KỸ THUẬT PHÂN TÍCH NHANH VI SINH BẰNG PETRIFILM VÀ MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG ĐỊNH DANH TRONG THỰC PHẨM, THỦY SẢN

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ CHUẨN BỊ MẪU c/ Phân phối và khử trùng: Phân phối với lượng cần thiết để chuẩn bị huyền phù ban đầu vào các bình, ống nghiệm có dung tích thích h

CÔNG TY CỔ PHẦN DỊCH VỤ KHCN SẮC KÝ – HẢI ĐĂNG

KĐT:

KỸ THUẬT PHÂN TÍCH NHANH VI SINH BẰNG PETRIFILM

VÀ MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG ĐỊNH DANH

TRONG THỰC PHẨM, THỦY SẢN

23-24/ 08/2012

Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ

Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh

Nguyên tắc chung:

- Mẫu thu bằng tăm bông vô trùng.

- Cho vào dung dịch ly trích ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát sáng.

I KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG KHÔNG KHÍ

• Nên được theo dõi ít nhất 2 tuần/lần, tùy vào kết quả kiểm tra

• Tiến hành:

KIỂM SOÁT MÔI TRƯỜNG PTN VI SINH

• < 15 KL/đĩa thì chất lượng vi sinh

của không khí là phù hợp

• > 15 KL/đĩa tiến hành xử lý lại PTN

 Đặt mt PCA tại các vị trí khác nhau trong PTN

 Đặt 2 đĩa tại vị trí hay qua lại

 Thời gian đặt đĩa 15 phút

 Ủ ở 35 0 C/ (48 ± 2)h

 Đếm các KL trên các đĩa và ghi nhận kết quả

KIỂM SOÁT MÔI TRƯỜNG PTN VI SINH

2 KIỂM SOÁT CÁC BỀ MẶT PHÒNG THÍ NGHIỆM

Kiểm soát VSV trên các bề mặt PTN: Qui định cách lấy mẫu bề mặt bằng kỹ thuật áp đĩa/que tăm bông quẹt trên bề mặt

- Que tăm bông: Que vô trùng

đựng trong tuýp

-Thạch đĩa petri: ĐK: 65mm, môi trường phù hợp

với VSV đích (bề mặt thạch lồi)

- Lấy mẫu bề mặt thạch

Áp mặt bề mặt thạch lên bề mặt cần thử/ thời gian tiếp xúc 10giây.

- Que tăm bông

Thấm ướt tăm bông lấy mẫu trên diện tích 20-100cm2 Cho tăm bông vào tuýp dd pha loãng.

CẤY MẪU

- Đ/v mẫu tăm bông

Lắc đều ống 30giây

Pha loãng nếu cần.

Cấy bằng kỹ thuật hộp đổ (1ml) hay trải trang (0,1ml)

- Đ/v chỉ tiêu Listeria monocytogenes, Salmonella spp

Lấy mẫu Swab, tăng sinh trên mt chọn lọc

- Đ/v mẫu bề mặt thạch

Ủ nhiệt độ thích hợp

- Đối với bề mặt thạch

Đếm CFU KL đặc trưng

- Đối với Swab

Đếm CFU trên mỗi đĩa và xác nhận

- Đối với tăng sinh

Theo qui trình của từng loại VSV

ĐỌC KẾT QUẢ

C N

) 1 , 0

∑C: tổng KL trên các đĩa đếm được

V: thể tích cấy

n 1 , n 2 : số đĩa ở nồng độ thứ nhất và thứ hai đếm được

d: độ pha loãng ban đầu chọn đếm

• Kiểm tra 1 lần/ tháng

• Tiến hành

 Đặt 3 đĩa môi trường Blood agar dưới dòng không khí của tủ cấy trong 1giờ (1 đĩa ở

giữa tủ cấy và hai đĩa ở hai góc của tủ cấy)

 Ủ các đĩa ở 35ºC/ (48 ± 2)h

• Không được có khuẩn lạc trên các đĩa

3 CHẤT LƯỢNG TỦ CẤY VI SINH

KỸ THUẬT LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU

I Mẫu phòng thử nghiệm:

1 Yêu cầu chung:

- Lấy mẫu phải tuân thủ theo đúng tiêu chuẩn cụ thể đối với từng sản phẩm.

