Thu nhận enzyme CELLULASE trong Aspergillus niger và ứng dụng trong sản xuất BIOETHANOL

Thu nhận enzyme CELLULASE trong Aspergillus niger và ứng dụng trong sản xuất BIOETHANOL

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

Chương 1: GIỚI THIỆU _3

Chương 2: TỔNG QUAN 4

2.1 Enzyme cellulase 4

2.2 Aspergillus Niger _4

2.3 Giới thiệu cơ chất _5

2.4 Cơ chế xúc tác 6

2.5 Tâm hoạt động 8

2.6 Các thông số cần xác định _9

Chương 3: QUY TRÌNH LÊN MEN, THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME CELLULASE 10

3.1 Sơ lược quy trình lên men 10

3.1.1 Môi trường nuôi cấy _11

3.1.2 Giống 12

3.1.3 Lên men 12

3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cellulase 12

3.2 Quy trình thu nhận và tinh sạch 13

3.2.1 Thu nhận enzyme cellulase _13

3.2.2 Tinh sạch enzyme cellulase _14

3.3 Phương pháp xác định hoạt tính _15

Chương 4: ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE TRONG SẢN XUẤT NHIÊN LIỆU SINH HỌC ETHANOL 17

4.1 Giới thiệu về nhiên liệu sinh học ethanol 17

4.2 Sơ đồ sản xuất ethanol và thuyết minh quy trình sản xuất _20

4.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất 20

4.2.2 Thuyết minh quy trình _21

4.2.2.1 Tiền xử lý _214.2.2.2 Thuỷ phân _224.2.2.3 Lên men 234.2.2.4 Chưng cất- khử nước 244.3 Các thông số kỹ thuật của hệ enzyme cellulase _24

4.4 Phương pháp xác định đường glucose sinh ra _25

Chương 5: KẾT LUẬN _26

Chương 1: GIỚI THIỆU



Enzyme cellulase là một trong những enzyme thương mại hóa lớn nhất hiện nay được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp dệt như làm mềm sợi bông, tẩy hay giữ màu, chống kết tủa…; dùng để tách chiết trong thực phẩm hay công nghiệp giấy và bột giấy.Thị trường cellulase dùng để tiền xử lý nguyên liệu cellulose sản xuất hàng hóa như bioethanol và các sản phẩm sinh học cơ bản khác trên quy mô lớn đã tăng đột ngột Ví dụ như thị trường cellulase tiềm năng được ước đoán trên 400 triệu USD mỗi năm, chỉ riêng sử dụng thủy phân bắp và rơm khô và trong tương lai sẽ chiếm khoảng 33% tổng giá trị công nghiệp enzyme của Mỹ Sự tiềm năng của thị trường enzyme cellulase có vai trò quan trọng của nổi bật trong công nghiệp năng lượng sinh học và các sản phẩm cơ bản của sinh học, là một động lực to lớn để phát triển công nghệ cellulase thủy phân vách tế bào thực vật Để phát triển công nghiệp cellulase đòi hỏi cần phải có những đặc điểm như hiệu suất xúc tác phản ứng cơ chất cellulose cao trong môi trường không hòa tan, tăng sự ổn định của môi trường nhiệt độ cao, khi pH thay đổi, và không bị ức chế nồng độ sản phẩm cao

Ngoài ra hệ enzyme cellulase trong Aspergillus niger cũng được nghiên cứu từ

lâu nhằm ứng dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học nhằm phục vụ nhu cầu chế biến thực phẩm, trong nông nghiệp sử dụng dể xử lý đất nhằm tăng độ màu mỡ

Chương 2: TỔNG QUAN



2.1 Enzyme cellulase

Cellulase là enzyme thuộc nhóm thủy phân cellulose thành glucose

Enzyme cellulase được thu nhận từ các nguồn khác nhau:

•Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen…

• Động vật: chủ yếu là do các vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột của động vật nhai lại hay mối

•Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…

Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật Các chủng vi sinh vật thường sử dụng:

•Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus, Trichodesma reesei …

•Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…

•Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis…

Trong đó nấm mốc và vi khuẩn là 2 nguồn tạo cellulase chủ yếu, ở mức độ ít hơn

Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào

tử bụi phồng lên ở ngọn Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng

Bào tử bụi của Aspergillus niger có màu đen.

