong khoảng từ 0,13 đến 2,64 mg/ l [41]

Laszlo Mark, Martin S Pour Nikfardjam, Peter Avar và Robert Ohmacht đã xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC để phân tích định lượng trans-resveratrol và trans-piceid trong rượu vang nho Hungary Điều kiện sắc ký: cột sắc

ký pha đảo C18 (6µm, 250× 4,6 mm), pha động sử dụng là hỗn hợp acid axetic : methanol : nước (10: 90: 1) làm dung môi A, hỗn hợp methanol- acid acetic- nước (90: 10: 1) làm dung môi B, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút vớichế độ chạy gradient,

29

detector ở 306 nm Phương pháp phân tích được thẩm định tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ lặp lại, độ thu hồi Khoảng tuyến tính của nồng độ từ 0,01 đến 101 mg/l với R2> 0,999; giới hạn phát hiện là 205 pg, độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích píc được xác định với độ lệch chuẩn lần lượt là 3,9% và 2,12% Độ thu hồi trong khoảng 93,8% đến 100,8% [34]

Tao Yi và cộng sự sử dụng phương pháp HPLC với detector PDA và ESI/MS

để phân tích định tính, định lượng thành phần hoá học chính trong thân rễ khô cốt khí củ Dựa trên sắc ký đồ riêng rẽ trên cột Altima C18 sử dụng pha động acid acetic và acetonitril, 9 thành phần bao gồm stilben, stilben glycosid, anthraquinon, anthraquinon glycosid được xác định bằng phân tích ESI/MS và 7 thành phần được xác định bởi HPLC- DAD Các giá trị thẩm định đầy đủ của phương pháp bao gồm

độ nhạy, độ tuyến tính, độ lặp lại, và độ tìm lại đã được kiểm soát Khoảng nồng độ tuyến tính từ 1- 200 mg/l với R2> 0,999, giới hạn phát hiện trong khoảng 0,51 đến 1,57 ng Độ lặp lại được xác định với giá trị RSD < 2,2% [50]

Ngoài ra phương pháp HPLC – UV/ DAD cũng được ứng dụng trong phân tích thường quy rượu vang đỏ, vỏ nho và các sản phẩm phụ làm rượu vang để xác định trans-resveratrol và quercetin

Như vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV hoặc detector khối phổ là phương pháp chính được ứng dụng để phân tích resveratrol cho kết quả nhanh nhạy và chính xác

1.4.3.2 Phương pháp phân tích hesperidin

Các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới phân tích hesperidin trong dược liệu và trong dịch sinh học đã công bố cho thấy phương pháp phân tích chủ yếu được sử dụng là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV hoặc detector khối phổ

Để đánh giá sự thay đổi nồng độ của hesperidin trong huyết tương chuột sau khi dùng thuốc đường uống.Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà Ly và cộng sự đã

sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV để định lượng hesperidin trong huyết thanh và huyết tương chuột Dung môi pha động sử dụng là acetonitril và nước, chương trình rửa giải gradient với tốc độ dòng 0,5

30

ml/phút, quan sát tại bước sóng 280 nm Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) trong phân tích hesperidin lần lượt là 0,44 và 1,46 μg/ml Độ thu hồi của hesperidin từ mẫu huyết tương là 94,4 ± 2,4% và độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc là 2,0% Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi chọn lọc ethyl acetat để loại tạp và làm giàu mẫu phân tích Sử dụng phương pháp xây dựng được, nhóm nghiên cứu đã định lượng nồng độ hesperidin trong huyết tương chuột tại nhiều thời điểm khác nhau sau uống thuốc, qua đó xây dựng đường cong nồng độ - thời gian và tính toán các thông số dược động học của hesperidin [14]

R Omidbaigi, M Faghih Nasiri và Z Bashiri Sadr đã sử dụng phương pháp HPLC với detector UV để theo dõi sự thay đổi hàm lượng Hesperidin trong quả các loài cam quýt trong suốt quá trình quả chín để xác định thời điểm thu hoạch tốt nhất, nghiên cứu sử dụng cột sắc ký pha đảo Bondapak C18 (300× 3,9 mm) pha động acetonitril và nước với tỷ lệ (21,5: 78,5) tốc độ dòng 2ml/ phút, thể tích tiêm mẫu 5 µl detector 258nm Kết quả đã xác định được hàm lượng hesperidin và nhận thấy hàm lượng hesperidin tăng liên tục từ lúc đậu quả đến 40 ngày tuổi [42]

Jaime A Y´ a˜ nez, Xiao Wei Teng, Kathryn A Roupe, Neal M Davies sử dụng phương pháp HPLC để phân tích hesperidin trong dịch sinh học Điều kiện sắc

ký gồm hệ thống HPLC shimadzu, cột Chiralpak AD-RH(5 µm, 150 x 4,6 mm), pha động gồm acetonitril, nước và acid phosphoric với tỷ lệ (42: 58: 0,01), lọc và khử khí giảm áp suất trước khi sử dụng, tốc độ dòng 0,8 ml/ phút, bước sóng phát hiện ở

298 nm Phương pháp được thẩm định các đặc tính: tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác và độ thu hồi Tính tuyến tính của nồng độ trong khoảng 0,5 đến 100 µg/ ml với hệ số R2 = 0,999 Giới hạn phát hiện của hesperidin trong dịch sinh học là 0,5 mg/ml Độ thu hồi trong khoảng từ 98,3 đến 99,9% Các nghiên cứu này cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp HPLC với cột sắc ký pha đảo để định lượng hesperidin trong dược liệu cũng như trong dịch sinh học [30]