- PTN phải nhận được đúng mẫu đại diện của sản phẩm và không bị hư hỏng

hoặc bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản.

- Tránh nhiễm bẩn từ bên ngoài.

- Vật chứa mẫu không được đầy quá ¾ để tránh rò rỉ và để trộn được dễ dàng

trong ptn.

- Nhận dạng các mẫu rõ ràng và toàn diện, ghi lại thông tin về mẫu.

- Ghi nhiệt độ tại thời điểm thu mẫu và nhận mẫu.

- Mẫu gửi đến ptn phải còn trong vật chứa nguyên vẹn chưa mở.

- Vật chứa mẫu phải vô trùng Nếu cần mở vật chứa mẫu thì chỉ thực hiện trong

khoảng thời gian ngắn đủ để chuyển mẫu.

KỸ THUẬT LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU

2 Vận chuyển:

- Vận chuyển bằng pp nhanh nhất tới ptn.

- Mẫu được bao gói sao cho tránh bị rò rỉ hoặc vỡ.

- Trên nhãn sản phẩm phải ghi rõ có cần bảo quản lạnh hay

không.

- Không sử dụng đá vụn để bảo quản mẫu.

Nhiệt độ trong quá trình vận chuyển:

- Sản phẩm không dễ phân hủy: nhiệt độ phòng (<400C)

- Sản phẩm đông lạnh và đông lạnh sâu: < -150C, tốt nhất là < -180C)

- Sản phẩm dễ phân hủy ở nhiệt độ môi trường: 1 0C – 8 0C.

KỸ THUẬT LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU

3 Nhận mẫu:

thông thường ptn không được nhận

tiết việc lấy mẫu, tên và địa chỉ của bên yêu cầu.

trong vòng 24h sau khi lấy mẫu Cá, sữa nguyên liệu trong vòng 36h.

KỸ THUẬT LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU

4 Bảo quản:

Nhiệt độ bảo quản:

- Sản phẩm không dễ phân hủy: nhiệt độ mt từ

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

5 Chuẩn bị huyền phù ban đầu:

a/ Nguyên tắc: chuẩn bị huyền phù sao cho thu được sự phân bố

vi sinh vật trong phần mẫu thử càng đồng đều càng tốt.

b/ Dịch pha loãng thường dùng:

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

b3/ Dịch pha loãng dùng cho các mục đích đặc biệt:

Dd muối pepton với Bromocresol tía:

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

Chỉnh về pH 7,2 bằng NaOH 1N Thêm nước cất cho đủ 1 lít

Sử dụng: pha loãng 1,25 mL dung dịch gốc thành 1 lít bằng nước cất

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

c/ Phân phối và khử trùng:

Phân phối với lượng cần thiết để chuẩn bị huyền phù ban đầu vào các bình, ống nghiệm có dung tích thích hợp Sai số cho phép sau khi khử

trùng không vượt quá: ±2%

Đậy nắp các ống nghiệm hoặc các bình không quá chặt.

Khử trùng 15 phút, 1210C, 1atm.

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

d/ Cách tiến hành:

d1/ Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu (dd pha loãng ban đầu)

- Cân một lượng m (g) với sai số cho phép ±5% hoặc đong một thể

tích V(ml) với sai số cho phép ±5% (tối thiểu là 10g hoặc 10ml),

của phần mẫu thử đại diện cho vào một chén đựng vô trùng hoặc túi bằng chất dẻo vô trùng.

- Cho một lượng dịch pha loãng 9 × m(g) hoặc 9 × V(ml) Lượng

thêm này có thể cân hoặc đong với sai số cho phép là ±5%.