Asp niger là nguyên nhân gây bệnh mốc đen ở một số loài thực vật nhưng lại ít

có khả năng gây bệnh cho người, nó chỉ có thể gây hại cho người khi hít vào với một lượng lớn, từ đó có thể gây ra các bệnh về phổi và hô hấp, nó cũng có thể gây nhiễm trùng tai Nó được nuôi cấy trong nhiều ngành công nghiệp như sản xuất acid citric, acid gluconic, hoặc thu các chế phẩm enzyme amylase, cellulase, α-galactosidase

2.3 Giới thiệu cơ chất

Enzyme cellulase có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất Người ta phân ra làm

2 loại chủ yếu sau:

• Cơ chất tự nhiên: gồm các nguồn phụ phẩm của các ngành nông nghiệp

như bã mía, bã cà phê, rơm rạ, sợi bông, cọng khoai mì, dây đậu sau thu hoạch…Chẳng hạn như cellulose là homopolymer mạch thẳng, được cấu tạo khoảng vài ngàn gốc glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside Cellulose có cấu tạo sợi, cấu trúc không đồng nhất gồm vùng kết tinh và vùng vô định hình Khoảng 40 sợi liên kết lại với nhau tạo thành liên kết microfibrin Nhiều sợi microfibrin tập hợp lại thành sợi macrofibrin có đường kính mặt cắt khoảng 0,5nm

 Cơ chất nhân tạo: gồm các cơ chất dùng để phân tích hoạt tính enzyme

cellulase như CMC (carboxulmethyl cellulose), HEC (hydroxyethyl cellulose… CMC (Carboxymethylcellulose) là một dẫn xuất của cellulose Cấu trúc của CMC dựa trên liên kết β-(1 4)-D-glucopyranose, có thành phần tương tự nhưng chỉ có liên kết của phần vô định và ngắn hơn so với cellulose

Bảng: Các loại cơ chất tan và không tan dùng đêt nuôi cấy và cố định hoạt tính enzyme.

hydroxyethyl cellulose (HEC)

Cellulose kết tinh như:

Cellulose kết tinhValonia celluloseCellulose vô định hình-PASC, RACCellulose nhuộm

Cellulose phát huỳnh quangDẫn xuất sinh màu

carboxymethylcellulose (TNP-CMC)Fluram-cellulose

bề mặt sợi microfibrin ở các vị trí ngẫu nhiên làm xuất hiện các đuôi khác nhau trên phần chất vô định hình, từ cellulose tạo thành các cellobiose, tiền đề cho xúc tác của cellobiosehydrolase trên các đầu mút của chuỗi tự do Điều này cho biết ảnh hưởng của enzyme trên phần carboxymethylcellulose và cellulose kết tinh Enyme endoglucanase của nấm thường là một monomer, có

pH hoạt động trong khoảng pH=4-5 và nhiệt độ t= 50 -70oC

 Enzyme exoglucanase (cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91)) hay C1 : sẽ cắt và giải phóng các cellobiose từ đầu không khử (đầu mút của chuỗi) tạo thành trong bước đầu tiên Exocellulase chiếm khoảng 40-70% thành phần hệ enzyme cellulase của nấm, xúc tác bằng cách tạo ra các cầu liên kết giữa cơ chất với enzyme Với Exocellulase pH hoạt động từ 4-5, nhưng khoảng nhiệt

độ rộng hơn so với endocellulase khoảng 37-60oC

 Enzyme β-glucanase (1,4- β - D -glucosidase(EC 3.2.1.21) ): thủy phân liên kết β-1,4-glucoside, cắt và giải phóng glucose tự do β –glucosidase thủy phân cellobiose, một số trường hợp cellodextrin thành glucose Enzyme β-glucanase cũng bị ức chế cạnh tranh bởi glucose, enzyme này có pH tối ưu dựa vào nơi hoạt động của nó và có nhiệt độ tối ưu khoảng 45-75oC

 Cơ chế xúc tác của enzyme CMCase cơ chất CMC: Do cơ chất CMC chỉ có

vật chất vô định hình trong phân tử nên phức hợp 3 enzyme của cellulose chỉ

có enzyme endoglucanase hoạt động Do đó CMC được dùng chủ yếu để xác định hoạt tính endoglucanase (Cx) nên được gọi là CMCase

Hình: Sơ đồ các bước thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase

2.5 Tâm hoạt động

Trung tâm hoạt động của enzyme là phần của phân tử enzyme trực tiếp kết hợp với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tạo thành và chuyển hóa phức chất trung gian giữa enzyme và cơ chất để tạo thành sản phẩm phản ứng Trung tâm hoạt động bao gồm nhiều nhóm chức năng khác nhau của amino acid, phân tử nước liên kết và nhiều khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) và vô cơ

Ở các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ hợp các nhóm chức năng của acid amin không tham gia tạo thành trục chính của sợi

polypeptide

Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể

dễ dàng bị cắt đứt trong quá tr.nh phản ứng để giải phóng enzyme và sản phẩm phản ứng

Trung tâm hoạt động của các enzyme có cấu trúc bậc 4 có thể nằm trên một phần dưới đơn vị hoặc bao gồm các nhóm chức năng thuộc các phần dưới đơn vị khác nhau.Đối với cellulase, tâm hoạt động là acid amin và không có cofactor cũng như coenzyme

2.6 Các thông số cần xác định

Trong quy trình lên men, thu nhận và tinh sạch enzyme cellulase từ Asp niger, ta

cần chú ý các thông số đặc tính của enzyme như sau:

•Khối lượng phân tử [Asp niger]: 26000 Da

•Chất nền: carboxymethylcellulose + H2O

•Nhiệt độ cất giữ: -15oC trong khoảng thời gian dài hoặc 4oC trong 3 ngày

•Khoảng nhiệt độ hoạt động: nhiệt độ quá cao hay quá thấp thường dễ làm biến tính enzyme do enzyme có bản chất là protein do đó enzyme hoạt động trong khoảng

20oC – 60oC

•Nhiệt độ tối ưu: 45 oC

•Khoảng pH : pH có vai trò quan trọng trong việc tạo môi trường cho hoạt động

enzyme, mỗi enzyme có một vùng hoạt động tốt nhất riêng cho mình nên khi pH thay đổi sẽ ảnh hưởng tới độ phân ly các nhóm chức cấu trúc nên trung tâm hoạt động của

enzym như OH, SH hoạt động của hệ enzyme trong nấm mốc Aspergillus niger

thường có môi trường axit: 3 – 8

•pH tối ưu: 3.8 – 4

•Nồng độ cơ chất: cơ chất vừa có vai trò là chất cảm ứng vừa có vai trò là chất ức chế sự sinh tổng hợp enzyme khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt.

•Chất ức chế : Ag+

Chương 3: QUY TRÌNH LÊN MEN, THU NHẬN VÀ TINH SẠCH

ENZYME CELLULASE



3.1 Sơ lược quy trình lên men

Quy trình lên men giống nấm mốc Asp niger thuộc dạng lên men bề mặt và được

thực hiện theo sơ đồ sau:

3.1.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường bán rắn có các thành phần gồm bã mía và cám mì theo tỉ lệ 4:6, độ ẩm 40 – 50%

Sau khi trộn đều môi trường ta cho vào các bình tam giác thể tích 250ml, sau đó hấp khử trùng ở 121oC/30 phút

Làm nguội môi trường và chuẩn bị cấy giống

Môi trường nuôi cấy

Lên men

Khử trùng

Giống

Chế phẩm enzyme thô

Khoáng và chất tăng

trưởng (nếu có)

Canh trường

Nước + đệm

Ly tâm và tủa bằng cồn lạnh

Lên men bán rắn bề mặt trong các khay.

Nuôi cấy Asp Niger trong 2 ngày, sau đó bắt đầu thu nhận enzyme thô.

3.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cellulase

Độ thoáng môi trường

Bã mía, cám mì tác nhân làm cho môi trường thoáng xốp, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tốt Ban đầu nấm mốc sẽ tận dụng những chất dễ tiêu trong môi trường như các loại đường nhưng khi môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt thì nấm mốc phải tiết

ra những enzyme để phân hủy cơ chất khác thành đường để tiếp tục tồn tại và phát triển Tuy nhiên, cũng tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất nhiều hay ít mà nấm mốc sẽ tiết ra lượng enzyme khác nhau

Độ ẩm

Độ ẩm là khoảng 40 -50 %, đây là yếu tố quan trọng trong môi trường Nếu độ

ẩm quá thấp thì xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào nấm mốc và làm cho tế bào

bị chết Điều này sẽ làm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Nếu độ ẩm quá cao thì cũng không tốt cho sự sinh trưởng và phát triển