- Dịch pha loãng luôn bằng nhiệt độ phòng trong suốt quá trình thao

tác, trừ trường hợp có tiêu chuẩn quy định.

- Trường hợp định lượng các bào tử, việc xử lý nhiệt huyền phù ban

đầu cần thực hiện ngay sau khi chuẩn bị và làm nguội nhanh.

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

d2/ Các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo:

- Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ± 5% cho vào ống

nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.

- Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn

d3/ Thời gian tiến hành:

Thời gian tính từ lúc chuẩn bị xong huyền phù ban đầu cho đến khi chất cấy tiếp xúc với môi trường không được vượt quá 45 phút và thời gian kể từ khi chuẩn

bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo không được vượt quá 30 phút.

* Nếu nhiệt độ phòng của phòng thử nghiệm quá cao thì hai khoảng thời gian này phải giảm đi.

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

6/ Chuẩn bị mẫu:

6.1/ Sản phẩm đông lạnh:

Rã đông trong điều kiện vô trùng ở 18 0 C đến 27 0 C (nhiệt độ ptn) tối đa

là 3h, hoặc ở 2 0 C ±2 0 C tối đa là 24h.

Khi lấy mẫu, sản phẩm vẫn còn đông lạnh thì có thể sử dụng một ít dịch pha loãng ở nhiệt độ phòng thử nghiệm để làm tan băng.

6.2/ Sản phẩm cứng và sản phẩm khô:

- Không được dập mẫu quá 2,5p/lần.

- Nếu không dập mẫu được thì phải xay hoặc nghiền nhưng không

được quá 1 phút.

6.3/ Sản phẩm lỏng và không sánh đặc:

Mẫu thử trước khi phân tích phải lắc đều.

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

6.4/ Sản phẩm không đồng nhất:

- Lấy mẫu bằng cách ước lượng từng phần, đại diện cho các phần trong mẫu ban

đầu.

- Có thể đồng hóa toàn bộ mẫu để lấy được mẫu đồng nhất.

6.5/ Mẫu phòng thử nghiệm có khối lượng bằng hoặc nhỏ hơn 50g:

Lấy toàn bộ mẫu để chuẩn bị dịch huyền phù.

6.6/ Miếng hoặc thân thịt để thử nghiệm:

Lấy mẫu sâu bên trong và bề mặt.

6.7/ Lát hoặc mẩu thịt riêng lẻ hoặc thịt đã nấu:

Lấy một dải thịt ở ngay giữa.

6.8/ Mảnh hoặc thỏi của sản phẩm đông lạnh: đồng hóa thật kỹ.

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

6.10/ Các món ăn sơ chế:

- Có bao gói: dùng kéo hoặc dao vô trùng để tháo

bỏ đối với bào bì mềm Đối với bao bì cứng phải khử trùng thật kỹ ở ngoài bằng cồn Tất cả thao tác đều trong điều kiện vô trùng.

6.11/ Cá tươi nguyên con:

Lấy một miếng mẫu hình khối từ cơ lưng, cắt và nghiền nhỏ trong dịch pha loãng.

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

6.12/ Động vật chân đầu nguyên con và thái lát:

Dùng kẹp vô trùng và dao loại bỏ da và chân Lấy mẫu ở cơ lưng và các đoạn xúc tu.

6.13/ Động vật giáp xác nguyên con như cua:

Dùng búa, kìm, hoặc kẹp vô trùng bẻ vỡ vỏ và càng, lấy phần thịt để phân tích.

6.14/ Động vật giáp xác như tôm nước ngọt, tôm đồng, tôm hùm…(nguyên con, hoặc bỏ đầu)

Trừ các con quá nhỏ, còn lại được bóc vỏ và thịt được cắt

thành từng miếng để phân tích.

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

6.16/ Cá khô, cá muối khô:

Dùng kéo cắt từ thân cá các miếng nhỏ kể cả da.

6.17/ Cá hun khói nguyên con:

Nếu da không ăn được thì loại bỏ da Lấy mẫu từ vùng lưng

và thịt được cắt nhỏ.

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

6.18/ Bột mì, hạt ngũ cốc, sản phẩm phụ từ ngũ cốc, thức ăn chăn nuôi và thức ăn chăn nuôi dạng bánh:

- Lắc kỹ bột đựng trong hộp bằng tay trước khi cân mẫu thử.

- Cho 1 phần mẫu thử vào 9 phần dd muối pepton và trộn.

- Trước khi đồng hóa, để yên từ 20 phút đến 30 phút ở 18-27 0 C.

6.19/ Sôcôla:

Làm nóng trước dịch pha loãng đến 40 0 C

Cho mẫu thử đã cân vào dịch pha loãng Lắc bằng tay để trộn đều.

Đặt hỗn hợp ở nhiệt độ phòng 20-30 phút để hóa lỏng.

6.20/ Trứng tươi nguyên quả:

Kiểm tra vỏ trứng hoặc bên trong tùy thỏa thuận giữa các bên.

• Khử trùng vỏ:

Loại bỏ các chất bẩn bằng khăn và nước rồi thấm khô.

Ngâm trong cồn 70, sau đó lấy ra để khô hoàn toàn, tránh nhiễm bẩn

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

6.21/ Trường hợp chung đối với sản phẩm giàu acid:

- Phải đảm bảo pH đưa về trung tính

- Nên sử dụng dịch pha loãng có bổ sung chất chỉ thị.

KỸ THUẬT CHUẨN BỊ DUNG DỊCH PHA LOÃNG VÀ

CHUẨN BỊ MẪU

6.22/ Thực phẩm có hàm lượng chất béo cao trừ bơ…

Bổ sung Tween 80 từ 1-10g/l ước chừng theo hàm lượng chất béo (ví

dụ, hàm lượng béo 40% thì bổ sung 4g/l).

Chủng vi sinh vật đối chiếu

Chủng đối chiếu (Reference cultures/strains)

I/

• Chủng đối chiếu cần thiết để:

- Kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cấy,

- Kiểm tra tính có giá trị của phương pháp thử,

- Chỉ thị sinh học trong trong các định lượng bằng phương pháp vi sinh vật,

• Chủng đối chiếu phải được nối chuẩn (Traceability):

- Sử dụng các chủng đối chiếu được cung cấp trực tiếp từ các bảo tàng giống quốc tế/quốc gia có uy tín (ví dụ: ATCC, NCTC, CIP,…)

- Dùng các sản phẩm thương mại của các chủng đối chiếu có bán trên thị trường nếu phòng thí nghiệm chứng minh được tính tương đương của chúng tại thời điểm sử dụng.

Chủng đối chiếu

II/

• Yêu cầu về chủng đối chiếu theo ISO 11133-1:

- Chủng đối chiếu (được cung cấp trực tiếp từ các bảo tàng giống có uy tín)

có thể cấy chuyển một lần để được chủng đối chiếu gốc (reference stocks)

- Chủng làm việc (working cultures) có thể được nhân chuẩn từ chủng đối chiếu gốc bằng cách cấy chuyển một lần

- Chủng đối chiếu gốc và chủng làm việc phải được kiểm tra về tính thuần chủng và các đặc điểm sinh hóa và được bảo quản bằng phương pháp thích hợp, như: đông lạnh hay đông khô.

- Không được sử dụng lại các chủng đối chiếu gốc đã được làm tan (phương pháp đông lạnh) hay phục hồi (phương pháp đông khô).

- Không được dùng chủng làm việc thay cho chủng đối chiếu gốc.

- Các sản phẩm thương mại của chủng đối chiếu chỉ được sử dụng như chủng làm việc.

Phần II: Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

• Phương pháp màng lọc

- Thường dùng định lượng vsv chỉ thị trong mâũ

nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường

nơi có mật độ vsv tương đối thấp

- Phương pháp này gồm bước lọc để tập trung vsv trong một mẫu nước trên màng lọc và xác định số

tế bào dựa vào số khlạc đếm được sau khi đặt

màng lọc lên đĩa thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vsv cần kiểm.

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

• Kích thước lỗ màng lọc là Kích thước lỗ màng lọc là 0,45 µ m hoặc 0,2 µ m được chế tạo từ sợi thuỷ tinh siêu mảnh, sợi polypropylene, thường được cung cấp trong trạng thái vô trùng.

• Ngoài ra còn màng lọc lưới kỵ nước trên đó có in các Ngoài ra còn màng lọc lưới kỵ nước trên đó có in các

ô vuông bằng vật liệu kỵ nước nhằm ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc Công thức tính cho màng lọc này: MPN= Nln(N/N-x), N: tổng số các ô vuông x: số ô có khlạc mọc

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

• Phương pháp đếm khuẩn lạc:

Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định

số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi

trường chọn lọc và không chọn lọc Do vậy phương pháp này có tên là phương pháp đếm khuẩn lạc hay đếm đĩa.

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

Phương pháp này có thể được thực hiện

bằng kỷ thuật hộp trải hay hộp đổ với các thiết bị hỗ trợ để đọc kết quả Trong

phương pháp này, cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho xuất hiện khuẩn lạc riêng lẻ

trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán.

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

• Số lượng khuẩn lạc tối ưu được đề nghị bởi

các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa.

cần thực hiện lặp lại trên ít nhất 2 đĩa ở mỗi nồng độ.

trình bày bằng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml (colony forming unit)

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

• Phương pháp MPN

(phương pháp có số xác suất cao nhất)

Là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vsv có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

• Thường thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha

loãng liên tiếp (gồm 9 ống)

• Ghi lại hiện tượng các ống nghiệm dương

tính ở từng nồng độ.

• Dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vsv

theo đơn vị MPN/100ml hay MPN/g mẫu

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

1/ Phương pháp sử dụng Petrifilm:

Petrifilm là dạng môi trường khô pha sẵn

ép thành dạng đĩa, có thể sử dụng ngay để

đếm vi khuẩn và nấm men nấm mốc.

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

Nhỏ mẫu ủ mẫu đếm

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật

Bảo quản:

• Khi chưa khui bao bì thì lưu trữ ở < 8 0 C hoặc để ở tủ đông đến hạn

sử dụng.

• Những bao bì đã được mở ra thì để ở nhiệt độ phòng với độ ẩm

50% tối đa khoảng 30 ngày

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

1 TPC:

• Ký hiệu khác: TPC (total plate count), APC (aerobic plate count)

• Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật phát triển và tạo được khuẩn lạc có thể nhìn thấy

được trong điều kiện có oxy.

• Số đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu-colony forming unit) là số khuẩn lạc được nhìn

thấy trong môi trường nuôi cấy.

* Lưu ý:

- TPC phản ánh mức độ nhiễm vi sinh vật trong mẫu.

- TPC không phản ánh tổng số vi sinh vật trong mẫu.

- TPC không phản ánh mức độ an toàn vệ sinh của thực phẩm, nước uống, nước sinh

hoạt…

- Số TPC có thể thấp hơn rất nhiều so với mật độ vi sinh vật trong mẫu.

Tổng số vi sinh vật hiếu khí

- Mẫu được đồng nhất, pha loãng theo luỹ thừa thập phân.

- Thời gian ủ 72h đối với mẫu thực phẩm, 48h đối với

mẫu nước

- Không phân biệt khuẩn lạc xuất hiện.

Tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC – ISO 4833:2003)

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm

n V

C

).

1 , 0

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm

Trong đó:

N: tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1ml mẫu.

C: tổng số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa.

Một số phương pháp phân tích vi sinh vật trong thực phẩm

Petri PCA (Plate Count Agar)

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

Petrifilm AOAC 990.12:2011

Petrifilm tổng vi khuẩn hiếu khí:

• Không có vòng giới hạn sẵn

• Được dùng với 1 mL mẫu

• Có thể thả nhanh màng phim xuống sau khi nhỏ mẫu