Yếu tố khác

Sự tổng hợp của enzyme còn phụ thuộc vào khả năng tiết tối đa của từng loại vi sinh vật có nghĩa là nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thìHoạt tính enzyme sẽ giảm do 2 nguyên nhân, thứ nhất do cơ chất tạo áp lực làm giảm quá trình sinh tổng hợp, thứ hai do cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa không đổi làm hoạt tính enzyme giảm

Khi cấy nấm mốc vào môi trường, chúng sẽ không tiết ngay ra enzyme mà sẽ tiết kiệm năng lượng đến mức tối đa và sử dụng ngay những chất dễ sử dụng nhất là các đường đơn, khoáng chất có sẵn Sau đó chúng sẽ tiết ra enzyme tùy vào thành phần các chất có trong môi trường

Nấm mốc phát triển được chia ra thành 4 giai đoạn như sau: thích nghi, phát triển, cân bằng và tử vong Ở giai đoạn thích nghi và phát triển, nấm mốc sẽ tìm cách thích nghi và tiết ra loại enzyme nào và số lượng bao nhiêu để có thể tồn tại và phát triển Theo thời gian thì lượng enzyme tiết ra sẽ tăng dần và đến một mức độ ổn định, sau đó

sẽ giảm đi khi môi trường Minh dưỡng cạn kiệt dần

3.2 Quy trình thu nhận và tinh sạch

3.2.1 Thu nhận enzyme cellulase

Mẫu: enzyme cellulase từ nấm mốc Asp Niger.

Cân 5g chế phẩm ezyme thô pha với nước tỷ lệ 1:5 (5g enzyme với 25 ml nước), dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều trong 20 phút rồi lọc qua bông

Đem dịch lọc ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút

Thu dịch chiết nằm ở phía trên, bỏ phần cặn phía dưới

- Lấy 25ml dịch chiết tủa bằng cồn lạnh 96oC tỷ lệ 1:3 (25ml dịch : 75 ml cồn) (Không sử dụng cồn ở nhiệt độ thường vì có thể làm biến tính và giảm hoạt lực của enzyme)

- Làm lạnh 30 phút.

- Dịch chiết được ly tâm lần 2 cũng ở 3000 vòng/phút trong vòng 10 phút Sau

ly tâm thu tủa phía dưới (là protein) và tách bỏ lớp dung dịch phía trên Pha dịch enzyme thu được trong dung dịch đệm acetate pH= 5=> nhằm đảm bảo quá trình biến tính của protein không xảy ra

3.2.2 Tinh sạch enzyme cellulase

Tinh sạch enzyme này bằng sắc ký lọc gel (chuẩn bị gel xem phụ lục)

Lọc qua bông Thu dịch chiết

Tủa bằng cồn

(1:3)

Thu cặn tủa protein

Ly tâm 3000 vòng/phút (10’)

Làm lạnh 30phút

Pha với nước (tỷ lệ 1:5)

Chế phẩm

enzyme

Khuấy 20 phút

Ly tâm 3000 vòng/phút (10’)

Nguyên tắc: Sắc ký lọc gel là kỹ thuật dùng để tách những phân tử có kích

thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel Những phân tử kich thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ

3.3 Phương pháp xác định hoạt tính

Cơ chất dùng để xác định hoạt động của hệ enzyme cellulase là cellulose không tan như giấy lọc, bột cellulose tinh khiết… Tuy nhiên, do lượng đường khử sinh ra không tuyến tính với lượng enzyme trong phản ứng, nghĩa là lượng enzyme tăng gấp đôi sẽ không sinh ra lượng đường khử gấp đôi trong cùng thời gian phản ứng Do đó ta

sử dụng cơ chất là dãn xuất của cellulose tan trong nước như CMC, hay HEC để xác định hoạt tính của CMCase

Với các cơ chất khác như giấy lọc dùng xác định hoạt tính enzyme exocellulose

Đơn vị đo hoạt tính riêng của cellulase là CU/mg (cellulase units)

Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford:

Chế phẩm enzyme thô

Cột sắc ký

Dung dịch đệm pH=5

Chế phẩm enzyme

Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.

Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS:

Phương pháp dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5.0 và 40oC Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS), màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm